CN110922457A

CN110922457A - 禾谷镰刀菌分泌的植物免疫诱抗蛋白FgPII1及其应用

Info

Publication number: CN110922457A
Application number: CN201911114941.7A
Authority: CN
Inventors: 王源超; 王雨音; 杨波; 郑文跃; 柳泽汉; 杨森
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2019-11-14
Filing date: 2019-11-14
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2039-11-14
Also published as: CN110922457B

Abstract

本发明公开了一种禾谷镰刀菌分泌的植物免疫诱抗蛋白FgPII1及其应用，该蛋白能够激活植物免疫反应，可以作为一种植物免疫诱导因子应用于植物病害的防控。该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。利用工程菌的过量表达可以获得高浓度的蛋白，可以用于激活烟草免疫系统，提高大豆的抗病性，所涉及的植物病害为大豆根腐病。该植物免疫诱抗蛋白不仅能够显著激活植物免疫，提高植物抗病性，而且见效快、浓度低。FgPII1为提高植物抗病性、防治植物病害提供了新的途径。

Description

禾谷镰刀菌分泌的植物免疫诱抗蛋白FgPII1及其应用

技术领域

本发明设计生物技术领域，具体地，涉及一种禾谷镰孢菌分泌的植物免疫诱抗蛋白及其应用。

背景技术

禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)是一种极具毁灭性的病原真菌，能够侵染小麦、大麦、大豆等多种植物，导致小麦赤霉病、大豆根腐病等病害的发生，给农业生产造成了巨大损失(O’Donnell et al.,2004)。由于生产上缺少针对禾谷镰孢菌的抗病品种，所以对于该病菌引起的植物病害主要依靠化学防治。然而，大量的使用化学农药带来了农业生产成本增加、植物药害、农残超标、病原抗药性、环境污染等一系列问题，不仅严重制约了农业的可持续发展，而且危及人类健康。

随着技术的进步和研究水平的提高，科学家逐渐解析了植物免疫的相关机制，发现植物具有完备的免疫系统(Jones and Dangl,2006)。在病原菌入侵植物的过程中，植物细胞表面的模式识别受体(Pattern Recognition Receptors,PRRs)会识别病原菌分泌的胞外因子，激活植物的基础免疫。这些能够激活植物免疫的胞外因子通常被称为植物免疫激发子(Plant Immunity Inducer，PII)。植物免疫激发子在许多微生物中广泛存在，且对微生物的适应和生存起着重要作用。植物免疫激发子通常是一类非常保守的物质，主要包括多肽、蛋白、寡糖、脂质等类型(Boutrotand Zipfel.,2017)。目前，随着绿色农药概念的提出和发展，开发高效环保的生物农药是农药未来发展的趋势，应用植物免疫的原理防治农作物的病虫害成为植物保护领域的重要发展方向，鉴定病原菌分泌的新型植物免疫诱抗蛋白也成为了国内外研究人员关注的焦点。

大量文献表明，在镰刀菌侵染植物的早期，能够诱导植物免疫反应(Rep et al.,2004；Houterman et al.,2008；Shcherbakova et al.,2016；Thynne et al.,2017)。因此，鉴定禾谷镰刀菌分泌的新型植物免疫诱抗蛋白，不仅能够揭示禾谷镰刀菌与植物互作机理，而且能为开发激活植物免疫的蛋白质类生物农药提供有效的蛋白资源。

参考文献

Boutrot F and Zipfel C.Function,discovery,and exploitation of plantpattern recognitionreceptors for broad-spectrumdisease resistance.Annu.Rev.Phytopathol.2017.55:257–86.

Houterman PM,Cornelissen BJC and Rep M.Suppression of plantresistance gene-based immunity by a fungal effector.Plos Pathogens,2008,4(5):e1000061.

Jones JD and Dangl JL.The plant immune system.Nature,2006,444(7117):323-329.

O’Donnell K,Ward TJ,Geiser DM,et al.Genealogical concordance betweenthe mating type locus and seven other nuclear genes supports formalrecognition of nine phylogenetically distinct species within the Fusariumgraminearum clade.Fungal Genet.Biol.,2004,41:600-623.

Rep M,Van Der Does H C,Meijer M,et al.A small,cysteine-rich proteinsecreted by Fusarium oxysporum during colonization of xylem vessels isrequired for I-3-mediated resistance in tomato.MolecμLar Microbiology,2004,53(5):1373-1383.

Shcherbakova LA,Odintsova TI,Stakheev AA,et al.Identification of anovel small cysteine-rich protein in the fraction from the biocontrolFusarium oxysporum strain CS-20that mitigates Fusarium wilt symptoms andtriggers defense responses in tomato.Frontiers in Plant Science,2016,6.

Thynne E,Saur IML,Simbaqueba J,et al.Fungal phytopathogens encodefunctional homologues of plant rapid alkalinization factor(RALF)peptides.MolecμLar Plant Pathology,2017,18(6):811-824.

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种禾谷镰刀菌分泌的植物免疫诱抗蛋白FgPII1。

本发明的目的之二在于提供一种编码禾谷镰刀菌分泌的植物免疫诱抗蛋白FgPII1的基因序列。

本发明的目的之三在于提供一种含有植物免疫诱抗蛋白FgPII1编码基因的重组表达载体。

本发明的目的之四在于提供一种禾谷镰刀菌分泌的植物免疫诱抗蛋白FgPII1及其基因的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种禾谷镰刀菌分泌的植物免疫诱抗蛋白FgPII1，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物免疫诱抗相关的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。

编码上述植物免疫诱抗蛋白FgPII1的基因；该基因为如下(1)或(2)：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)与SEQ ID NO.1至少具有70％以上的同源性的核苷酸序列；优选为与SEQ IDNO.1至少具有80％以上的同源性的核苷酸序列；进一步优选为与SEQ ID NO.1至少具有85％以上的同源性的核苷酸序列；更进一步优选为与SEQ ID NO.1至少具有90％以上的同源性的核苷酸序列；最优选为与SEQ ID NO.1至少具有95％以上的同源性的核苷酸序列。

含有上述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

上述的重组载体为在pGEX-4T-2中插入FgPII1的编码基因得到的原核表达载体。该原核表达载体可用于大肠杆菌Rossetta(DE3)表达。得到分子量约41KD的融合表达蛋白(GST-FgPII1)，能够诱导烟草、大豆等植物产生抗性反应，提高植物免疫力，降低镰刀菌、终极腐霉菌和大豆疫霉菌引起的大豆根腐病的危害。

利用本发明的FgPII1氨基酸序列，可以设计和人工合成密码子优化的有利于在大肠杆菌中表达的核酸序列。

上述的植物免疫诱抗蛋白FgPII1、上述的编码基因或者上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在诱导植物防卫反应及提高植物抗病性中的应用。

所述的抗病性为抗镰刀菌、终极腐霉菌和大豆疫霉菌引起的植物病害。所述植物为烟草、大豆等。

一种防治植物病害的方法，用上述的植物免疫诱抗蛋白FgPII1处理植物防治由镰刀菌、终极腐霉菌和大豆疫霉菌引起的植物病害。

本发明提供的植物免疫诱抗蛋白FgPII1在诱导植物防卫反应及提高植物抗病性中的应用。所述的抗病性为抗镰刀菌、终极腐霉菌和大豆疫霉菌引起的植物病害，例如大豆根腐病。当用于诱导植物抗性，减轻大豆根腐病危害时，所述FgPII1的浓度为1nM。

本发明所述的植物免疫诱抗蛋白，可以是通过基因工程技术原核表达得到的蛋白，也可以是利用禾谷镰刀菌培养液纯化得到的蛋白质。具有相同的效果。

本发明的有益效果为：

该植物免疫诱抗蛋白可显著提高植物的抗病性，使用浓度低，见效快，作用时间长。FgPII1利用植物自身的免疫系统，为提高植物抗性提供了新的途径，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为在烟草叶片上表达植物免疫诱抗蛋白FgPII1后诱导的烟草叶片的过敏性坏死检测；

图2为检测FgPII1是否在烟草叶片上正常表达的Western blot检测图，所用抗体为anti-HA；

图3为通过原核表达系统表达并纯化后得到的植物免疫诱抗蛋白FgPII1的Western blot检测图，所用抗体为anti-GST；

图4为植物免疫诱抗蛋白FgPII1注射处理烟草叶片后，诱导烟草抗病相关基因的表达；

图5为植物免疫诱抗蛋白FgPII1处理大豆下胚轴后，接种大豆疫霉菌的发病症状图；

图6为植物免疫诱抗蛋白FgPII1处理大豆下胚轴并接种大豆疫霉菌后的生物量统计图；

图7为植物免疫诱抗蛋白FgPII1处理大豆下胚轴后，接种禾谷镰孢菌的发病症状图；

图8为植物免疫诱抗蛋白FgPII1处理大豆下胚轴并接种禾谷镰孢菌后的生物量统计图；

图9为植物免疫诱抗蛋白FgPII1处理大豆下胚轴后，接种终极腐霉菌的发病症状图；

图10为植物免疫诱抗蛋白FgPII1处理大豆下胚轴并接种终极腐霉菌后的生物量统计图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。本发明实施例所涉及引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

实施例1.植物免疫诱抗蛋白FgPII1的分离与鉴定

将禾谷镰刀菌接种于PDA(取去皮马铃薯200g，切成小块，加超纯水煮沸30min，用四层纱布过滤除去马铃薯块，向滤液中加入葡萄糖20g，琼脂粉15g，将滤液用超纯水补足至1000mL，溶化后分装，121℃高压蒸汽灭菌30min)平板上，25℃条件下培养7天，挑取菌落边缘处接种于200mL装有PDB(配方同PDA培养基，琼脂粉不加)液体培养基的500mL三角瓶中，置于25℃、180r/min的摇床中培养5天，得到禾谷镰刀菌的培养液。取培养滤液在4℃、8000rpm条件下离心30min，收集上清液，用0.22μM的滤膜(Whatman)进一步过滤去除杂质。收集50mL培养液所得滤液送至深圳华大基因公司进行蛋白质组学分析。基于禾谷镰刀菌基因组已经测序完成，将蛋白质组学分析所得的数据比对禾谷镰刀菌蛋白质数据库，确定了培养滤液中的7个禾谷镰刀菌分泌的候选蛋白。

实施例2.植物免疫诱抗蛋白FgPII1编码基因的克隆与植物瞬时表达

(1)总RNA提取：以液体培养的禾谷镰刀菌菌丝为材料，总RNA的抽提采用Omega公司RNA提取试剂盒按照说明操作，用分光度计检测其RNA含量和质量。

(2)反转录生成第一链：取0.5μg RNA作模板，根据Takara公司PrimeScript反转录酶配套试剂使用说明进行cDNA合成，定容至20μL反应。取适量的反转录产物用于随后的基因克隆PCR。

(3)以cDNA第一链为RT-PCR模板，常规方法做PCR，扩增FgPII1编码基因的全长：

PCR引物扩增序列：

上游引物：SEQ ID NO.3

(5’-CAGCTAGCATCGATTCCC ATGCTCTTCTTCAAGTCTAT-3’)

下游引物：SEQ ID NO.4

(5’-AATCTCTAGAGGATCCCC GCTAGTGCCAGTGCAGCCA-3’)，

50μL反应体系为，其中5×buffer 10μL，2.5mM dNTPs 4μL,TakaraPrimerSTARTaq酶0.5μL,模板cDNA 1μL，加水至50μL；PCR扩增程序为98℃预变性3min，98℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸30秒，循环35次，72℃延伸10min；利用琼脂糖凝胶电泳及溴化乙锭(EB)染色检测所得条带是否为目的条带，并进一步切胶回收FgPII1编码基因的PCR产物。用Agarose Gel DNAPurification Kit(TaKaRa)试剂盒对电泳条带进行回收。所得到的FgPII1编码基因的PCR产物根据CloneExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme)试剂盒说明书，连接到SmaI酶切的pGR107::3HA载体上得到pGR107::FgPII1-3HA质粒，进一步转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂布到LB(含卡纳50μg/mL)平板，37℃培养16h后，进行菌落PCR验证，挑取阳性克隆，按照质粒提取试剂盒操作(Takara)提取质粒，送公司测序(上海生工)，序列如SEQ ID NO.1。测序正确的质粒电击转化到农杆菌GV3101中，涂布于LB(含卡纳霉素50μg/mL，利福平50μg/mL)平板，28℃条件下培养，48h后进行菌落PCR验证，并挑取正确克隆进行后续实验。

(4)农杆菌培养

分别从平板上挑取转染pGR107::FgPII1-3HA载体及pGR107::GFP-3HA载体的农杆菌GV3101单菌落，分别接种到2mL LB液体培养基中(含卡纳霉素50μg/mL，利福平50μg/mL)于恒温摇床上28℃，200rpm培养过夜至OD600为2.0。将过夜培养的GV3101农杆菌液5000g离心3min收集菌体。用缓冲液(组分：10mM 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid,10mMMgCl₂,200μM acetosyringone pH 5.6)悬浮菌液后离心收集菌体。重复洗2次后，用缓冲液稀释菌液至终浓度各为0.5。

(5)烟草叶片上瞬时表达FgPII1编码基因

将稀释至一定浓度的的农杆菌用1mL去掉针头的注射器注射到烟草叶片中，注射后烟草于温室(21-23℃、14h光照/10h黑暗)培养。

(6)FgPII1蛋白累计量检测

收集注射两天后的烟草叶片进行蛋白表达量的检测。将收集的烟草叶片液氮速冻后研磨加入蛋白提取液(组分为：150mM NaCl,50mM Tris-HCl pH 7.5,1.0％(v/v)NP-40,1.0％(v/v)protease inhibitor cocktail)混匀至于冰上30min。18000g离心收集上清液80μL加入20μL 5倍蛋白上样缓冲液混合均匀后沸水浴5min。取10μL样品在SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，120V跑胶1.5h。反应结束后将蛋白样品转到PVDF膜上，用5％PBST牛奶孵育封膜。加入1:5000稀释的HA一抗(Abmart)孵育2h后用PBST洗膜5min三次，随后加入1:10000稀释的鼠抗(LI-COR,irdye 800,926-32210)孵育30min后用PBST洗膜5min三次，扫膜拍照。

结果：烟草叶片上瞬时表达FgPII1三天后，烟草叶片出现了明显的过敏性坏死反应(如图1)。Western检测证实FgPII1能够正常表达(如图2)。

实施例3.植物免疫诱抗蛋白FgPII1的原核表达和纯化

(1)原核表达载体的构建

设计植物免疫诱抗蛋白FgPII1编码基因的特异性引物，

上游引物：SEQ ID NO.5

(5’-TCCCCAGGAATTCCC ATGAGCCCCATCCTCGAGACC-3’)

下游引物：SEQ ID NO.6

(5’-CGCTCGAGTCGACCCGCTAGTGCCAGTGCAGCCA-3’)，

50μL反应体系：其中5×buffer 10μL，2.5mM dNTPs 4μL,Takara PrimerSTARTaq酶0.5μL,模板cDNA 1μL，加水至50μL；PCR扩增程序为98℃预变性3min，98℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸40秒，循环35次，最后72℃延伸10min；琼脂糖凝胶上进行电泳分离，溴化乙锭(EB)染色照相，记录结果，并切胶回收FgPII1编码基因的PCR产物。用Agarose GelDNAPurification Kit(TaKaRa)对电泳条带进行回收。切胶回收的FgPII1编码基因的PCR产物根据CloneExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme)按照说明操作连接到SmaI酶切的pGEX-4T-2载体上得到pGEX-4T-2-FgPII1质粒，转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂LB(含氨苄50μg/mL)平板，37℃培养16h后菌落PCR验证挑取三个阳性克隆按照质粒提取试剂盒操作(Takara)提取质粒，送南京金斯瑞公司测序，序列如SEQ ID NO.1。测序正确的质粒热激转化大肠杆菌Rossetta(DE3)感受态细胞涂布到LB(含氨苄50μg/mL)平板，37℃培养16h，随后菌落PCR验证，挑取阳性克隆用于后续实验。

(2)蛋白诱导表达

将验证正确的表达菌株过夜活化培养，同时使用含有pGEX-4T-2空质粒的菌株作对照。分别取1mL过夜培养菌液，加入到含有50μg/mL氨苄的100mL LB液体培养基中(2％接种量)，37℃、200r/min振荡培养2～3h，培养至OD600为0.6～0.8，加入诱导剂IPTG(终浓度为1mM)，20℃、220r/min继续振荡培养16h，诱导表达目的蛋白。高速离心，收集菌体加入缓冲液，所得菌悬浮液经高压破碎菌体后，4℃高速离心，收集上清，得到表达蛋白液。取20μL上清液，加入5μL的5×SDS蛋白上样缓冲液，沸水浴中加热10min，13000r/min离心10min，取上清进行SDS-PAGE检测，进行考马斯亮兰染色。

结果：经过SDS-PAGE检测，获得一个分子量约41kD的包含GST的融合表达蛋白(GST-FgPII1)。

(3)原核表达蛋白的纯化

使用AKTA Explorer 100蛋白纯化仪进行原核表达蛋白的纯化。选用GST标签蛋白纯化柱进行亲和层析，先用清洗缓冲液平衡亲和层析柱；取步骤(2)中得到的蛋白溶液进样，流速为1mL/min，至基线平稳后，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰，利用超滤管将洗脱峰的组分进行脱盐处理，随后进行SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯度。

结果：获得纯化后的大小约为41KD的原核表达蛋白(GST-FgPII1)如图3。

实施例4.植物免疫诱抗蛋白FgPII1在烟草上引起的防卫反应

(1)FgPII1诱导抗性相关基因转录水平显著升高

经测定浓度后的FgPII1蛋白，将其浓度调整到1μM。选取生长旺盛的5～6期的烟草中部叶片，用1mL不带针头的注射器，将FgPII1蛋白从叶片背面注入不同的叶片中。同时以相同浓度的pGEX-4T-2(表达空载体蛋白)作为对照，注射6h后，收集样品，进行抗性相关基因转录水平的检测。提总RNA的抽提采用Omega公司RNA提取试剂盒按照说明操作，用分光度计检测其RNA含量和质量。

反转录生成第一链:取0.7μg RNA作模板，根据Takara公司PrimeScript反转录酶配套试剂使用说明进行cDNA合成，定容至20μL反应。反转录产物用水进行10倍稀释用于实时定量PCR反应检测基因沉默效率。

实时荧光定量PCR反应所用引物如下：

NbCYP71D20上游引物：SEQ ID NO.7

5’-CCGCACCATGTCCTTAGAG-3’

NbCYP71D20下游引物：SEQ ID NO.8

5’-CTTGCCCCTTGAGTACTTGC-3’

NbAcre31上游引物：SEQ ID NO.9

5’-AATTCGGCCATCGTGATCTTGGTC-3’

NbAcre31下游引物：SEQ ID NO.10

5’-GAGAAACTGGGATTGCCTGAAGGA-3’

NbWRKY7上游引物：SEQ ID NO.11

5’-CACAAGGGTACAAACAACACAG-3’

NbWRKY7下游引物：SEQ ID NO.12

5’-GGTTGCATTTGGTTCATGTAAG-3’

NbEF1a上游引物：SEQ ID NO.13

5’-TGGTGTCCTCAAGCCTGGTA-3’

NbEF1a下游引物：SEQ ID NO.14

5’-ACGCTTGAGATCCTTAACCGC-3’

PCR反应体系包含cDNA 5μL，SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNase H Plus)10μL,前后引物歌0.4μL，ROX Reference Dye II 0.4μL，水13.8μL。反应程序：I:95℃30秒，II:95℃5秒，60℃34秒，步骤II反应40个循环。溶解曲线分析程序是：95℃15秒，60℃1分钟，95℃15秒。数据分析采用2-ΔΔCT方法，检测结果如图6所示。参考文献:Livak,K.J.,andSchmittgen,T.D.(2001).Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.Methods 25,402-408.

结果：荧光定量PCR结果表明1μM FgPII1蛋白处理烟草叶片后6h，诱导烟草抗病相关基因的表达量显著升高(如图4)。

实施例5.植物免疫诱抗蛋白FgPII1增强大豆的抗病性

(1)FgPII1增强大豆对大豆疫霉菌的抗性

将纯化后的FgPII1溶液稀释到1nM，将生长5天的大豆黄化苗浸泡到1nM FgPII1溶液中，25℃培养室中遮光处理12h后，取出黄化苗，接种大豆疫霉菌，25℃培养室中遮光保湿2天后进行发病症状观察拍照(图5)。每处理10株，重复3次。并取样利用荧光定量PCR进行大豆疫霉菌侵染生物量测定，方法同实施例4)，选择PsActin基因作为大豆疫霉内参基因，GmCYP2基因为大豆内参基因。定量引物序列如下：

GmCYP2上游引物：SEQ ID NO.15

5’-CGGGACCAGTGTGCTTCTTCA-3’

GmCYP2下游引物：SEQ ID NO.16

5’-CCCCTCCACTACAAAGGCTCG-3’

PsActin上游引物：SEQ ID NO.17

5’-ACTGCACCTTCCAGACCATC-3’

PsActin下游引物：SEQ ID NO.18

5’-CCACCACCTTGATCTTCATG-3’

结果：与pGEX-4T-2表达的空载体蛋白对照相比，使用FgPII1处理的大豆黄化苗在接种大豆疫霉菌后均出现病斑长度显著性减小，大豆疫霉侵染的生物量显著降低(图6)。

(2)FgPII1增强大豆对禾谷镰孢菌的抗性

将纯化后的FgPII1溶液稀释到1nM，将生长5天的大豆黄化苗浸泡到1nM FgPII1溶液中，25℃培养室中遮光处理12h后，取出黄化苗，接种禾谷镰孢菌，25℃培养室中遮光保湿2天后进行发病症状观察拍照(图7)。每处理10株，重复3次。并取样利用荧光定量PCR进行禾谷镰刀菌侵染生物量测定，方法同实施例(4)。选择FgCYP基因作为禾谷镰刀菌内参基因。定量引物序列如下：

FgCYP上游引物：SEQ ID NO.19

5’-GTCCAATCCACTCCATCCTC-3’

FgCYP下游引物：SEQ ID NO.20

5’-CGGTCTTCTCGAGAGGTTCA-3’

结果：与pGEX-4T-2表达的空载体蛋白对照相比，使用FgPII1处理的大豆黄化苗在接种尖刀镰刀菌后均出现病斑长度显著性减小，禾谷镰孢菌侵染的生物量显著降低(图8)。

(3)FgPII1增强大豆对终极腐霉的抗性

将纯化后的FgPII1溶液稀释到1nM，将生长5天的大豆黄化苗浸泡到1nM FgPII1溶液中，25℃培养室中遮光处理12h后，取出黄化苗，接种终极腐霉，25℃培养室中遮光保湿2天后进行发病症状观察拍照(图9)。每处理10株，重复3次。并取样利用荧光定量PCR进行终极腐霉侵染生物量测定，方法同实施例(4)。终极腐霉菌内参基因定量引物序列如下：Pu上游引物：SEQ ID NO.21

5’-CAACTGGAAAAGCAAGCGG-3’

Pu下游引物：SEQ ID NO.22

5’-CCGAAGAACTGTGTCCGC-3’

结果：与pGEX-4T-2表达的空载体蛋白对照相比，使用FgPII1处理的大豆黄化苗在接种尖刀镰刀菌后均出现病斑长度显著性减小，禾谷镰孢菌侵染的生物量显著降低(图10)。

序列表

FgPII1编码基因全长核苷酸序列：SEQIDNO.1(DNA序列)禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)序列长399

ATGCTCTTCTTCAAGTCTATCGTCTCTCTCGCAGCCCTCGTTGGCGTTGCTGTTGCCAGCCCCATCCTCGAGACCCGCCAGTCTGCCACTCGCTGCGGCAGCACCAGCTACACTGCTGCTCAGGTCAAGGCCGCTGCCAACGCCGCGTGCCAGTACTACCAGAATGATGATACCGCTGGTAGCTCGACTTACCCTCATCAATACAACAACCGAGAGGGCTTTGACTTTCCTGTGAACGGTCCTTACCAAGAGTTCCCCATCCGAACTAGCGGTGTTTACACCGGAGGCTCGCCCGGTGCCGACCGTGTTGTTATCAACACCAACTGTCAATTCGCCGGTGCTATCACCCATACCGGCGCTTCTGGAAACAACTTTGTTGGCTGCACTGGCACTAGCTAA

FgPII1全长蛋白序列：SEQIDNO.2(氨基酸序列)禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)序列长132

MLFFKSIVSLAALVGVAVASPILETRQSATRCGSTSYTAAQVKAAANAACQYYQNDDTAGSSTYPHQYNNREGFDFPVNGPYQEFPIRTSGVYTGGSPGADRVVINTNCQFAGAITHTGASGNNFVGCTGTS

SEQ ID NO.3(DNA人工序列Artificial sequence)序列长38

cagctagcatcgattcccatgctcttcttcaagtctat

SEQ ID NO.4(DNA人工序列Artificial sequence)序列长37

aatctctagaggatccccgctagtgccagtgcagcca

SEQ ID NO.5(DNA人工序列Artificial sequence)序列长36

tccccaggaattcccatgagccccatcctcgagacc

SEQ ID NO.6(DNA人工序列Artificial sequence)序列长34

cgctcgagtcgacccgctagtgccagtgcagcca

SEQ ID NO.7(DNA人工序列Artificial sequence)序列长19

ccgcaccatgtccttagag

SEQ ID NO.8(DNA人工序列Artificial sequence)序列长20

cttgccccttgagtacttgc

SEQ ID NO.9(DNA人工序列Artificial sequence)序列长24

aattcggccatcgtgatcttggtc

SEQ ID NO.10(DNA人工序列Artificial sequence)序列长24

gagaaactgggattgcctgaagga

SEQ ID NO.11(DNA人工序列Artificial sequence)序列长22

cacaagggtacaaacaacacag

SEQ ID NO.12(DNA人工序列Artificial sequence)序列长22

ggttgcatttggttcatgtaag

SEQ ID NO.13(DNA人工序列Artificial sequence)序列长20

tggtgtcctcaagcctggta

SEQ ID NO.14(DNA人工序列Artificial sequence)序列长21

acgcttgagatccttaaccgc

SEQ ID NO.15(DNA人工序列Artificial sequence)序列长21

cgggaccagtgtgcttcttca

SEQ ID NO.16(DNA人工序列Artificial sequence)序列长21

cccctccactacaaaggctcg

SEQ ID NO.17(DNA人工序列Artificial sequence)序列长20

actgcaccttccagaccatc

SEQ ID NO.18(DNA人工序列Artificial sequence)序列长20

Ccaccaccttgatcttcatg

SEQ ID NO.19(DNA人工序列Artificial sequence)序列长20

gtccaatccactccatcctc

SEQ ID NO.20(DNA人工序列Artificial sequence)序列长20

cggtcttctcgagaggttca

SEQ ID NO.21(DNA人工序列Artificial sequence)序列长20

caactggaaaagcaagcgg

SEQ ID NO.22(DNA人工序列Artificial sequence)序列长20

ccgaagaactgtgtccgc

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 禾谷镰刀菌分泌的植物免疫诱抗蛋白FgPII1及其应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 399

<212> DNA

<213> 禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)

<400> 1

atgctcttct tcaagtctat cgtctctctc gcagccctcg ttggcgttgc tgttgccagc 60

cccatcctcg agacccgcca gtctgccact cgctgcggca gcaccagcta cactgctgct 120

caggtcaagg ccgctgccaa cgccgcgtgc cagtactacc agaatgatga taccgctggt 180

agctcgactt accctcatca atacaacaac cgagagggct ttgactttcc tgtgaacggt 240

ccttaccaag agttccccat ccgaactagc ggtgtttaca ccggaggctc gcccggtgcc 300

gaccgtgttg ttatcaacac caactgtcaa ttcgccggtg ctatcaccca taccggcgct 360

tctggaaaca actttgttgg ctgcactggc actagctaa 399

<210> 2

<211> 132

<212> PRT

<213> 禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)

<400> 2

Met Leu Phe Phe Lys Ser Ile Val Ser Leu Ala Ala Leu Val Gly Val

1 5 10 15

Ala Val Ala Ser Pro Ile Leu Glu Thr Arg Gln Ser Ala Thr Arg Cys

20 25 30

Gly Ser Thr Ser Tyr Thr Ala Ala Gln Val Lys Ala Ala Ala Asn Ala

35 40 45

Ala Cys Gln Tyr Tyr Gln Asn Asp Asp Thr Ala Gly Ser Ser Thr Tyr

50 55 60

Pro His Gln Tyr Asn Asn Arg Glu Gly Phe Asp Phe Pro Val Asn Gly

65 70 75 80

Pro Tyr Gln Glu Phe Pro Ile Arg Thr Ser Gly Val Tyr Thr Gly Gly

85 90 95

Ser Pro Gly Ala Asp Arg Val Val Ile Asn Thr Asn Cys Gln Phe Ala

100 105 110

Gly Ala Ile Thr His Thr Gly Ala Ser Gly Asn Asn Phe Val Gly Cys

115 120 125

Thr Gly Thr Ser

130

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagctagcat cgattcccat gctcttcttc aagtctat 38

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aatctctaga ggatccccgc tagtgccagt gcagcca 37

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccccaggaa ttcccatgag ccccatcctc gagacc 36

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgctcgagtc gacccgctag tgccagtgca gcca 34

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccgcaccatg tccttagag 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttgcccctt gagtacttgc 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aattcggcca tcgtgatctt ggtc 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gagaaactgg gattgcctga agga 24

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cacaagggta caaacaacac ag 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggttgcattt ggttcatgta ag 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tggtgtcctc aagcctggta 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acgcttgaga tccttaaccg c 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgggaccagt gtgcttcttc a 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cccctccact acaaaggctc g 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

actgcacctt ccagaccatc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ccaccacctt gatcttcatg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gtccaatcca ctccatcctc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cggtcttctc gagaggttca 20

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

caactggaaa agcaagcgg 19

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccgaagaact gtgtccgc 18

Claims

1.一种禾谷镰刀菌分泌的植物免疫诱抗蛋白FgPII1，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，该基因为如下(1)或(2)：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)与SEQ ID NO.1至少具有70％以上的同源性的核苷酸序列；优选为与SEQ ID NO.1至少具有80％以上的同源性的核苷酸序列；进一步优选为与SEQ ID NO.1至少具有85％以上的同源性的核苷酸序列；更进一步优选为与SEQ ID NO.1至少具有90％以上的同源性的核苷酸序列；最优选为与SEQ ID NO.1至少具有95％以上的同源性的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，该重组载体为在pGEX-4T-2中插入FgPII1的编码基因得到的原核表达载体。

6.权利要求1中所述的植物免疫诱抗蛋白FgPII1、权利要求2或3中所述的编码基因或者权利要求4中所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在诱导植物防卫反应及提高植物抗病性中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗病性为抗镰刀菌、终极腐霉菌和大豆疫霉菌引起的植物病害。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为烟草或大豆。

9.一种防治植物病害的方法，其特征在于，用权利要求1所述的植物免疫诱抗蛋白FgPII1处理植物防治由镰刀菌、终极腐霉菌和大豆疫霉菌引起的植物病害。