CN111574601B - 一种木霉菌疏水蛋白Thfb6及其菌株、植物ISR激发子及激发方法 - Google Patents

Abstract

本发明“一种木霉菌疏水蛋白Thfb6及其菌株、植物ISR激发子及激发方法”属于分子生物学领域。所述木霉菌疏水蛋白Thfb6的氨基酸序列如SEQ ID NO.1。基于所述木霉菌疏水蛋白Thfb6，本发明还提供一种植物ISR激发子及其激发方法以及一种TMV抗性诱导剂及其诱导方法。本发明的木霉菌疏水蛋白Thfb6能够引起植物叶片发生活性氧爆发、诱导细胞胞外碱化、胼胝质和酚类物质积累等早期防御反应，提高叶片中PAL、POD、PPO等抗逆性酶活性提高，诱导病程相关蛋白基因PR‑1b、系统抗性标记基因NPR1以及防御反应关键酶基因PAL的表达，并诱导烟草提高对烟草花叶病的抗病性，同时还能诱导黄瓜对枯萎病抗性。

Description

一种木霉菌疏水蛋白Thfb6及其菌株、植物ISR激发子及激发 方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种木霉菌疏水蛋白Thfb6及其菌株、植物ISR 激发子及激发方法。

背景技术

木霉菌(Trichoderma spp.)是广泛研究和应用的植物病害生防真菌，易于定植于植物根际并与植物建立有益的相互作用，诱导植物抗病性是木霉菌主要的防病机制之一。早在1997年， Bigirimana等首次证明了木霉可诱导植物抗病性，后来发现多种木霉菌能够诱导植物对病原物产生局部或系统抗性。其抗病性信号传递途径十分复杂，有多种信号途径参与，各途径中的信号调控因子交叉互作形成复杂的信号网络。

能够诱导寄主防卫反应的生物来源和非生物来源的物质统称为激发子。第六次国际植物组织培养大会规定来自于植物的激发子称为内源激发子，来自于微生物的激发子的称为真激发子。研究发现，木霉菌能产生多种诱导植物产生诱导性系统抗病性(InducedSystemic Resistance,ISR)的激发子(或诱导子)，不同激发子可激活植物不同的防御信号，是导致木霉菌诱导植物ISR反应的复杂信号网络的根本原因。木霉菌产生的蛋白类激发子已见报道的有十余种，分别为Cerato-platanins家族的Sm1和epl1、Swollenin、糖苷水解酶类Thph1和 ThPG1、II型疏水蛋白等。

疏水蛋白(hydrophobin)是真菌特有的小分子疏水性蛋白质，分子量约为8-30kDa，大部分疏水蛋白含有8个位置保守的半胱氨酸残基，两两配对形成4个二硫键。疏水蛋白表面活性很高，其最大的特性是具有双亲性，能够在气体-液体、气体-固体等两相界面自组装形成纳米级厚度的蛋白膜，微观呈现为密集、有序覆盖在表面的一端亲水另一端疏水的小棒状结构，帮助真菌形成气生菌丝和分生孢子，并利于孢子分化与扩散。

疏水蛋白通常分为两类：I型和II型，分类依据为水缘性图谱(氨基酸疏水性-亲水性图谱)和组装成两性蛋白膜的溶解性。I型真菌疏水蛋白形成的两亲性蛋白膜高度难溶，100℃水浴仍难溶于2％SDS，仅溶解或解聚于蚁酸(formic acid)和三氟乙酸(TFA)等极少数有机溶剂中，代表性的I型疏水蛋白有裂褶菌中的SC3和SC4、双孢蘑菇(Agaricusbisporus) 中的ABH1和粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)中的EAS等；II型疏水蛋白形成的两亲性蛋白膜则相反，可溶解或解聚于2％SDS或60％乙醇等多种有机溶剂中，在冷冻或高压下能解离成单体，如里氏木霉中的HFB I、HFB II和荷兰榆树病菌(Ophiostoma ulmi)中的CU等。由于疏水蛋白独特的物理特性，已被针对性的开展应用领域的研究，如来自瑞氏木霉(T.reesei)的 HFBⅠ、HFBⅡ被用于蛋白分离剂、乳化剂及包被材料等。

近年来研究发现，疏水蛋白能作为激发子诱导植物ISR，如长枝木霉(T.longibrachiatum) HYTLO1能够激活百脉根ISR相关的防御反应，包括活性氧爆发、提高SOD、PPO、POD等抗逆性相关酶的活性、提高植物抗毒素以及病程相关蛋白表达等。棘孢木霉(T. asperellum)HBF2-6可诱导杨树JA和生长素信号途径相关基因高效表达。哈茨木霉hyd1能够诱导玉米的ISR，提高玉米对茎腐病及叶斑病的抗性。

激发子引起植物的防御反应分为两个阶段。第一阶段发生在激发子作用于植物的几分钟内，包括活性氧(ROS)爆发、形成NO、离子流跨越细胞膜、胞外介质碱化等。第二个阶段发生在激发子与植物识别后的几小时到几天内，诱导植物产生多种防御信号，包括PR蛋白的表达、诱导次级代谢产物如胼胝质、酚类物质和木质素等积累、抗逆性相关酶基因的上调表达及酶活性提高，如苯丙氨酸解氨酶(Phenylalnine ammonialyase，PAL)及PPO、SOD、POD等、(Blumwald et al.,1998)。PR蛋白具有较高的稳定性可以在植物体内运输和积累，作用于特定的组织部位随着这些植物防御反应事件的发生，激发子最终激活植物的防御体系，产生系统抗性。

有关木霉菌激发子诱导植物ISR的信号传递研究积累相对贫乏。因此本领域亟需开发更多的可诱导植物ISR的新的激发子和诱导剂。

发明内容

基于本领域上述迫切需求，本发明提供一种木霉菌疏水蛋白及其氨基酸序列以及该蛋白的应用。

本发明的技术方案如下：

一种木霉菌疏水蛋白Thfb6，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1。

所述的一种木霉菌疏水蛋白Thfb6的cDNA序列如SEQ ID NO.2。

所述的一种木霉菌疏水蛋白Thfb6为保藏号为CGMCC No.19906的木霉菌Trichoderma harzianum菌株NM11分泌的疏水蛋白。

一株哈茨木霉Trichoderma harzianum菌株NM11，其特征在于，其保藏号为CGMCCNo. 19906。

一种植物ISR激发子，其特征在于，包括，所述的一种木霉菌疏水蛋白Thfb6，和/或，所述的哈茨木霉Trichoderma harzianum菌株NM11分泌的木霉菌疏水蛋白Thfb6。

所述的植物ISR激发子为异源表达的木霉菌疏水蛋白Thfb6；

优选地，所述异源表达载体选自：原核表达载体、或，真核表达载体；

所述原核表达载体选自pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-32a、pET-32b、pET-32c；

所述真核表达载体选自：pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC；pPIC9；pHIL-S1；pPIC9K；

优选地，所述植物ISR激发子为可表达木霉菌疏水蛋白Thfb6的转化体；

优选地，所述转化体的宿主为大肠杆菌E.coli、毕赤酵母Pichia pastoris；

更优选地，所述宿主为E.coli BL21 DE3菌株、E.coli Rosetta2 DE3菌株、毕赤酵母 KM71H菌株、GS115、X-33菌株；

优选地，所述植物ISR激发子还包括缓冲液；所述缓冲液优选Tris-HCl缓冲液；

优选地，所述植物ISR激发子为pH8.0、浓度为20umol/L的木霉菌疏水蛋白Thfb6的20mM Tris-HCl溶液；

更优选地，所述植物为烟草、黄瓜。

除烟草、黄瓜外，本领域技术人员可基于本发明记载的内容将该蛋白应用于其它种属或类别的植物中用于激发植物ISR，并能获得与本发明类似的预期的ISR激发效果。

一种植物ISR激发方法，其特征在于，采用所述的木霉菌疏水蛋白Thfb6，和/或，所述的哈茨木霉Trichoderma harzianum菌株NM11分泌的木霉菌疏水蛋白Thfb6，和/或，所述的植物ISR激发子处理植物；

优选地，所述处理指，使所述的木霉菌疏水蛋白Thfb6，和/或，所述的植物ISR激发子渗入植物体内；

更优选地，所述渗入植物体内指通过注射进入植物叶片内，或，通过喷施在叶片表面渗入，所述植物为烟草、黄瓜。

一种TMV抗性诱导剂，其特征在于，包括：所述的木霉菌疏水蛋白Thfb6，和/或，所述的植物ISR激发子。

一种TMV抗性诱导方法，其特征在于，采用所述的木霉菌疏水蛋白Thfb6，和/或，所述的哈茨木霉Trichoderma harzianum菌株NM11分泌的木霉菌疏水蛋白Thfb6，和/或，所述的植物ISR激发子处理烟草。

所述处理指，将所述的木霉菌疏水蛋白Thfb6，和/或，所述的植物ISR激发子注射进入烟草植株体内；

更优选地，所述注射指注射进烟草植株的叶片内。

本发明活化前期筛选的一株具有防治多种植物病害的木霉菌TrichodermaHarzianum菌株NM11，提取Trichoderma Harzianum NM11的总RNA，并合成cDNA，以cDNA为模板，采用PCR技术，克隆获得疏水蛋白Thfb6的cDNA序列；通过序列比对和分析，确定Thfb6为一种II型疏水蛋白；

利用pET-28a载体，构建Thfb6的原核表达载体，在E.coli BL21(DE3)中诱导表达并纯化，获得重组蛋白Thfb6。优化的重组蛋白诱导表达条件为：培养温度28℃，IPTG诱导浓度为0.5mM，转速200rpm，诱导时间4h；

将Thfb6重组蛋白处理三生烟(N.tabacum cv.Samsun NN)叶片及其悬浮细胞。分析Thfb6 蛋白处理后叶片表面坏死斑、活性氧爆发、代谢产物检测等，明确Thfb6能够诱导烟草早期免疫防御反应；检测Thfb6处理后烟草叶片的PAL、POD、PPO酶活性检测；检测Thfb6处理后烟草叶片中防御相关基因的PR-1b、NPR1以及PAL的表达量；开展Thfb6诱导三生烟抑制烟草花叶病毒(TMV)侵染的研究，明确Thfb6具有诱导烟草提高抗烟草花叶病毒的能力；开展Thfb6诱导黄瓜抗枯萎病研究。确定Thfb6为一种能够诱导植物防御反应的蛋白类激发子。

本发明通过大量筛选，获得一株对镰刀菌、立枯丝核菌、疫霉菌等均有较强拮抗作用的哈茨木霉NM11菌株，同时克隆了该菌株的部分基因，其中Thfb6编码II型疏水蛋白。通过利用大肠杆菌表达系统异源表达并纯化的Thfb6蛋白处理烟草叶片，发现该蛋白能够引起烟草叶片发生活性氧爆发、诱导细胞胞外碱化、胼胝质和酚类物质积累等早期防御反应，提高叶片中PAL、POD、PPO等抗逆性酶活性提高，诱导病程相关蛋白基因PR-1b、系统抗性标记基因NPR1以及防御反应关键酶基因PAL的表达，并诱导烟草提高对烟草花叶病的抗病性，此外还发现，Thfb6能诱导黄瓜对枯萎病抗性，证实Thfb6具有诱导植物系统抗性的激发子功能，有重要的研究开发潜力。本发明为进一步研究和利用木霉菌基因资源、开发新型植物诱抗剂、安全高效地防治植物病害奠定了基础。

本发明的木霉菌Trichoderma harzianum菌株NM11的保藏信息如下：

命名：NM11

分类名称：哈茨木霉

拉丁名称：Trichoderma harzianum

保藏号：CGMCC No.19906

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2020年6月1日

附图说明

图1为NM11菌株总RNA提取的电泳图片。

图2为疏水蛋白Thfb6基因cDNA片段电泳检测，其中，M：250bp DNA LadderMarker。

图3为本发明的一个实施例提供的可表达Thfb6的原核表达载体pET-fb6。

图4为本发明的一个实施例提供的重组疏水蛋白Thfb6的分离纯化SDS-PAGE结果。其中，M：marker；1：含有空载体pET-28a的细胞破碎液上清；2：Thfb6表达菌株的破碎液沉淀；3：Thfb6表达菌株破碎液上清过Ni柱滤液；4-6：纯化蛋白Thfb6；7：Thfb6表达菌株的破碎液上清。

图5为本发明另一个实施例提供的Thfb6处理的烟草及空白对照处理的对比照片，其中， A：20mM Tris-HCl；B：Thfb6处理。

图6为本发明另一个实施例提供的Thfb6处理烟草及空白对照处理的细胞活性氧检测对比结果，其中，A：20mM Tris-HCl；B：Thfb6处理。

图7为本发明一个实施例提供的Thfb6处理烟草及对照处理的叶片胼胝质检测对比结果，其中，A：20mM Tris-HCl；B：Thfb6处理。

图8为本发明一个实施例提供的Thfb6处理和对照处理的烟草悬浮细胞酚类检测对比结果，其中，A：20mM Tris-HCl；B：Thfb6处理。

图9为本发明一个实施例提供的Thfb6处理和对照处理的烟草悬浮细胞胞外碱化测定结果，其中，CK：20mM Tris-HCl。

图10为本发明一个实施例提供的Thfb6处理和对照处理的Thfb6诱导烟草苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性变化对比。

图11为本发明另一个实施例提供的Thfb6处理和对照处理的Thfb6诱导烟草多酚氧化酶 (PPO)活性变化对比。

图12为本发明另一个实施例提供的Thfb6处理和对照处理的Thfb6诱导烟草过氧化物酶 (POD)活性变化对比。

图13为本发明另一个实施例提供的Thfb6处理和对照处理的Thfb6诱导烟草防御相关基因的表达对比。

图14为本发明另一个实施例提供的Thfb6处理和对照处理的Thfb6诱导黄瓜幼苗抗枯萎病实验对比。

具体实施方式

下面结合附图，通过具体的实施例和实验例对本发明做进一步的详细描述，但并不以此限制本发明的保护范围。

生物材料的来源

烟草、黄瓜种子可商购获得；TMV-GFP由清华大学刘玉乐教授馈赠、黄瓜枯萎病菌(F.oxsporum)均可商购获得。

表达载体、宿主细胞E.coli BL21(DE3)可商购获得。

本发明实验例部分使用的全部试剂均可商购获得。

第1组实施例、本发明的木霉菌疏水蛋白Thfb6

本组实施例提供一种木霉菌疏水蛋白Thfb6，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1。

更具体的实施例中，所述木霉菌疏水蛋白Thfb6的cDNA序列如SEQ ID NO.2。

在优选的实施例中，其为木霉菌Trichoderma Harzianum菌株NM11分泌的疏水蛋白。

本发明经大量实验研究发现，木霉菌属有不同的菌种和菌株，各不同木霉菌中疏水蛋白基因数及序列差异较大，只有本发明提供的该菌株的Thfb6具有ISR激发子功能。具体的ISR 激发子功能验证数据详见下述实验例2-7。

第2组实施例、本发明的植物ISR激发子

本组实施例提供一种植物ISR激发子，其特征在于，包括，第1组实施例任一项提供的一种木霉菌疏水蛋白Thfb6。

在优选的实施例中，所述的植物ISR激发子为异源表达的木霉菌疏水蛋白Thfb6；

在一些具体的实施例中，所述异源表达载体选自：原核表达载体、或，真核表达载体；

所述原核表达载体选自pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-32a、pET-32b、pET-32c；

所述真核表达载体选自：pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pPIC9；pHIL-S1；pPIC9K。

本发明异源表达载体不局限于上面所述的载体，本领域技术人员可根据实际需要，对载体进行常规选择或改造调整。

在另一些实施例中，所述植物ISR激发子为可表达木霉菌疏水蛋白Thfb6的转化体；

在优选的实施例中，所述转化体的宿主为大肠杆菌、毕赤酵母；

在更优选的实施例中，所述宿主为E.coli BL21 DE3菌株、E.coli Rosetta2 DE3菌株、毕赤酵母KM71H菌株、GS115菌株、X-33菌株；

在具体的实施例中，所述植物ISR激发子还包括缓冲液；所述缓冲液优选Tris-HCl缓冲液；

在进一步的实施例中，所述植物ISR激发子为pH8.0、浓度为20umol/L的木霉菌疏水蛋白Thfb6的20mM Tris-HCl溶液；

在更具体的实施例中，所述植物为烟草、黄瓜。

除烟草、黄瓜外，本领域技术人员可基于本发明记载的内容将该蛋白应用于其它种属或类别的植物中用于激发植物ISR，并能获得与本发明类似的预期的ISR激发效果。

第3组实施例、本发明的植物ISR激发方法

本组实施例提供一种植物ISR激发方法，其特征在于，采用第1组实施例任一项提供的木霉菌疏水蛋白Thfb6，和/或，第2组实施例任一项所述的植物ISR激发子处理植物；

在具体的实施例中，所述处理指，将所述的木霉菌疏水蛋白Thfb6，和/或，所述的植物 ISR激发子注射进入植物体内；

在更优选的实施例中，所述注射指注射进植物叶片内，所述植物为烟草、黄瓜。

第4组实施例、本发明的TMV抗性诱导剂

本组实施例提供一种TMV抗性诱导剂，其特征在于，包括：第1组实施例任一项提供的所述木霉菌疏水蛋白Thfb6，和/或，第2组实施例任一项提供的所述的植物ISR激发子。

第5组实施例、本发明的TMV抗性诱导方法

本组实施例提供一种TMV抗性诱导方法，其特征在于，采用第1组实施例任一项提供的所述的木霉菌疏水蛋白Thfb6，和/或，第2组实施例任一项提供的所述的植物ISR激发子处理烟草。

在一些具体的实施例中，所述处理指，将所述的木霉菌疏水蛋白Thfb6，和/或，所述的植物ISR激发子注射进入烟草植株体内；

在更优选的实施例中，所述注射指注射进烟草植株的叶片内。

实验例1、疏水蛋白Thfb6基因cDNA的克隆、异源表达及纯化

1.Trichoderma Harzianum NM11总RNA的提取及cDNA合成

将哈茨木野生菌NM11接种到PDA培养基上，28℃恒温培养3d，用直径0.5cm的打孔器打取菌饼，取3～5个菌饼接种到含100mL PD液体培养基的三角瓶中，28℃恒温震荡培养48h，收集菌丝，采用RNA提取试剂盒(TRNzol Universal Reagent)提取总RNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量(图1)。使用天根FastQuant RT Kit(With gDNAase)合成cDNA 第一链。

2.疏水蛋白基因Thfb6 cDNA克隆、测序及分析

根据前期获得的Thfb6基因序列，设计疏水蛋白基因Thfb6特异性PCR引物，F：5’ -ATGAAGTTCTCTGCCATCGCTC-3’(SEQ ID No.3)，R：5’ -TTACTGGGGAAGGGCATCCTGGC-3’(SEQID No.4)。以cDNA为模板，进行PCR扩增。 PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳纯化后，切胶回收，回收产物即为疏水蛋白cDNA(SEQ ID No. 2)。用微量紫外分光光度计(NanoPhotometer-NP80)检测样品浓度并稀释至克隆所需浓度，再与pEASY-T5载体连接，42℃热激转入E.coliTrans1-T1感受态细胞中，挑取阳性单克隆进行测序验证，获得的Thfb6 cDNA全长序列309bp，编码102个氨基酸(SEQ ID No.1)。利用 Signal P 4.1分析Thfb6信号肽切割位点为21/22。

3.Thfb6基因原核表达载体构建

根据Signal P4.1预测结果以及In-fusion克隆要求，设计特异性引物，D6F：5’ -CGAGCTCCGTCGACAAGCTTTCACTCAGGAGCACCAGTTCGATATC-3’(SEQ ID No.5)，和PET-D6R：5’-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTACTGGGGAAGGGCATCCTGGCAC-3’ (SEQ ID No.6)。PCR扩增疏水蛋白基因cDNA去信号肽片段，与经Hind III/Xho I双酶切后的原核表达载体pET-28a连接，构建Thfb6表达载体pET-fb6(图3)，将pET-fb6及pET-28a 空载体分别转入E.coli BL21(DE3)中，菌液PCR及单酶切确定阳性单克隆，经测序验证原核表达菌株，保存备用。

3疏水蛋白诱导表达及纯化

在LB培养基(含Kam 50μg/mL)中分别培养含pET-fb6及pET-28a空载体的E.coliBL21 (DE3)，培养新鲜菌液至OD₆₀₀＝0.6-0.8，加入IPTG诱导表达重组蛋白。调整IPTG浓度、诱导时间和温度等条件，确定优化的疏水蛋白诱导表达条件为：培养温度28℃，IPTG诱导浓度为0.5mM，转速200rpm，诱导时间4h。诱导后的菌液5000rpm离心3-5min获得菌体，用20mM/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液重悬菌体，置于冰上进行超声波细胞破碎，4℃3500rpm 离心，获得细胞破碎液上清和沉淀，沉淀用20mM Tris-HCl(pH 8.0)重悬，分别吸取100μL 细胞破碎液上清和重悬沉淀，加入适量蛋白Loading Buffer，沸水浴10min进行蛋白变性，离心2min后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE) 检测(图4)。分离胶浓度为15％，电泳电压及时间：80V 15min后120V 55min。

为大量表达和纯化Thfb6重组蛋白，将新鲜表达菌株种子液转接到20mL LB培养基中继续培养，按照1:100的比例接种到含400mL LB的1L锥形瓶中，37℃230rpm培养3h左右至OD₆₀₀＝0.8，加IPTG诱导，诱导结束后，离心获得菌体，冰上超声波破碎，离心得到的上清液经0.45μm水洗滤膜过滤处理后，利用

Ni-NTA Resin填充的重力柱进行纯化，最后获得纯化的疏水蛋白Thfb6。取30μL蛋白液进行SDS-PAGE，检测蛋白纯度及大小。利用Modified BCA Protein Assay Kit测定蛋白浓度。

实验例2、疏水蛋白诱导烟草早期防御反应

1、疏水蛋白诱导烟草叶片细胞坏死

三生烟(N.tabacum cv.Samsun NN)播种两周后，移栽单株至单一小盆内，光照培养箱 25℃恒温培养，生长6周后，挑选健康的烟苗，将上述获得的Thfb6重组蛋白溶液(即pH8.0、含有浓度为20μmol/L的Thfb6重组蛋白的20mM Tris-HCl溶液)做为实验组，用1mL无针头的一次性注射器于烟草叶背面轻轻注入叶片中，观察烟草叶片反应，对照组为等量的缓冲液(即pH8.0、20mM Tris-HCl溶液)。24h后观察，Thfb6能够引起烟草叶片细胞坏死(图5)。

缓冲液的配制：1.配1M Tris-HCl(pH8.0)母液。称取121.1g Tris-Base，加入700ml双蒸水，完全溶解后，加入浓盐酸调节pH至8±0.01。加双蒸水容至1L，0.45μm滤膜过滤，保存。进一步用双蒸水稀释至20mM，即为20mM Tris-HCl。该缓冲液为蛋白提取纯化时常用的缓冲液。

2、Thfb6诱导烟草活性氧积累

采用二氨基联苯胺(DAB)组织染色法检测ROS爆发情况：分别采用前述的Thfb6重组蛋白溶液(实验组)及缓冲液(对照组)分别处理24h后的烟草叶片，蒸馏水冲洗干净，放入DAB-HCL染色液(1mg/mL，PH＝3.8)中，抽真空使染色剂浸没烟草叶片，黑暗室温条件下孵育1-2h。倒掉染色液，用95％乙醇浸泡叶片，沸水浴10min，重复1-2次使叶片中叶绿素全部脱去，用70％甘油浸泡叶片，置于载玻片上，显微镜观察。DAB染色后，对照组缓冲液处理的烟草叶片呈暗灰色，而Thfb6处理的烟草叶片能观察到明显的砖红色样的物质积累(图6)，表明Thfb6处理烟草，能够使烟草产生活性氧(主要为过氧化氢)与DAB结合产生红褐色物质。

3、疏水蛋白诱导烟草胼胝质积累

胼胝质是植物发生防御反应的重要指标之一。利用苯胺蓝染色法检验Thfb6处理后烟草叶片胼胝质的累积：分别摘取采用前述的Thfb6重组蛋白溶液(实验组)及缓冲液(对照组) 分别处理24h后的烟草叶片，置于乙酸/乙醇＝1/3(V/V)的溶液中脱色，待叶片脱色完全后放到0.07M磷酸氢二钾-苯胺蓝(0.1％)溶液中染色过夜，然后切成小块，置于荧光显微镜下观察。能够观察Thfb6处理后的烟草叶片呈现点状荧光，即为胼胝质。缓冲液处理的烟草叶片没有出现胼胝质积累(图7)。

4、Thfb6诱导烟草悬浮细胞酚类物质积累

制备烟草悬浮细胞：在MS固体培养基中，培养烟草无菌苗。取无菌苗幼嫩叶片置于MS 固体培养基中，遮光培养7天(25℃)，得到烟草愈伤组织。将疏松的愈伤组织移至BY-2液体培养基中，置于摇床设置条件为：25℃，130rmp，遮光培养。每7天烟草悬浮培养细胞与BY-2新鲜培养基在超净台中按1:10继代一次，取生长约5天处于对数生长期的细胞用于后续实验。

烟草悬浮细胞(BY-2)培养基：蔗糖30g，KH2PO4 2g，MS盐4.3g，VB1盐酸噻胺1ml，肌醇(50mg/ml)2ml，2,4-D(1mg/ml)200ul，定容至1L，用KOH调至pH＝5.2，每瓶分装100ml，115℃高压蒸汽灭菌20min

取300μL生长约5天处于对数生长期的烟草悬浮细胞，实验组加入50μL的Thfb6重组蛋白溶液，对照组加入50uL缓冲液，于26℃，120rpm，暗培养108h后，用蛋白缓冲液20 mMTris-HCl冲洗两次，然后取少量悬浮细胞滴在载玻片上，用激发波长为365nm的紫外荧光显微镜观察悬浮细胞中酚类物质的积累。酚类物质如阿魏酸、木质素、东莨菪亭、东莨菪苷等会在紫外光的激发下显示蓝色荧光，显示Thfb6处理后的烟草悬浮细胞有酚类物质积累(图8)。

5、疏水蛋白诱导烟草悬浮细胞胞外介质的碱化

取1mL浓度为1g/mL的烟草悬浮细胞于灭菌的10ml塑料试管中，置于摇床中(25℃，150rpm)孵育45min，待其pH稳定至5.35-5.4，加入终浓度为10μM的Thfb6，继续孵育。用pH检测仪每10min检测培养基的pH，持续监测160min。以20mM Tris-HCl蛋白缓冲液为阴性对照，每个处理重复三次。

结果显示，实验组Thfb6重组蛋白溶液处理的烟草悬浮细胞pH从10min内有轻微下降，之后在20min内迅速升高至5.5，之后缓慢升高到5.65，之后迅速下降。而对照组缓冲液处理对pH的影响都在5.35-5.4之间波动，未出现明显上升(图9)。实验结果说明，Thfb6可以诱导烟草悬浮细胞胞外介质的碱化，调节植物细胞内外的离子流动。

实验例3、Thfb6诱导烟草叶片抗逆性酶活性

1、Thfb6诱导烟草苯丙氨酸解氨酶活性提高

苯丙氨酸解氨酶(phenylalaninammo－nialyase，PAL)是植物体内苯丙烷代谢途径的关键酶，其活性高低控制着植物体内多种次生酚类化合物、类黄酮植保素、木质素等抗菌物质的合成，因此PAL在植物的次生代谢和抗病代谢中具有重要作用，是植物防御反应中的关键酶。研究发现，许多植物在遭受外部伤害时，植物的防卫系统特别是苯丙烷类代谢被激活，PAL活性迅速上升，因此PAL活性可以作为植物抗防御能力的一个生理指标。

选取2.5月龄的烟草植株，实验组用50μL的Thfb6重组蛋白溶液处理烟草叶片，缓冲液为对照组，每个处理10株。处理后0d、1d、3d、5d、7d分别取处理叶片的上一位叶，称取2g叶片组织，活性测定采用PAL检测试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司PAL-1-Y)，按说明书进行操作。以每g组织在每mL反应体系中每min使290nm下吸光值变化0.1 为一个酶活性单位。结果如图10，实验条件下，实验组Thfb6处理后烟草叶片中PAL酶活性显著增加，处理后第5d达到最高值，约为对照组的5.75倍。

2、Thfb6诱导烟草多酚氧化酶(PPO)活性变化

植物体中的多酚氧化酶，可以将植物受到病原菌侵染时产生的酚类物质氧化为毒性更强的醌类物质，以此来形成植物防御的生理保障，抑制病原菌的进一步危害。选取2.5月龄的烟草植株，实验组用50μL的Thfb6重组蛋白溶液处理烟草叶片，蛋白缓冲液为对照，每个处理10株。对照采用缓冲液，处理后0d、1d、3d、5d、7d分别取处理叶片的上一位叶，称取2g叶片组织，活性测定采用PPO检测试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司PPO-1-Y)，按说明书进行操作。PPO活性计算按每分钟每g组织在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单单位。检测结果如图11：实验条件下，Thfb6处理后烟草叶片中PPO活性增加，在处理后第3d达到最高值，约为对照的5.6倍。

3.Thfb6诱导烟草过氧化物酶(POD)活性变化

过氧化物酶在植物体内多以过氧化物酶体的形式存在，主要作用是使毒性物质失去活性，调节体内氮素物质，同时在种子中参与乙醛酸循环氧化脂肪为种子的萌发提供营养物质。叶片处理同前，采用试剂盒检测POD酶活性(苏州科铭生物技术有限公司POD-1-Y)，POD 活性按每g组织在每mL反应体系中每分钟470nm下吸光值变化0.01为一个酶活力单位。结果如图12，实验条件下，实验组用Thfb6重组蛋白溶液处理后烟草叶片中POD活性显著增加，处理后第3d达到最高值，约为对照组(采用的缓冲液)的2.6倍。

实验例4、Thfb6诱导烟草防御相关基因的表达

利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测烟草防御相关基因的表达。首先用Thfb6重组蛋白溶液(实验组)和缓冲液(对照组)分别处理烟草植株的三片叶，之后连续5d取处理叶片的上三片叶，检测病程相关蛋白基因PR-1b，系统抗性标记基因NPR1以及防御反应关键酶基因PAL的相对表达水平，以EF-1α为内参基因，每个处理重复三次。利用Beacon Designer8软件，根据Genbank中PR-1b、NPR1、PAL、EF-1α基因的序列设计引物(表1)以择EF-1α基因为内参基因。

表1防御相关基因特异性引物

实验结果显示：病程相关蛋白基因PR-1b的相对表达量在Thfb6处理后的3天后明显上调表达。 PR-1b在Thfb6处理后的第5d较对照提高了9.6倍(图13最左侧图表)。对照处理的烟草植株， PR-1b的相对表达量也有小幅提高，这可能是由于注射时的机械损伤引起的短暂防御反应；系统抗性标记基因NPR1，在激发子诱导第4天，表达量迅速增加，缓冲液处理组没有明显变化 (图13中间图表)。PAL基因在Thfb6诱导1d后即表现出上调表达，第3d达到最高，其相对表达量是对照的5.6倍，之后出现下降趋势(图13最右侧图表)。以上结果索命，Thfb6能够诱导烟草防御相关基因的表达，证实Thfb6激发烟草植株产生系统性抗性。

实验例5、Thfb6诱导本生烟抑制TMV侵染的实验

培养2月龄烟草苗，取50μL(20μmol/L)Thfb6重组蛋白溶液(实验组)从烟草叶片背面注入，每株烟草苗处理三片叶，每处理6株，以缓冲液作对照组。3d后，在处理叶片的上三片叶接种TMV-GFP(添加了GFP标签的TMV，病斑在紫外灯下呈现绿色荧光)。接种方法如下：取-80℃保存的感染TMV-GFP的本生烟叶片粉末，每克粉末加入10ml水，5000rpm 离心5min，取上清液，用棉棒沾等量病毒溶液均匀涂抹于叶片上表面，处理后的本生烟放在温室中培养。接种后1d、2d、5d，分别在100W长波紫外线灯下观察统计TMV侵染点数及侵染直径。结果见表2：本研究的木霉菌疏水蛋白Thfb6可明显提高植物对TMV的抗性，50ul (20uM)Thfb6处理本生烟叶3d后接种TMV-GFP，对病斑数及病斑直径的最高抑制率分别达到35.44％和41.71％。

表2.Thfb6诱导本生烟抑制TMV侵染实验

实验例6、Thfb6诱导黄瓜幼苗抗枯萎病实验

采用试管苗法检测Thfb6诱导黄瓜的抗病性。培养黄瓜幼苗,将中农6号黄瓜((购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所公司)种子于28℃清水中浸泡4小时，置于铺有无菌纱布的培养皿中，滴加灭菌水保湿，于室温培养4天至长出子叶和根，移植到规格100×10mm的试管中，试管中装有10mL半量MS培养基，自然光下、25-28℃培养10天。试管中加入1mL黄瓜枯萎病菌(F.oxsporum)新鲜菌液，所述黄瓜枯萎病菌菌液为接种黄瓜枯萎病菌于28℃、PD 液体培养基中，150rpm振荡培养3天的新鲜黄瓜枯萎病菌。同时，黄瓜每株幼苗叶片喷施500uL 5mM Thfb6重组蛋白溶液(实验组)，连续喷施3d，对照组使用缓冲液，处理和对照分别使用50株黄瓜苗。继续于28℃、自然光照的条件下培养，实验重复3次。15天后调查黄瓜幼苗的病情分级，各病情分级如下：

0级：无症状，对照1中苗长势最好，叶片大、多、茎粗壮

5级：对照2中苗枯死或长势最差的测试苗

1级：苗长势比0级差，比2级好

2级：苗长势比1级差，比3级好

3级：苗长势比2级差，比4级好

4级：苗长势比3级差，比5级好

病情指数＝[∑(病级株数×代表级数)÷(植株总数×最高代表级值)]×100

防治效果＝(对照病情指数－处理病情指数)÷对照病情指数×100

防治效果如图14，调查统计结果见表3，喷施本发明的Thfb6对黄瓜幼苗的平均防效为 57.07％。显示页面喷施Thfb6能够诱导黄瓜产生系统抗性，提高对根根腐病防御能力，有重要的开发应用价值。

表3Thfb6诱导黄瓜抗枯萎病效果

本发明所有的实验例部分提及的实验组的“Thfb6重组蛋白溶液”为pH8.0、含有浓度为 20μmol/L的Thfb6重组蛋白的20mM Tris-HCl溶液。

对照组的“缓冲液”为pH8.0、20mM Tris-HCl溶液。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种木霉菌疏水蛋白Thfb6及其菌株、植物ISR激发子及激发方法

<130> P200365/ZWB

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 102

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 木霉菌Trichoderma Harzianum疏水蛋白Thfb6氨基酸序列

<400> 1

Met Lys Phe Ser Ala Ile Ala Leu Phe Ala Ser Leu Ala Ile Ala Ala

1 5 10 15

Pro Ala Thr Glu Ala Thr Gln Glu His Gln Phe Asp Ile Tyr Asp Gly

20 25 30

Pro Cys Ser Gly Gly Val Thr Asn Asn Ile Pro Lys Cys Cys Gly Ala

35 40 45

Gly Leu Leu Asp Leu Leu Tyr Leu Asp Cys Glu Thr Pro Asp Glu Val

50 55 60

Thr Ser Pro Leu Asn Pro Leu Asp Ala Val Cys Ala Arg Met Gly Leu

65 70 75 80

Ser Ala Lys Cys Cys Thr Leu Gly Ile Ala Asp Leu Gly Val Leu Cys

85 90 95

Gln Asp Ala Leu Pro Gln

100

<210> 2

<211> 421

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 木霉菌Trichoderma Harzianum疏水蛋白Thfb6基因cDNA序列

<400> 2

atgaagttct ctgccatcgc tctcttcgcc tcgctggcca ttgccgcgcc cgccacggag 60

gccactcagg agcaccagtt cgatatctac gatggtcctt gctcgggcgg cgtcaccaac 120

aacatcccca agtgctgtgg cgctggtctc cttgatctcc tctacctgga ctgcgagact 180

cgtgagtcat caaatgcgtc atctcatgta aagagcatgt gctaataatg cctttagccg 240

atgaagtcac ttctcccctc aaccccctgg acgctgtctg tgctcgcatg ggtctctcgg 300

ccaagtgctg caccctcggc atcgtaagtg ctctcatact ttacgtatct tggataagaa 360

gttactaact agtcttcagg ccgacctcgg tgttttgtgc caggatgccc ttccccagta 420

a 421

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Thfb6特异性PCR引物F

<400> 3

atgaagttct ctgccatcgc tc 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Thfb6特异性PCR引物R

<400> 4

ttactgggga agggcatcct ggc 23

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物D6F

<400> 5

cgagctccgt cgacaagctt tcactcagga gcaccagttc gatatc 46

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物PET-D6R

<400> 6

gtggtggtgg tggtgctcga gttactgggg aagggcatcc tggcac 46

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PAL基因上游引物

<400> 7

actcagtgaa cgacaaccc 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PAL基因下游引物

<400> 8

tcagattaga tggcaaccc 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> β-actin基因上游引物

<400> 9

tgttatggtt ggtatgggtc 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> β-actin基因下游引物

<400> 10

tcagtaagta gcacaggatg c 21

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PR-1b上游引物

<400> 11

tttatgacgg ctgctaagg 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PR-1b下游引物

<400> 12

cctatgacat tacctggagg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NPR1基因上游引物

<400> 13

ctgtatctct tgctatggcg 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NPR1基因下游引物

<400> 14

aatctactgt tgtcctctgt g 21

Claims (4)

1.氨基酸序列如SEQ ID NO.1的木霉菌疏水蛋白Thfb6在诱导烟草抑制TMV侵染、或，诱导烟草提高苯丙氨酸解氨酶活性、或，诱导烟草提高多酚氧化酶活性、或，诱导烟草提高过氧化物酶活性、或，诱导黄瓜幼苗抗枯萎病方面的用途。

2.根据权利要求1所述的氨基酸序列如SEQ ID NO.1的木霉菌疏水蛋白Thfb6在诱导烟草抑制TMV侵染、或，诱导烟草提高苯丙氨酸解氨酶活性、或，诱导烟草提高多酚氧化酶活性、或，诱导烟草提高过氧化物酶活性、或，诱导黄瓜幼苗抗枯萎病方面的用途，其特征在于，其cDNA序列如SEQ ID NO.2。

3.根据权利要求1或2所述的氨基酸序列如SEQ ID NO.1的木霉菌疏水蛋白Thfb6在诱导烟草抑制TMV侵染、或，诱导烟草提高苯丙氨酸解氨酶活性、或，诱导烟草提高多酚氧化酶活性、或，诱导烟草提高过氧化物酶活性、或，诱导黄瓜幼苗抗枯萎病方面的用途，其特征在于，为保藏号为CGMCC No.19906的木霉菌Trichoderma harzianum菌株NM11分泌的疏水蛋白。

4.保藏号为CGMCC No.19906为哈茨木霉Trichoderma harzianum菌株NM11在诱导烟草抑制TMV侵染、或，诱导烟草提高苯丙氨酸解氨酶活性、或，诱导烟草提高多酚氧化酶活性、或，诱导烟草提高过氧化物酶活性、或，诱导黄瓜幼苗抗枯萎病方面的用途。

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