CN106577774A - 一种海洋动物源农药的生产方法 - Google Patents

Abstract

一种海洋动物源农药的生产方法，具体步骤为原料预处理、醇提、离心、预过滤、超滤浓缩、盐析、溶解、酶解、第二次超滤浓缩、层析、第三次超滤浓缩、喷雾干燥、复配。整个制备过程反应条件温和，工艺流程简单，除乙醇外不使用其它有机溶剂；使用盐析法将蛋白、多糖结合皂苷进行沉淀分离；同时，盐析除掉大部分脂类，与传统使用醚类等有机溶剂去除脂类的方法相比更加安全环保；使用固定化酶将大分子蛋白分解为多肽及氨基酸，有效降低后续处理中大孔树脂对蛋白的吸附，从而增加洗脱液中目标产物的量。使用香草醛‑硫酸显色法对动物源农药原料粉进行海星皂苷含量分析，含量为69.4‑73.1%，通过复配，最终获得一种海洋动物源农药。

Description

一种海洋动物源农药的生产方法

技术领域

本发明属于生物农药领域，具体涉及一种以危害海洋养殖业动物生产动物源农药的方法。

背景技术

海星（starfish）属于棘皮动物门（Echinodermata），海星纲（Asteroidea）。海星种类有2000多种，分布于世界各大洋中，我国海星有100余种。海星以多种无脊椎动物或动物尸体为食, 特别喜食牡砺、贻贝和蛤蜊等软体动物，是贝类和沿海养殖业的大敌，严重危害沿海的养殖渔业。目前，贝类底播养殖区域的海星随网捕捞后，多被直接丢弃或经暴晒粉碎后用作农作物肥料，这对环境是一种污染，也造成了资源浪费。

长久以来，化学合成农药一直是防治昆虫危害的重要手段，并且具有杀灭速度快，持久性强，使用方便等优点。但化学农药通常具有降解难的特点，长期使用，会发生富集作用。动物源农药主要包括动物毒素和激素两类，动物源农药的显着特点是高效低毒，对人、畜和植物安全，对环境比较友好，不富集，是目前无公害水果栽培中提倡使用的农药种类。海星具有较高的蛋白、脂质含量，同时含有皂苷、甾醇、多糖等化学物质，在食品、饲料、医药领域具有良好的开发前景。其中海星成分之一的海星皂苷具有毒性，对环节动物、软体动物、节肢动物以及脊椎动物均有毒性，已有研究人员证实海星皂苷已被证明能抑制果蝇的蛹化，使得子代蛹化数目减少，为海星在农药领域的应用提供了理论依据。

公开号CN201310026646.2的中国发明专利公开了《一种用植物、动物源的绿色环保农药及配置方法》，所述绿色环保农药的组份由野生植物、食用作物、动物胆汁组成，野生植物为：曼陀罗、蓖麻籽、鱼藤草；食用作物有：辣椒王、大蒜、川椒、黄连素；动物胆汁有：鱼胆汁、鸡胆汁或猪胆汁；配置方法为：对野生植物进行洗净、粉碎、压榨、化验提生物碱、筛去水分杂质；对食用作物进行洗净→榨汁或浸泡；对动物胆汁洗净、破出胆汁；然后混合配在一起，搅拌均匀制成。其使用了动物源胆汁作为杀虫成分，产量低，原料来源有限，碱性配方，存在破坏土壤酸碱性的问题。

山东半岛海区海星分布数量很多，且未能有效利用，为了解决这一问题，本发明由此而产生。

发明内容

本发明提供一种海洋动物源农药的生产方法。

为实现上述发明目的，本发明公开的技术方案特征包含如下步骤：

a)原料预处理：新鲜海星清洗除去泥沙杂质后，进行晾晒风干，粉碎机粉碎至80～200目；

b)醇提：加入粉碎后海星重量5～15倍浓度为55%(v/v)乙醇溶液，65℃保温，搅拌提取5～15h;

c)离心：使用离心机将海星组织与醇提液进行分离，保留上清液;

e)预过滤：使用45μm超滤膜对c)中的上清液进行过滤，收集滤出液；

f)超滤浓缩：使用中空纤维素膜截留量1000D对e）中的滤出液进行超滤浓缩，加入适量纯化水，除去小分子杂质、盐和乙醇，浓缩至体积为原体积的1/20～1/10，得到超滤浓缩液;

g)盐析：向步骤f)中的超滤浓缩液中逐步加入NH₄Cl至饱和，静置5～10h，离心保留沉淀;

h)溶解：将步骤g)中的离心沉淀用与f)中超滤浓缩液等体积的纯化水溶解;

i)酶解：使用固定化蛋白酶对h)中的溶液进行酶解，50℃保温24小时;

j)第二次超滤浓缩：将固定化蛋白酶从酶解液中移出，使用中空纤维素膜截留量10000D进行超滤浓缩，加入适量纯化水，除去氨基酸和多肽，浓缩为酶解液体积的1/20～1/10;

k)层析：将步骤j)中的浓缩液上样于处理过的AB-8型大孔吸附树脂，用少量10%的乙醇溶液进行洗柱，后用70%乙醇进行洗脱，洗脱体积为5～10倍柱体积，收集洗脱液;

l) 第三次超滤浓缩：使用中空纤维素膜截留量10000D进行超滤，浓缩至喷雾干燥合适浓度;

m)喷雾干燥：将步骤l)中获得的浓缩液进行喷雾干燥，设置进口温度为160℃，出口温度为60℃，喷雾干粉为动物源农药原药；

n)复配：将步骤m)中的动物农药原药加入农药助剂进行复配，最终获得动物源农药。

优选的，步骤i)的固定化蛋白酶包括但不限于中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶等。

优选的，步骤m)中加入的农药助剂包括但不限于分散剂、稳定剂、缓释剂、增效剂等。

与现有技术相比本发明的优点在于，整个制备过程反应条件温和，工艺流程简单，除乙醇外不使用其它有机溶剂；首次使用盐析法将与蛋白、多糖结合的皂苷进行沉淀分离；同时，盐析后除掉大部分脂类，与传统使用醚类等有机溶剂去除脂类的方法相比更加安全环保；后又使用固定化酶将大分子蛋白分解为多肽及氨基酸，有效降低后续处理中大孔树脂对蛋白的吸附，从而增加洗脱液中目标产物的量。使用香草醛-硫酸显色法对动物源农药原料粉进行海星皂苷含量分析，总皂苷含量为69.4-73.1%，有效成分含量较高。

具体实施方式

本发明实质性特点可从下述实施例中得以体现，但这些实施例仅作为说明，而不能对本发明进行限制。

实施例

称量500kg新鲜海星，清洗泥沙后码放于晾晒网上晒干10天，放入粉碎机中粉碎至100目，称重为209kg。将粉碎的海星干粉加入到反应釜中，添加480L浓度为55%（v/v）乙醇，升温至65℃，搅拌提取10h。将料液分批次转移至工业离心机中进行第一次离心，3000r/min离心30min，保留上清液。使用孔径45μm的水性纤维素膜对上清液进行初步过滤，保留滤出液。使用截留量1000D的中空纤维素膜对滤出液进行超滤浓缩除杂，期间加入纯化水200L，当浓缩液体积降为40L时停止超滤，向其中加入氯化铵14kg，搅拌至完全溶解后静置10h，3000r/min离心30min保留沉淀，加入40L纯化水溶解沉淀，加入固定化中性蛋白酶1kg， 50℃保温24h，将固定化酶从酶解液中移出，使用截留量10000D的中空纤维素膜对其进行超滤，期间加入纯化水200L，浓缩至3.5L时停止超滤，上样于处理过的AB-8型大孔吸附树脂，柱体积为5L，上样流速为0.5ml/min，上样完毕后，先用100ml浓度为10%（v/v）乙醇洗柱，后用40L浓度为70%（v/v）乙醇洗脱并收集洗脱液。使用截留量10000D的中空纤维素膜进行超滤浓缩，浓缩至5L，进行喷雾干燥，设置进口温度为160℃，出口温度为60℃，收集喷雾干粉476.5g。

将上述干粉进行复配，质量比为喷雾干粉：皂角粉：十二烷基磺酸钠=1000:500:10，获得海洋动物源农药719.5g。

试验例1：

进行韭蛆杀灭试验，在韭菜收割后，对其根部进行浇注，使农药或杀虫剂渗达韭菜根部。实验共设计3个处理。处理1：清水对照；处理2：1.5%天然除虫菊素EW按照说明书稀释1200倍；处理3：本发明农药1：1000加水稀释。试验地点为烟台市福山区门楼镇韭菜大棚内，种植的韭菜品种为平韭二号，土壤养分中等。每个处理小区面积3m²，设3次重复，共9个小区，随机区组排列。于2015年4月12日上午施肥。施肥前调查韭蛆虫口密度，施肥后14d和21d分别调查防治效果。每个小区取5个点，每点取样0.25m²（约1穴），计算各处理的虫口退减率。

虫口退减率（%）=（防治前虫口数-防治后虫口数）/防治前虫口数×100

试验结果如表1所示：

表1

处理	稀释倍数	处理前虫口数（头/穴）	14d减退率%	21d减退率%
					1	-	189.2	54	51
2	1200	191.6	92	96
					3	1000	183.0	89	91

由上表可见，本发明杀灭韭蛆的效果与天然除虫菊素EW效果相当，两者的杀虫效果较清水对照组有明显提高，可见，本发明产品具有较强的杀灭田间害虫的作用。

试验例2：

试验选择在山东省烟台市福山区门楼镇自留地内进行，甘蓝品种为郑研新丰结球甘蓝，土壤养分中等。于2016年9月20日菜青虫二至三龄高峰期，使用喷雾器进行喷施,每个处理小区面积3m²，设3次重复，共12个小区，随机区组排列。实验共设计4个处理。处理1：清水对照；处理2：1.5%天然除虫菊素EW按照说明书稀释；处理3：0.9%阿维菌素乳油按说明书使用；处理4：本发明农药1：30加水稀释。调查方法：每小区5点取样，于施药前调查每株上的幼虫基数，药后1d、3d、7d分别调查残存活虫数，计算虫口减退率。

虫口退减率（%）=（防治前虫口数-防治后虫口数）/防治前虫口数×100

试验结果如表2所示：

表2

处理	稀释倍数	处理前虫口数（头/株）	1d减退率%	37d减退率%	7d减退率%
						1	-	2.425	-6.07	0	-57.19
2	1200	2.500	94.37	95.79	96.22
						3	3000	1.825	86.31	100	100
4	1000	2.050	87.69	96.84	97.32

由上表可见，本发明杀灭菜青虫的效果与天然除虫菊素EW效果相当，优于0.9%阿维菌素乳油，可见，本发明产品具有较强的杀灭菜青虫的作用。

Claims (3)

1.一种海洋动物源农药的生产方法，其特征是，包含如下生产步骤：

a)原料预处理：新鲜海星清洗除去泥沙杂质后，进行晾晒风干，粉碎机粉碎至80～200目；

b)醇提：加入粉碎后海星重量5～15倍浓度为55%(v/v)乙醇溶液，65℃保温，搅拌提取5～15h;

c)离心：使用离心机将海星组织与醇提液进行分离，保留上清液;

e)预过滤：使用45μm超滤膜对c)中的上清液进行过滤，收集滤出液；

f)超滤浓缩：使用中空纤维素膜截留量1000D对e）中的滤出液进行超滤浓缩，加入适量纯化水，除去小分子杂质、盐和乙醇，浓缩至体积为原体积的1/20～1/10，得到超滤浓缩液;

g)盐析：向步骤f)中的超滤浓缩液中逐步加入NH₄Cl至饱和，静置5～10h，离心保留沉淀;

h)溶解：将步骤g)中的离心沉淀用与f)中超滤浓缩液等体积的纯化水溶解;

i)酶解：使用固定化蛋白酶对h)中的溶液进行酶解，50℃保温24小时;

j)第二次超滤浓缩：将固定化蛋白酶从酶解液中移出，使用中空纤维素膜截留量10000D进行超滤浓缩，加入适量纯化水，除去氨基酸和多肽，浓缩为酶解液体积的1/20～1/10;

k)层析：将步骤j)中的浓缩液上样于处理过的AB-8型大孔吸附树脂，用少量10%的乙醇溶液进行洗柱，后用70%乙醇进行洗脱，洗脱体积为5～10倍柱体积，收集洗脱液;

l) 第三次超滤浓缩：使用中空纤维素膜截留量10000D进行超滤，浓缩至喷雾干燥合适浓度;

m)喷雾干燥：将步骤l)中获得的浓缩液进行喷雾干燥，设置进口温度为160℃，出口温度为60℃，喷雾干粉为动物源农药原药；

n)复配：将步骤m)中的动物农药原药加入农药助剂进行复配，最终获得动物源农药。

2.根据权利要求1所述的一种海洋动物源农药的生产方法，其特征在于：所述步骤i)的固定化蛋白酶包括但不限于中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶等。

3.根据权利要求1所述的一种海洋动物源农药的生产方法，其特征在于：所述步骤m)中加入的农药助剂包括但不限于分散剂、稳定剂、缓释剂、增效剂等。