CN112538489A

CN112538489A - 一种生防腐霉诱导植物抗性的Elicitin类基因及其表达载体和应用

Info

Publication number: CN112538489A
Application number: CN202011565256.9A
Authority: CN
Inventors: 窦道龙; 景茂峰; 杨坤; 董小华; 李佳露
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN112538489B

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种生防腐霉诱导植物抗性的Elicitin类基因及其表达载体和应用，本发明筛选了一种分别来自寡雄腐霉(Pythium oligandrum)的Elicitin类基因POD8和缠器腐霉(Pythium periplocum)的Elicitin类基因PPOD2，所述POD8和PPOD2基因的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO.1—2所示。可以提高作物对疫霉菌、核盘菌的抗性。所述Elicitin基因可以用于基因工程，构建抗病的作物，同时为我们在农业生产中制定抗病策略、控制病害提供有力指导。

Description

一种生防腐霉诱导植物抗性的Elicitin类基因及其表达载体和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种生防腐霉诱导植物抗性的Elicitin类基因及其表达载体和应用。

背景技术

在植物与病原菌的长期协同进化过程中，病原菌为了更好地侵染植物，进化出大量的攻击寄主的武器，例如效应蛋白(effector)。病原菌分泌这些效应蛋白到植物体内为了促进其更好地侵染寄主植物，然而，伴随着植物的共同进化，有些效应蛋白会被植物自身进化的调控抗病相关的基因识别。对病原体的识别通常会触发局部抗性反应，称为超敏反应(HR)，其特征在于感染部位的快速细胞死亡。对于研究植物与病原菌互作而言，这一明显的HR反应也是作为激发植物免疫的重要信号。活性氧积累也是一个触发植物免疫反应的关键信号，也可以作为植物防御反应触发的信号标识。利用农杆菌介导的瞬时表达系统接种病原菌是最直接评估基因是否能够诱导植物抗性的方法。

寡雄腐霉(Pythium oligandrum)和缠器腐霉(Pythium periplocum)广泛存在于植物根系生态系统，在与植物接触过程中通过分泌大量激发子诱导植物对病原菌产生广泛、长期的抗性，同时对很多致病菌有很强的重寄生和拮抗作用。目前，国际上寡雄腐霉产品以卵孢子为有效成分，尚未开发出基于寡雄腐霉免疫诱抗蛋白的相关产品。我们通过大量筛选获得了两个分别来源于寡雄腐霉(Pythium oligandrum)和缠器腐霉(Pythiumperiplocum)的同源基因能够触发植物过敏性反应(HR)和活性氧(ROS)积累的基因。这两个基因都包含Elicitin结构域，是典型的免疫激发子。此外我们利用农杆菌介导的瞬时表达系统客观评估发现能够诱导植物产生抗性。激发HR，促进ROS积累，触发植物免疫，诱导植物产生抗病反应，有助于研究开发植物免疫诱抗剂。这两个基因的强大功能既可以作为开发植物免疫诱抗剂的候选基因，又可以利用转基因技术直接将基因导入植物体内，开发培育抗病品种。

发明内容

本发明的目的在于一种生防腐霉诱导植物抗性的Elicitin类基因及其表达载体的应用。本发明提供一种生防腐霉免疫诱抗蛋白的候选基因，可以利用转基因技术将所述基因导入植物，开发抗病品种。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明鉴定到分别来自寡雄腐霉(Pythium oligandrum)的Elicitin类基因POD8和缠器腐霉(Pythium periplocum)的Elicitin类基因PPOD2，所述POD8和PPOD2基因的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO.1—2所示。两个Elicitin类基因编码的蛋白质为POD8和PPOD2，其氨基酸序列依次分别如SEQ ID NO.3—4所示。

含有上述Elicitin类基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。

该重组表达载体的出发载体为表达载体PBIN-PLUS。含有上述Elicitin类基因的重组表达载体PBIN-PLUS:POD8和PBIN-PLUS:PPOD2。

构建所述Elicitin类基因POD8和PPOD2基因的重组表达载体PBIN-PLUS:POD8和PBIN-PLUS:PPOD2。以植物表达载体PBIN-PLUS为出发载体，将POD8和PPOD2基因分别插入PBIN-PLUS的Sma1酶切位点获得。

所述Elicitin类基因及其表达载体可以激发植物免疫反应，为开发免疫诱抗剂提供知识基础，为防控作物病虫害提供理论指导。

一种植物免疫诱抗剂，该诱抗剂含有上述的生防腐霉免疫诱抗蛋白或上述生防腐霉免疫诱抗蛋白的发酵液。

上述的Elicitin类基因、上述的蛋白或上述的重组表达载体在诱导植物产生坏死和活性氧积累中的应用。

上述的Elicitin类基因、上述的蛋白或上述的重组表达载体在开发植物免疫诱抗剂中的应用。

上述的Elicitin类基因在培育抗病作物品种中的应用。

一种激发植物免疫的方法，将上述的基因或重组表达载体导入植株中，便能够激发植物免疫反应，提高植物抗性。也是一种构建抗病品种的方法，将上述的基因或重组表达载体导入作物植株中，经过抗性筛选得到阳性转化植株，获得抗病作物品种。

本发明的有益效果：

本发明分别从寡雄腐霉和缠器腐霉中鉴定到两个Elicitin类同源基因，将其重组连接到pET32a载体体外表达获得蛋白。将所述蛋白注射植物体内，能够产生显著的HR反应，促进活性氧积累，激发植物免疫。所述POD8和PPOD2蛋白可以作为开发植物免疫诱抗剂的潜在候选者，为防控植物病害理论支撑。同时将所述基因重组连接到植物表达载体PBIN-PLUS中导入作物中，可以提高作物对疫霉菌、核盘菌的抗性。所述Elicitin基因可以用于基因工程，构建抗病的作物，同时为我们在农业生产中制定抗病策略、控制病害提供有力指导。

附图说明

图1为两个elictin家族蛋白在本式烟上的表型分析。

其中，A为原核表达蛋白注射本式烟叶片会诱导HR表型；B为原核表达蛋白能够激发过氧化氢积累；C为农杆菌瞬时表达两个基因在烟草上能够提高植物对寄生疫霉的抗性；D为农杆菌瞬时表达两个基因在烟草上能够提高植物对核盘菌的抗性。

图2为体外原核表达蛋白下胚轴浸泡评估对大豆疫霉的抗性。

其中，A为病斑直径测量数据；B为生物量检测数据。(Dunnett’s test:****p<0.0001)

图3为活性氧迸发强度定量统计图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1 2个Elicitin类基因的扩增和测序

1、实验菌株

供试菌株寡雄腐霉(Pythium oligandrum)¹、缠器腐霉(Pythium periplocum)²、寄生疫霉(Phytophthora parasitica)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)和大豆疫霉(Phytophthora sojae)由南京农业大学植病系植物与疫霉互作实验室保存。菌株保存于10％V8固体培养基，保存温度为10℃。

2、供试本氏烟草幼苗的准备

本氏烟草(Nicotiana benthamiana)播种于装有蛭石(2-4mm)的塑料花盆(d＝10cm)里，放到14h光照(强光照射)/10h黑暗的温室中生长。使其生长7天，生长出两片真叶后，将其移栽至蛭石黑土提及体积比例为5：1的培养土里生长30天，取相同3，4，5叶位的叶片用作表达实验基因。

3、提取寡雄腐霉(Pythium oligandrum)、缠器腐霉(Pythium periplocum)RNA，并获得目的基因的cDNA

收集寡雄腐霉和缠器腐霉菌丝，然后液氮速冻后放入研钵冷却研磨。参照天根总RNA抽提纯化试剂盒推荐方法进行寡雄腐霉和缠器腐霉RNA提取和纯化。参照诺维赞公司RNA反转录试剂盒提供的方法，以Oligo(dT)为引物反转录合成c D N A。以上述c D N A为模板，用相应上下游引物进行PCR扩增(引物序列见表1)。

表1引物序列

name	sequence
		PBIN-PLUS-Sma1-POD8-F	CGATAGGGTACCCCCATGAAGCCTTTCACCGTC
PBIN-PLUS-Sma1-POD8-R	GGATCCGTCGACCCCGACCTCAATGCCGAGGGC
		PBIN-PLUS-Sma1-PPOD2-F	CGATAGGGTACCCCCATGAAGCTTTTCACCGTC
PBIN-PLUS-Sma1-PPOD2-R	GGATCCGTCGACCCCGACCTCAATCCCGAGGGC
		POD8-pET32a-F	GCCATGGCTGATATCGGATCCATGTACGATGAAGTCACC
POD8-pET32a-R	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGACCTCAATGCCGAGGGC
		PPOD2-pET32a-F	GCCATGGCTGATATCGGATCCATGTACGATGAAGTCACC
PPOD2-pET33a-R	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGACCTCAATCCCGAGGGC

PCR反应体系为：2.5μL 10×PCR反应缓冲液；1.5μL 1.5mM MgCl2；0.5μL 2.5mMdNTPs；0.25μL Taq DNA聚合酶(5.0U/μL)；0.5μL引物；0.5μL模板；无菌水补足至25μL。

反应程序为：94℃5min预变性；94℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1:30min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

上述PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、回收，经测序确认无误后，获得的序列为所述2个Elicitin类基因的核苷酸序列。该Elicitin类基因包括分别来自寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)的Elicitin类基因POD8和缠器腐霉(Pythium periplocum)的Elicitin类基因PPOD2，所述POD8和PPOD2基因的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO.1—2所示。两个Elicitin类基因编码的蛋白质，其氨基酸序列依次分别如SEQ ID NO.3—4所示。后续研究发现其具有诱导植物产生坏死和活性氧积累的强大功能。

实施例2构建PBIN-PLUS:POD8/PBIN-PLUS:PPOD2表达载体

将PBIN-PLUS(BIOVECTOR中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)空载体质粒用SmaI进行酶切。利用诺维赞公司的同源重组酶将实施例1分别以PBIN-PLUS-Sma1-POD8-F/R以及PBIN-PLUS-Sma1-PPOD2-F/R为引物获得的PCR扩增产物(POD8和PPOD2)分别和载体连接。

反应体系如下：2μL 10×CEⅡ反应缓冲液；2μL上述PCR回收产物；2μL上述酶切后的空载体；1μL同源重组酶；无菌水补足至10μL。

反应程序为：37℃条件下反应30min。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，在Kan抗性培养基上筛选转化子，挑取阳性克隆提取质粒进行菌落PCR鉴定。将鉴定到的阳性克隆测序，正确即获得了PBIN-PLUS:POD8/PBIN-PLUS:PPOD2表达载体。

实施例3构建pET32a:POD8/pET32a:PPOD2原核表达载体

将pET32a空载体质粒用BamHⅠ和XhoⅠ进行酶切。利用诺维赞公司的同源重组酶将实施例1中分别以POD8-pET32a-F/R以及PPOD2-pET32a-F/R为引物获得的PCR扩增产物(POD8和PPOD2)和载体连接。

反应程序为：37℃条件下反应30min。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，在Amp抗性培养基上筛选转化子，挑取阳性克隆提取质粒进行菌落PCR鉴定。将鉴定到的阳性克隆测序，正确即获得了pET32a:POD8/pET32a:PPOD2表达载体。

实施例4表达载体转化农杆菌及功能验证

1、获得农杆菌感受态细胞

在LB固体培养基平板上划线培养农杆菌GV3101菌株，28℃条件下倒置培养18-20h；将单菌落置于LB液体培养基(含有100mg/L Rif)，28℃条件下振荡培养18-20h；100倍体积的不含抗生素的菌液加入菌液中，28℃条件下振荡培养OD600至0.3-0.5；冰上冷却后，4℃条件下4000r/min离心5min，弃上清；加入20mmol/L的CaCl2溶液使沉淀悬浮，4℃条件下4000r/min离心5min，弃上清；加入20mmol/L的CaCl2溶液再次使菌体沉淀悬浮备用。

2、PBIN-PLUS:POD8/PBIN-PLUS:PPOD2表达载体转化农杆菌

利用电转法将PBIN-PLUS:POD8/PBIN-PLUS:PPOD2载体分别转化农杆菌细胞；利用70％酒精冲洗电击杯三次，然后完全风干酒精。将100ng表达载体加入农杆菌感受态，冰上放置30min。将农杆菌感受态细胞转移至电击杯中，利用2.5kV的电压进行电击转化。电击完成后将农杆菌感受态细胞加入到400μL LB液体培养基中，28℃振荡培养2h。吸取20μL菌液，均匀涂抹在含有50mm卡那霉素和25mm的利福平固体LB培养基平板上，28℃倒置培养48h。挑取单菌落进行菌落PCR，获取阳性克隆。

3、在本氏烟草中瞬时表达PBIN-PLUS:POD8/PBIN-PLUS:PPOD2蛋白

将上述阳性克隆放置于LB液体培养基中，28℃震荡培养30h。将菌液收集，用8000rpm离心2min，利用10mM MgCl2清洗三次。最后用10mM的MgCl2稀释菌液至OD600值0.3。将菌液与含有沉默抑制子P19的菌液1：1混合。用1mL注射器注射分别注射满同一本氏烟草叶片的左面和右面。

4、瞬时表达PBIN-PLUS:POD8/PBIN-PLUS:PPOD2蛋白的本氏烟抗病性检测

将确认表达蛋白的叶片剪下，放置于滤纸保湿的托盘内。用7mm打孔器在寄生疫霉和核盘菌的平板生长边缘打孔，将打下的菌碟菌面向下得左右对称放置在本氏烟叶片的左右两侧。将托盘放置于25℃培养箱，黑暗，36h。取出叶片，然后用手持紫外荧光仪照射叶片。颜色变深的区域即为寄生疫霉的侵染区域。核盘菌可以直接肉眼观察。用量尺测量侵染区域的直径，表达PBIN-PLUS:GFGP蛋白的叶面为对照，比较两种蛋白对本氏烟抗性的影响。发现来自寡雄腐霉和缠器腐霉的两个Elicitin蛋白显著提高了本氏烟草对寄生疫霉和核盘菌的抗性(如图1所示)。

5、体外原核表达蛋白的获取

通过在18℃下孵育12h，将重组的PET-32a载体转化到含0.1mM IPTG的大肠杆菌BL21菌株中。通过考马斯亮蓝染色和蛋白质印迹确定蛋白质表达水平。

6、大豆疫霉侵染下胚轴评估抗病表型

播种4天后收集黄化的大豆幼苗。大豆幼苗根部浸泡于蛋白溶液，黑暗处理4h。下胚轴分别用大豆疫霉菌菌丝块接种，并在黑暗和潮湿的环境中分别孵育36h,统计结果。每种病原体至少进行了3次幼苗感染，实验结果如图2所示。

7、活性氧(ROS)积累检测³

注射所有处理基因36h后，用1mg/ml DAB溶液于黑暗中染色8h，然后用95％乙醇脱色处理，最后用相机拍照记录表型，实验结果如图3所示。

参考文献

1.Benhamou,N.et al.Pythium oligandrum:an example of opportunisticsuccess.Microbiology 158,2679-2694,doi:10.1099/mic.0.061457-0(2012).

2.Paul,B.&Masih,I.ITS1 region of the nuclear ribosomal DNA of themycoparasite Pythium periplocum,its taxonomy,and its comparison with relatedspecies.FEMS Microbiology Letters(2000).

3.Jambunathan,N.Determination and detection of reactive oxygenspecies(ROS),lipid peroxidation,and electrolyte leakage in plants.Methods MolBiol 639,292-298,doi:10.1007/978-1-60761-702-0_18(2010).

POD8基因

ATGAAGCCTTTCACCGTCGCTGCTCTCTGCATCGCTGCTTTCACTCAGGCCGCTGCCTACGATGAAGTCACCGAGTGTCCAATCGAAGAGATCCTCAAGCTTCGTGCCTTGGCTGAGGAACCTGCTCGTCCAACGTGCGAAGCGGTGTCCGGCTACACGTTCATCCCACCACCGGGTGAGCCAACGCCAGCTCAGATCTTGCTCATGTGCTTGACCCCAGAGTGCAAGACCACTATCAACACGCTCATCTCGATCAATCCTGCCGATTGTGTGCTTGTCCTCGGTGACGTGCGCATCAACGTCAAGAAGCTCGCGGAGAGCTACAAGCCAGCCTGCCAGGCCCTCGGCATTGAGGTCTAA

PPOD2基因

ATGAAGCTTTTCACCGTCGCTGCTCTCTGCATCGCTGCTTTCACTCAGGCCGCTGCCTACGATGAAGTCACCGAGTGTCCAATCGAAGAGATCCTCAAGCTCCGTGCCTTGGCTGAGGAACCTGCTCGTCCAACGTGCGAAGCGGTGTCCGGCTACACGTTCATCCCACCACCGGGTGAGCCAACGCCAGCTCAGATCTTGCTCATGTGCTTGACCCCAGAGTGCAAGACCACCATCAACACGCTCATCTCGATCAAACCTGCCGATTGTGTGCTTGTCCTCGGTGACGTGCGCATCAACGTCAAGAAGCTCGCGGAGAGCTACAAGCCAGCCTGCCAGGCCCTCGGGATTGAGGTCTAA

POD8蛋白

MKPFTVAALCIAAFTQAAAYDEVTECPIEEILKLRALAEEPARPTCEAVSGYTFIPPPGEPTPAQILLMCLTPECKTTINTLISINPADCVLVLGDVRINVKKLAESYKPACQALGIEV*

PPOD2蛋白

MKLFTVAALCIAAFTQAAAYDEVTECPIEEILKLRALAEEPARPTCEAVSGYTFIPPPGEPTPAQILLMCLTPECKTTINTLISIKPADCVLVLGDVRINVKKLAESYKPACQALGIEV*

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种生防腐霉诱导植物抗性的Elicitin类基因及其表达载体和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 360

<212> DNA

<213> 寡雄腐霉(Pythium oligandrum)

<400> 1

atgaagcctt tcaccgtcgc tgctctctgc atcgctgctt tcactcaggc cgctgcctac 60

gatgaagtca ccgagtgtcc aatcgaagag atcctcaagc ttcgtgcctt ggctgaggaa 120

cctgctcgtc caacgtgcga agcggtgtcc ggctacacgt tcatcccacc accgggtgag 180

ccaacgccag ctcagatctt gctcatgtgc ttgaccccag agtgcaagac cactatcaac 240

acgctcatct cgatcaatcc tgccgattgt gtgcttgtcc tcggtgacgt gcgcatcaac 300

gtcaagaagc tcgcggagag ctacaagcca gcctgccagg ccctcggcat tgaggtctaa 360

<210> 2

<211> 360

<212> DNA

<213> 缠器腐霉(Pythium periplocum)

<400> 2

atgaagcttt tcaccgtcgc tgctctctgc atcgctgctt tcactcaggc cgctgcctac 60

gatgaagtca ccgagtgtcc aatcgaagag atcctcaagc tccgtgcctt ggctgaggaa 120

cctgctcgtc caacgtgcga agcggtgtcc ggctacacgt tcatcccacc accgggtgag 180

ccaacgccag ctcagatctt gctcatgtgc ttgaccccag agtgcaagac caccatcaac 240

acgctcatct cgatcaaacc tgccgattgt gtgcttgtcc tcggtgacgt gcgcatcaac 300

gtcaagaagc tcgcggagag ctacaagcca gcctgccagg ccctcgggat tgaggtctaa 360

<210> 3

<211> 119

<212> PRT

<213> 寡雄腐霉(Pythium oligandrum)

<400> 3

Met Lys Pro Phe Thr Val Ala Ala Leu Cys Ile Ala Ala Phe Thr Gln

1 5 10 15

Ala Ala Ala Tyr Asp Glu Val Thr Glu Cys Pro Ile Glu Glu Ile Leu

20 25 30

Lys Leu Arg Ala Leu Ala Glu Glu Pro Ala Arg Pro Thr Cys Glu Ala

35 40 45

Val Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Pro Pro Pro Gly Glu Pro Thr Pro Ala

50 55 60

Gln Ile Leu Leu Met Cys Leu Thr Pro Glu Cys Lys Thr Thr Ile Asn

65 70 75 80

Thr Leu Ile Ser Ile Asn Pro Ala Asp Cys Val Leu Val Leu Gly Asp

85 90 95

Val Arg Ile Asn Val Lys Lys Leu Ala Glu Ser Tyr Lys Pro Ala Cys

100 105 110

Gln Ala Leu Gly Ile Glu Val

115

<210> 4

<211> 119

<212> PRT

<213> 缠器腐霉(Pythium periplocum)

<400> 4

Met Lys Leu Phe Thr Val Ala Ala Leu Cys Ile Ala Ala Phe Thr Gln

1 5 10 15

Ala Ala Ala Tyr Asp Glu Val Thr Glu Cys Pro Ile Glu Glu Ile Leu

20 25 30

Lys Leu Arg Ala Leu Ala Glu Glu Pro Ala Arg Pro Thr Cys Glu Ala

35 40 45

Val Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Pro Pro Pro Gly Glu Pro Thr Pro Ala

50 55 60

Gln Ile Leu Leu Met Cys Leu Thr Pro Glu Cys Lys Thr Thr Ile Asn

65 70 75 80

Thr Leu Ile Ser Ile Lys Pro Ala Asp Cys Val Leu Val Leu Gly Asp

85 90 95

Val Arg Ile Asn Val Lys Lys Leu Ala Glu Ser Tyr Lys Pro Ala Cys

100 105 110

Gln Ala Leu Gly Ile Glu Val

115

Claims

1.一种生防腐霉诱导植物抗性的Elicitin类基因，该基因为POD8和PPOD2中的至少一种，所述POD8和PPOD2的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO.1～2所示。

2.权利要求1所述Elicitin类基因编码的生防腐霉免疫诱抗蛋白，该蛋白的氨基酸序列依次分别如SEQ ID NO 3～4所示。

3.含有权利要求1所述Elicitin类基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体的出发载体为表达载体PBIN-PLUS。

5.一种植物免疫诱抗剂，其特征在于，该诱抗剂含有权利要求2所述的生防腐霉免疫诱抗蛋白或权利要求2所述生防腐霉免疫诱抗蛋白的发酵液。

6.权利要求1中所述的Elicitin类基因、权利要求2中所述的蛋白或权利要求3或4中所述的重组表达载体在诱导植物产生坏死和活性氧积累中的应用。

7.权利要求1中所述的Elicitin类基因、权利要求2中所述的蛋白或权利要求3或4中所述的重组表达载体在开发植物免疫诱抗剂中的应用。

8.权利要求1所述的Elicitin类基因在培育抗病作物品种中的应用。

9.一种激发植物免疫的方法，其特征在于，将权利要求1所述的Elicitin类基因或权利要求3或4中所述的重组表达载体导入植株中，激发植物免疫反应，提高植物抗性。

10.一种培育抗病作物品种的方法，其特征在于，将权利要求1所述的Elicitin类基因或权利要求3或4中所述的重组表达载体导入植株中，经过抗性筛选得到阳性转化植株，获得抗病作物品种。