CN116987161A - 一种弱毒变黑轮枝菌外泌蛋白激发子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物保护及生物防治领域，尤其涉及一种弱毒变黑轮枝菌外泌蛋白激发子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，本发明发现了一种新型的未知功能的蛋白PeGD1的蛋白激发子的应用，所述蛋白激发子PeGD1是一种新型蛋白激发子，可用于提高马铃薯抗性和诱导马铃薯防御反应，通过激活马铃薯体内ROS爆发、H2O2积累、CAT、SOD等相关防御酶活性，同时主要激活马铃薯体内水杨酸信号途径来抵御马铃薯黄萎病，从而实现对马铃薯黄萎病的防治作用，为提高马铃薯的抗病性及马铃薯黄萎病的生物防治提供了新材料。

Description

一种弱毒变黑轮枝菌外泌蛋白激发子及其应用
技术领域
本发明涉及植物保护及生物防治领域，尤其涉及一种弱毒变黑轮枝菌(Gibellulopsis nigrescens)外泌蛋白激发子及其应用。
背景技术
弱毒菌株可以抑制病原物对寄主植物的危害，进而达到绿色、环保的生防目的，是当前预防控制植物病害最具潜力的方法之一。国内外众多研究显示，对于弱毒菌株的交叉保护作用可能存在两种机制，一种是弱毒菌株可能在预先接种过程中抢先占据了空间位点并与强毒菌株形成空间竞争，导致发病降低。另外一种则是寄主植物基因转录后沉默机制(PTGS)即寄主植物响应弱毒菌株的基因在转录后才沉默，使一个即将入侵的致病菌株成为了该机制的靶向作用目标，致病RNA被降解。然而，从真菌群落中选择合适的弱毒分离株作为潜在的拮抗剂通常需要长时间的鉴定和筛选。此外，利用基因工程技术将致病菌变成新的无毒菌株虽然可轻松快速地获得生防制剂，但是经过编辑的生物体，即使不含外来DNA，其安全性和是否符合转基因生物体设立的规则还有待考究。
激发子是能够通过调动植物本身所具有的抗病潜能而不是像杀菌剂、抗菌素那样直接抑制病原菌来诱导植物产生抗病性，从而抵抗病原菌的侵染，是一种新的植物保护剂(植物疫苗)的开发研究。近年来，从病原菌中分离鉴定出具有新功能的激发子已成为国内外科学家关注的焦点，然而从弱毒病原菌中分离蛋白激发子目前却鲜有报道。因此，针对马铃薯产区主要土传病害-马铃薯黄萎病的发生日益严重，农药过度使用造成的环境污染及食品安全问题，亟需发掘、筛选一种绿色、环保、的新型材料，以达到减少杀菌剂的使用，实现绿色、环保的生防目的。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种弱毒变黑轮枝菌外泌蛋白激发子及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种弱毒变黑轮枝菌外泌蛋白激发子PeGD1，其氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
本发明还提供了一种所述弱毒变黑轮枝菌外泌蛋白激发子PeGD1的编码基因。
本发明还提供了一种所述弱毒变黑轮枝菌外泌蛋白激发子PeGD1或权利要求2所述弱毒变黑轮枝菌外泌蛋白激发子PeGD1的编码基因在提高植物抗病能力中的应用。
优选的，所述弱毒变黑轮枝菌外泌蛋白激发子PeGD1的有效浓度为0.125～1.000mg/mL。
优选的，所述提高植物抗病能力包括提高植物抗性和/或诱导植物防御反应。
优选的，所述提高植物抗性是提升植物对大丽轮枝菌病原体的抗性，所述诱导植物防御反应是诱导减少大丽轮枝菌病原体对植物的病害。
优选的，所述提高植物抗性是通过激活ROS爆发、H2O2积累以及提高防御酶活性来实现，所述防御酶包括CAT、SOD、POD和PAL酶中的一种或多种。
优选的，所述提高植物抗性还包括提高SA、JA/ET的含量以及其相关信号通路基因的相对表达量。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
本发明发现了一种未知功能的蛋白激发子PeGD1的应用，包括通过激活马铃薯体内ROS爆发、H2O2积累和CAT、SOD、POD、PAL相关防御酶活性的提高，激活马铃薯体内水杨酸信号途径并激活茉莉酸/乙烯信号途径及信号途径相关合成基因的相对表达量，进而提高马铃薯对黄萎病病菌的抗性，来实现对马铃薯对黄萎病的防治作用，为马铃薯黄萎病的生物防治工作积累了新的材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例1粗蛋白诱导马铃薯叶片HR反应且Tris(20mM)为对照；
图2为实施例1中活性蛋白层析柱分馏图；
图3为实施例1中SDS-PAGE测试图；其中Marker:250kD；
图4为实施例1中系统发育树分析图；
图5为实施例2中蛋白激发子PeGD1目的基因的PCR扩增图；其中，M为Marker:5000bp，1为PeGD1；
图6为实施例2中菌液PCR图；其中M为Marker:DL2000 bp；数字1-7为DH5α菌株编号；
图7为实施例2中pREST-CH-PeGD1重组质粒的双酶切结果图；其中1为Marker，2为pREST-CH-PeGD1；
图8为实施例2中蛋白激发子PeGD1表达鉴定图；其中对照1、2为IPTG诱导表达前菌体总蛋白，菌株1-6为IPTG诱导蛋白表达后菌体总蛋白；
图9为实施例2中的纯化及SDS-PAGE电泳图；其中A为蛋白激发子PeGD1重组蛋白的纯化结果，B为SDS-PAGE电泳图；
图10为实施例3中不同浓度的蛋白激发子PeGD1诱导马铃薯叶片的过敏反应图，其中BAK1为正对照，PBS为阴性对照，1代表蛋白浓度为125μg/mL，2代表250μg/mL，3代表500μg/mL，4代表1000μg/mL；
图11为实施例3中蛋白激发子PeGD1诱导马铃薯抗黄萎病图；
图12为实施例3中蛋白激发子PeGD1诱导马铃薯活性氧爆发及细胞程序性死亡结果图，其中A为活性氧爆发，B为细胞程序性死亡；
图13为实施例3中蛋白激发子PeGD1诱导马铃薯H2O2及相关防御酶活性变化图；其中A为不同时间点H2O2含量，B-E为不同时间点CAT、SOD、POD、PAL酶活性变化；
图14为实施例3中蛋白激发子PeGD1诱导马铃薯体内SA含量及相关合成基因相对表达量变化图，其中A为不同时间点SA含量，B为不同时间点SA相关合成基因的相对表达量；
图15为实施例3中蛋白激发子PeGD1诱导马铃薯体内JA/ET含量及相关合成基因相对表达量变化，其中A为不同时间点JA含量，B为不同时间点JA相关合成基因的相对表达量，C为不同时间点ET含量，D为不同时间点ET相关合成基因的相对表达量。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明作进一步说明，本发明实施例仅用于描述本发明的技术方案，并非限定于本发明。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
本发明所述实施例公开的弱毒变黑轮枝菌外泌蛋白激发子PeGD1(以下简称“蛋白激发子PeGD1”)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例1蛋白激发子PeGD1的分离、纯化及序列分析
1、试验材料
供试菌株为变黑轮枝菌G.nigrescens Vn-1，来源于内蒙古农业大学园艺与植物保护学院菌种保藏室。
供试植物为马铃薯费乌瑞它组培苗购买自呼和浩特市武川县塞丰马铃薯种业有限公司。
2、变黑轮枝菌Vn-1蛋白激发子的分离鉴定
2.1变黑轮枝菌Vn-1发酵液的制备
用灭菌的黄枪头取培养10d的变黑轮枝菌Vn-1的边缘菌丝，将菌饼接种在含有1000mL灭菌的优化查氏液体培养基中，每50mL培养基放6个菌饼，在25℃180r/min条件下摇培8d。离心机12,000r/min 4℃离心15min取上清液备用。
2.2粗蛋白的提取
将变黑轮枝菌Vn-1发酵液用灭菌的0.22μm的过滤器过滤后用饱和度为80％的硫酸铵4℃沉淀过夜，随后用离心机4℃12,000r/min离心15min，所得的沉淀用pH 7.4的20mMTris-HCl缓冲液悬浮4℃脱盐24h。用10kD的超滤离心管13,000r/min 4℃离心20min得到粗蛋白，-80℃保存备用。
2.3生物活性的检测
以具有7片真叶的马铃薯为材料，将50μL(1μmol/L)粗蛋白溶液从叶子背面注射进叶片中去，蛋白缓冲液为对照，每个处理重复3次。处理24h后，观察是否有过敏反应的坏死斑形成，确定蛋白激发子是否具有活性。
结果如图1所示，24h后观察到叶片上出现典型的HR过敏反应，这说明粗蛋白中含有可以引发马铃薯过敏坏死反应的蛋白种类。
3、变黑轮枝菌Vn-1蛋白激发子的分离纯化
将上述步骤2.2得到粗蛋白用pure蛋白纯化仪以及阴离子层析柱HP Q HiTrapTM(5mL)和Superdex 200increase 10/300GL分子筛按照仪器说明书分离纯化目的蛋白。具体操作如下：
(1)将保存在-80℃的粗蛋白在冰上溶解后，启动并连接pure蛋白纯化仪，先用阴离子层析柱HP Q Hi TrapTM(5mL)进行粗蛋白分馏并收集A280吸收峰下的蛋白。设置仪器流速1mL/min蛋白取样按峰值出现的体积，取样量为100μL；
(2)用5倍体积20％酒精冲洗层析柱，达到平衡后，用5倍体积pH为7.4浓度为20mM的Tris-HCl上样缓冲液平衡层析柱，冲淋基线至平行；
(3)取500μL准备好的粗蛋白溶液通过上样孔进行上样后，用蛋白上样缓冲液20mMTris-HCl进行目标蛋白线性洗脱，并根据pure显示收集各个蛋白洗脱峰；
(4)待目标蛋白收集完成后，使用20mM Tris-HCI缓冲液和20％乙醇重新清洗层析柱，4℃保存层析柱。
(5)取50μL收集的蛋白注射至马铃薯叶片的背面，24h后观察叶片的HR反应，并选择可产生HR反应的蛋白用分子筛进行再次分馏；
(6)取上述步骤(5)中可产生HR反应的分馏蛋白，用分子筛Superdex200increase10/300GL按照上述(1)～(5)的操作步骤进行蛋白分馏，但流速设置为0.5mL/min，蛋白取样按峰值出现的时间，取样量为100μL；
(7)取50μL步骤(6)中收集的蛋白再次注射至马铃薯叶片的背面，24h后观察叶片的HR反应，并将剩余蛋白用SDS-PAGE测定蛋白质的纯度及大小，电泳结束之后，再按照考马斯亮蓝染法来检验蛋白的纯度和测量分子量大小。
结果表明，在洗脱体积为20～30mL之间有一个明显的峰值，A 280mAU值达46(见图2)，将该峰值的蛋白收集后，用浓缩管再次浓缩后进行SDS-PAGE验证。根据R250考马斯亮蓝染色，有一个约17kD的条带(见图3)，将该条带切胶后送赛思基因科技(青岛)有限公司进行质谱鉴定。
4、蛋白质激发子质谱鉴定及序列分析
根据质谱鉴定de novo测序得到蛋白质氨基酸序列该蛋白共有153个氨基酸。将该序列在NCBI的Pblast进行比对，比对结果显示，该蛋白激发子目前尚未命名且无功能报道。与比对序列比较，序列一致率均低于60％。从NCBI的Protein blast的非冗余(NR)数据库选择了33个来自不同菌种的蛋白进行系统发育树分析，发现PeGD1与来源于海洋真菌(Emericellopsis atlanti)的未命名蛋白同源性较高。但也仅为58.39％。与轮枝菌属的长孢轮枝菌(Verticillium longisporum)和大丽轮枝菌(Verticillium dahliae VDG2)分别有一段同源序列，但是序列一致率只有53.85％(见图4)。因此，确定该蛋白为一种新的能诱导马铃薯叶片HR反应的蛋白激发子，并将其命名为PeGD1(A protein elicitor fromGibellulopsis nigrescens)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2蛋白激发子PeGD1基因的克隆与测序
1、实验材料
变黑轮枝菌Vn-1：来源于内蒙古农业大学园艺与植物保护学院菌种保藏室。
2、蛋白激发子PeGD1的克隆与测序
将变黑轮枝菌Vn-1菌株在PDA培养基上生长15d后，收集菌丝并用天根TRNzolUniversal总RNA提取试剂盒的方法进行总RNA的提取，然后根据不含信号肽和终止密码子的蛋白激发子PeGD1的核苷酸序列设计特异性引物GD1-F和GD1-R，最后利用RT-PCR技术扩增获得不含信号肽及终止密码子的蛋白激发子PeGD1基因的全长cDNA片段。
所述蛋白激发子PeGD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该序列的5'端第1～54位核苷酸为信号肽序列，第460～462位核苷酸为终止密码子，在蛋白质表达时需要将信号肽及终止密码子去掉。
根据不含信号肽的蛋白激发子PeGD1基因序列利用Primer 6.0进行特异性引物设计，引物如下所示：
GD1-F(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)：
5'-GCCCCCTCCCCTGCCGCCGAGGTCAA-3'；
GD1-R(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)：
5'-AGGGAGGGCCTGGACGGGGTAGC-3'；
以cDNA为模板(靶序列)，用特异性引物GD1-F和GD1-R组成的引物对进行PCR扩增(靶序列为405bp)。
PCR扩增体系如表1所示：
表1
PCR反应程序为：98℃预变性30s，98℃变性5s，72℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃最后延伸2min。PCR反应结束后，将产物经1％琼脂糖凝胶泳检测(见图5)，分子量大小和目标基因大小一致为405bp。
将PCR扩增产物回收，按照T克隆载体pMD19-T的说明书连接pMD19-T，构成PeGD1-pMD19-T重组质粒。然后将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α菌株中，涂布于含有Amp的LB固体培养基并经过菌落PCR鉴定(见图6)，选取阳性克隆菌株3号送至北京擎科生物科技有限公司测序验证阳性克隆。利用NCBI网站的BLAST功能，将所测定的序列进行比对分析，测序结果经过比对和靶序列完全匹配。
实施例3蛋白激发子PeGD1的表达与纯化
1、蛋白激发子PeGD1基因工程表达菌株的构建
(1)重组质粒PeGD1-pMD19-T的提取
用捷瑞公司的质粒提取试剂盒按照说明书提取重组质粒PeGD1-pMD19-T。
(2)引物设计及带有双酶切位点的目的片段扩增：
利用表达载体pREST-CH，根据PeGD1基因序列，选择限制性内切酶BamH1和EcoR1进行特异性引物设计(加粗部分为酶切位点且两端带有保护碱基)。
GD1-BamH1-F(其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)：
ATATAGCCCCCTCCCCTGCCGCCGAG；
GD1-EcoR1-R(其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)：
GCGCA AGGGAGGGCCTGGACGGGGTA；
PCR反应体系如下表2：
表2
扩增条件为：扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环，72℃最后延伸10min，4℃保存。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，并回收带有酶切位点的目的基因片段。
(3)使用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ切割pREST-CH载体并用胶回收带有酶切位点的线性化的线性质粒。
(4)使用T4连接酶将纯化后均带有酶切位点的目的基因片段连接到双酶切的载体pRSET-CH。
(5)取6μL连接产物通过42℃热激的方法转化到XL1-Blue感受态细胞中，然后涂布在含有60μg/mL Amp的固体LB-Amp筛选平板上，37℃静置培养过夜。
(6)挑取固体LB-Amp筛选平板上的单克隆菌落加入到含有100μg/mL Amp的2mLLB-Amp液体培养基中，37℃、240r/min摇菌过夜培养后，使用质粒抽提试剂盒提取质粒。
(7)双酶切验证及测序
将提取的重组质粒，用BamH1和EcoR1双酶切验证，并送北京擎科生物科技有限公司测序，结果表明，用BamHⅠ和EcoRⅠ对pRSET-CH-PeGD1进行双酶切，获得3.1kb的pRSET-CH载体片段和405bp的目标基因片段(见图7)，利用NCBI网站的BLAST功能，将所测定的序列进行比对分析。测序结果经过比对和靶序列完全匹配。
2、蛋白激发子PeGD1重组蛋白的表达
(1)重组质粒转化到BL21感受态
将经测序验证正确的重组表达质粒PeGD1-pRSET-CH通过42℃热激的方法转化到大肠杆菌BL21中。
(2)IPTG诱导重组蛋白表达
分别挑取5～7个阳性克隆菌落，取其中的一部分接种于2mL含氨苄(100μg/mL)的LB培养液中，7℃，220rpm振荡培养过夜后，接种1mL过夜培养物到含10mL 37℃预热的LB培养液(含氨苄100μg/mL)的50mL离心管中，37℃震荡培养100min，直到OD600为0.5～0.7，留取1mL菌液至新EP管中，放置于冰上，作为诱导前对照。加入IPTG(贮存液浓度为0.5mol/L，取20μL加入10mL菌液中)，至终浓度为1mmol/L，30℃振荡培养4h，诱导蛋白表达。
(3)SDS-PAGE鉴定
取诱导后的菌液1mL于新的EP管中，与诱导前的菌液12,000rpm离心2min，弃掉培养液，收集菌体，一同进行细菌裂解。沉淀物重悬在50μLPBS中，充分涡旋震荡至彻底分散，加入5μL 10×loading buffer(用前加入10％β-巯基乙醇)，沸水浴8min，冰上冷却5min。
SDS-PAGE电泳：应用分离胶浓度为12％的PAGE胶进行跑胶鉴定，100mA恒流电泳80min，将PAGE胶放入考马斯亮蓝染液中染色2h，室温脱色液中脱色6h，凝胶成像仪上拍照记录结果，结果表明，与对照组相比，IPTG诱导组6号菌株增加表达最明显，故选用6号菌株进行大量表达(见图8)。
3、蛋白激发子PeGD1重组蛋白的分离纯化
选择蛋白表达量高阳性克隆菌落，按照上述步骤2(2)的方式进行蛋白的大量诱导表达。取振荡培养的菌液，4℃，12,000rpm离心30min，用pH为7.4的PBS缓冲液冲洗沉淀3次后再次离心。再用0.1M的PBS缓冲液重悬菌体，利用超声细胞破碎仪冰浴破碎40min(200W，破碎4s，间隔3s)，12,000rpm离心20min，收集上清液即为重组蛋白粗提液。
将重组蛋白粗提液采用实施例1中步骤3所述蛋白激发子的分离纯化方法进行重组蛋白的纯化，用SDS-PAGE鉴定是否为目的蛋白，结果如图9所示，重组蛋白在洗脱体积为20～30mL时，在A280有明显吸收峰。回收后经SDS-PAGE验证，大小为14kD，后利用Brandford的方法测定蛋白激发子PeGD1重组蛋白的浓度为1mg/mL。
综上所述，本发明将蛋白激发子PeGD1在IPTG的诱导下进行了原核表达，利用特异性引物PCR扩增得到蛋白激发子PeGD1不含信号肽和终止子的编码序列为405bp。该编码序列被克隆后连接到T克隆载体pMD19-T上，经过菌落PCR，测序验证正确后将基因构建到表达载体pRSET-CH中，组成了含有蛋白激发子PeGD1的新载体pRSET-CH-PeGD1，再次经过质粒PCR，酶切和测序验证后，转入大肠杆菌BL21进行表达，后经IPTG诱导后，蛋白激发子PeGD1可表达，浓度为1mg/mL，本实施例2在构建表达载体过程中选择特异的酶切位点，该位点为编码基因不包括的，同时根据基因的特性，在限制性酶切位点前加入了保护碱基，这样能够使基因形成正确的阅读框和酶切更易进行。
实施例4蛋白激发子PeGD1诱导马铃薯黄萎病抗性研究
1、试验材料
供试菌株为最强毒大丽轮枝菌(V.dahliae)Vd-36。
供试植物为马铃薯费乌瑞它组培苗，购买自呼和浩特市武川县塞丰马铃薯种业有限公司。
2、马铃薯的种植
马铃薯的种植：准备好一套洁净无菌的水培管道种植系统，管道用75％的酒精擦洗干净。在营养液池中加入清水后加入杀菌剂奥克泰氏杀菌剂，调整至最终浓度为30ppm，将管道冲洗5次，之后将水倒掉后重新在营养液池中加满清水，配制无土栽培营养液并加入到20L的营养液桶池中。所述营养液的pH为6.8，EC值为1.9，所述无土栽培的营养液的配方为：硝酸钙1360mg/L，硝酸钾1100mg/L，硫酸镁500mg/L，磷酸二氢铵270mg/L，硼酸3.0mg/L，硫酸锰1.6mg/L，硫酸锌0.28mg/L，硫酸铜0.12mg/L，钼酸钠0.10mg/L，EDTA铁钠20mg/L，其余以水补足。
选取生长高度一致的马铃薯组培苗在无菌环境下敞开瓶盖3d，之后移栽在事先准备好的水培管道系统中(昼/夜温度为26℃/20℃，完全光照14h，完全黑暗10h，湿度为65％)，生长7d后，待小苗叶片生长至10片叶子以上移栽在盛有陶粒的小花盆中，其中陶粒在121℃的高压灭菌锅中灭菌30min，小花盆用5％的高锰酸钾浸泡10min。种植过程在无菌的环境下进行。
3、不同浓度的PeGD1在植物上的HR诱导反应
将实施例3中通过原核表达得到的蛋白质(浓度为1mg/mL)用0.1M的PBS缓冲液进行稀释，分别稀释1倍、2倍、4倍、6倍，即蛋白质溶液的最终浓度分别为1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL。选择生长5～7片真叶的马铃薯苗，用1mL不带针头的注射器将不同浓度的蛋白质溶液从叶子背面注射到叶片中，BAK1为阳性对照，PBS为普通对照，注射24h后观察叶片HR反应情况，确定蛋白激发子的生物活性并在紫外光下进行拍照。每个处理重复3次，每个重复分别为3片植物叶片。
结果表明，将50μL纯化后不同浓度(125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL)的蛋白激发子PeGD1注射到马铃薯叶片，BAK1为阳性对照，蛋白缓冲液PBS为阴性对照。注射24h后，在马铃薯叶片上，随着激发子浓度的增加，HR反应也逐渐增强，浓度为125μg/mL时最弱，浓度为1000μg/mL时最强(见图10)。
4、茎部注射PeGD1后诱导马铃薯抗黄萎病测定
用1mL的带针头的一次性注射器将0.125mg/mL的PeGD1蛋白溶液50μL注射到长有5～7片真叶的马铃薯苗茎部。试验共设置1个对照组，3个处理组。对照组为注射0.1M的PBS缓冲液；处理组1为单独注射PeGD1蛋白溶液，处理组2为注射PeGD1蛋白溶液后24h再接种强毒菌株Vd-36，处理组3为单独接种强毒菌株Vd-36，14d后观察马铃薯黄萎病发生情况。
离体接种：采集上述设置的4个处理组的叶片放在含有滤纸的培养皿上，用灭菌的蓝枪头从培养好的Vd-36的PDA培养基上打菌饼，每个叶片背面放一个菌饼。将接种好的培养皿放在恒温箱中，定期喷水，保证培养皿的湿润，7d后观察马铃薯叶片发病情况。
根据上述步骤3的实验结果，将浓度为125μg/mL的重组蛋白激发子50μL从马铃薯茎部注射到马铃薯体内，24h后接种最强毒菌株Vd-36，14d后观察马铃薯黄萎病的发病情况。盆栽实验显示，单独注射PeGD1及PBS缓冲液，植物并未发病，先注射PeGD1 24h后再接种强毒菌株Vd-36，14d后植物几乎未发病，而单独接种Vd-36却表现明显的黄萎病症状。此外离体接种试验的结果与盆栽试验结果一致(见图11)。
5、DAB及台盼蓝染色
DAB染色：将DAB溶解在含有10mM Na2HPO4和0.05％吐温20的溶液中，调整DAB终浓度为1mg/mL，备用。
选择处理后0、12、24、48h的马铃薯叶片浸入DAB染液中，真空抽滤20～30min后黑暗条件下，室温过夜，后将马铃薯叶片放到95％的乙醇溶液中，沸水浴20min，随后用扫描仪对脱色的马铃薯叶片进行扫描。
台盼蓝染色：每1mL乳酚溶液(乳酸、丙三醇、苯酚、H2O按体积比1：1：1：1混合)溶解2.5mg台盼蓝，共配制100mL备用。
选择处理后0、12、24、48h的马铃薯叶片浸入台盼蓝染液中，真空抽滤25min后黑暗条件下，室温过夜，后将马铃薯叶片放到95％的乙醇溶液中，沸水浴20min，随后用扫描仪对脱色的马铃薯叶片进行扫描。
结果显示，当马铃薯先在茎部注射PeGD1 24h后，再接种Vd-36后在12h时，活性氧大爆发且细胞程序性死亡较严重。这说明PeGD1诱导了植物与病原菌相互作用的早期防卫反应(见图12)。
6、过氧化氢积累及酶活测定。
如图13的结果显示，先注射PeGD1后再接种强毒菌株Vd-36，H2O2、CAT、SOD、POD、PAL几种酶活在12hpi时明显高于其他时间点，24hpi后开始逐渐下降并逐渐趋于稳定。而对照无变化。该处理组的H2O2积累和防御酶活性的变化与步骤5的DAB染色、台盼蓝染色的结果一致。这说明弱毒变黑轮枝菌Vn-1的外泌蛋白可诱导马铃薯对强毒菌株Vd-36产生抗性，且在12hpi时激活了马铃薯体内一系列生理生化反应，如活性氧爆发、相关防御酶活性的增强等。
7、信号通路水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、乙烯(ET)含量以及相关合成基因相对表达量测定。
实验测定了处理组PeGD1+Vd-36不同时间点：0、12、24、48hpi时马铃薯叶片SA含量及相关信号通路基因的相对表达量。如图14所示，处理组(PeGD1+Vd-36)，在12、24hpi时马铃薯叶片内的SA含量均高于对照组。且12hpi时达到最高，24hpi后逐渐下降，这与ROS、H2O2及相关防御酶活性的变化一致。SA信号通路下游的PR类抗性基因的相对表达量在12和24hpi时显著上调，尤其是StPR1b基因在12、24、48hpi时显著高于其他基因的相对表达量。
此外，实验测定了处理组PeGD1+Vd-36不同时间点：0、12、24、48hpi时马铃薯叶片内JA/ET的含量及相关信号通路基因的相对表达量(见图15)。JA的含量在处理组PeGD1+Vd-36和对照组之间没有显著差异，而ET的含量在24hpi时明显高于对照。JA合成相关基因PDF1.2在12hpi时的相对表达量有一个明显的跃升，而ET合成相关基因ACS1、ACS3、ACS7、ACS9、ER的相对表达量均在24hpi时有一个较大跃升；但在12hpi时及其他关键接种时间点，JA/ET相关基因的相对表达量明显低于SA。这表明弱毒变黑轮枝菌Vn-1分泌的蛋白激发子PeGD1可能主要激活了SA信号通路，同时在24hpi也微弱地激活了JA/ET信号通路，从而诱导马铃薯抵御强毒菌株Vd-36的侵染。
综上所述，本发明所述蛋白激发子PeGD1存在寄主选择性，不同浓度的蛋白激发子PeGD1注射马铃薯叶片24h后，只有浓度为1000μg/mL时可产生HR反应。而在马铃薯叶片上，随着激发子浓度的增加，HR反应也逐渐增强。通过测定在马铃薯茎部注射PeGD1 24h后再接种强毒菌株Vd-36的马铃薯叶片在不同时间点SA、JA/ET的含量及相关合成基因的相对表达量结果显示，PeGD1诱导马铃薯产生了系统获得性抗性，且在12hpi时激活了马铃薯体内的SA信号通路，在24hpi时微弱地激活了马铃薯体内的JA/ET信号通路，从而实现马铃薯对强毒菌株Vd-36的抵御作用。同时，植物PR类抗性基因StPR1b除0hpi外，其他时间点的相对表达量均明显高于对照，因此，我们推测该基因在马铃薯抵御病原菌的过程中可能起主要作用。根据以上实验结果可知，当用弱毒菌株预先接种植物后，弱毒菌株会分泌一种外泌蛋白激发子，蛋白激发子与寄主植物相互识别、相互作用，随后通过激发植物体内一系列生理生化反应而启动了植物自身的防御反应，刚好当强毒菌株入侵植物时，植物可抵御强毒菌株的入侵。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种弱毒变黑轮枝菌外泌蛋白激发子PeGD1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.一种权利要求1所述弱毒变黑轮枝菌外泌蛋白激发子PeGD1的编码基因。
3.一种权利要求1所述弱毒变黑轮枝菌外泌蛋白激发子PeGD1或权利要求2所述弱毒变黑轮枝菌外泌蛋白激发子PeGD1的编码基因在提高植物抗病能力中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述弱毒变黑轮枝菌外泌蛋白激发子PeGD1的有效浓度为0.125～1.000mg/mL。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述提高植物抗病能力包括提高植物抗性和/或诱导植物防御反应。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述提高植物抗性是提升植物对大丽轮枝菌病原体的抗性，所述诱导植物防御反应是诱导减少大丽轮枝菌病原体对植物的病害。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述提高植物抗性是通过激活ROS爆发、H2O2积累以及提高防御酶活性来实现，所述防御酶包括CAT、SOD、POD和PAL酶中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述提高植物抗性还包括提高SA、JA/ET的含量以及其相关信号通路基因的相对表达量。
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