CN107996616A - 银胶菊抗虫抑菌活性成分、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物化学领域，公开了银胶菊抗虫抑菌活性成分、制备方法及应用。采用乙醇或者乙酸乙酯为溶剂提取制得的银胶菊活性成分，不仅对黄粉虫幼虫、小菜蛾、菜青虫以及萝卜蚜等害虫具有显著的杀灭效果，而且对金黄色葡萄球菌、芒果可可球二孢菌、王草镰刀菌、甘蔗小球腔菌以及镰孢炭疽菌等病原菌也具有显著的抑制效果，具有较好的应用前景。本发明还公开了上述银胶菊活性成分的制备方法，操作简便，可重复性高。

Description

银胶菊抗虫抑菌活性成分、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，特别是指银胶菊抗虫抑菌活性成分、制备方法及应用。

背景技术

银胶菊(Parthenium hysterophorus)，菊科(Compositae)银胶菊属草本植物，原产于中美洲热带地区，我国最早是在1926年有发现，现如今入侵中国分布于广东、海南、广西、贵州及云南等地，银胶菊尽管在我国出现的时间不长，但是分布却较为广泛。已在散布地区对人类健康、生态环境和农业生产造成危害。银胶菊一般生长于开阔向阳的环境，主要生存环境是路边、抛荒地(如建筑工地和新建公路两侧)、废弃地、果园、农田耕地等，学校运动场四周也见零星分布，其中绝大部分生长在路边，然后是抛荒地与废弃地，银胶菊喜中性和碱性的土地，但是在干燥和潮湿的生境中均有生长。对不同生境类型均具有较强的适应性，这可能也是银胶菊入侵蔓延的原因之一。目前对入侵毒草银胶菊的防治主要以物理防治和化学防治为主，综合来看，效果不佳，且容易对环境造成影响。与其防治，不如对其进行合理开发利用，变废为宝。合理利用废物，从中寻找出具有杀虫抑菌的活性物质使其大量资源得以利用是对入侵杂草进行有效控制的新思路，具有深入研究探讨的价值。

发明内容

本发明提出了一种银胶菊抗虫抑菌活性成分的制备方法及其应用，能够高效的提取银胶菊中的生物活性成分。采用本发明的方法提取的银胶菊提取物具有较好的杀虫和抑菌活性。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种银胶菊抗虫抑菌活性成分，其特征在于，包括：银胶菊乙醇粗提物和/或乙酸乙酯提取物。

一种银胶菊抗虫抑菌活性成分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

定量称取银胶菊粉末，加入乙醇或者乙酸乙酯作为提取剂，采用索氏提取法或者超声波提取法提取，合并提取液，回收乙醇，浓缩、干燥即得银胶菊乙醇粗提物和/或乙酸乙酯提取物。

进一步，采用索氏提取法提取时，所述的银胶菊粉末与提取剂的比例为1:10-30(w/v)，加热功率80-160w，所述的提取时间为6-10h；所述乙醇的体积分数为60％-100％；提取时间10h、加热功率160w、料液比1︰15、乙醇体积分数80％。

进一步，采用超声波提取法提取过程中，所述的银胶菊粉末与提取剂的比例为1:10-30(w/v)，超声波的功率为60-100w，提取时间为2h；所述乙醇的体积分数为60％-100％。

以上所述的银胶菊提抗虫抑菌活性成分在制备杀灭黄粉虫幼虫的制剂上的应用。

以上所述的银胶菊提抗虫抑菌活性成分在制备抑制枯草芽孢杆菌的制剂上的应用。

以上所述的银胶菊提抗虫抑菌活性成分在制备抑制金黄色的葡萄球菌的制剂上的应用。

进一步，在制备抑制金黄色葡萄球菌的制剂上，以乙醇为溶剂时，采用索氏提取法提取。

以上所述的银胶菊提抗虫抑菌活性成分在制备杀灭小菜蛾、菜青虫和/或萝卜蚜的制剂上的应用。

以上所述的银胶菊抗虫抑菌活性成分在制备抑制芒果可可球二孢菌、王草镰刀菌、甘蔗小球腔菌和/或镰孢炭疽菌的制剂上的应用。

本发明的有益效果：

采用乙醇或者乙酸乙酯为溶剂提取制得的银胶菊活性成分，不仅对黄粉虫幼虫、小菜蛾、菜青虫以及萝卜蚜等害虫具有显著的杀灭效果，对金黄色葡萄球菌、芒果可可球二孢菌、王草镰刀菌、甘蔗小球腔菌以及镰孢炭疽菌等病原菌也具有显著的抑制效果，具有较好的应用前景。为银胶菊的资源化利用提供了新途径，具有一定的生态效益和经济效益。本发明提供的活性成分的制备方法，操作简便，可重复性高，制得的粗提物抗虫和抑菌活性明显提高，分离得到的化合物具有显著的抗虫抑菌活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为3种提取方法提取效果的比较；

图2为提取时间与银胶菊粗提物提取率的关系；

图3为提取功率与银胶菊粗提物提取率的关系；

图4为料液比与银胶菊粗提物提取率的关系；

图5为乙醇体积分数与银胶菊粗提物提取率的关系；

图6为银胶菊提取物对四种病原真菌抑制效果的比较。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种银胶菊抗虫抑菌活性成分的制备方法，包括以下步骤：

定量称取银胶菊粉末，加入乙醇作为提取剂，采用索氏提取法提取，所述的银胶菊粉末与提取剂的比例为1:10(w/v)，加热功率80w，所述的提取时间为6h；所述乙醇的体积分数为60％，合并提取液，回收乙醇，浓缩、干燥即得银胶菊乙醇提取物。

实施例2

一种银胶菊抗虫抑菌活性成分的制备方法，包括以下步骤：

定量称取银胶菊粉末，加入乙醇作为提取剂，采用索氏提取法提取，所述的银胶菊粉末与提取剂的比例为1:30(w/v)，加热功率160w，所述的提取时间为10h；所述乙醇的体积分数为100％，合并提取液，回收乙醇，浓缩、干燥即得银胶菊乙醇提取物。

实施例3

一种银胶菊抗虫抑菌活性成分的制备方法，包括以下步骤：

定量称取银胶菊粉末，加入乙醇作为提取剂，采用索氏提取法提取，提取条件为：提取时间8h、加热功率160w、料液比1︰15、乙醇体积分数80％。提取完成后，合并提取液，回收乙醇，浓缩、干燥即得银胶菊乙醇提取物。

实施例4

一种银胶菊抗虫抑菌活性成分的制备方法，包括以下步骤：

定量称取银胶菊粉末，加入乙酸乙酯作为提取剂，采用索氏提取法提取，提取条件为：提取时间10h、加热功率160w、料液比1︰15，乙醇体积分数80％。提取完成后，合并提取液，回收乙醇，浓缩、干燥即得银胶菊乙酸乙酯提取物。

实施例5

一种银胶菊抗虫抑菌活性成分的制备方法，包括以下步骤：

定量称取银胶菊粉末，加入乙醇作为提取剂，采用超声波提取法提取，提取条件为：银胶菊粉末与提取剂的比例为1:30(w/v)，超声波的功率为60w，提取时间为2h；乙醇的体积分数为60％。合并提取液，回收乙醇，浓缩、干燥即得银胶菊乙醇提取物。

实施例6

一种银胶菊抗虫抑菌活性成分的制备方法，包括以下步骤：

定量称取银胶菊粉末，加入乙醇作为提取剂，采用超声波提取法提取，提取条件为：银胶菊粉末与提取剂的比例为1:20(w/v)，超声波的功率为100w，提取时间为2h；乙醇的体积分数为100％。合并提取液，回收乙醇，浓缩、干燥即得银胶菊乙醇提取物。

实施例7

一种银胶菊抗虫抑菌活性成分的制备方法，包括以下步骤：

定量称取银胶菊粉末，加入乙酸乙酯作为提取剂，采用超声波提取法提取，提取条件为：银胶菊粉末与提取剂的比例为1:10(w/v)，超声功率为80w，提取时间为2h。合并提取液，回收乙醇，浓缩、干燥即得银胶菊乙酸乙酯提取物。

3种提取溶剂提取效果分析

分别采用索氏提取法、超声波提取法和浸渍法，采用不同的溶剂提取银胶菊提取物，各个提取方法的具体操作如下所示，其结果如表1和图3所示。

(1)索式提取法

称量200g银胶菊粉末，用滤纸包成小药包，每个处理20g，每支提取管中放入一个小药包，向500ml的提取瓶中倒入相应溶剂于索氏提取器提取，提取条件参照实施例2，合并提取液置于旋转蒸发仪中真空回收溶剂浓缩至膏状物质，放在低温下冷冻干燥，称量并计算提取率。

(2)超声波提取法

称取200g银胶菊粉末分装于250mL的锥形瓶中，每瓶20g，并分别加入相应溶剂，提取条件参考实施例7，合并提取液进行离心过滤，过滤后的溶液，再置于旋转蒸发仪中真空回收溶剂浓缩至膏状物质，放在低温下冷冻干燥，称重并计算提取率。

(3)浸渍提取法

称取200g银胶菊粉末于小桶(约5升)中，加入2000mL的相应溶剂，密封处理后放置在干燥避光处。室温下浸泡三天，收集提取液进行离心过滤，再置于旋转蒸发仪中真空回收溶剂浓缩至膏状物质，放在低温下冷冻干燥，称重并计算提取率。

表13种提取溶剂提取效果的分析

注:表中数据为平均数±标准误，同一列字母后表示Duncan氏差异显著(P<0.05,LSD)(本章表格下同)

由表1可以看出，同一种提取方法，使用不同的溶剂提取结果是不同，三种溶剂粗提物的平均重量均差异显著，用水来提取银胶菊提取率最高，索氏提取法、超声波提取法和常温浸渍法的提取率分别达到了18.41％、13.63％和11.24％，乙醇次之，索氏提取法、超声波提取法和常温浸渍法的提取率分别是6.96％、5.62％和5.46％，乙酸乙酯的提取率最低，采用常温浸渍法提取时提取率仅为3.57％。

由图1可以看出，以水为提取溶剂，3提取方法中，索氏提取法提取率最高，与其他两种方法差异显著，其次为超声波提取法，常温浸渍法最少。以乙醇和乙酸乙酯为提取溶剂时，也是索氏提取法提取率最高，与其他两种方法也差异显著，超声波提取法和常温浸渍法提取率较为接近，差异不显著。

综合以上研究结果发现，从提取率上分析，三种提取方法，索氏提取法得到的银胶菊提取物最多；三种提取溶剂，水的提取率最高，其次是乙醇，乙酸乙酯的提取率最低。从提取时间上分析，超声提取法所用时间最短，常温浸渍法需要时间最长，因此还需进行生物测定，通过分析比较其杀虫和抑菌效果进而选择出较佳的提取溶剂和提取方法。

不同提取方法及不同溶剂的银胶菊提取物对黄粉虫幼虫触杀效果

采用点滴法对黄粉虫3龄幼虫进行触杀活性测定，如表2所示，3种方法分别用3种溶剂提取的银胶菊提取物对黄粉虫3龄幼虫均有一定的触杀活性，5倍液对黄粉虫幼虫的校正死亡率最高，随着稀释倍数增加，校正死亡率也随之降低，40倍药液最低。

结果表明用乙醇提取的银胶菊提取物对黄粉虫幼虫触杀效果最好，在5倍稀释液时，常温浸渍法、超声波提取法和索氏提取法的24h矫正死亡率分别高达为70％、72.88％和81.35％。其次乙酸乙酯，在5倍稀释液时，常温浸渍法、超声波提取法和索氏提取法的24h矫正死亡率分别为48.33％、53.45％和65％。而水提取的银胶菊提取物对黄粉虫幼虫触杀效果不明显，矫正死亡率未超过25％。在较高浓度时，三种溶剂的杀虫效果差异均显著，杀虫效果从高到低的次序为：乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞水提物。

由表2，在不同稀释倍数下索氏提取法提取的银胶菊提取物对黄粉虫幼虫的触杀效果均是最好，死亡率高于其他两种提取方法，其次是超声波提取法，最差是常温浸渍法。

表2银胶菊粗提物对黄粉虫幼虫的触杀效果

选取5倍稀释液条件下对黄粉虫触杀效果进行差异显著性分析，结果见表3，结果表明：以水为溶剂时，索氏提取法与其他两种方法差异显著；以乙醇和乙酸乙酯为溶剂时，索氏提取法与常温浸渍法差异显著，与超声波提取法差异不显著。杀虫效果从高到低的次序为：索氏提取法＞超声波提取法＞常温浸渍法。

表3 3种提取方法5倍稀释液对黄粉虫死亡率的差异显著性分析

注：已显示同类子集中的组均值，Alpha＝0.05。

银胶菊提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌活性测定

采用滤纸片法对枯草芽孢杆菌进行了抑菌活性的测定，如表4所示，不同溶剂提取的银胶菊提取物对枯草芽孢杆菌的抑制效果也不同，不同稀释倍数的乙醇和乙酸乙酯粗提液对枯草芽孢杆菌均有不同程度的抑制作用，并随着稀释倍数增加，抑菌率逐渐降低，5倍稀释液的抑菌效果最佳，40倍稀释液最差；而水提液无抑制效果，与乙醇和乙酸乙酯粗提液均差异显著。

乙醇与乙酸乙酯相比较，乙醇提取物的抑菌效果较好，在稀释倍数为5时，在超声波提取法中，乙醇提取物和乙酸乙酯提取物的抑菌效果差异可达到的显著性水平；在稀释倍数为10时，在索氏提取法中，两者的差异也达到的显著水平；但在稀释倍数为20时乙酸乙酯提取物的抑菌效果大大下降，三种溶剂粗提液的差异均达显著水平，可以发现乙醇粗提液的抑制效果随浓度梯度减弱，而乙酸乙酯提取物须在较高浓度时，才有较好的抑制效果。稀释倍数为40时，不同溶剂的提取物抑菌率均较低，仅表现出微弱的抑菌活性，差异不大。

由表4可知，从整体上看，在不同稀释倍数下，索氏提取法提取的银胶菊提取物对枯草芽孢杆菌抑菌效果均是最好，其次是超声波提取法，最差是常温浸渍法。

表4银胶菊粗提物对枯草芽孢杆菌的抑制效果

注：“—”为表示没有抑菌圈

选取5倍稀释液条件下对枯草芽孢杆菌的抑制效果进行差异显著性分析，结果见表5。以乙醇为溶剂时，索氏提取法与常温浸渍法差异显著，与超声波提取法差异不显著；以乙酸乙酯为溶剂时，索氏提取法和超声波提取法差异不显著，与常温浸渍法差异显著。

表5 3种提取方法5倍稀释液显著性分析

注：已显示同类子集中的组均值，使用调和均值样本大小＝3，Alpha＝0.05。

银胶菊提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性测定

采用滤纸片法对金黄色葡萄球菌进行了抑菌活性的测定，如表6所示，不同溶剂提取的银胶菊提取物对金黄色葡萄球菌的抑制效果也不同，不同稀释倍数的乙醇和乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用，并随着稀释倍数增加，抑菌率逐渐降低，5倍稀释液的抑菌效果最佳，40倍稀释液最差；而水提物无抑制效果，与乙醇和乙酸乙酯提取物均差异显著。

乙醇与乙酸乙酯两种溶剂相比较，乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌的抑制效果较好，在稀释倍数为5时，在常温浸渍法中，乙醇提取物和乙酸乙酯提取物的抑菌效果的差异达到的显著水平；在稀释倍数为10时，在常温浸渍法和超声波提取法中，两者的差异达到的显著水平；但在稀释倍数为20和40时，两种溶剂粗提粗的差异就不大了，仅表现出微弱的抑菌活性。两种溶剂须在较高浓度时，才有较好的抑制效果，低浓度是抑菌效果都不显著。

由表6可知，从整体上看，在不同稀释倍数下，索氏提取法提取的银胶菊提取物对金黄色葡萄球菌抑菌效果均是最好，其次是超声波提取法，最差是常温浸渍法。

表6银胶菊提取物对金黄色葡萄球菌的抑制效果

注：“—”为表示没有抑菌圈

选取5倍稀释液条件下对金黄色葡萄球菌的抑制效果进行差异显著性分析，结果见表7，以乙酸乙酯为溶剂时，索氏提取法与常温浸渍法差异显著，与超声波提取法差异不显著；以乙醇为溶剂时，索氏提取法其他两种提取方法差异均显著，常温浸渍法和超声波提取法差异不显著。

表7 3种提取方法5倍稀释液显著性分析

注：已显示同类子集中的组均值，使用调和均值样本大小＝3，Alpha＝0.05。

水作为溶剂，经济易得，而且极性大、溶解范围广。其缺点是由于浸出范围广，选择性相对差，容易浸出大量无效成分，而且会引起一些有效成分的水解。试验中银胶菊水提液对供试菌未表现出抑制效果，反而具有促进作用，杀虫效果也不佳，可能是水不能很好地将银胶菊中杀虫抑菌活性物质提取出来或者更多含有促进生长的活性物质被提取出的原因，这需要进一步研究证实。乙醇和乙酸乙酯作为提取溶剂，在高浓度时，抑菌效果差异不大，低浓度时，乙醇抑菌效果更优，另外考虑到乙醇提取率更高、比乙酸乙酯使用起来更稳定，更安全，且成本比较低，故选择乙醇作为提取溶剂进行后面实验研究。无论从提取率还杀虫抑菌效果，三种提取方法比较，索氏提取法最佳，其次是超声波提取法，浸渍法虽然提取率较高，但是没有抑菌效果。因此综合以上结果分析，筛选处索氏提取法和超声波提取法作为本申请的提取方法，其中最佳提取方法是索氏提取法。提取溶剂选择乙醇和乙酸乙酯，而乙醇又优于乙酸乙酯。

索氏提取法影响因子的优化

取乙醇作为提取溶剂，索氏提取法作为提取方法，探讨提取时间、提取功率、料液比、乙醇体积分数四种因子对提取效果的影响，优化银胶菊提取物的提取方法。

1.单因素对银胶菊粗提物提取率的影响

称取等量的银胶菊粉末，分别放入索氏提取器中，圆底烧瓶中加入提取剂，以提取时间6h、提取功率120w、料液比1︰15、乙醇体积分数60％为基础工艺条件，分别设置不同水平的提取时间(4、6、8、10h与12h)、提取功率(40、80、120、160w与200w)、料液比(1:10、1:15、1:20、1:25与1:30)、乙醇体积分数(20％、40％、60％、80％与100％)，进行单因素试验，计算获得的银胶菊粗提物浸膏重量作为银胶菊粗提取率指标。其结果如图2-5所示。

1.提取时间对提取率的影响

银胶菊提取率随提取时间的增加而呈现总体增加的趋势，可见随着提取时间的延长，加热时间的增加，液体冷凝回流的次数增多，银胶菊提取物的溶出率也增加，提取更充分(图2)，但提取时间的延长，会增加其他高分子杂质的浸出，综合各因素的影响，选取6h，8h，10h为进一步试验的3个水平。

2.提取功率对提取率的影响

银胶菊提取率随提取功率的增加而升高(图3)，从减少仪器损耗和节能的角度分析，选择80、120w和160w作为进一步试验的3个水平。

3.料液比对提取率的影响

料液比为1:15时，提取率达到峰值，随着料液比的减少，提取率缓慢下降(图4)，选取1∶10、1∶15和1∶20作为进一步试验的3个水平。

4.乙醇体积分数对提取率的影响

乙醇体积分数逐步增加至80％时，提取物也逐步达到最大，高于80％时，提取率却降低(图5)，选取60％、80％和100％作为进一步试验的3个水平。

根据单因素试验的结果，选取了4个因素较佳的3个水平，运用3水平4因素正交试验以探究银胶菊粗提物的最佳提取工艺条件(表8表9)所示。

表8因素水平表

表9不同因素对银胶菊粗提物提取率的影响

极差分析表明，R_B.>R_A>R_D>R_C，即影响银胶菊中粗提物提取率的顺序依次为:提取功率>提取时间>乙醇体积分数>料液比。索氏提取银胶菊粗提物的适宜提取工艺为A₃B₃C₂D₂，即最佳提取条件是提取时间为10h，提取功率为160w，料液比1︰15，乙醇体积分数80％。

对正交试验最优提取工艺A₃B₃C₂D ₂进行3次平行验证试验，结果为银胶菊活性物质提取率为14.97％，15.02％，14.97％，平均提取率为14.99％，RSD4.01％。表明在该工艺条件下的银胶菊活性物质的提取率相对稳定，从而达到了设计优化试验的目的。

银胶菊提取物杀虫和抑菌效果考察

按照正交实验优化得到的提取方法，提取制得银胶菊提取物。称量10g提取物，用5ml80％乙醇溶解，再用无菌水定容于10ml，配制母液浓度为1g/ml，按等比稀释法，用无菌水将母液稀释成浓度分别为0.2g/ml、0.1g/ml、0.05g/ml、0.025g/ml 4个浓度梯度的提取物药液，0.2g/ml、0.1g/ml、0.05g/ml、0.025g/ml分别称为5倍稀释液、10倍稀释液、20倍稀释液、40倍稀释液，在稀释液中加入2～3滴吐温-80，形成均一、稳定的液体，即为待测溶液。对照组用为5ml80％乙醇加用无菌水定容到10ml，然后再用无菌水稀释。

(1)银胶菊提取物对小菜蛾和菜青虫的触杀作

分别20头大小基本一致的取小菜蛾、菜青虫3龄幼虫，放入自制滤网中，浸于不同的处理液中10s后迅速取出，用滤纸吸干多余药液，置于有新鲜白菜或芥蓝叶并垫有保湿滤纸的培养皿(直径＝9cm)中，用保鲜膜封盖，并用针扎数孔透气，每个处理重复3次，用对照溶液做同样处理，观察处理后的虫体的症状，而后将培养皿置于温度25℃湿度为80％的培养箱内，于24h、48h后调查死亡情况，计算死亡率、校正死亡率和致死中浓度。

(2)银胶菊提取物对萝卜蚜的触杀作用

采集虫口大小整齐且分布较集中的萝卜叶片，剔除不合格的虫，保留大小适中且健康无翅成蚜为试虫，并将带虫叶片修剪为每片30头，把修剪好的带虫叶片在试液中浸3s后取出，沥干，用滤纸吸去多余的药液，待溶剂自然挥发后置于垫有保湿滤纸的培养皿(直径＝9cm)中，用保鲜膜封盖，并用针扎数孔透气，重复3次，用对照溶液做同样处理，观察处理后的虫体的症状，而后将培养皿置于温度25℃湿度为80％的培养箱内培养，于24h、48h后调查死亡情况，计算死亡率、校正死亡率和致死中浓度。

(3)银胶菊提取物对小菜蛾和菜青虫的拒食作用

将白菜叶剪成3cm×3cm的叶片，然后将叶片放在不同浓度的药液中浸3s后取出，用对照溶液做同样处理，晾干后置于垫有保湿滤纸的培养皿(直径＝9cm)中，每培养皿放置2片处理叶片，然后接入5头饥饿3h的3龄小菜蛾幼虫，重复3次，24h后，用方格纸测定试虫取食白菜叶面积，计算拒食率。

芥蓝叶剪成3cm×3cm的叶片，然后将叶片放在不同浓度的药液中浸3s后取出，用对照溶液做同样处理，晾干后置于垫有保湿滤纸的培养皿中，每培养皿放置1片处理叶片，然后接入5头饥饿3h的3龄菜青虫，重复3次，24h后，用方格纸测定试虫取食芥蓝叶面积，计算拒食率。

所得的死亡数和取食面积数据用EXCEL 2003软件和SPSS 20软件处理，通过SPSS20 one-way ANOVA进行分析，并用Duncan’s的新复极差法(P＝0.05)检验其差异显著性。进行probit回归分析，求出药剂的毒力回归方程、LC50值及95％置信限。

死亡率(％)＝(死亡数/供试虫数)×100％

矫正死亡率(％)＝[(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)]×100％

拒食率(％)＝[(对照组取食量-处理组取食量)/对照取食量]×100％

各个测试结果如表10-15所示。

表10不同稀释倍数的银胶菊提取液对小菜蛾的触杀活性

注:表中数据为平均数±标准误，同一列字母后表示Duncan氏差异显著(P<0.05,LSD)(本章表格下同)

表11银胶菊提取液对小菜蛾幼虫的触杀毒力测定结果

银胶菊提取物对小菜蛾3龄幼虫具有较好的触杀效果，触杀效果随提取物浓度增加而升高，5倍稀释药液校正死亡率最高，24h的5倍稀释液的校正死亡率高达86.42％，其毒力回归方程为y＝4.27+3.94x，LC₅₀＝0.085g/mL，r＝0.881；在稀释倍数为40和80时，触杀效果与对照没有显著性的差异。48h的5倍稀释液的校正死亡率可达到87.52％，其毒力回归方程为y＝4.17+3.37x，LC₅₀＝0.063g/mL，r＝0.867，稀释倍数为80时，触杀效果与对照没有显著性的差异。

表12不同稀释倍数的银胶菊提取液对萝卜蚜的触杀活性

表13银胶菊提取液对萝卜蚜幼虫的触杀毒力测定结果

银胶菊提取物对萝卜蚜具有较好的触杀效果，触杀效果随提取物浓度增加而升高，5倍稀释药液校正死亡率最高，24h的5倍稀释液的校正死亡率可达到为56.67％，与各浓度的差异都达到显著水平，其毒力回归方程为y＝2.09+2.63x，LC₅₀＝0.157g/mL，r＝0.914。48h的5倍稀释液的校正死亡率可达到83.89％，其毒力回归方程为y＝3.16+2.36x，LC₅₀＝0.046g/mL，r＝0.903。

表14不同稀释倍数的银胶菊提取液对小菜蛾和菜青虫的拒食活性

表15银胶菊提取液对小菜蛾和菜青虫幼虫的拒食活性测定结果

采用叶片法对小菜蛾和菜青虫进行拒食活性测定，研究发现乙醇提取物对小菜蛾和菜青虫都有较好拒食作用，随着浓度增大其拒食率也增加，处理叶片与对照叶片相比，被取食的面积明显少很多；处理后24h，5倍、10倍和20倍稀释液处理的叶片比80倍40倍稀释液处理的叶片被取食的面积少，5倍稀释药液对小菜蛾和菜青虫拒食率分别达到99.65％和100％。小菜蛾和菜青虫的AFC₅₀值分别为0.03g/ml和0.02g/ml。

银胶菊提取物对4种病原真菌抑制作用

参照杀虫实验中的处理液配置方法配置不同浓度的银胶菊提取物溶液。在超净工作台内,按1：9的比例将不同浓度银胶菊提取液和约45℃PDA培养基均匀混合，充分摇匀迅速倒入培养皿(直径为9cm)中，冷凝后即成为不同浓度的带毒培养基。

在超净工作台内,将培养5天的四种病原真菌在菌落边缘打取菌饼(直径为6mm)，接种于含毒培养基中央，菌丝面向下，每皿1块。等量相应溶剂作为对照，每处理重复3次，28℃恒温培养箱内培养，直至对照长满，用十字交叉法测量处理组的菌落直径，计算菌丝抑制率。菌落扩散直径(cm)＝测量菌落平均直径-0.6(菌饼直径)

抑制率(％)＝(对照菌落直径—处理菌落直径)/对照菌落直径*100％

所得的菌落直径数据用EXCEL 2003软件和SPSS 20软件处理，通过SPSS 20 one-way ANOVA进行分析，并用Duncan’s的新复极差法(P＝0.05)检验其差异显著性。进行probit回归分析，求出药剂的毒力回归方程、LC50值及95％置信限。其结果如表15-22所示。

(1)银胶菊提取物对王草镰刀菌的抑制活性

表15不同浓度银胶菊提取物对王草镰刀菌的抑制作用

注:表中数据为平均数，同一列数据后标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05,LSD)(下同)

由表15可知，银胶菊5倍和10倍稀释液对王草镰刀菌抑制效果都较好，抑制率分别为78.51％和76.29％，前三个质量浓度抑菌效果均超过60％。抑菌效果随浓度的降低而下降，40倍和80倍稀释液抑菌效果较差，仅为32.14％和17.4％。

表16银胶菊提取物对王草镰刀菌的毒力

由表16可知，不同浓度银胶菊提取物对王草镰刀菌的抑制作用呈线性增长趋势，浓度越高，胶菊提取物对王草镰刀菌的抑制作用越大，其线性回归方程为y＝5.77x-1.1，R²＝0.939，相关性良好，由此得出银胶菊提取物对王草镰刀菌菌丝生长的抑制中浓度EC50为1.548mg/ml。

(2)银胶菊提取物对甘蔗小球腔菌的抑制活性

表17不同浓度银胶菊提取物对甘蔗小球腔菌的抑制作用

由表17可知，银胶菊5倍稀释液对甘蔗小球腔菌抑制效果最好，抑制率为70％，20倍和40稀释液抑菌效果较为接近，抑菌率为48.33％和48.14％。抑菌效果随浓度的降低而下降，80倍稀释液抑菌效果较差，仅为33.59％。

表18银胶菊提取物对甘蔗小球腔菌的毒力

由表18可知，不同浓度银胶菊提取物对甘蔗小球腔菌的抑制作用呈线性增长趋势，浓度越高，胶菊提取物对甘蔗小球腔菌的抑制作用越大，其线性回归方程为：y＝2.58x-0.52，R²＝0.854，相关性良好，由此得出银胶菊提取物对甘蔗小球腔菌菌丝生长的抑制中浓度EC50为2.201mg/ml。

(3)银胶菊提取物对芒果可可球二孢菌的抑制活性

由表19可知，银胶菊5倍和10倍稀释液对芒果可可球二孢菌抑制效果较好，抑制率为76.11％和66.67％，20倍、40倍和80倍稀释液抑菌效果差异均达到显著水平，抑菌效果随浓度的降低，其下降幅度也较大，在稀释倍数为80时，抑菌效果较差，仅为9.07％。

表19不同浓度银胶菊提取物对芒果可可球二孢菌的抑制作用

表20银胶菊提取物对芒果可可球二孢菌的毒力

由表20可知，不同浓度银胶菊提取物对芒果可可球二孢菌的抑制作用呈线性增长趋势，浓度越高，胶菊提取物对芒果可可球二孢菌的抑制作用越大，其线性回归方程为:y＝5.96x-1.43，R²＝0.963，相关性良好，由此得出银胶菊提取物对芒果可可球二孢菌菌丝生长的抑制中浓度EC50为1.752mg/ml。

(4)银胶菊提取物对镰孢炭疽菌的抑制活性

表21不同浓度银胶菊提取物对镰孢炭疽菌的抑制作用

由表21可知，不同浓度银胶菊提取物对镰孢炭疽菌均较好抑制效果，在较低作用浓度下，银胶菊提取物对镰孢炭疽菌依然能发挥较高的抑制作用抑菌效果均超过50％。随着浓度的增加，对镰孢炭疽菌的抑菌率逐渐上升，银胶菊5倍稀释液对镰孢炭疽菌抑制效果最好，抑制率高达为100％，且不同浓度之间银胶菊提取物对镰孢炭疽菌抑制效果均差异显著。

表22银胶菊提取物对镰孢炭疽菌的毒力

由表22可知，不同浓度银胶菊提取物对镰孢炭疽菌的抑制作用呈线性增长趋势，浓度越高，胶菊提取物对镰孢炭疽菌的抑制作用越大，其线性回归方程为:y＝5.82x-0.24，R²＝0.944，相关性良好，由此得出银胶菊提取物对镰孢炭疽菌菌丝生长的抑制中浓度EC50为1.545mg/ml。

(5)银胶菊提取物对四种病原真菌抑制效果的比较

由图6可知，在不同处理浓度下，均是镰孢炭疽菌抑菌效果最好，在同一处理浓度时，银胶菊的提取物对不同的病原菌的抑制效果有差异，稀释倍数为5时，镰孢炭疽菌抑菌效与其他三种供试病原菌均差异显著，王草镰刀菌、甘蔗小球腔菌和芒果可可球二孢菌间差异不显著，抑菌效果的顺序为镰孢炭疽菌＞王草镰刀菌＞甘蔗小球腔菌＞芒果可可球二孢菌，稀释倍数为10时，四种病原菌间差异均达到显著水平，抑菌效果的顺序同5倍稀释液；稀释倍数为40和80时，四种病原菌间差异也均显著，较低作用浓度下,银胶菊提取物对镰孢炭疽菌和芒果可可球二孢菌依然能发挥较好的抑制作用，抑菌效果的顺序为镰孢炭疽菌＞芒果可可球二孢菌＞王草镰刀菌＞甘蔗小球腔菌。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种银胶菊抗虫抑菌活性成分，其特征在于，包括：银胶菊乙醇粗提物和/或乙酸乙酯提取物。

2.一种银胶菊抗虫抑菌活性成分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

定量称取银胶菊粉末，加入乙醇或者乙酸乙酯作为提取剂，采用索氏提取法或者超声波提取法提取，合并提取液，回收乙醇，浓缩、干燥即得银胶菊乙醇提取物或者银胶菊乙酸乙酯提取物。

3.如权利要求1所述的银胶菊抗虫抑菌活性成分的制备方法，其特征在于：采用索氏提取法提取时，所述的银胶菊粉末与提取剂的比例为1:10-30(w/v)，加热功率80-160w，所述的提取时间为6-10h；所述乙醇的体积分数为60％-100％；提取时间10h、加热功率160w、料液比1︰15、乙醇体积分数80％。

4.如权利要求1所述的银胶菊抗虫抑菌活性成分的制备方法，其特征在于：采用超声波提取法提取过程中，所述的银胶菊粉末与提取剂的比例为1:10-30(w/v)，超声波的功率为60-100w，提取时间为2h；所述乙醇的体积分数为60％-100％。

5.如权利要求1-4任一项所述的银胶菊抗虫抑菌活性成分在制备杀灭黄粉虫幼虫的制剂上的应用。

6.如权利要求1-4任一项所述的银胶菊抗虫抑菌活性成分在制备抑制枯草芽孢杆菌的制剂上的应用。

7.如权利要求1-4任一项所述的银胶菊抗虫抑菌活性成分在制备抑制金黄色的葡萄球菌的制剂上的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：在制备抑制金黄色葡萄球菌的制剂上，以乙醇为溶剂时，采用索氏提取法提取。

9.如权利要求1-4任一项所述的银胶菊抗虫抑菌活性成分在制备杀灭小菜蛾、菜青虫和/或萝卜蚜的制剂上的应用。

10.如权利要求1-4任一项所述的银胶菊抗虫抑菌活性成分在制备抑制芒果可可球二孢菌、王草镰刀菌、甘蔗小球腔菌和/或镰孢炭疽菌的制剂上的应用。