CN107602575B - 一类潜在的绿色的有效防治南方根结线虫的马兜铃酸及其衍生物类化合物的分离筛选方法 - Google Patents

一类潜在的绿色的有效防治南方根结线虫的马兜铃酸及其衍生物类化合物的分离筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一类潜在的绿色有效防治南方根结线虫的马兜铃酸及其衍生物类化合物的分离筛选方法，主要包括以下步骤：将马兜铃属植物枝干剪成小段、烘干、粉碎、甲醇提取、最后经石油醚、氯仿萃取，浓缩，取石油醚和氯仿浸膏分别进行洗脱，采用反复柱层析、沉淀和重结晶的方法进行分离纯化，针对分离获得的化合物进行活性筛选，得到3种具有杀线虫活性的化合物。采用本发明方法工艺流程较为简单，获得的三种杀线虫活性化合物作为植物次生代谢产物，是一类潜在的绿色的杀线虫(尤其南方根结线虫)的化合物，通过活性评估对比，可以将其作为先导化合物，为进一步的结构修饰研究奠定基础。

Description

一类潜在的绿色的有效防治南方根结线虫的马兜铃酸及其衍 生物类化合物的分离筛选方法
技术领域
本发明涉及化合物提取分离技术领域，尤其涉及一类潜在的绿色的有效防治南方根结线虫的马兜铃酸及其衍生物类化合物的分离筛选方法。
背景技术
植物寄生线虫(PPNs)在全球每年造成约1570亿美元的农作物损失。其中，南方根结线虫(RKNs)被认为是世界上主要的植物寄生线虫物种，影响了许多一年生和多年生植物物种的数量和质量，如番茄、胡椒、西瓜和洋葱。化学杀虫剂是传统的杀线虫剂的来源。然而，化学杀虫剂的连续使用使得线虫群体对其逐渐产生抗药性，同时也对环境污染和对人类、哺乳动物和其他非目标生物产生不良作用；当然，这种化学杀虫剂的持续使用也导致了自然生物控制系统的中断和昆虫种类的暴发。因此，迫切需要开发环境友好的替代品，以确保食品安全及生态安全问题。植物次生代谢产物因为具有可降解性，对环境无污染，对哺乳动物无毒等优点，引起了人们广泛的关注。近些年来，关于植物次生代谢产物对防治南方根结线虫线虫的研究也逐渐增多。绵毛马兜铃是一种马兜铃属多年生草本植物，主要分布在中国西南地区。据报道，马兜铃属植物具有丰富的生物活性成分，包括马兜铃酸、马兜铃内酰胺、其他生物碱和萜类化合物等，其在医药和农业化学等领域均受到了广泛的关注。而关于绵毛马兜铃的化学成分和生物活性的研究的相关报道则很少。前期研究发现，绵毛马兜铃的甲醇浸膏对RKNs有很强的线虫活性。通过广泛的文献调研，目前并未有关于马兜铃属植物材料对线虫活性研究的相关报道，也未有其生物活性成分对线虫活性研究的相关报道，这可能有助于新一类植物性杀虫的植物次生代谢产物的发现。因此，我们通过生物活性导向法，获得了三种线虫活性化合物，通过核磁谱分析为化合物A、B、C，并将其对2龄线虫活性进行了进一步的毒力评价比较，为进一步的先导化合物的发现和结构修饰奠定基础。
发明内容
针对以上现有技术的不足之处，本发明提供一类潜在的绿色的有效防治南方根结线虫的马兜铃酸及其衍生物类化合物的分离筛选方法。
本发明采取的技术方案如下：
一类潜在的绿色有效防治南方根结线虫的马兜铃酸及其衍生物类化合物的分离筛选方法，包括以下步骤：
将马兜铃属植物枝干剪成小段、烘干、粉碎、甲醇提取、然后经石油醚、氯仿萃取，浓缩，取萃取所得石油醚浸膏和氯仿浸膏分别进行二次硅胶柱层析洗脱，并结合反复凝胶柱层析、沉淀和重结晶的方法进行分离纯化。
优选的，所述的一类潜在的绿色有效防治南方根结线虫的马兜铃酸及其衍生物类化合物的分离筛选方法，包括以下步骤：
S1：取10～30kg马兜铃属植物枝干剪成小段，50～60℃烘干8～10h、粉碎，加入4L甲醇常温浸提，重复2次以上，抽滤，所得滤液于40～55℃减压蒸发得2～3kg的甲醇浸膏；
S2：将甲醇浸膏加入到1～3L蒸馏水中溶解，加入1～3L石油醚萃取，重复2次以上；水溶液部分继续用1～3L氯仿萃取，重复2次以上；在减压下蒸发，分别得到石油醚浸膏和氯仿浸膏；
S3：石油醚浸膏经60～80目粗硅胶拌样，于200～300目细硅胶柱分离，一级洗脱剂先采用石油醚-乙酸乙酯系统以梯度洗脱，再采用乙酸乙酯-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；二级洗脱剂先采用石油醚-氯仿系统以梯度洗脱；再采用氯仿-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；洗脱之后得到的每个流分均采用反复的凝胶柱层析、沉淀和重结晶，先后得到纯的化合物，于冰箱保存待进行进一步的结构分析和活性评价；
S4：氯仿浸膏经60～80目粗硅胶拌样，于200～300目细硅胶柱分离，一级洗脱剂采用石油醚-丙酮系统以梯度洗脱，再采用丙酮-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；二级洗脱剂先采用石油醚-氯仿系统以梯度洗脱；再采用氯仿-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；洗脱之后得到的每个流分均采用反复的凝胶柱层析、沉淀和重结晶，于冰箱保存待进行进一步的结构分析和活性评价。
优选的，步骤S3中所述石油醚-乙酸乙酯系统和石油醚-氯仿系统进行梯度洗脱的体积比均为100:0，99:1，98:2，96:4，92:8，90:10，88:12，85:15，83:17，80:20，75:25，70:30，65:35，60:40，50:50，30:70，0:100；所述乙酸乙酯-甲醇系统和氯仿-甲醇系统的体积比为9:1，5:5；步骤S4中所述石油醚-丙酮系统和石油醚-氯仿系统进行梯度洗脱的体积比均为：100:0，95:5，90:10，85:15，70:30，50:50，25:75，10:90；所述丙酮-甲醇系统和氯仿-甲醇系统进行梯度洗脱的体积比均为9:1，5:5；所述凝胶柱均为sephadex LH-20。
优选的，所述马兜铃属植物为：绵毛马兜铃。
优选的，通过所述的一类潜在的绿色有效防治南方根结线虫的马兜铃酸及其衍生物类化合物的分离筛选方法，提取分离得到的化合物经过以下方法进行活性筛选和评价：
A.选用2龄线虫作为受试对象，在待测化合物中先加入DMSO，再滴加吐温-80，经混合、超声、加热溶解，然后用超纯水稀释，分别取上述溶液和线虫悬浮液倒入12孔板中，最终的测试物的浓度为200～300μg/mL，DMSO溶剂含量则不超过0.5％，DMSO：吐温-80混合溶剂则不超过1％，再分别以同样量的无菌水、DMSO：吐温-80混合溶剂作为空白对照和溶剂对照，于培养箱内放置，每组处理重复2次以上，分别在24、48、72、96h后测试每组处理的线虫的存活和死亡的数量；
B.将死亡率大于50％的化合物溶液按梯度稀释，根据步骤A的方法进行测定。
通过所述的一类潜在的绿色有效防治南方根结线虫的马兜铃酸及其衍生物类化合物的分离筛选方法，提取分离得到的化合物经过以下方法进行活性筛选和评价：
A.选用2龄南方根结线虫作为受试对象，在待测化合物中加入100μL DMSO，再滴加2滴吐温-80，经混合、超声、加热溶解，然后用超纯水稀释至10mL，分别取1mL上述溶液和1mL的线虫悬浮液，所述线虫悬浮液中含有70～150条2龄线虫，倒入12孔板中，最终的测试物的浓度为200μg/mL，DMSO溶剂含量则不超过0.5％，DMSO：吐温-80混合溶剂则不超过1％，再分别以同样量的无菌水、DMSO：吐温-80混合溶剂作为空白对照和溶剂对照，于25℃培养箱内放置，每组处理重复2次以上，分别在24、48、72、96h后测试每组处理的线虫的存活和死亡的数量；
B.将死亡率大于50％的化合物溶液按梯度稀释成12.5、25、50、100和200μg/mL，根据步骤A的方法进行测定。
优选的，所述的一类潜在的绿色有效防治南方根结线虫的马兜铃酸及其衍生物类化合物的分离筛选方法，分离得到一类马兜铃酸及其衍生物，所述的一类马兜铃酸及其衍生物在制备线虫杀虫剂中应用。
优选的，所述线虫为南方根结线虫。
优选的，所述杀虫剂可直接施用于植物。
优选的，所述马兜铃酸及其衍生物具有如下结构：
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)本发明提出的马兜铃属植物材料在我国分布广泛，种植采集购买方便，针对杀线虫研究结果可以直接将该属植物材料大量投入农业生产的应用中，且具有无污染，可降解等优点，是一类潜在的杀根结线虫(尤其是南方根结线虫)的植物材料。
2)本发明提出的三种杀线虫活性化合物作为植物次生代谢产物，是一类潜在的绿色的杀根结线虫(尤其南方根结线虫)的化合物，通过活性评估对比，可以将其作为先导化合物，为进一步的结构修饰研究奠定基础。
3)本发明提出的工艺流程简单易行，其制备方法可以为马兜铃属植物材料中马兜铃酸和马兜铃内酰胺类衍生物的化学成分的分离和杀线虫活性评估的研究提供借鉴，同时也可以为其他合成的或提取分离的化合物提供杀线虫活性评估的方法。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚，但本发明的保护范围不限于以下实施例。
实施例1：
一类潜在的绿色有效防治南方根结线虫的马兜铃酸及其衍生物类化合物的分离筛选方法，包括以下步骤：
S1：取10kg马兜铃属植物枝干剪成小段，50℃烘干10h，加入4L甲醇常温浸提，重复3次，抽滤，所得滤液于40℃减压蒸发得甲醇浸膏；
S2：将甲醇浸膏加入到1L蒸馏水中溶解，加入1L石油醚萃取，重复3次；水溶液层继续用1L氯仿萃取，重复3次；在减压下蒸发，得到石油醚浸膏和氯仿浸膏；
S3：石油醚浸膏经80目粗硅胶拌样，于200目细硅胶柱分离，一级洗脱剂先采用石油醚-乙酸乙酯系统以梯度洗脱，再采用乙酸乙酯-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；同理，二级洗脱剂先采用石油醚-氯仿系统以梯度洗脱；再采用氯仿-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子。洗脱之后得到的每个流分均采用反复的凝胶柱(sephadex LH-20)层析、沉淀和重结晶，先后得到纯的化合物，于冰箱(优选4℃)保存待进行进一步的结构分析和活性评价；
步骤S3所述石油醚-乙酸乙酯系统和石油醚-氯仿系统进行梯度洗脱的体积比均为100:0，99:1，98:2，96:4，92:8，90:10，88:12，85:15，83:17，80:20，75:25，70:30，65:35，60:40，50:50，30:70，0:100；所述乙酸乙酯-甲醇系统和氯仿-甲醇系统的体积比均为9:1，5:5；
S4：同理，氯仿浸膏经80目粗硅胶拌样，于300目细硅胶柱分离，一级洗脱剂采用石油醚-丙酮系统以梯度洗脱，再采用丙酮-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；二级洗脱剂先采用石油醚-氯仿系统以梯度洗脱；再采用氯仿-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子。洗脱之后得到的每个流分均采用反复的凝胶柱层析、沉淀和重结晶，于冰箱(优选4℃)保存待进行进一步的结构分析和活性评价。
步骤S4中所述石油醚-丙酮系统和石油醚-氯仿系统的体积比为：100:0，95:5，90:10，85:15，70:30，50:50，25:75，10:90；所述丙酮-甲醇系统和氯仿-甲醇系统进行梯度洗脱的体积比均为9:1，5:5。
提取分离得到的化合物经过以下方法进行活性筛选和评价：
A.选用2龄南方根结线虫作为受试对象，在待测化合物中加入100μL DMSO，再滴加2滴吐温-80，经混合、超声、加热溶解，然后用超纯水稀释至10mL，分别取1mL上述溶液和1mL的线虫悬浮液，所述线虫悬浮液中含有70条2龄线虫，倒入12孔板中，最终的测试物的浓度为200μg/mL，DMSO溶剂含量则不超过0.5％，DMSO：吐温-80混合溶剂则不超过1％，再分别以同样量的无菌水、DMSO：吐温-80混合溶剂作为空白对照和溶剂对照，于25℃培养箱内放置，每组处理重复3次，分别在24、48、72、96h后测试每组处理的线虫的存活和死亡的数量；
B.将死亡率大于50％的化合物溶液按梯度稀释成12.5、25、50、100和200μg/mL，根据步骤A的方法进行测定。
实施例2：
一类潜在的绿色有效防治南方根结线虫的马兜铃酸及其衍生物类化合物的分离筛选方法，包括以下步骤：
S1：取30kg马兜铃属植物枝干剪成小段，60℃烘干8h、加入4L甲醇常温浸提，重复5次，抽滤，所得滤液于55℃减压蒸发得甲醇浸膏；
S2：将甲醇浸膏加入到3L蒸馏水中溶解，加入3L石油醚萃取，重复5次；水溶液层继续用3L氯仿萃取，重复5次；在减压下蒸发，得到石油醚浸膏和氯仿浸膏；
S3：石油醚浸膏经60目粗硅胶拌样，于300目细硅胶柱分离，一级洗脱剂先采用石油醚-乙酸乙酯系统以梯度洗脱，再采用乙酸乙酯-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；同理，二级洗脱剂先采用石油醚-氯仿系统以梯度洗脱；再采用氯仿-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子。洗脱之后得到的每个流分均采用反复的凝胶柱(sephadex LH-20)层析、沉淀和重结晶，先后得到纯的化合物，于冰箱(优选4℃)保存待进行进一步的结构分析和活性评价；
步骤S3所述石油醚-乙酸乙酯系统和石油醚-氯仿系统进行梯度洗脱的体积比均为100:0，99:1，98:2，96:4，92:8，90:10，88:12，85:15，83:17，80:20，75:25，70:30，65:35，60:40，50:50，30:70，0:100；所述乙酸乙酯-甲醇系统和氯仿-甲醇系统进行梯度洗脱的的体积比均为9:1，5:5；
S4：同理，氯仿浸膏经60目粗硅胶拌样，于200目细硅胶柱分离，一级洗脱剂采用石油醚-丙酮系统以梯度洗脱，再采用丙酮-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；二级洗脱剂先采用石油醚-氯仿系统以梯度洗脱；再采用氯仿-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子。洗脱之后得到的每个流分均采用反复的凝胶柱层析、沉淀和重结晶，于冰箱(优选4℃)保存待进行进一步的结构分析和活性评价。
步骤S4中所述石油醚-丙酮系统、石油醚-氯仿系统的体积比为：100:0，95:5，90:10，85:15，70:30，50:50，25:75，10:90；所述丙酮-甲醇系统和氯仿-甲醇系统进行梯度洗脱的体积比均为9:1，5:5。
提取分离得到的化合物经过以下方法进行活性筛选和评价：
A.选用2龄南方根结线虫作为受试对象，在待测化合物中加入100μL DMSO，再滴加2滴吐温-80，经混合、超声、加热溶解，然后用超纯水稀释至10mL，分别取1mL上述溶液和1mL的线虫悬浮液，所述线虫悬浮液中含有150条2龄线虫，倒入12孔板中，最终的测试物的浓度为200μg/mL，DMSO溶剂含量则不超过0.5％，DMSO：吐温-80混合溶剂则不超过1％，再分别以同样量的无菌水、DMSO：吐温-80混合溶剂作为空白对照和溶剂对照，于25℃培养箱内放置，每组处理重复3次，分别在24、48、72、96h后测试每组处理的线虫的存活和死亡的数量；
B.将死亡率大于50％的化合物溶液按梯度稀释成12.5、25、50、100和200μg/mL，根据步骤A的方法进行测定。
对比例1：
一类潜在的绿色有效防治南方根结线虫的马兜铃酸及其衍生物类化合物的分离筛选方法，包括以下步骤：
S1：取10kg马兜铃属植物枝干剪成小段，50℃烘干5h，加入4L甲醇常温浸提，重复3次，抽滤，所得滤液于55℃减压蒸发得甲醇浸膏；
S2：将甲醇浸膏加入到1L蒸馏水中溶解，加入1L石油醚萃取，重复3次；水溶液层继续用1L氯仿萃取，重复3次；在减压下蒸发，得到石油醚浸膏和氯仿浸膏；
S3：石油醚浸膏经60目粗硅胶拌样，于300目细硅胶柱分离，一级洗脱剂先采用石油醚-乙酸乙酯系统以梯度洗脱，再采用乙酸乙酯-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；同理，二级洗脱剂先采用石油醚-氯仿系统以梯度洗脱；再采用氯仿-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子。洗脱之后得到的每个流分均采用反复的聚酰胺柱层析、沉淀和重结晶，先后得到纯的化合物，于4℃冰箱保存待进行进一步的结构分析和活性评价；
步骤S3中所述石油醚-乙酸乙酯系统和石油醚-氯仿系统进行梯度洗脱的体积比均为100:0，80:20，60:40，0:100；所述乙酸乙酯-甲醇系统和氯仿-甲醇系统进行梯度洗脱的体积比为4:6，3:7；
S4：同理，氯仿浸膏经60目粗硅胶拌样，于200目细硅胶柱分离，一级洗脱剂采用石油醚-丙酮系统以梯度洗脱，再采用丙酮-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；二级洗脱剂先采用石油醚-氯仿系统以梯度洗脱；再采用氯仿-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子。洗脱之后得到的每个流分均采用反复的聚酰胺柱层析、沉淀和重结晶，于4℃冰箱保存待进行进一步的结构分析和活性评价。
步骤S4中所述石油醚-丙酮系统、石油醚-氯仿系统进行梯度洗脱的体积比均为：100:0，85:15，25:75，10:90；所述丙酮-甲醇系统和氯仿-甲醇系统进行梯度洗脱的体积比均为4:6，3:7。
提取分离得到的化合物经过以下方法进行活性筛选和评价：
A.选用2龄南方根结线虫作为受试对象，在待测化合物中加入100μL DMSO，再滴加2滴吐温-80，经混合、超声、加热溶解，然后用超纯水稀释至10mL，分别取1mL上述溶液和1mL的线虫悬浮液，所述线虫悬浮液中含有150条2龄线虫，倒入12孔板中，最终的测试物的浓度为200μg/mL，DMSO溶剂含量则不超过0.5％，DMSO：吐温-80混合溶剂则不超过1％，再分别以同样量的无菌水、DMSO：吐温-80混合溶剂作为空白对照和溶剂对照，于25℃培养箱内放置，每组处理重复3次，分别在24、48、72、96h后测试每组处理的线虫的存活和死亡的数量；
B.将死亡率大于50％的化合物溶液按梯度稀释成12.5、25、50、100和200μg/mL，根据步骤A的方法进行测定。
对比例2：
一类潜在的绿色有效防治南方根结线虫的马兜铃酸及其衍生物类化合物的分离筛选方法，包括以下步骤：
S1：取10kg马兜铃属植物枝干剪成小段，50℃烘干12h，加入4L甲醇常温浸提，重复3次，抽滤，所得滤液于55℃减压蒸发得甲醇浸膏；
S2：将甲醇浸膏加入到1L蒸馏水中溶解，加入1L石油醚萃取，重复3次；水溶液层继续用1L氯仿萃取，重复3次；在减压下蒸发，得到石油醚浸膏和氯仿浸膏；
S3：石油醚浸膏经60目粗硅胶拌样，于300目细硅胶柱分离，一级洗脱剂先采用石油醚-乙酸乙酯系统以梯度洗脱，再采用乙酸乙酯-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；同理，二级洗脱剂先采用石油醚-氯仿系统以梯度洗脱；再采用氯仿-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子。洗脱之后得到的每个流分均采用反复的大孔树脂住层析、沉淀和重结晶，先后得到纯的化合物，于4℃冰箱保存待进行进一步的结构分析和活性评价；
步骤S3中所述石油醚-乙酸乙酯系统和石油醚-氯仿系统进行梯度洗脱的体积比均为98:2，75:25，50:50，30:70；所述乙酸乙酯-甲醇系统和氯仿-甲醇系统进行梯度洗脱的体积比为7:3，2:8；
S4：同理，氯仿浸膏经60目粗硅胶拌样，于200目细硅胶柱分离，一级洗脱剂采用石油醚-丙酮系统以梯度洗脱，再采用丙酮-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；二级洗脱剂先采用石油醚-氯仿系统以梯度洗脱；再采用氯仿-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子。洗脱之后得到的每个流分均采用反复的大孔树脂住层析、沉淀和重结晶，于4℃冰箱保存待进行进一步的结构分析和活性评价。
步骤S4中所述石油醚-丙酮系统、石油醚-氯仿系统进行梯度洗脱的体积比均为：100:0，85:15，25:75，10:90；所述丙酮-甲醇系统和氯仿-甲醇系统的体积比均为7:3，2:8。
提取分离得到的化合物经过以下方法进行活性筛选和评价：
A.选用2龄南方根结线虫作为受试对象，在待测化合物中加入100μL DMSO，再滴加2滴吐温-80，经混合、超声、加热溶解，然后用超纯水稀释至10mL，分别取1mL上述溶液和1mL的线虫悬浮液，所述线虫悬浮液中含有150条2龄线虫，倒入12孔板中，最终的测试物的浓度为200μg/mL，DMSO溶剂含量则不超过0.5％，DMSO：吐温-80混合溶剂则不超过1％，再分别以同样量的无菌水、DMSO：吐温-80混合溶剂作为空白对照和溶剂对照，于25℃培养箱内放置，每组处理重复3次，分别在24、48、72、96h后测试每组处理的线虫的存活和死亡的数量；
B.将死亡率大于50％的化合物溶液按梯度稀释成12.5、25、50、100和200μg/mL，根据步骤A的方法进行测定。
实验例1：
将实施例与对比例中分离筛选得到的具有杀灭线虫作用的化合物进行核磁共振分析获得其结构：
a.实施例1和实施例2中均获得三种具有杀灭线虫作用的化合物，结构如下：
b.对比例1仅获得上述具有杀灭线虫作用的化合物A，对比例2仅获得上述具有杀灭线虫作用的化合物B。
实验例2：
实施例与对比例分离得到的具有杀灭线虫作用的活性化合物在96h后的毒力测定结果见下表：
表1：毒力测定结果
实验结果表明，实施例中获得三种具有杀灭线虫的化合物，而对比例中仅能获得一种具有杀灭线虫活性的化合物，且获得的化合物纯度较低，对比例中LC50、95％CL、X2均大于实施例，说明本发明方案获得具有杀灭线虫作用的化合物，并且其杀灭效果较好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims (7)

1.一类潜在的绿色有效防治南方根结线虫的化合物的分离筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将马兜铃属植物枝干剪成小段、烘干、粉碎、甲醇提取；
S2：然后经石油醚、氯仿萃取，浓缩，得石油醚浸膏和氯仿浸膏；
S3：石油醚浸膏经60～80目粗硅胶拌样，于200～300目细硅胶柱分离，一级洗脱剂先采用石油醚-乙酸乙酯系统以梯度洗脱，再采用乙酸乙酯-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；二级洗脱剂先采用石油醚-氯仿系统以梯度洗脱；再采用氯仿-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；洗脱之后得到的每个流分均采用反复的凝胶柱层析、沉淀和重结晶，先后得到纯的化合物，于冰箱保存待进行进一步的结构分析和活性评价；
S4：氯仿浸膏经60～80目粗硅胶拌样，于200～300目细硅胶柱分离，一级洗脱剂采用石油醚-丙酮系统以梯度洗脱，再采用丙酮-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；二级洗脱剂先采用石油醚-氯仿系统以梯度洗脱；再采用氯仿-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；洗脱之后得到的每个流分均采用反复的凝胶柱层析、沉淀和重结晶，于冰箱保存待进行进一步的结构分析和活性评价；
步骤S3中所述石油醚-乙酸乙酯系统和石油醚-氯仿系统进行梯度洗脱的体积比均为100:0，99:1，98:2，96:4，92:8，90:10，88:12，85:15，83:17，80:20，75:25，70:30，65:35，60:40，50:50，30:70，0:100；所述乙酸乙酯-甲醇系统和氯仿-甲醇系统的体积比为9:1，5:5；步骤S4中所述石油醚-丙酮系统和石油醚-氯仿系统进行梯度洗脱的体积比均为：100:0，95:5，90:10，85:15，70:30，50:50，25:75，10:90；所述丙酮-甲醇系统和氯仿-甲醇系统进行梯度洗脱的体积比均为9:1，5:5；所述凝胶柱均为sephadex LH-20；
所述化合物的结构式分别如式A、B和C所示：
2.根据权利要求1所述的一类潜在的绿色有效防治南方根结线虫的化合物的分离筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取10～30kg马兜铃属植物枝干剪成小段，50～60℃烘干8～10h、粉碎，加入4L甲醇常温浸提，重复2次以上，抽滤，所得滤液于40～55℃减压蒸发得2～3kg的甲醇浸膏；
S2：将甲醇浸膏加入到1～3L蒸馏水中溶解，加入1～3L石油醚萃取，重复2次以上；水溶液部分继续用1～3L氯仿萃取，重复2次以上；在减压下蒸发，分别得到石油醚浸膏和氯仿浸膏；
S3：石油醚浸膏经60～80目粗硅胶拌样，于200～300目细硅胶柱分离，一级洗脱剂先采用石油醚-乙酸乙酯系统以梯度洗脱，再采用乙酸乙酯-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；二级洗脱剂先采用石油醚-氯仿系统以梯度洗脱；再采用氯仿-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；洗脱之后得到的每个流分均采用反复的凝胶柱层析、沉淀和重结晶，先后得到纯的化合物，于冰箱保存待进行进一步的结构分析和活性评价；
S4：氯仿浸膏经60～80目粗硅胶拌样，于200～300目细硅胶柱分离，一级洗脱剂采用石油醚-丙酮系统以梯度洗脱，再采用丙酮-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；二级洗脱剂先采用石油醚-氯仿系统以梯度洗脱；再采用氯仿-甲醇系统以梯度洗脱，最后以甲醇清洗柱子；洗脱之后得到的每个流分均采用反复的凝胶柱层析、沉淀和重结晶，于冰箱保存待进行进一步的结构分析和活性评价。
3.根据权利要求1所述的一类潜在的绿色有效防治南方根结线虫的化合物的分离筛选方法，其特征在于，所述马兜铃属植物为：绵毛马兜铃。
4.根据权利要求1所述的一类潜在的绿色有效防治南方根结线虫的化合物的分离筛选方法，其特征在于，提取分离得到的化合物经过以下方法进行活性筛选和评价：
A.选用2龄南方根结线虫作为受试对象，在待测化合物中先加入DMSO，再滴加吐温-80，经混合、超声、加热溶解，然后用超纯水稀释，分别取上述溶液和南方根结线虫悬浮液倒入12孔板中，最终的测试物的浓度为200～300μg/mL，DMSO溶剂含量则不超过0.5％，DMSO：吐温-80混合溶剂则不超过1％，再分别以同样量的无菌水、DMSO：吐温-80混合溶剂作为空白对照和溶剂对照，于培养箱内放置，每组处理重复2次以上，分别在24、48、72、96h后测试每组处理的南方根结线虫的存活和死亡的数量；
B.将死亡率大于50％的化合物溶液按梯度稀释，根据步骤A的方法进行测定。
5.根据权利要求4所述的一类潜在的绿色有效防治南方根结线虫的化合物的分离筛选方法，其特征在于，提取分离得到的化合物经过以下方法进行活性筛选和评价：
A.选用2龄南方根结线虫作为受试对象，在待测化合物中加入100μL DMSO，再滴加2滴吐温-80，经混合、超声、加热溶解，然后用超纯水稀释至10mL，分别取1mL上述溶液和1mL的南方根结线虫悬浮液，所述南方根结线虫悬浮液中含有70～150条2龄南方根结线虫，倒入12孔板中，最终的测试物的浓度为200μg/mL，DMSO溶剂含量则不超过0.5％，DMSO：吐温-80混合溶剂则不超过1％，再分别以同样量的无菌水、DMSO：吐温-80混合溶剂作为空白对照和溶剂对照，于25℃培养箱内放置，每组处理重复2次以上，分别在24、48、72、96h后测试每组处理的南方根结线虫的存活和死亡的数量；
B.将死亡率大于50％的化合物溶液按梯度稀释成12.5、25、50、100和200μg/mL，根据步骤A的方法进行测定。
6.根据权利要求1所述的一类潜在的绿色有效防治南方根结线虫的化合物的分离筛选方法，其特征在于，分离得到所述的式A、B和C的化合物，所述的式A、B和C的化合物在制备南方根结线虫杀虫剂中应用。
7.根据权利要求6所述的一类潜在的绿色有效防治南方根结线虫的化合物的分离筛选方法，其特征在于，所述南方根结线虫杀虫剂可直接施用于植物。
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