CN102388927A

CN102388927A - 一种从小桐子果壳中制备杀虫物质的方法

Info

Publication number: CN102388927A
Application number: CN2011103171450A
Authority: CN
Inventors: 郭巧生; 李育川; 刘丽; 史红专
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2011-10-19
Filing date: 2011-10-19
Publication date: 2012-03-28

Abstract

本发明公开了一种从小桐子果壳中提取、分离出杀虫活性物质的方法。其步骤是：1、将小桐子果壳晒干后粉碎，按体积1∶10加入乙醇(工业酒精)，密封后在室温冷浸提取，用旋转蒸发仪回收乙醇，浓缩得到乙醇粗提物浸膏。2、将乙醇提取物浸膏用2倍体积的蒸馏水充分溶解后，转移到分液漏斗中，加入2倍体积的石油醚反复萃取，丢弃石油醚萃取液，保留石油醚萃取后的剩余水相；取石油醚萃取后的剩余水相，加入2倍体积的三氯甲烷萃取，分液后丢弃三氯甲烷萃取液，保留三氯甲烷萃取后的剩余水相；取三氯甲烷萃取后的剩余水相，加入2倍体积的乙酸乙酯萃取，分液后丢弃乙酸乙酯萃取液，保留乙酸乙酯萃取后的剩余水相；取乙酸乙酯萃取后的剩余水相，加入2倍体积的正丁醇萃取，分液后丢弃剩余水相，获得具有对蚜虫、菜青虫等常见农作物害虫具有毒杀作用的正丁醇萃取物。本发明制备方法简单易行，所得乙醇提取物和正丁醇萃取物杀虫效果显著，可作为制备植物源杀虫剂的原药应用。

Description

一种从小桐子果壳中制备杀虫物质的方法

技术领域

本发明涉及一种从小桐子(Jatropha curcas L.)果壳中制备出杀虫活性物质的方法，属植物源农药研究技术领域。

背景技术

小桐子又名麻疯树，为大戟科(Euphorbiaceae)麻疯树属(Jatropha)落叶灌木，是国内外传统的药用、有毒植物。因其种仁含油率最高可达61.5％，现在非洲、北美、印度、东南亚及中国西南等地的热区，已作为一种极为适宜的生物柴油原料被人工大面积栽培。随着中国生物柴油小桐子原料基地的建成，如何科学地开发利用生物柴油小桐子产业中产生的大量“副产物”——占干果量30％-40％的果壳，是生物柴油小桐子产业基地建设中急需解决和面对的难题之一，也是实现小桐子产业提质增效的有效途径之一。

农药是用于防治植物病、虫、草害的药剂，是保证农业稳产、增收的重要生产资料。植物在与有害生物长期协同进化过程中，产生了许多具有杀虫、抗菌和化感活性的次生代谢产物。这些次生代谢物质来源于自然，在自然界有其顺畅的降解途径，易降解，不会引起生物富集现象；具有低毒、低残留、对人畜安全、对环境友好、不易产生抗药性等优点。因此，利用植物次生代谢产物研发高效、低毒、低残留、选择性好与环境相容的“绿色植物源农药”已成为未来农药业发展的必然趋势和方向。

经对国内外文献和专利检索发现，目前，国内外对小桐子杀虫活性研究已有少量报道。有关小桐子杀虫活性物质的研究主要集中于种子油、油饼和枝叶。除本专利申请人外，还未见有关从小桐子果壳中提取、分离杀虫活性物质的报道。随着中国生物柴油小桐子原料基地的建成，每年将产生超过200万吨的小桐子果壳，利用小桐果壳开发植物源杀虫剂，既解决了产业中果壳污染问题，又新辟了小桐子果壳资源利用途径，因此利用小桐子果壳制备植物源杀虫活性物质这一发明，意义重大。

本发明提供了一种以小桐子果壳为材料，利用溶剂进行提取，然后对粗提物进行液-液分配萃取分离，获得一种对蚜虫、菜青虫等常见农作物害虫具有毒杀作用的活性物质。本发明对利用能源植物小桐子开发植物源杀虫剂具有现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种从小桐子果壳中制备出具有杀虫作用的活性物质的工艺制备方法，所得的活性组分对蚜虫、菜青虫等有明显的杀虫效果，24h死亡率达90％以上。

为了达到上术目的，本发明采用以下技术方案：

1、摘取新鲜黄熟果实，种子脱粒后将果壳晒干后保存。果壳于投料前用60℃通风干燥箱中干燥12h，用粉碎机粉碎，过2mm筛后。

2、将粉碎后的果壳粉置入容器中，加入果壳粉10倍体积的乙醇(工业酒精)，密封后在室温下冷浸，期间5h摇动1次，3d后抽滤，保存滤液。滤渣重复上述操作2次，合并3次滤液，用旋转蒸发仪回收乙醇，浓缩得到乙醇粗提物浸膏。

3、乙醇粗提物浸膏用3倍体积的蒸馏水充分溶解后，转移到分液漏斗中。

4、往分流漏斗中加入2倍体积的石油醚(II类)，多次摇匀，静置过夜，对萃取液进行分液，重复3次，丢弃石油醚萃取液，获得石油醚萃取后的剩余水相；取石油醚萃取后的剩余水相转移到分液漏斗中，再加入2倍体积的三氯甲烷，多次摇匀，静置过夜，对萃取液进行分液，重复3次，丢弃三氯甲烷萃取液，获得三氯甲烷萃取后的剩余水相；取三氯甲烷萃取后的剩余水相转移到分液漏斗中，再加入2倍体积的乙酸乙酯，多次摇匀，静置过夜，对萃取液进行分液，重复3次，丢弃乙酸乙酯萃取液，获得乙酸乙酯萃取后的剩余水相；取乙酸乙酯萃取后的剩余水相转移到分液漏斗中，再加入2倍体积的正丁醇，多次摇匀，静置过夜，对萃取液进行分液，重复3次，合并正丁醇萃取液，丢弃剩余水相，用旋转蒸发仪浓缩正丁醇萃取液，获得具有对蚜虫、菜青虫等常见农作物害虫具有毒杀作用的正丁醇萃取物。

本发明的优点在于：

随着中国生物柴油小桐子原料基地的建成，占干果量30％-40％的果壳利用问题，是生物柴油小桐子产业基地建设中急需解决的难题之一，对其进行开发利用，“变废为宝”潜力巨大。

伴随着利用种仁生产生物柴油，大批量的果壳被丢弃，本发明将采收后被丢弃的外果壳进行利用，开辟了一条小桐子果壳资源利用新途径，为小桐子产业提质增效注入了新内容。

用小桐子果壳提取、分离杀虫活性物质目前未见报道。

本发明所用原料来源丰富，制备方法简单易行，成本较低，便于操作，所得组分杀虫活性强，可作为一种新植物源杀虫制剂原药应用于实际生产。

附图说明

图1小桐子果壳中杀虫物质的提取、分离流程图

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及制备出的物质杀虫活性更清楚明白，本发明用具体实例对提取、分离过程及其所得活性物质的杀虫活性进行测试效果，但并非说明本发明仅限用于这些例子。

试验例1

(1)小桐子果壳粗提物的制备方法。准确称取小桐子果壳粉碎样品5份，每份100g，放入大圆底烧瓶中，分别加入1000mL蒸馏水、95％乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、石油醚，其中蒸馏水中另加1mL三氯甲烷。密封后于室温下冷浸，5h摇动1次，3d后抽滤，保存滤液。滤渣重复上述操作2次，合并3次滤液，用旋转蒸发仪浓缩得到6种溶剂粗提物的浸膏，所得浸膏在室温下敞开放置4d，待无溶剂气味后，称重并置于4℃冰箱保存备用。每处理3次重复，分别计算各粗提物的提取率。

(2)粗提物对菜青虫室内毒力测定处理液浓度设计方法：分别准确称取小桐子果壳的6种粗提物浸膏各2g，加2mL吐温-80，拌匀使其充分乳化，用蒸馏水溶解并定容至100mL，配成浓度为20g·L^-1粗提物原液；分别取各粗提物原液5、10、15、20、25和30mL，用蒸馏水定溶至50mL，配制成浓度为2、4、6、8、10和12g·L^-1处理药液，摇匀后待用；取体积分数2％的吐温-80水溶液5、10、15、20、25和30mL，用蒸馏水定溶至50mL，配制成相应浓度的对照液。

(3)不同溶剂粗提物对菜青虫的毒力测定方法：小桐子不同溶剂粗提物对菜青虫的毒力测定采用浸虫法进行。选择大小一致，经4h饥饿处理的人工饲养菜的青虫4龄幼虫，每10头为一处理同时挑入浸虫器中，放入配制好的药液中浸沾3s，取出擦干药液后倒入垫有滤纸的培养皿中，将新鲜的叶片在稀释好的溶液中浸渍3s，晾干后，饲喂试虫，每处理3次重复。在培养箱中培养72h后，统计各组和相应对照组的死亡虫数，采用上述同样的方法计算半致死浓度(LC₅₀)和相对毒力指数，进行回归分析和差异显著性分析。

(4)数据处理和分析：相对毒力指数和校正死亡率的计算公式如下：

相对毒力指数＝最大的LC₅₀/不同溶液粗提物的LC₅₀；校正死亡率＝[(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)]×100％。

采用南京农业大学植保学院编制的抗药性生物测计数据处理及管理系统Version 2.5进行回归分析和差异显著性分析。如果任意两个处理组的半数致死浓度(LC₅₀)在95％置信区(95％FL)间有重叠，则判定这两组的LC₅₀差异不显著。其它数据采用SPSS 13.0进行方差分析。

(5)小桐子果壳不同溶剂粗提物对菜青虫的毒力测定结果见下表。结果表明：各溶剂粗取物对人工饲养4龄菜青虫的72h毒力由强至弱依次为三氯甲烷提取物、乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水提取物、石油醚提取物，LC₅₀均值分别为2.8569、3.1038、7.7681、9.3923、11.6147和14.2024g·L^-1，相对毒力指数分别为5.0、4.6、1.8、1.5、1.2和1.0；毒力最强的是三氯甲烷提取物和乙醇提取物，两者对菜青虫的72h毒力与70％吡虫啉无显著差异，显示出极高的毒杀活性，但因正丁醇粗提物的提取率较低。因此，本研究选择提取率高且毒杀活性强的乙醇粗取物进行进一步的分离研究。

表1小桐子果壳粗取物对菜青虫的室内毒力(72h，浸虫法)

注：同列中不同小写字母表示在5％水平上差异显著。下同。

试验例2

(1)乙醇粗提取物的分离萃取方法：采用液-液萃取法分别对小桐子果壳的乙醇粗提取物进行分离萃取。分别准确称取小桐子果壳的乙醇粗提取物各100g，用2L蒸馏水充分溶解，转移到分液漏斗中，加入2L石油醚(II类)萃取，多次摇匀，静置过夜，对萃取液进行分液，重复3次，合并3次所得萃取液，再用旋转蒸发仪浓缩至稠膏状，得到石油醚萃取物。然后依次用三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取物；最后再将剩余水溶液旋转浓缩得到水萃取物。所得稠膏状萃取物在室温下敞开放置4d，待无溶剂气味后，称重。每处理设3个重复，计算萃取率。

(2)各种萃取物对菜青虫的毒杀活性测定方法：准确称取以上5种萃取物各0.8g，分别用加0.8mL吐温-80，拌匀，使其充分乳化，再用蒸馏水溶解，定容至100mL，制成8g·L^-1处理液。对照液用0.8mL吐温-80加蒸馏水定容至100mL制成。分别采用喷雾法对菜青虫进行处理。菜青虫每组30头，每处理设3个重复，分别于处理24h后和72h后调查残虫数，计算死亡率。

(3)数据处理和分析：校正死亡率的计算公式如下：

校正死亡率＝[(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)]×100％。

数据采用SPSS 13.0对原始数据进行方差分析。

(4)小桐子果壳乙醇粗提物不同溶剂萃取物对菜青虫毒杀活性测定方法：以人工饲养4龄菜青虫为活性追踪试虫，用浸虫法测定各萃取物的毒杀活性。测定结果见表2，当浓度为8mg·mL^-1时，各萃取物对菜青虫的毒杀活性结果表明，正丁醇萃取物对4龄菜青虫72h毒杀活性最高，其72h校正死亡率为93.09％，其对4龄菜青虫72h毒杀活性与70％吡虫啉无显著差异，显示出极高的毒杀活性，因此可以看出小桐子果壳乙醇粗提物中的杀虫活性物质主要存在于正丁醇萃取物部位中。

表28mg·mL^-1小桐子果壳乙醇提取物的不同萃取物对菜青虫的生物活性测定(72h，浸虫法)

试验例3

(1)正丁醇萃取物对豌豆长管蚜毒杀活性测定：分别准确称取正丁醇萃取物和70％吡虫啉各2g，加2mL吐温-80，拌匀使其充分乳化，用蒸馏水溶解并定容至100mL，配成浓度为20g·L^-1萃取物原液；分别取各萃取物原液5、10、15、20、25和30mL，用蒸馏水定溶至50mL，配制成浓度为2、4、6、8、10和12g·L^-1处理药液，摇匀后待用；取体积分数2％的吐温-80水溶液5、10、15、20、25和30mL，用蒸馏水定溶至50mL，配制成相应浓度的对照液。

(2)正丁醇萃取物对豌豆长管蚜的室内毒力测定方法采用喷雾法。于测试前采集带有豌豆长管蚜的蚕豆植株，剪下带虫叶片，用3号毛笔刷去若蚜和有翅蚜，每叶保留50头健壮大小一致的干母；分别用上述处理液和相应浓度的对照液对带虫叶的正反面进行喷雾；用吸水纸吸去多余药液，待药液自然挥发干后，将带虫叶面向上，置入铺有2层滤纸具盖的培养皿(直径15cm)中，每个培养皿加4滴蒸馏水保湿；将培养皿置于25℃、相对湿度80％的培养箱中培养，每天光照12h。培养24h后统计各组的死亡虫数，每处理3次重复，结果取平均值并计算半数致死浓度(LC50)和相对毒力指数，采用试验例1相同的方法进行回归分析和差异显著性分析。

(3)测定结果表明正丁醇萃取物对豌豆长管蚜的毒力与70％吡虫啉差异不显著(LC₅₀在95％置信区间有重叠)，显示出极高的毒杀活性，其LC₅₀值分别为：2.6933。

表3正丁醇萃取物对豌豆长管蚜室内毒力效应回归分析(24h，喷雾法)¹⁾

试验例4

正丁醇萃取物对桃蚜毒杀活性测定：正丁醇萃取物对桃蚜的室内毒力的梯度溶液配制和毒杀活性测定方法及数据处理方法与实例1完全相同。测定结果表明正丁醇萃取物对桃蚜的毒力与70％吡虫啉差异不显著(LC₅₀在95％置信区间有重叠)，显示出极高的毒杀活性，其LC₅₀值分别为：2.5656。

表4正丁醇萃取物对桃蚜室内毒力效应回归分析(24h，喷雾法)¹⁾

试验例5

(1)正丁醇萃取物对菜青虫(4龄幼虫)毒杀活性测定：分别准确称取正丁醇萃取物和70％吡虫啉各2g，加2mL吐温-80，拌匀使其充分乳化，用蒸馏水溶解并定容至100mL，配成浓度为20g·L^-1萃取物原液；分别取各萃取物原液5、10、15、20、25和30mL，用蒸馏水定溶至50mL，配制成浓度为2、4、6、8、10和12g·L^-1处理药液，摇匀后待用；取体积分数2％的吐温-80水溶液5、10、15、20、25和30mL，用蒸馏水定溶至50mL，配制成相应浓度的对照液。

(2)对菜青虫的毒力测定采用浸虫法进行。选择大小一致，经4h饥饿处理的菜青虫4龄幼虫，每10头为一处理同时挑入浸虫器中，放入配制好的药液中浸沾3s，取出擦干药液后倒入垫有滤纸的培养皿中，将新鲜的叶片在稀释好的溶液中浸渍3s，晾干后，饲喂试虫，每处理3次重复。在培养箱中培养72h后，统计各组和相应对照组的死亡虫数，采用实例1同样的方法计算半致死浓度(LC₅₀)和相对毒力指数，进行回归分析和差异显著性分析。测定结果表明正丁醇萃取物对菜青虫的72h毒力与70％吡虫啉无显著差异(LC₅₀在95％置信区间有重叠)，显示出极高的毒杀活性，其LC₅₀值分别为：3.7678。

表5正丁醇萃取物对菜青虫的室内毒力(72h，浸虫法)1)

试验例6

正丁醇萃取物对桃蚜毒杀活性测定：准确称取正丁醇萃取物和70％吡虫啉各0.8g，分别用加0.8mL吐温-80，拌匀，使其充分乳化，再用蒸馏水溶解，定容至100mL，制成8g·L^-1处理液。对照液用0.8mL吐温-80加蒸馏水定容至100mL制成。采用喷雾法分别对桃蚜进行处理。桃蚜每组100头，每处理设3个重复，分别于处理24h后调查残虫数，计算校正死亡率(计算同实例1)。采用SPSS 13.0对数据进行方差分析。结果正丁醇萃取物对桃蚜24h校正死亡效率为91.19％，与70％吡虫啉的毒杀活性无显著差异，显示出极好的杀虫活性。

表6正丁醇萃取物对桃蚜的生物活性测定(24h，喷雾法)

注：表中数据为3次重复的平均值；同列中不同的小写字母表示在5％水平上差异显示。

试验例7

正丁醇萃取物对菜青虫毒杀活性测定：准确称取正丁醇萃取物和70％吡虫啉各0.8g，用加0.8mL吐温-80，拌匀，使其充分乳化，再用蒸馏水溶解，定容至100mL，制成8g·L-1处理液。对照液用0.8mL吐温-80加蒸馏水定容至100mL制成。采用喷雾法对菜青虫进行处理。菜青虫每组30头，每处理设3个重复，分别于处理72h后调查残虫数，计算校正死亡率(计算同实例1)。采用SPSS 13.0对数据进行方差分析。结果正丁醇萃取物对菜青虫72h校正死亡效率为93.09％，与70％吡虫啉的毒杀活性无显著差异，显示出极好的杀虫活性。

表7正丁醇萃取物对菜青虫的生物活性测定(72h，浸虫法)

Claims

1.一种从小桐子果壳中制备杀虫物质的方法，其特征在于包括下列步骤：

(1)摘取新鲜黄熟果实，种子脱粒后将果壳晒干后保存，果壳于投料前用60℃通风干燥箱中干燥12h，用粉碎机粉碎，过2mm筛后；

(2)将粉碎后的果壳粉置入容器中，加入果壳粉10倍体积的乙醇，密封后在室温下冷浸，期间5h摇动1次，3d后抽滤，保存滤液，滤渣重复上述操作2次，合并3次滤液，用旋转蒸发仪回收乙醇，浓缩得到乙醇粗提物浸膏；

(3)乙醇粗提物浸膏用3倍体积的蒸馏水充分溶解后，转移到分液漏斗中；

(4)往分流漏斗中加入2倍体积的石油醚，多次摇匀，静置过夜，对萃取液进行分液，重复3次，丢弃石油醚萃取液，获得石油醚萃取后的剩余水相；取石油醚萃取后的剩余水相转移到分液漏斗中，再加入2倍体积的三氯甲烷，多次摇匀，静置过夜，对萃取液进行分液，重复3次，丢弃三氯甲烷萃取液，获得三氯甲烷萃取后的剩余水相；取三氯甲烷萃取后的剩余水相转移到分液漏斗中，再加入2倍体积的乙酸乙酯，多次摇匀，静置过夜，对萃取液进行分液，重复3次，丢弃乙酸乙酯萃取液，获得乙酸乙酯萃取后的剩余水相；取乙酸乙酯萃取后的剩余水相转移到分液漏斗中，再加入2倍体积的正丁醇，多次摇匀，静置过夜，对萃取液进行分液，重复3次，合并正丁醇萃取液，丢弃剩余水相，用旋转蒸发仪浓缩正丁醇萃取液，获得具有对蚜虫、菜青虫等常见农作物害虫具有毒杀作用的正丁醇萃取物。

2.按照权利要求1所述方法得到的小桐子果壳乙醇提取物和正丁醇萃取物的制备方法。

3.按照权利要求1所述方法得到的乙醇提取物和正丁醇萃取物在触杀、拒食或趋避蚜虫、菜青虫方面的用途。

4.按照权利要求1所述方法得到的乙醇提取物和正丁醇萃取物在制备植物源杀虫剂原药方面的用途。