CN110037054A - 一种提高烟草抗病性的水溶性多肽诱导剂及其应用 - Google Patents

Abstract

一种提高烟草抗病性的水溶性多肽诱导剂及其应用，所述诱导剂包括：15～25份水溶性多肽、50～70份溶剂、5～15份渗透剂、5～15份稳定剂，所述水溶性多肽提取自青霉菌灭活菌丝体；该水溶性多肽的制备方法为：将青霉菌灭活菌丝体用盐析法提取多肽粗提物，再将多肽粗提物经过三级分离和活性筛选得到所述水溶性多肽浓缩干燥样品，该水溶性多肽能诱导烟草抵抗烟草花叶病毒及烟草黑胫病病菌。本发明提取方法简单，并能对废物进行充分利用，效果佳，质量稳定。

Description

一种提高烟草抗病性的水溶性多肽诱导剂及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高烟草抗病性的水溶性多肽诱导剂及其应用。

背景技术

植物自身即拥有抵御病原物和非生物胁迫的机制，分为固有抗性和诱导抗性。诱导抗性是植物在一定的诱导因子刺激下，对随后的病原菌侵染产生抵抗性的一种现象。这是利用植物自身的防卫体系来进行病害防治，克服了抗病育种年限长、抗病品种产量低、化学防治易造成环境污染和病菌的抗药性等诸多缺点。随着人们对这方面研究的加深，利用诱导抗性防治植物病害在可持续农业模式中越来越受重视。植物诱导抗病剂，又称激发子(Elicitor)，是可以诱导植物抗性的一系列物理、化学或生物源诱导因子的总称。这些物质可被植物识别为信号物质，诱发植物自身的免疫系统，最终使植物获得抵御病害的能力。因此，植物诱抗剂可称得上是植物的“疫苗”，对植物诱抗剂的研究与开发对可持续发展农业具有非常重要的意义。

现有技术中，多肽保与AHO2种诱导剂的组合应用对控制TMV有良好效果,能明显推迟带毒隐症烟株TMV的发病时间,移栽后70d对以清水和东旺毒消为对照的大田期烟株TMV的平均防效分别达到69.64％和43.25％。

青霉菌灭活菌丝体(Dry mycelium of Penicillium chrysogenum)是工业生产青霉素的残余副产物,是包含菌丝体、代谢物、发酵残余物的混合体，国家规定高温灭活后可排放。研究表明，青霉菌灭活菌丝体可以作为有机肥料促进作物生长，并且能够诱导植物产生抗病性，提高植物对多种病害的抵抗能力。然而，青霉菌灭活菌丝体成分复杂，以其直接作为诱导抗病剂虽然工艺简单，但由于其中有效物质未确定，因此无法以有效成分来准确定量，其作用的稳定性受到一定影响。开发青霉菌灭活菌丝体中具有稳定诱导抗病效果的成分作为植物诱抗剂，以实现有效、稳定、广谱的病害防治效果，在农业生产上具有重要意义。前人曾尝试利用亲和层析、离子交换层析、高效液相色谱等方法分离青霉菌灭活菌丝体中的有效成分，然而并未获得良好结果。针对青霉菌灭活菌丝体中的某一类物质进行分离和提取，或能达到更好的效果。青霉菌灭活菌丝体中含有一定量的多肽物质，其中的水溶性多肽可以稳定诱导植物产生系统抗病性。本发明提供了一种简便、快捷的办法提取青霉菌灭活菌丝体中的水溶性多肽，并将其制备为高效诱导抗烟草花叶病毒(TMV)抗病剂应用于农业生产。

发明内容

针对以上问题，本发明提供了一种简便、快捷的办法提取青霉菌灭活菌丝体中的水溶性多肽，并将其制备为高效诱导抗烟草花叶病毒(TMV)抗病剂应用于农业生产。

本发明采用的技术方案为，一种提高烟草抗病性的水溶性多肽诱导剂，所述诱导剂包括：15～25份水溶性多肽、50～70份溶剂、5～15份渗透剂、5～15份稳定剂，所述水溶性多肽提取自青霉菌灭活菌丝体。

优选地，所述溶剂为水，所述渗透剂为氨基磺酸钠或吐温，所述稳定剂为氨基酸碱类物质。

优选地，所述水溶性多肽的制备方法为：

a.将青霉菌灭活菌丝体用盐析法提取多肽粗提物：

1)将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣倒入预混池，按照残渣:硅藻土质量比为10:1～10：3的比例加入干燥的硅藻土，搅拌混合均匀；

2)将上述预混合料80℃～110℃鼓风干燥灭活0.5～2.5小时；

3)干燥后的混合料每50～100克用1升蒸馏水溶解，用八层纱布或双层棉布过滤除去不能溶解的残渣，将过滤得到的澄清液体倒入大烧杯；

4)向大烧杯中缓慢加入硫酸铵，边加入边搅拌溶解，至硫酸铵浓度达到80％～100％，将溶液静置8～16小时至有沉淀物析出，此时溶液呈悬浊状态，将悬浊液倒入离心管，3000rmp离心，弃掉上层液体，取沉淀；

5)每1克沉淀用50～100毫升蒸馏水溶解，用截留分子量小于3.0kDa以下的滤膜超滤或透析除盐；

6.)除盐后的溶液可作为储备液于4℃保存，如需长期保存，可用氮气吹干，即获得所需的干燥多肽粗提物；

b.将步骤a中的粗提物经过三级分离和活性筛选得到所述水溶性多肽浓缩干燥样品。

所述多肽粗提物的分离方法为：

(1)一级分离：将多肽提取物缓冲液(PH7.6,150mmol/L乙酸铵)溶解，12000rpm，10min离心取上清，0.45μm滤膜过滤，滤下液备用。用pure层析系统，Hiload16/60Superdex30prep grade预装柱对上述滤下液进行分离制备，每次进样3mL，用缓冲液(PH7.6,150mmol/L乙酸铵)1mL/min等度洗脱1.8个柱体积，280nm检测，分段收集馏分。

(2)活性组分筛选：对各分离组分进行心叶烟诱导处理，进行枯斑抑制率对比试验，筛选诱导活性强的组分。

各个一级分离组分用去离子水溶解，分别配制成1mg/mL工作液用于烟草诱导处理。将配制好的各个一级组分分别均匀涂抹在心叶烟下位三片叶的叶片上表面，每片叶涂抹100μL。对照用100μL清水涂抹叶片，每个处理3株烟，重复三次。

(3)二级分离:将筛选出的一级组分用含0.1％TFA的超纯水溶解，12000rpm离心10min，上清用0.22μm滤膜过滤；

再将所得的样品组分用高效液相色谱系统(Agilent 1260)，Zorbax 300SB-C18色谱柱对活性较强组分进行二级分离纯化，合并相同组分。

(4)活性组分筛选：将各个二级分离组分用去离子水溶解，分别配制成1mg/mL母液用于烟草BY-2细胞诱导处理，分别用终浓度为5μg/mL的各个二级分离组分处理烟草BY-2细胞，空白对照用等体积无菌水处理，用终浓度为1μmol/mL的flg22处理细胞作为阳性对照，进行ROS检测。

(5)三级分离和活性筛选：将有明显诱导活性的二级组分进行进一步分离纯化，色谱柱为Zorbax 300SB-C18，流动相A为0.09％TFA+99.91％甲醇，流动相B为0.1％TFA+99.9％超纯水，每次进样体积50μL，检测波长为280nm，参照二级组分各自的出峰时间及洗脱梯度，流速2mL/min，按照峰型分段收集。收集到的各个组分利用BY-2细胞进行诱导抗病效果检测，将诱导抗病效果最佳的组分进行收集得到水溶性多肽的水溶液，进一步对水溶性多肽干燥得到水溶性多肽样品。

上述步骤制得的多肽诱导剂在提高烟叶抗烟草花叶病毒及烟草黑胫病病菌的抗性中的应用。

将本发明制备的水溶性多肽样品用水、渗透剂以及稳定剂配置成诱导剂工作液，涂抹在心叶烟上可以提高其抵抗烟草花叶病毒及黑胫病病菌的能力，抑制效果分别达到92.3％和78％。

本发明制备的提高烟草抗病性的水溶性多肽诱导剂具有以下优点：

1.本水溶性多肽是从工业上废弃的青霉菌灭活菌丝体中首次分离提取获得，充分利用废弃资源，变废为宝，对植物诱导抗性具有稳定且良好的诱导效果。

2.具有较强的诱导抗烟草花叶病毒基因表达的活性，能够诱导烟草产生系统抗性。

3.提取方法简单、快捷。

4.本发明与直接使用青霉菌菌丝体做为诱导剂相比，具有更好的稳定性，且能更好的进行施用量的确定。

具体实施方式

本发明将结合实施例作进一步的说明，但不是限制本发明。

实施例1：

青霉菌灭活菌丝体水溶性多肽的制备方法:

1.将青霉菌灭活菌丝体用盐析法提取多肽粗提物。

1)将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣倒入预混池，按照残渣:硅藻土质量比为10:2的比例加入干燥的硅藻土，搅拌混合均匀；

2)将上述预混合料90℃鼓风干燥灭1.5小时；

3)干燥后的混合料每75克用1升蒸馏水溶解，用八层纱布或双层棉布过滤除去不能溶解的残渣，将过滤得到的澄清液体倒入大烧杯；

4)向大烧杯中缓慢加入硫酸铵，边加入边搅拌溶解，至硫酸铵浓度达到90％，将溶液静置12小时至有沉淀物析出，此时溶液呈悬浊状态，将悬浊液倒入离心管，3000rmp离心，弃掉上层液体，取沉淀；

5)每1克沉淀用75毫升蒸馏水溶解，用截留分子量小于3.0kDa以下的滤膜超滤或透析除盐；

6)除盐后的溶液用氮气吹干，获得所需的干燥多肽粗提物。

2.将步骤1中的粗提物经过三级分离和活性筛选得到水溶性多肽液，经干燥后得到水溶性多肽，使用时将10份水溶性多肽、70份溶剂、15份渗透剂、5份稳定剂水溶性多肽配置成水溶性多肽诱导剂。

实施例2：

青霉菌灭活菌丝体水溶性多肽的制备方法:

1.将青霉菌灭活菌丝体用盐析法提取多肽粗提物。

1)将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣倒入预混池，按照残渣:硅藻土质量比为10:1的比例加入干燥的硅藻土，搅拌混合均匀；

2)将上述预混合料80℃鼓风干燥灭1小时；

3)干燥后的混合料每50克用1升蒸馏水溶解，用八层纱布或双层棉布过滤除去不能溶解的残渣，将过滤得到的澄清液体倒入大烧杯；

4)向大烧杯中缓慢加入硫酸铵，边加入边搅拌溶解，至硫酸铵浓度达到80％，将溶液静置10小时至有沉淀物析出，此时溶液呈悬浊状态，将悬浊液倒入离心管，3000rmp离心，弃掉上层液体，取沉淀；

5)每1克沉淀用50毫升蒸馏水溶解，用截留分子量小于3.0kDa以下的滤膜超滤或透析除盐；

6)除盐后的溶液用氮气吹干，获得所需的干燥多肽粗提物。

2.将步骤1中的粗提物经过三级分离和活性筛选得到水溶性多肽液，经干燥后得到水溶性多肽，使用时将20份水溶性多肽、60份溶剂、10份渗透剂、10份稳定剂水溶性多肽配置成水溶性多肽诱导剂。

实施例3：

青霉菌灭活菌丝体水溶性多肽的制备方法:

1.将青霉菌灭活菌丝体用盐析法提取多肽粗提物。

1)将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣倒入预混池，按照残渣:硅藻土质量比为10:3的比例加入干燥的硅藻土，搅拌混合均匀；

2)将上述预混合料100℃鼓风干燥灭2小时；

3)干燥后的混合料每100克用1升蒸馏水溶解，用八层纱布或双层棉布过滤除去不能溶解的残渣，将过滤得到的澄清液体倒入大烧杯；

4)向大烧杯中缓慢加入硫酸铵，边加入边搅拌溶解，至硫酸铵浓度达到80％，将溶液静置14小时至有沉淀物析出，此时溶液呈悬浊状态，将悬浊液倒入离心管，3000rmp离心，弃掉上层液体，取沉淀；

5)每1克沉淀用100毫升蒸馏水溶解，用截留分子量小于3.0kDa以下的滤膜超滤或透析除盐；

6)除盐后的溶液用氮气吹干，获得所需的干燥多肽粗提物。

2.将步骤1中的粗提物经过三级层析分离和活性筛选得到水溶性多肽液，经干燥后得到水溶性多肽，使用时将15份水溶性多肽、70份溶剂、5份渗透剂、10份稳定剂配置成水溶性多肽诱导剂。

实施例4

水溶性多肽对增强抗烟草花叶病毒的抗性作用的测定。

供试寄主：烟草品种红花大金元漂浮育成的健康苗200株，16h光照下，26℃恒温培养，取80株烟龄为两个月的心叶烟烟苗进行实验。

具体试验方法：

1.将80株心叶烟平均分为诱导组和对照组，诱导组用配制的水溶性多肽诱导剂进行处理，对照组用清水处理。具体处理方法为：选取心叶烟3片下位叶片，将水溶性多肽诱导剂和清水分别均匀涂抹在叶片上，每片叶涂抹100～200μL。

2.抗病相关基因检测

a.取诱导组和对照组烟苗各20株，分别于处理后0，1，3，5，7天取处理叶片以及上位叶片，液氮速冻后于-80℃下保存。

b.烟叶总RNA提取:采用Trizol(Takara)法，取2.5μg总RNA进行cDNA第一链的合成，基因表达分析采用实时荧光定量PCR的方法，以在真核细胞中高度保守并组成型表达的β-actin基因作内参照。所测基因的引物和在GenBank中的登录号如表1所示。

表1抗性相关基因特异性引物

表1结果显示，通过用制备的水溶性多肽液处理后，与对照相比，所检测的各个抗病相关基因均有不同程度上调，其中，有明显说明该样品能够诱导植物产生抗病防卫反应。并且，处理叶片以及上部未处理叶片抗病相关基因均有表达，说明该样品能够诱导烟草产生系统抗性，而不仅仅是局部抗性。

3.钝化试验

a.在水溶性多肽诱导剂(或清水)处理后第5天，于处理叶片上摩擦接种浓度为0.35mg/ml的烟草花叶病毒，每片叶接种100μL。

b.原位接种试验：接种烟草花叶病毒后第5天统计枯斑数量，计算枯斑抑制率。

枯斑抑制率＝(对照组枯斑数-诱导组枯斑数)/对照组枯斑数×100％

原位接种试验结果显示，诱导组枯斑数目明显低于对照组，枯斑抑制率为71.3％～92.3％，枯斑大小约为对照的一半，说明多肽样品显著诱导了烟草局部抗性，从而有效防治烟草花叶病毒侵染。

c.异位接种试验：取诱导组和对照组烟苗各10株，在多肽样品(或清水)处理后第5天，于处理叶片的上位叶摩擦接种烟草花叶病毒，每片叶接种100μL。

接种烟草花叶病毒后第5天统计枯斑数量，计算枯斑抑制率。

异位接种试验结果显示，多肽样品诱导组枯斑数目明显低于对照组，枯斑抑制率为66.2％～83.6％，枯斑大小约为对照的1/3，说明多肽样品诱导了烟草的系统抗性，从而有效防御烟草花叶病毒的侵染。

实施例5

水溶性多肽诱导剂对增强抗烟草黑胫病的抗性作用的测定。

试验方法：

取长势一致的烟草品种红花大金元漂浮育成的健康苗200株，一半用制备的工作液进行喷施处理，另一半用清水喷施作为对照，处理后一周接种烟草黑胫病病菌(Phytophthora nicotianae)，步骤与实施例4中钝化实验中原位接种试验方法相同，唯一不同在于接种的病菌不同，原位接种的实验结果表明诱导组黑胫病发病率与对照相比降低78％，异位接种的试验结果表明诱导组黑胫病发病率与对照相比降低45％。

Claims (4)

1.一种提高烟草抗病性的水溶性多肽诱导剂，其特征在于，所述诱导剂包括：15～25份水溶性多肽、50～70份溶剂、5～15份渗透剂、5～15份稳定剂，所述水溶性多肽提取自青霉菌灭活菌丝体。

2.根据权利要求1所述的一种提高烟草抗病性的水溶性多肽诱导剂，其特征在于，所述溶剂为水，所述渗透剂为氨基磺酸钠或吐温，所述稳定剂为氨基酸碱类物质。

3.根据权利要求1所述的一种提高烟草抗病性的水溶性多肽诱导剂，其特征在于，所述水溶性多肽的制备方法为：

a.将青霉菌灭活菌丝体用盐析法提取多肽粗提物：

1)将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣倒入预混池，按照残渣:硅藻土质量比为10:1～10：3的比例加入干燥的硅藻土，搅拌混合均匀；

2)将上述预混合料80℃～110℃鼓风干燥灭活0.5～2.5小时；

3)干燥后的混合料每50～100克用1升蒸馏水溶解，用八层纱布或双层棉布过滤除去不能溶解的残渣，将过滤得到的澄清液体倒入大烧杯；

4)向大烧杯中缓慢加入硫酸铵，边加入边搅拌溶解，至硫酸铵浓度达到80％～100％，将溶液静置8～16小时至有沉淀物析出，此时溶液呈悬浊状态，将悬浊液倒入离心管，3000rmp离心，弃掉上层液体，取沉淀；

5)每1克沉淀用50～100毫升蒸馏水溶解，用截留分子量小于3.0kDa以下的滤膜超滤或透析除盐；

6.)除盐后的溶液可作为储备液于4℃保存，如需长期保存，可用氮气吹干，即获得所需的干燥多肽粗提物；

b.将步骤a中的粗提物经过三级分离和活性筛选得到所述水溶性多肽浓缩干燥样品。

4.根据权利要求1所述的一种提高烟草抗病性的水溶性多肽诱导剂在提高烟叶抗烟草花叶病毒及抗烟草黑胫病病菌的抗性中的应用。