WO2007104518A2 - Verwendung neuer substanzen zur pathogenabwehr und zur wachstumsförderung bei kulturpflanzen - Google Patents

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WO2007104518A2
WO2007104518A2 PCT/EP2007/002154 EP2007002154W WO2007104518A2 WO 2007104518 A2 WO2007104518 A2 WO 2007104518A2 EP 2007002154 W EP2007002154 W EP 2007002154W WO 2007104518 A2 WO2007104518 A2 WO 2007104518A2
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Heinrich Pette Institut
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
    • A01N47/40—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides
    • A01N47/42—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides containing —N=CX2 groups, e.g. isothiourea
    • A01N47/44—Guanidine; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A01N61/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing substances of unknown or undetermined composition, e.g. substances characterised only by the mode of action

Definitions

  • the present invention relates to the use of substances which inhibit the conversion of the inactive form of the eukaryotic initiation factor 5A (eIF-5A) into the active form for the control of phytopathogens.
  • the present invention further relates to the use of these inhibitors to promote growth in crops.
  • pathogenic fungi While some types of fungi, as saprophytes, decompose dead cellulosic material, pathogenic fungi infect living organisms. These pathogenic fungi are divided into human pathogenic and phytopathogenic fungi. The latter can lead to considerable losses in yield and quality in the cultivation of turmeric plants and in addition to damage to the crop during storage by so-called camp pests.
  • phytopathogenic fungi for example of Fusarium graminearum, occurs both sexually via ascospores, which are formed in fruiting bodies and ejected in spring in humid weather, and also asexually via macroconidia.
  • the ascospores are significantly responsible for the infestation intensity at the beginning of the season when they reach the plants and cause infections there.
  • plants at the time of flowering are much more susceptible to infection than at earlier or later times.
  • the overwintering of many phytopathogenic fungi takes place on crop residues that remain on the field after harvesting.
  • Fusarium phytopathogenic fungi affecting the field yield and quality e.g., poorer bake, brew and seed quality
  • field yield and quality e.g., poorer bake, brew and seed quality
  • the mycotoxins formed by fungi on the plant or during storage of the crop on it are problematic because they are difficult or impossible to remove from the crop after harvesting and thus may partially enter human foods or animal feed.
  • Such, for example, contaminated with Fusarium toxins food or feed can cause severe poisoning (toxicoses) in humans and animals with significant health problems. So far, about 100 toxins produced by Fusaria have been identified, which have been classified into three main groups based on their chemical structure.
  • Trichothecene Members of the first group of Trichothecene are u.a. Mono- and diacetoxyscirpenol, T-2 toxin (or neosolaniol), HT-2 toxin, deoxynivalenol (DON), nivalenol and fusarenone X.
  • the deoxynivalenol and the nivalenol from this group belong to the most important mycotoxins in cereal cultivation today. Both toxins are mainly formed by Fusarium graminearum, but also by Fusarium culmorum and Fusarium crookwellense.
  • Trichothecenes in general are potent inhibitors of protein synthesis and are cell damaging, but probably not carcinogenic. Furthermore, they are toxic to the skin, attack the digestive system and affect the nervous system, blood formation and the immune system. The most common form of food poisoning with toxins from the trichothecene group is vomiting, diarrhea and skin reactions.
  • the low-toxicity zearalenone belongs in the second group. Despite its low toxicity, this toxin, due to its pronounced estrogens and anabolic effect, causes damage, particularly to livestock, as prolonged uptake of this toxin can result in swelling of the female genitalia, ranging from infertility to pseudo-pregnancies.
  • the third group includes fumonisins, which include fumonisin Bl, a highly toxic carcinogenic substance that interferes with the biosynthesis of sphingosine, a building block of lipids.
  • fumonisin Bl a highly toxic carcinogenic substance that interferes with the biosynthesis of sphingosine, a building block of lipids.
  • fungicides generally have either only a slight, but in part even an epidemic-promoting, ie a load-increasing effect.
  • fungicides such as protection against Fusariu / n mushrooms and can on this Way the toxin load of the crop sufficiently reduce.
  • Another approach is the genetic engineering or breeding development of robust or resistant cultivar varieties in order to reduce the sensitivity of the plants to infestation with phytopathogens or to make the plants resistant to infestation. Since, on the one hand, the development of a new marketable variety, for example, takes an average of 10 years in all cereals, it is very expensive and on the other hand often robust or resistant lines losses in terms of other significant plant characteristics, such as stability or yield stability, have not yet for all Crop plants robust or resistant plants available against the most important phyto- pathogens, which are comparable in terms of their performance with the currently used high performance species.
  • Object of the present invention is therefore to reduce the burden of food and feed with toxins from phytopathogens and increase the yield of crops.
  • DHS deoxyhypusine synthase
  • Deoxyhypusine synthase is one of the two enzymes responsible for converting the inactive form of the eukaryotic initiation factor 5A (eIF-5A) into the active form. After a large number of organisms from the microbiological and zoological field, the deoxyhypusine synthase has meanwhile also been identified in tobacco (OBER & HARTMANN (1999) J. Biol. Chem. 274 (45): 32040-32047).
  • the eukaryotic initiation factor 5A (eIF-5A) as substrate of the DHS is a small protein of 17.5 kDa, which presumably is ubiquitous in eukaryotes and archaebacteria (OBER & HARTMANN, loc. Cit.).
  • the protein is transcribed as an inactive form and is converted into the active form by the post-translational modification of lysine at position 50 within the 154 amino acid protein in two steps. During this modification, in a first step, the aminobutyl moiety of a spermidine is NAD-dependent transferred to the ⁇ -NH 2 group of the lysine, resulting in an inactive eIF-5A intermediate carrying a deoxyhypusine instead of the modified lysine.
  • hydroxylation of deoxyhypusine to hypusine results in the active form of eIF-5A.
  • the first reaction step is catalyzed by the deoxyhypusine synthase (DHS), the second step by the deoxyhypusin hydroxylase (DHH) (PARK et al., (1994) J. Biol. Chem. 269 (45): 27827-27832, SOMMER et al (2004) J. Biomolecular Screening 9 (5): 434-438).
  • eIF-5A is the only known cellular protein that contains the unusual and rare amino acid hypusin. Biosynthesis of the hypusin and formation of the active form of the eIF-5A is usually extremely efficient since neither the unmodified inactive eIF-5A precursor nor the deoxyhypusin-containing intermediate is detectable in the cell (PARK et al., Loc. cit.). With the conversion of lysine into the hypusin, the maturation of the inactive eIF-5A into the active eIF-5A, where the hypusin is critical to the biological activity of the eIF-5A.
  • eIF-5A The function of the eIF-5A has not yet been finally clarified.
  • the initially assumed function as a general translation initiation factor could not be confirmed, since protein synthesis in eIF-5A-deficient yeast cells is reduced by only about 30% and the polysome profile is only slightly altered (WANG et al., Loc. Cit.).
  • DHS deoxyhypusine synthase
  • eIF-5A is a nucleocytoplasmic shuttle protein that is actively exported from the nucleus, with hypoxin modification possibly being involved in this process (LIPOWSKY et al (2000) EMBO J. 19: 4362-4371; ROSORIUS et al. (1999) J. Cell Sci. 112: 2369-2380).
  • elF-5A has been shown to be a cellular cofactor of the HIV-1 regulatory protein Rev (RUHL et al., (1993) J. Cell Biol. 123: 1309-1320; BEVEC et al. (1996) Science 271: 1858 -1860).
  • Rev is an essential viral regulator that constantly moves between the nucleus and the cytoplasm of the host cell, and is thus involved in HIV-I Rev-mediated trans activation.
  • Rev mediates nucleocytoplasmic transport of incompletely spliced and unspliced viral mRNAs (POLLARD & MALIM (1998) Ann, Rev. Microbiol 52: 491-532).
  • eIF-5A plays a crucial role in the nucleocytoplasmic translocation of Rev and the Rev-mediated export of viral RNA (BEVEC et al. (1996) Science 271: 1858-1860; ELFGANG et al. (1999) Proc. Natl Acad., U.S.A. 96: 6229-6234; HAUBER et al. (2005) J. Clin. Invest. 115 (1).-76-85).
  • tetravalent guanylhydrazone CNI-1493 (also referred to as AXD455 or semapimod, see the following structural formula) was identified in this context as an effective inhibitor of DHS.
  • the present invention thus relates to the use of a substance which inhibits the conversion of the inactive form of the eukaryotic initiation factor 5A (eIF-5A) into the active form (hereinafter referred to as "inhibitor") for controlling phytopathogens.
  • eIF-5A eukaryotic initiation factor 5A
  • the object is achieved, namely to reduce the burden of food and feed with toxins from phytopathogens and / or to increase the yield of crops. It has been shown that the use of the inhibitor according to the invention inhibits the growth of phytopathogens, and thus an efficient control of Fhytopathogenen is possible.
  • the phytopathogens are phytopathogens of crop plants.
  • the use according to the invention leads to a reduction in the mycotoxin burden of the crop plants.
  • a pathogen is generally a pathogen that has the ability to cause disease. It is important to distinguish between human, animal and phytopathogenic pathogens, each causing a specific disease in humans, animals or plants.
  • plant pathogen or “phytopathogen” which may be used interchangeably refer to a pathogenic agent which, upon infestation of a plant, inhibits or impairs its growth, reproduction or fruiting, e.g. by the development of diseases on the plant, and thus causes economic damage.
  • these terms also encompass those pathogens which attack stored crops and result in contamination of the crop with phytotoxins, without necessarily affecting the plant itself.
  • Particularly preferred according to the invention is a use of the substance against phytopathogenic fungi.
  • the phytopathogen used to control the inhibitor is a phytopathogenic fungus.
  • the phytopathogenic fungi to be controlled are preferably selected from the group consisting of the genera Alternaria, Bipolaris, Blumeria, Botrytis, Bremia, Calviceps, Cercospora, Cladosporium, Colletotrichum, Corynespora, Dia- porthe, Diplocarpon, Drechslera, Elsinoe, Erysiphe, Fusarium, Gaeumannomycetes, Gibberella, Gloeodes, Gloeosporiurn, Glomerella, Gymnosporangium, Leptothryium, Leveillula, Mycospharella, Peronospora, Phaeoisariopsis, Phomopsis, Phyllactinia, Physalospora, Phytophthora, Plasmopara, Podosphaera, Pseudocercosporella, Pseudoperonospora, Puccinia, Pyricularia, Pythium
  • the phytopathogenic fungus of the genus Physalospora is the species Physalospora canker, wherein the term "species" represents a hierarchical order level in the biological classification of the organisms below the genus.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Blumeria is the species Blumeria graminis.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Botrytis is the species Botryris cinerea.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Corynespora is the species Corynespora melonis.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Diplocarpon is the species Diplocarpon rosae.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Elsinoe is the species Elsinoe fawcetti.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Diaporthe is the species Diaporthe citri.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Erysiphe is the species Erysiphe cichoracearum.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Sphaerotheca is the species Sphaerotheca fuliginea.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Leveilulla is the species Levillulla taurica.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Phyllactina is the species Phylactina kakicola.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Gloesporium is the species Gloeasporium kaki.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Gymnosporangium is the species Gymnosporangium yamadae.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Leptothryium is the species Lepothryium pomi.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Podosphaera is the species Podosphaera leucotricha.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Gloeodes is the species Gloeodes pomigena.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Cladospoerium is the species Ciacosporium carpophilum.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Phytophthora is the species Phytophthora infestans.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Glomerella is the species Glomerella cingulata.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Phaeoisariopsis is the species Phaeoisariopsis vitis.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Sphaceloma is the species Sphace- loma ampelina.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Pseudocercosporella is the species Pseudocercosporella herpotrichoides.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Pyricularia is the species Pyricularia oryzae (Magnaporthe grisea).
  • the phytopathogenic fungus of the genus Stagonospora is the species Stagonospora nodorum.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Uncinula is the species Uncinula necator.
  • the phytopathogenic fungus of the genus Gaeumannomyces is the species Gaeumannomyces grarainis.
  • a control of the infestation of cultivated plants with phytopathogenic fungi of the genus Fusarium is a preferred aim of the use according to the invention of the inhibitor.
  • the fungi of the genus Fusarium belong to the natural micro flora of the soil and contribute to the natural degradation of the biomass in order to make them available again as nutrients. However, fungi of this genus are also important pathogens in cereal cultivation, which lead to quality and yield losses due to the causation of diseases.
  • Fusarium phytopathogenic fungi controlled according to the invention are preferably selected from the group consisting of Fusarium dimerium, Fusarium culmorum, Fusarium merismoids, Fusarium decemcellulare, Fusarium chlamydosporum, Fusarium moniliforme, Fusarium proliferatum, Fusarium anthophilum, Fusarium subglutinans, Fusarium nygamai, Fusarium sambucinum Fusarium crookwellense, Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme, Fusarium oxysporum, Fusarium poae, Fusarium avenaceum spp.
  • avenaceum Fusarium avenaceum spp. ayvalues, Fusarium avenaceum spp. nurragi, Fusarium heterosporum, Fusarium acumatum spp. acuminatum, Fusarium acuminatum spp.
  • the inhibitor CNI-1493 has the special property to prevent the spread of Fusarium on wheat (see Figures 1 and 2). As shown in Example 1, the inhibitor is able to affect or completely suppress the germination of Fusarium conidia (see Example 1 and Figure 1). Furthermore, the inhibitor is able to suppress the growth of Fusarium on wheat spikes and thus to reduce the damage to the spikelets (see Example 2 and Figure 2).
  • CNI-1493 as a deoxyhypusine synthase inhibitor, is an effective inhibitor which can prevent the infection of crop plants by phytopathogenic fungi or, after infection, can effectively suppress the spread of the fungi.
  • CNI-1493 can reliably stop the spread of a phytopathogenic fungus and thus reduce or prevent the quality and yield losses caused by fungal infestation.
  • the substance CNI-1493 is therefore particularly preferred according to the invention, wherein salts or (chelate) complexes which are well known to the person skilled in the art are expressly included.
  • these salts or complexes are also meant, even if it is not expressly mentioned.
  • the inhibitor is used according to the invention for controlling the ergot (pathogen: Claviceps purpurea).
  • Ergot is a fungus found on rye, triticale, wheat, grass, oats and, more rarely, barley, characterized by a particular form of fruit that contains strong toxic alkaloids.
  • the ears are sticky, yellowish drops, the so-called "honeydew" bar.
  • long, thick, horn-like bent sclerotia develop with a furrowed, gray to black-violet surface. The sclerotia fall to maturity time or threshing on the ground or are harvested with.
  • the substance which inhibits the conversion of the inactive form of the eukaryotic initiation factor 5A (eIF-5A) into the active form is used for growth promotion in crop plants.
  • the promotion of growth according to the invention is reflected above all in an increase in the crop yield, since more or more fruits are obtained by promoting the growth of the plant.
  • the substance which inhibits the conversion of the inactive form of the eukaryotic initiation factor 5A (eIF-5A) into the active form and which is used to control phytopathogens on crops or to increase harvest yield in crops is an inhibitor Deoxyhypusine synthase (DHS).
  • DHS Deoxyhypusine synthase
  • the inhibitor of deoxyhypusine synthase is the tetravalent guanylhydrazone CNI-1493 (see above formula).
  • the inhibitor of deoxyhypusine synthase is the bis-diguanylated amine N 1 -guanyl-l, 7-diaminoheptane (GC7) (JAKUS et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 13151 -13,159).
  • the inhibitor of deoxyhypusine synthase (DHS) for the use according to the invention as an inhibitor has an IC 50 of ⁇ 10 ⁇ M.
  • the value IC 50 denotes the specific inhibitor concentration at which the enzymatic step catalyzed by the DHS is inhibited by 50% (JAKUS et al., loc. cit.).
  • the inhibitors are preferably selected from the group consisting of 1, 3-diaminopropane, 1,7-Dia ⁇ iix ⁇ oheptan, 1, ⁇ -Diarninooctan, spermidine, N 1 , N 7 -bisbis-guanyl-1, 7-diaminoheptan, N 1 , N 8 -bis-guanyl-l, 8-diaminooctane, N 1 -guanyl-1, 8-diaminooctane, N ⁇ guanylcaldine, IS 1 -guanylspermidine, N 8 -guanylspermidine and bis-guanylated spermidine (hirudonin).
  • a combination of at least two inhibitors is used as an inhibitor of the conversion of the inactive form of the eukaryotic initiation factor 5A (eIF-5A) into the active form for controlling phytopathogens on crop plants or for increasing the yield of crop crops.
  • This combination preferably comprises either at least two inhibitors of deoxyhypusine synthase (DHS) or at least two inhibitors of deoxyhy- pusin hydroxylase (DHH).
  • the combination used comprises at least one inhibitor of deoxyhypusine synthase (DHS) and at least one inhibitor of deoxyhypusine hydroxylase (DHH).
  • the inhibitor of DHH is the ⁇ - [N- (3-hydroxy-4-pyridone)] - ⁇ -amino-propionic acid, which is also referred to as mimosine (see HANAUSKE-ABEL et al. (1996) Biochim. Biophys Acta 1221: 115-124).
  • DHH inhibitors selected from the group consisting of ciclopirox, 2, 2'-dipyridyl, deferiprone and deferoxamine (see CLEMENT et al., (2002) Int. J. Cancer 100: 491-498).
  • ciclopirox is already in the literature a fungicidal activity against dermatophytes and some other mushrooms described.
  • the DHH inhibitors are particularly suitable as active ingredients in the abovementioned combinations.
  • the crop plants in which an inventive use of the inhibitor for pathogen control and / or growth promotion is provided are preferably cereal plants and maize. These include wheat, durum wheat, triticale, barley, oats, rye and beets. The list is not to be regarded as a conclusive listing, since the inhibitor according to the invention can also be used on other crops which are infested with the above-mentioned phytopathogens.
  • an inhibitor of the conversion of the inactive form of the eukaryotic initiation factor 5A (eIF-5A) into the active form for controlling phytopathogens and / or for promoting growth in crops can be carried out in the greenhouse or in the field, for example by using a solution which contains the substance.
  • the solution can be sprayed on the one hand on the plants, on the other hand, the skilled person are familiar with other ways to apply the solution.
  • the spraying can - if necessary - be done several times.
  • the application of the inhibitor takes place at the times known to those skilled in the art.
  • an infection can be optimally prevented (preventive use) or reduced, on the other hand, an effective infection can be effectively slowed down or suppressed (curative application).
  • the inhibitor is applied to grasses, for example, preferably during flowering when wet weather occurs by spraying.
  • grasses for example, preferably during flowering when wet weather occurs by spraying.
  • the person skilled in the art will have further options and the best times for application of the inhibitor known. These do not differ from the use of other fungicides.
  • the present invention furthermore relates to a composition for the use according to the invention for combating pathogens and / or for promoting growth, which is a substance or a combination of substances which converts the inactive form of the eukaryotic initiation factor 5A (eIF-5A) into the active form inhibits, in combination with formulation agents (such as emulsifiers, wetting agents, flowables, etc.).
  • a composition for the use according to the invention for combating pathogens and / or for promoting growth which is a substance or a combination of substances which converts the inactive form of the eukaryotic initiation factor 5A (eIF-5A) into the active form inhibits, in combination with formulation agents (such as emulsifiers, wetting agents, flowables, etc.).
  • formulation agents such as emulsifiers, wetting agents, flowables, etc.
  • the composition according to the invention contains an inhibitor of deoxyhypurine synthase (DHS) as a substance which inhibits the conversion of the inactive form of the eukaryotic initiation factor 5A (elF-5A) into the active form.
  • DHS deoxyhypurine synthase
  • composition according to the invention comprises the tetravalent guanylhydrazone CNI-1493 (cf. the above formula) as inhibitor of deoxyhypusine synthase (DHS).
  • DHS deoxyhypusine synthase
  • composition according to the invention comprises, as inhibitor of deoxyhypusine synthase (DHS), the Jbis-diguanylated amine N 1 -guanyl-1,1-diaminoheptane (GC7).
  • DHS deoxyhypusine synthase
  • GC7 Jbis-diguanylated amine N 1 -guanyl-1,1-diaminoheptane
  • the inventive composition comprises an inhibitor of D ⁇ oxyhypusin synthase (DHS) with an IC 50 of ⁇ 10 uM, which is selected from the group consisting of 1, 3-diaminopropane, 1,7-diaminoheptane, 1 , 8-diaminooctane, spermidine, N 1 , N 7 -bis-guanyl-1, 7-diaminoheptane, N 1 , N 8 - J bis-guanyl-1, 8-diaminooctane, N 1 - guanyl-1, 8-diaminooctane , N 1 -guanylcaldine, N 1 -guanylspermidine, N 8 -guanylspermidine and bis-guanylated spermidine (hirudonin).
  • DHS D ⁇ oxyhypusin synthase
  • the composition may also comprise at least two inhibitors.
  • such a combination may consist of either at least two inhibitors of deoxy hypoxin synthase (DHS) or of at least one inhibitor of deoxyhypusine synthase (DHS) and at least one inhibitor of deoxyhypusine hydroxylase (DHH).
  • the combination of the inhibitor of deoxyhypusine hydroxylase comprises the ⁇ - [N- (3-hydroxy-4-pyridone)] - ⁇ -amino-propionic acid (also referred to as mimosine).
  • the combination preferably comprises a DHH inhibitor selected from the group consisting of ciclopirox, 2, 2'-dipyridyl, deferiprone and deferoxamine.
  • FIG. 1 Inhibition of the germination of Fusarium graminearum in culture by various concentrations of the inhibitor CNI-1493 in the culture medium. Compared to the controls (pure medium (“control”) or pure medium and DMSO ("control + DMSO”)), the inhibitor in the culture medium from concentrations of 1 ⁇ M has a marked inhibiting effect on the germination of the fungus. A comparison between the blank control and the DMSO control shows that DMSO has no influence on the germination capacity as solvent of the inhibitor. The values were determined from 8 parallels.
  • FIG. 2 Inhibition of infection of wheat spikelets with Fusarium graminearum in the presence of CNI-1493.
  • the spiked spikelets were each treated with water ("control"), with a suspension of 200 Fusarium graminearum wild-type conidia in either water (“F. graminearum wt”) or water + DMSO ("F. graminearum wt + DMSO”). and inoculated with a suspension of 200 Fusarium graminearum wild-type conidia in water and 10 ⁇ M CNI-1493 (dissolved in DMSO; "F. graminearum wt + CNI-1493").
  • FIG 4 Effect of CNI-1493 on the quality and weight of wheat grains.
  • the grains were harvested from the ears of Figure 3 and were divided into several groups: grains of untreated spikes ("control"), granules of inoculated spikelets (“DMSO +” and “CNI-1493+”) and grains of untreated spikelets, respectively in which 2 central spikelets or 4 spikelet pairs were inoculated on the same ear (“DMSO” or "CNI-1493-”).
  • control controls
  • DMSO + granules of inoculated spikelets
  • CNI-1493+ granules of inoculated spikelets
  • DMSO granules of inoculated spikelets
  • CNI-1493- grains of untreated spikelets
  • Control + DMSO Addition of 2 ⁇ l pure DMSO
  • the inhibitor CNI-1493 precipitated in the culture medium.
  • the microtiter plates were incubated at 150 rpm and 28 ° C for the indicated time (12, 24, 36 and 48 h). After completion of the incubation, the plates were read in the fluorescence plate reader Flouroskan II from Labsystems, Dynex Hybaid Labsystems, Frankfurt, and determined by determining the fluorescence of germinating the conidia from these hyphae growth compared to the drug-free control (see FIG. 1). A comparison of the results of the blank control and the DMSO control show that DMSO as a solvent for the inhibitor has no inhibiting effect on the germination of the conidia.
  • the spiked spikelets were each either with water ("control"), with a suspension of 200 Fusarium conidia in water (“F. graminearum wt”) or water + DMSO ("F. graminearum wt + DMSO ”) and inoculated with a suspension of 200 Fusarium conidia in water and 10 ⁇ M CNI-1493 (dissolved in DMSO," F. graminearum wt + CNI-1493 ").
  • the plants were kept for a further 21 days in the climatic chamber under the conditions described by VOIGT et al. (loc.cit.) before the fungal infection was visually observed and evaluated (see Table 1). For this purpose, the ratio of the number of affected spikelet and the total number of spikelets was determined.
  • DMSO + grains of spikelets inoculated directly with DMSO
  • DMSO- Grains of spikelets inoculated with DMSO
  • CNI-1493 + Grains from spikelets directly inoculated with CNI-1493
  • CNI-1493- Spikelets of spikelets adjacent to spikelets inoculated with CNI-1493
  • the grains of each grain type were randomized into groups of ten and weighed. For each group of grains, at least 7 groups of ten were obtained. In FIG. 4, the grain weight of the individual types is shown as FIG.
  • the grain weight of the individual types is shown as FIG.
  • the inoculation of the spikeli with DMSO led to a significant increase in the grain weight of about 6%. Since there was no significant difference between the samples "DMSO +" and “DMSO-", DMSO seems to lead to a slight increase in the grain weight both directly and systemically.

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Abstract

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Substanzen, welche die Umwandlung der inaktiven Form des eukaryotischen Initiationsfaktors 5A (eIF-5A) in die aktive Form hemmen, zur Bekämpfung von Phytopathogenen. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Hemmstoffs zur Förderung des Wachstums bei Kulturpflanzen.

Description

Verwendung neuer Substanzen zur Pathogenabwehr und zur Wachstumsförderung bei Kulturpflanzen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Substanzen, welche die Umwandlung der inaktiven Form des eukaryoti- schen Initiationsfaktors 5A (eIF-5A) in die aktive Form hemmen, zur Bekämpfung von Phytopathogenen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung dieser Hemmstoffe zur Förderung des Wachstums bei Kulturpflanzen.
Während einige Pilzarten als Saprophyten totes Zellulose- haltiges Material zersetzen, befallen pathogene Pilzarten lebende Organismen. Diese pathogenen Pilze gliedern sich in hu- manpathogene und phytopathogene Pilze auf. Letztere können zu erheblichen Ertrags- und Qualitätseinbußen beim Anbau von KuI- turpflanzen und zusätzlich zu einer Schädigung des Ernteguts während der Lagerung durch sogenannte Lagerschädlinge führen.
Die Verbreitung von phytopathogenen Pilzen, beispielsweise von Fusarium graminearum, erfolgt sowohl sexuell über Ascosporen, die in Fruchtkörpern gebildet und im Frühjahr bei feuchter Witterung ausgeschleudert werden, als auch asexuell über Ma- krokonidien . Dabei sind die Ascosporen maßgeblich für die Befallstärke zu Beginn der Saison verantwortlich, wenn diese auf die Pflanzen gelangen und dort Infektionen auslösen. Weiterhin sind Pflanzen zum Zeitpunkt der Blüte deutlich anfälliger gegenüber einer Infektion als zu früheren oder späteren Zeitpunkten. Die Überwinterung vieler phytopathogener Pilze erfolgt auf Ernteresten, die nach der Ernte auf dem Feld verbleiben.
Ein Beispiel für die direkte Schadwirkung von phytopathogenen Pilze der Gattung Fusarium mit Einfluß auf den Feldertrag und dessen Qualität (z.B. schlechtere Back-, Brau- und Saatgutqualität) ist die sogenannte partielle bzw. völlige Taubährigkeit und die Bildung sogenannter Schmacht- oder Kümmerkörner.
Neben der Ertrags- oder Qualitätsminderung durch einen Pilzbefall sind die von den Pilzen produzierten Stoffwechselprodukte, die sogenannten Mykotoxine, welche die Ernteprodukte belasten, in letzter Zeit als weiteres großes Problem ins Zentrum des öffentlichen und wissenschaftlichen Interesses gerückt.
Die von Pilzen auf der Pflanze oder während der Lagerung des Ernteguts auf diesem gebildeten Mykotoxine sind problematisch, da sie nach der Ernte nur schwer oder gar nicht aus dem Erntegut entfernt werden können und so teilweise in Nahrungsmittel des Menschen oder Futtermittel von Tieren gelangen können. Solche, beispielsweise mit Fusarium-Toxinen belasteten Lebensoder Futtermittel können bei Mensch und Tier schwere Vergiftungen (Toxikosen) mit erheblichen gesundheitlichen Problemen auslösen. Bislang wurden etwa 100 von Fusarien gebildete Toxine identifiziert, die anhand ihrer chemischen Struktur in drei Hauptgruppen eingeteilt wurden.
Mitglieder der ersten Gruppe der Trichothecene sind u.a. Mono- und Diacetoxyscirpenol, T-2-Toxin (oder Neosolaniol) , HT-2- Toxin, Deoxynivalenol (DON) , Nivalenol und Fusarenon X.
Das Deoxynivalenol und das Nivalenol aus dieser Gruppe gehören zu den heute im Getreideanbau bedeutendsten Mykotoxinen. Beide Toxine werden vor allem durch Fusarium graminearum, aber auch durch Fusarium culmorum und Fusarium crookwellense gebildet.
Trichothecene allgemein sind starke Hemmstoffe der Proteinsynthese und wirken zeilschädigend, aber vermutlich nicht krebserzeugend. Weiterhin wirken sie hauttoxisch, greifen das Verdauungssystem an und beeinträchtigen das Nervensystem, die Blutbildung und das Immunsystem. Die häufigsten Beschwerden, die bei einer Vergiftung mit Toxinen aus der Gruppe der Trichothecene über die Nahrung auftreten, sind Erbrechen, Durchfall und Hautreaktionen.
Das nur gering toxische Zearalenon gehört in die zweite Gruppe. Trotz seiner geringen Toxizität führt dieses Toxin wegen seiner ausgeprägten Östrogenen und anabolen Wirkung zu Schäden vor allem beim Nutzvieh, da eine länger andauernde Aufnahme dieses Toxin mit einer Schwellung der weiblichen Genitalien beginnend bis zur Unfruchtbarkeit oder zu Scheinschwangerschaften führen kann.
Zu der dritten Gruppe gerechnet werden die Fumonisine, zu denen mit dem Fumonisin Bl ein hochtoxischer, krebserregender Stoff gehört, der in die Biosynthese von Sphingosin, einem Baustein der Lipide, eingreift. Während bei Nutztieren eine Intoxikation mit Fumonisin Bl u.a. zu der durch die pathologische Veränderung der weißen Hirnsubstanz gekennzeichneten, potentiell tödlich verlaufenden equinen Leukoenzephalomalazie (ELEM, eine Gehirnerkrankung bei Pferden) , zu Lungenödemen bei Schweinen (PPE-Syndrom, "porcine pulmonary edema") und dem als „toxic feed Syndrome" umschriebenen Krankheitsbild bei Geflügel führen kann, hat sich bei Versuchen mit Ratten gezeigt, daß eine Vergiftung mit Fumonisin Bl Leberkrebs auslösen kann.
Eine Vergiftung mit diesem Toxin bzw. generell hohe Fumonisin- konzentrationen im Mais werden auch als Ursache für das verstärkte Austreten von Speiseröhrenkrebs in Teilgebieten Südafrikas, Chinas und möglicherweise auch Italien diskutiert.
Der Befall von Kulturpflanzen mit einigen phytopathogenen Pilzen kann momentan noch nicht zufriedenstellend bekämpft werden. Während es gegen einige Pilze sehr gute Fungizide oder durch Züchtung erhaltene Pflanzen mit verbesserter Resistenz gibt, stehen für andere Phytopathogene , allen voran für Fusa- rium, weder resistente Kulturpflanzen im Feld noch durch ausreichend gute Fungizide bereit.
Bei Fusarien waren bisher Versuche, durch gezielte Eingriffe in den Lebenszyklus der Pilze den Pilzbefall zu verringern, bislang nicht erfolgreich. Weiterhin führte auch eine Umstellung des Anbaus der Kulturpflanzen auf bodenschonende, nicht- wendende Anbauverfahren nicht zu positiven Ergebnissen, da diese ackerbaulichen Veränderungen beispielsweise den Befall mit Ährenfusariosen sogar förderten. Die Behandlung von beispielsweise Fusarium graminearum mit Fungiziden zur Reduzierung des Toxingehaltes im Erntegut stellte sich als problematisch heraus, da der Wirkungsgrad des Fungizideinsatzes im Hinblick auf die Belastung des Erntegutes mit dem Mykotoxin Deoxynivalenol entweder zu gering war, oder die Toxinbela- stung, d.h. der Deoxynivalenolgehalt, im Vergleich zu Kontrollen durch den Fungizideinsatz sogar erhöht war.
Andere Untersuchungen der Veränderung der Belastung des Ernte- gutes mit verschiedenen Toxinen beim Einsatz von Fungiziden zeigten, daß Fungizide allgemein entweder nur eine geringe, teilweise aber sogar eine befallsfördernde, d.h. eine bela- stungssteigernde Wirkung haben. Momentan bietet keines der zurzeit auf dem Markt erhältlichen Fungizide einen ausreichenden Schutz z.B. gegenüber Fusariu/n-Pilzen und kann auf diese Weise die Toxinbelastung des Erntegutes ausreichend verringern.
Ähnliche Probleme finden sich auch bei anderen Pilzen als den Pilzen der Gattung Fusarium.
Ein anderer Ansatz ist die gentechnische oder züchterische Entwicklung robuster oder resistenter Kulturpflanzensorten, um die Empfindlichkeit der Pflanzen gegenüber einem Befall mit Phytopathogenen zu verringern bzw. um die Pflanzen gegenüber einem Befall resistent zu machen. Da einerseits die Entwicklung einer neuen marktreifen Sorte beispielsweise bei allen Getreidearten im Schnitt 10 Jahre dauert, sie sehr aufwendig ist und andererseits häufig robuste oder resistente Linien Einbussen hinsichtlich anderer wesentlicher Pflanzenmerkmale, wie beispielsweise der Standfestigkeit oder der Ertragsstabilität, aufweisen, sind noch nicht für alle Kulturpflanzen robuste oder resistente Pflanzen gegen die bedeutendsten Phyto- pathogene verfügbar, die hinsichtlich ihrer Leistung mit den momentan verwendeten Hochleistungsarten vergleichbar sind.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die Belastung von Nahrungs- und Futtermitteln mit Toxinen aus Phytopathogenen zu reduzieren und den Ernteertrag bei Kulturpflanzen zu erhöhen.
Zur Lösung der Aufgabe wird der Gegenstand der angefügten Ansprüche vorgeschlagen.
Überraschenderweise zeigte sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung mit Pilzen der Gattung Fusarium, daß eine Inhibierung der der Deoxyhypusinsynthase (DHS) das Wachstum des Pilzes negativ beeinflusst und diese Wirkung für eine Bekämpfung von Phytopathogenen eingesetzt werden kann.
Die Deoxyhypusinsynthase (DHS) ist eines der beiden Enzyme, die für die Umwandlung der inaktiven Form des eukaryotischen Initiationsfaktors 5A (eIF-5A) in die aktive Form verantwortlich sind. Nach einer Vielzahl von Organismen aus dem mikrobiologischen und zoologischen Bereich wurde die Dεoxyhypusinsynthase mittlerweile auch im Tabak (OBER & HARTMANN (1999) J. Biol. Chem. 274(45) :32040-32047) identifiziert.
Die Gene für die DHS und den eIF-5A wurden weiterhin von WANG et al. (J. Biol. Chem. 276 (20) : 17541-17549 (2001)) auch in der Tomate identifiziert, wobei eine Induzierung dieser Gene während der Seneszenz der Pflanze nachgewiesen werden konnte.
Der eukaryotische Initiationsfaktors 5A (eIF-5A) als Substrat der DHS ist ein kleines Protein von 17,5 kDa, das vermutlich in Eukaryoten und Archaebakterien ubiquitär vorkommt (OBER & HARTMANN, loc. cit.) . Das Protein wird als inaktive Form trans- latiert und wird erst durch die posttranslationelle Modifizierung des Lysins an Position 50 innerhalb des 154- Aminosäurenproteins in zwei Schritten in die aktive Form überführt. Während dieser Modifizierung wird in einem ersten Schritt der Aminobutylrest eines Spermidins NAD-abhängig auf die ε-NH2-Gruppe des Lysins übertragen, wodurch ein inaktives eIF-5A-Zwischenprodukt entsteht, das ein Deoxyhypusin anstelle des modifizierten Lysins trägt. Im zweiten Schritt entsteht dann durch Hydroxylierung des Deoxyhypusins zum Hypusin (Λf-(4- amino-2-hydroxybutyl) lysin) die aktive Form des eIF-5A. Der erste Reaktionsschritt wird dabei durch die Deoxyhypusinsynthase (DHS) , der zweite Schritt durch die Deoxyhypusin- hydroxylase (DHH) katalysiert (PARK et al . (1994) J. Biol. Chem. 269 (45) : 27827-27832 ; SOMMER et al . (2004) J. Biomolecular Screening 9(5) :434-438) .
eIF-5A ist das einzige bisher bekannte zelluläre Protein, das die ungewöhnliche und seltene Aminosäure Hypusin enthält. Die Biosynthese des Hypusins und die Bildung der aktiven Form des eIF-5A erfolgt für gewöhnlich äußerst effizient, da weder der unmodifizierte, inaktive eIF-5A-Vorläufer noch das Deoxyhypusin-enthaltende Zwischenprodukt in der Zelle nachweisbar sind (PARK et al . , loc. cit.) . Mit der Umwandlung des Lysins in das Hypusin ist die Reifung des inaktiven eIF-5A in das aktive eIF-5A vollendet, wobei das Hypusin für die biologische Aktivität des eIF-5A entscheidend ist.
Die Funktion des eIF-5A konnte bisher noch nicht abschließend geklärt werden. Die anfänglich vermutete Funktion als genereller Translationsinitiationsfaktor konnte nicht bestätigt werden, da die Proteinsynthese in eIF-5A-defizienten Hefezellen nur um ca. 30% verringert und das Polysomenprofil nur geringfügig verändert ist (WANG et al . ; loc. cit.) . Die Tatsache, daß eine künstliche Deaktivierung der Deoxyhypusinsynthase (DHS) in Hefezellen zu einem Verlust der Teilungsfähigkeit der Zellen führte und die Zellen sich statt dessen vergrößerten, führte zu dem Schluß, daß aktiviertes eIF-5A die Translation einer Untergruppe von mRNAs erleichtert, die für die Zellteilung benötigt werden, und eIF-5A daher für die Zellprolifera- tion wichtig ist (PARK et al . , loc. cit.) .
Andere Daten aus Versuchen mit Säugerzellen legen nahe, daß eIF-5A ein nukleocytoplasmatisches Shuttle-Protein ist, das aktiv aus dem Kern exportiert wird, wobei die Hypusinmodifika- tion an diesem Vorgang möglicherweise beteiligt ist (LIPOWSKY et al. (2000) EMBO J. 19:4362-4371; ROSORIUS et al . (1999) J. Cell Sei. 112:2369-2380). Weiterhin konnte gezeigt werden, daß elF- 5A ein zellulärer Kofaktor des regulatorischen HIV-I Proteins Rev ist (RUHL et al . (1993) J. Cell Biol. 123:1309-1320; BEVEC et al. (1996) Science 271:1858-1860). Rev ist ein essenzieller viraler Regulator, der sich ständig zwischen dem Kern und dem Cytoplasma der Wirtszelle bewegt, und so an der HIV-I Rev- vermittelten trans-Aktivierung beteiligt ist.
Auf diese Weise vermittelt Rev den nukleocytoplasmatischen Transport von unvollständig gespleißten und ungespleißten viralen mRNAs (POLLARD & MALIM (1998) Annυ . Rev. Microbiol . 52:491- 532) . Als Kofaktor dieses Enzyms spielt eIF-5A eine entscheidende Rolle bei der nukleocytoplasmatischen Translokation von Rev und dem Rev-vermittelten Export viraler RNA (BEVEC et al . (1996) Science 271:1858-1860; ELFGANG et al . (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:6229-6234; HAUBER et al . (2005) J. Clin. In- vest. 115(1) .-76-85) . Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nun überraschenderweise gefunden, dass Substanzen, welche die Umwandlung der inaktiven Form des eukaryotischen Initiationsfaktors 5A (eIF-5A) in die aktive Form hemmen, zur Bekämpfung von Phytopathogenen geeignet sind. Überraschenderweise sind diese Substanzen zur Förderung des Wachstums bei Kulturpflanzen geeignet.
Das vierwertige Guanylhydrazon CNI-1493 (auch als AXD455 oder Semapimod bezeichnet; siehe die folgende Strukturformel) wurde in diesem Zusammenhang als wirksamer Inhibitor der DHS identifiziert .
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung einer Substanz, welche die Umwandlung der inaktiven Form des eukaryotischen Initiationsfaktors 5A (eIF-5A) in die aktive Form hemmt (nachfolgend als "Hemmstoff" bezeichnet) , zur Bekämpfung von Phytopathogenen. Damit wird die gestellte Aufgabe gelöst, nämlich die Belastung von Nahrungs- und Futtermitteln mit Toxinen aus Phytopathogenen zu reduzieren und/oder den Ernteertrag bei Kulturpflanzen zu erhöhen. Es konnte gezeigt werden, dass die erfindungsgemäße Verwendung des Hemmstoffs das Wachstum von Phytopathogenen hemmt, und dadurch eine effiziente Bekämpfung von Fhytopathogenen möglich ist.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung sind die Phytopatho- gene Phytopathogene von Kulturpflanzen.
Durch die Bekämpfung von Phytopathogenen von Kulturpflanzen im Sinne einer Verlangsamung oder Unterdrückung der Ausbreitung eines Phytopathogens auf einer Pflanze bzw. im Feld führt die erfindungsgemäße Verwendung zu einer Verringerung der Mykoto- xinbelastung der Kulturpflanzen.
Ein Pathogen ist im allgemeinen ein Erreger, der die Fähigkeit besitzt, eine Krankheit zu verursachen. Dabei ist zwischen human-, tier- und pflanzenpathogenen Erregern zu unterscheiden, die jeweils spezifisch bei Mensch, Tier oder Pflanze eine Krankheit hervorrufen. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung bezeichnen die Begriffe "Pflanzenpathogen" oder "Phytopa- thogen" , die austauschbar verwendet werden können, einen pa- thogenen Erreger, der nach Befall einer Pflanze deren Wachstum, Fortpflanzung oder Fruchtbildung hemmt oder beeinträchtigt, z.B. durch die Entwicklung von Krankheiten auf der Pflanze, und auf diese Weise wirtschaftliche Schäden verursacht. Von diesen Begriffen werden für die Zwecke der vorliegenden Erfindung auch solche Erreger umfasst, die gelagertes Erntegut befallen und zu einer Belastung des Ernteguts mit Phytotoxinen führen, ohne zwangsläufig die Pflanze selbst zu befallen.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist eine Verwendung der Substanz gegen phytopathogene Pilze. In solchen Ausführungsformen ist das Phytopathogen, zu dessen Bekämpfung der Hemmstoff verwendet wird, ein phytopathogener Pilz.
Dabei werden die zu bekämpfenden phytopathogenen Pilze bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt bestehend aus den Gattungen Alternaria, Bipolaris, Blumeria, Botrytis, Bremia, Calviceps, Cercospora, Cladosporium, Colletotrichum, Corynespora, Dia- porthe, Diplocarpon, Drechslera, Elsinoe, Erysiphe, Fusarium, Gaeumannomycetεs, Gibberella, Gloeodes, Gloeosporiurn, Glome- rella, Gymnosporangium, Leptothryium, Leveillula, Mycosphae- rella, Peronospora, Phaeoisariopsis, Phomopsis, Phyllactinia, Physalospora, Phytophthora, Plasmopara, Podosphaera, Pseu- docercosporella, Pseudoperonospora, Puccinia, Pyricularia, Py- thium, Rhizoctonia, Sclerotinia, Sphaceloma, Sphaerotheca, Stagonospora, Tilletia, Typhula, Uncinula, Uromyces, Ustilago und Verticillium. Der Begriff der "Gattung" bezeichnet dabei eine hierarchische Ordnungsstufe in der biologischen Systematik der Organismen darstellt.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Physalospora die Art Physalospora canker, wobei der Begriff der "Art" eine hierarchische Ordnungsstufe in der biologischen Systematik der Organismen unterhalb der Gattung darstellt.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Blumeria die Art Blumeria graminis .
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Botrytis die Art Botryris cinerea.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Corynespora die Art Corynespora melonis.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Diplocarpon die Art Diplocarpon rosae.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Elsinoe die Art Elsinoe fawcetti . In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Diaporthe die Art Diaport- he citri.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Erysiphe die Art Erysiphe cichoracearum .
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Sphaerotheca die Art Spha- erotheca fuliginea.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Leveilulla die Art Levei- lulla taurica.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Phyllactina die Art Phyl- lactina kakicola.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Gloesporium die Art Gloe- sporium kaki .
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Gymnosporangium die Art Gymnosporangium yamadae .
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Leptothryium die Art Lep- tothryium pomi .
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Podosphaera die Art Podos- phaera leucotricha.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Gloeodes die Art Gloeodes pomigena . In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Cladospörium die Art CIa- dosporium carpophilum.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Phytophthora die Art Phytophthora infestans .
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Glomerella die Art Glome- rella cingulata.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Phaeoisariopsis die Art Phaeoisariopsis vitis.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Sphaceloma die Art Sphace- loma ampelina.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Pseudocercosporella um die Art Pseudocercosporella herpotrichoides .
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Pyricularia die Art Pyri- cularia oryzae (Magnaporthe grisea) .
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Stagonospora die Art Sta- gonospora nodorum.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Uncinula die Art Uncinula necator . In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der phytopathogene Pilz der Gattung Gaeumannomyces die Art Gaeumannomyces grarainis .
Eine Bekämpfung des Befalls von Kulturpflanzen mit phytopatho- genen Pilzen der Gattung Fusarium ist ein bevorzugtes Ziel der erfindungsgemäßen Verwendung des Hemmstoffes.
Die Pilze der Gattung Fusarium gehören zu der natürlichen Mi- kroflora des Bodens und tragen zum natürlichen Abbau der Biomasse bei, um sie als Nährstoffe wieder verfügbar zu machen. Jedoch sind Pilze dieser Gattung auch bedeutende Krankheitserreger im Getreideanbau, die wegen der Verursachung von Krankheiten zu Qualitäts- und Ertragseinbußen führen.
Bevorzugt sind die erfindungsgemäß bekämpften phytopathogenen Pilze der Gattung Fusarium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fusarium dimerium, Fusarium culmorum, Fusarium merismoi- des, Fusarium decemcellulare, Fusarium chlamydosporum, Fusarium moniliforme, Fusarium proliferatum, Fusarium anthophilum, Fusarium subglutinans , Fusarium nygamai , Fusarium sambucinum, Fusarium crookwellense, Fusarium graminearum, Fusarium moniliforme, Fusarium oxysporum, Fusarium poae, Fusarium avenaceum spp . avenaceum, Fusarium avenaceum spp. aywerte, Fusarium avenaceum spp. nurragi , Fusarium heterosporum, Fusarium acumi- natum spp. acuminatum, Fusarium acuminatum spp. armeniacum, Fusarium longipes, Fusarium compactum, Fusarium equiseti , Fusarium scripi, Fusarium polyphialidicum, Fusarium semitectum, , Fusarium beomiforme, Fusarium tricinctum, Fusarium sporotri- chioides, Fusarium torulosum, Fusarium sambucinum Fusarium so- lani, Fusarium verticillioides, Fusarium graminearum, Fusarium pseudograminearum und Fusarium lateritium ausgewählt.
Ein Beispiel für den Befall von Getreide mit phytopathogenen Pilzen der Gattung Fusarium ist die sogenannte "partielle Tau- bährigkeit" . Diese entsteht, wenn der Pilz bis in die Spindel der Ähre vordringt und die dort liegenden Kornanlagen infiziert. Durch eine Unterbrechung der Nährstoffversorgung beim Eindringen der Hyphen in die Leitbahnen kommt es zu einem vor- zeitigen Ausbleichen einzelner Ährchen, Ährchengruppen oder des oberen Ährenteils an grünen Ähren und zur Kümmerkornbil- dung. Auf befallenen Spelzen und Körnern können sind die Schadpilze als rosafarbener Belag erkennbar sein.
Versuche haben nun überraschenderweise gezeigt, daß der Hemmstoff CNI-1493 (s. obige Formel) die besondere Eigenschaft aufweist, die Ausbreitung von Fusarium auf Weizen zu unterbinden (siehe Figuren 1 und 2) . Wie in Beispiel 1 gezeigt ist, ist der Hemmstoff in der Lage, die Keimung von Fusarium- Konidien zu beeinträchtigen bzw. ganz zu unterdrücken (siehe Beispiel 1 und Figur 1) . Weiterhin vermag der Hemmstoff das Wachstum von Fusarium auf Weizenähren zu unterdrücken und so die Schädigung der Ährchen zu reduzieren (siehe Beispiel 2 und Figur 2) . Somit ist CNI-1493 als Hemmstoff der Deoxyhypusin- synthase ein wirksamer Hemmstoff, der die Infektion von Kulturpflanzen durch phytopathogene Pilze verhindern bzw. nach erfolgter Infektion eine Ausbreitung der Pilze wirksam unterdrücken kann. Auf diese Weise kann CNI-1493 die Ausbreitung eines phytopathogenen Pilzes zuverlässig stoppen und so die durch den Pilzbefall verursachten Qualitäts- und Ertragseinbußen vermindern oder verhindern. Die Substanz CNI-1493 ist daher erfindungsgemäß besonders bevorzugt, wobei Salze oder (Chelat- ) Komplexe, die dem Fachmann gut bekannt sind, ausdrücklich eingeschlossen sind. Soweit hierin von der Substanz CNI-1493 (auch unter Verwendung der Strukturformel oder anderer Bezeichnungen) die Rede ist, sind auch gleichzeitig diese Salze oder Komplexe gemeint, auch wenn es nicht ausdrücklich erwähnt ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der Hemmstoff erfindungsgemäß zur Bekämpfung des Mutterkorns (Erreger: Claviceps purpurea) verwendet.
Das Mutterkorn ist ein auf Roggen, Triticale, Weizen, Gräser, Hafer sowie seltener auf Gerste vorkommender Pilz, der durch seine besondere, stark giftige Alkaloide enthaltende Fruchtform gekennzeichnet ist. Während der Blüte sind an den Ähren klebrige, gelbliche Tropfen, der sogenannte "Honigtau" sieht- bar. Während der Reife entstehen dann anstelle der Karyopsen in einzelnen Ährchen lange, dicke, hornartig verbogene Sklero- tien mit einer gefurchten, grau- bis schwarzviolεtten Oberfläche. Die Sklerotien fallen zur Reifezeit bzw. beim Drusch auf den Boden oder werden mit geerntet .
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Substanz, welche die Umwandlung der inaktiven Form des eukaryotischen In- itiierungsfaktors 5A (eIF-5A) in die aktive Form hemmt, zur Wachstumsförderung bei Kulturpflanzen verwendet.
Die erfindungsgemäße Wachstumsförderung schlägt sich dabei vor allem in einer Erhöhung des Ernteertrages nieder, da durch die Förderung des Wachstums der Pflanze mehr oder größere Früchte erzielt werden.
Bevorzugt handelt es sich bei der Substanz, welche die Umwandlung der inaktiven Form des eukaryotischen Initiationsfaktors 5A (eIF-5A) in die aktive Form hemmt, und die zur Bekämpfung von Phytopathogenen auf Kulturpflanzen oder zur Erhöhung des Ernteertrages bei Kulturpflanzen verwendet wird, um einen Hemmstoff der Deoxyhypusinsynthase (DHS) .
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Hemmstoff der Deoxyhypusinsynthase (DHS) um das tetravalente Guanylhydrazon CNI-1493 (s. obige Formel) .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Hemmstoff der Deoxyhypusinsynthase (DHS) das bis- diguanylierte Amin N1-guanyl-l, 7-diaminoheptan (GC7) (JAKUS et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:13151-13159).
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform weist der Hemmstoff der Deoxyhypusinsynthase (DHS) für die erfindungsgemäße Verwendung als Hemmstoff eine IC50 von < 10 μM auf. Dabei bezeichnet der Wert IC50 jeweils die für den jeweiligen Hemmstoff spezifische Konzentration, bei welcher der von der DHS katalysierte enzymatische Schritt um 50 % inhibiert wird (JAKUS et al., loc. cit.) . Die Hemmstoffe sind dabei bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1, 3-Diaminopropan, 1,7- Diaπiixϊoheptan, 1, δ-Diarninooctan, Spermidin, N1,N7-jbis-Guanyl- 1, 7-diaminoheptan, N1,N8-jbis-Guanyl-l, 8-diaminooktan, N1- Guanyl-1, 8-diaminooctan, N^Guanylcaldin, IS^-Guanylspermidin, N8-Guanylspermidin und bis-guanyliertem Spermidin (Hirudonin) .
Weiterhin hat sich überraschend gezeigt, daß eine Inokulierung von Ährchen des Weizens mit 10 μM CNI-1493 als Hemmstoff der Deoxyhypusinsynthase zu einer signifikanten Erhöhung des Korngewichts bei Weizen um ca. 20 % im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die mit Wasser inokuliert wurden (siehe Beispiel 4), führt (siehe Figur 4B) . Somit stellt dieser Hemmstoff eine wirksame Substanz dar, mit deren Hilfe durch äußere Anwendung der Ernteertrag von Nutzpflanzern erhöht werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird als Hemmstoff der Umwandlung der inaktiven Form des eukaryotisehen Initiationsfaktors 5A (eIF-5A) in die aktive Form zur Bekämpfung von Phytopathogenen auf Kulturpflanzen oder zur Erhöhung des Ernteertrages bei Kulturpflanzen eine Kombination von mindestens zwei Hemmstoffen verwendet. Diese Kombination umfasst bevorzugt entweder mindestens zwei Hemmstoffe der Deoxyhypusinsynthase (DHS) oder mindestens zwei Hemmstoffe der Deoxyhy- pusinhydroxylase (DHH) . In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die verwendete Kombination mindestens einen Hemmstoff der Deoxyhypusinsynthase (DHS) und mindestens einen Hemmstoff der Deoxyhypusinhydroxylase (DHH) .
Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Hemmstoff der DHH die ß- [N- (3-hydroxy-4-pyridon) ] -α-amino-propionsäure, die auch als Mimosin bezeichnet wird (siehe HANAUSKE-ABEL et al . (1996) Biochim. Biophys. Acta 1221:115-124).
Weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt sind DHH-Hemmstoffe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ciclopirox, 2 , 2 ' -Dipyridyl , Deferiprone und Deferoxamine (siehe CLEMENT et al . (2002) Int. J. Cancer 100:491-498). Für Ciclopirox ist in der Literatur bereits eine fungizide Wirkung gegenüber Dermathophyten und einigen anderen Pilzen beschrieben. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung eignen sich die DHH-Hemmstoffe (einschließlich Ciclopirox) in besonderer Weise als Wirkstoffe in den oben genannten Kombinationen.
Die Kulturpflanzen bei denen eine erfindungsgemäße Verwendung des Hemmstoffs zur Pathogenbekämpfung und/oder Wachstumsförderung vorgesehen ist, sind bevorzugt Getreidepflanzen und Mais. Dazu gehören bevorzugt Weizen, Hartweizen (Durum), Triticale, Gerste, Hafer, Roggen und Rüben. Die Liste ist nicht als abschließende Auflistung anzusehen, da der Hemmstoff erfindungsgemäß auch auf weiteren Kulturpflanzen verwendet werden kann, die mit den oben genannten Phytopathogenen befallen sind.
Die erfindungsgemäße Verwendung eines Hemmstoffs der Umwandlung der inaktiven Form des eukaryotischen Initiationsfaktors 5A (eIF-5A) in die aktive Form zur Bekämpfung von Phytopathogenen und/oder zur Förderung des Wachstums bei Kulturpflanzen kann im Gewächshaus oder im Freiland beispielsweise durch Verwendung einer Lösung erfolgen, welche die Substanz enthält. Die Lösung kann dabei einerseits auf die Pflanzen gesprüht, andererseits sind dem Fachmann weitere Möglichkeiten geläufig, die Lösung anzuwenden. Das Aufsprühen kann - soweit erforderlich - mehrfach erfolgen.
Idealerweise erfolgt das Aufbringen des Hemmstoffs zu den dem Fachmann bekannten Zeitpunkten, wenn das Risiko einer Infektion der Kulturpflanze mit einem Phytopathogen erhöht ist, beispielsweise während der Blühphase und bei bestimmten Witterungsverhältnissen. Mit einer abgestimmten Verwendung des Hemmstoffs kann einerseits eine Infektion optimal verhindert (präventive Anwendung) oder verringert, andererseits eine erfolgte Infektion effektiv verlangsamt oder unterdrückt werden (kurative Anwendung) .
Der Hemmstoff wird bei Gräsern beispielsweise bevorzugt während der Blüte bei Auftreten von feuchter Witterung durch Aufsprühen aufgebracht. Dem Fachmann sind weitere Möglichkeiten und die besten Zeitpunkte für eine Aufbringung des Hemmstoffs bekannt. Diese unterscheiden sich nicht von der Anwendung anderer Fungizide.
Die geeigneten Zeitpunkte für einen Fungizideinsatz und die Kriterien bezüglich der besten Art des Fungizideinsatzes sind dem Fachmann bekannt. Eine ausführliche Darstellung ist in entsprechenden Lehrbüchern des Pflanzenschutzes zu finden. Entsprechende Informationen werden auch von der Bundesoberbehörde und Bundesforschungsanstalt bba - Biologische Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft - veröffentlicht (vgl. z.B. die auf der Internetseite der bba (www.bba.de) vorhandenen Links „Pflanzenschutz" und „Datenbanken") .
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin eine Zusammensetzung für die erfindungsgemäße Verwendung zur Patho- genbekämpfung und/oder zur Wachstumsförderung, die eine Substanz oder eine Kombination von Substanzen, welche die Umwandlung der inaktiven Form des eukaryotischen Initiationsfaktors 5A (eIF-5A) in die aktive Form hemmt/hemmen, in Kombination mit Formulierungsmitteln (wie z.B. Emulgatoren, Benetzungsmitteln, Flowables etc.) umfasst. Die Zusammensetzung liegt dabei bevorzugt in Formulierungszuständen vor, die ihre Aktivität garantieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Zusammensetzung als Substanz, welche die Umwandlung der inaktiven Form des eukaryotischen Initiationsfaktors 5A (elF- 5A) in die aktive Form hemmt, einen Hemmstoff der Deoxyhypu- sinsynthase (DHS) .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung das tetravalente Guanylhydrazon CNI-1493 (vgl. obige Formel) als Hemmstoff der Deoxyhypusin- synthase (DHS) .
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung als Hemmstoff der Deoxyhypusin- synthase (DHS) das Jbis-diguanylierte Amin N1-guanyl-l, 7- diaminoheptan (GC7) . In einer weiter bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfin- dungsgemäße Zusammensetzung einen Hemmstoff der Dεoxyhypusin- synthase (DHS) mit einem IC50 von < 10 μM, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 1, 3-Diaminopropan, 1,7- Diaminoheptan, 1, 8-Diaminooctan, Spermidin, N1, N7-bis-Guanyl- 1, 7-diaminoheptan, N1,N8-Jbis-Guanyl-1, 8-diaminooctan, N1- Guanyl-1, 8-diaminooctan, N1-Guanylcaldin, N1-Guanylspermidin, N8-Guanylspermidin und bis-guanyliertem Spermidin (Hirudonin) .
Erfindungsgemäß kann die Zusammensetzung auch mindestens zwei Hemmstoffe umfassen. Eine solche Kombination kann sich erfindungsgemäß aus entweder mindestens zwei Hemmstoffen der Deoxy- hypusinsynthase (DHS) oder aus mindestens einem Hemmstoff der Deoxyhypusinsynthase (DHS) und mindestens einem Hemmstoff der Deoxyhypusinhydroxylase (DHH) zusammensetzen.
Vorzugsweise umfasst die Kombination als Hemmstoff der Deoxyhypusinhydroxylase (DHH) die ß- [N- (3-Hydroxy-4-pyridone) ] -α- amino-propionsäure (auch als Mimosin bezeichnet) .
Weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt umfasst die Kombination einen DHH-Hemmstoff ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ciclopirox, 2, 2' -Dipyridyl, Deferiprone und Deferoxamine .
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen und Figuren eingehender beschrieben, ohne darauf beschränkt zu sein.
Beschreibung der Figuren
Figur 1 Inhibierung der Keimung von Fusarium graminearum in Kultur durch verschiedene Konzentrationen des Hemmstoffs CNI-1493 im Kulturmedium. Verglichen mit den Kontrollen (reines Medium ("Kontrolle") bzw. reines Medium und DMSO ("Kontrolle + DMSO")) wirkt der Hemmstoff im Kulturmedium ab Konzentrationen von 1 uM deutlich inhibierend auf die Keimfähigkeit des Pilzes. Ein Vergleich zwischen der Leerkontrolle und der DMSO-Kontrolle zeigt, daß DMSO als Lösungsmittel des Hemmstoffs keinen Einfluß auf die Keimfähigkeit hat. Die Werte wurden aus 8 Parallelen ermittelt. Beim Ansatz mit 1 μM CNI-1493 konnte nach Inku- bierung über 72 h nur bei 2 der 8 Wiederholungen ein Wachstum der Myzelien beobachtet werden (Symbol "*"), nach einer Inkubierung über 144 h nur bei 3 der 8 Wiederholungen (Symbol "**") .
Figur 2 Inhibierung der Infektion von Weizenährchen mit Fusarium graminearum in Anwesenheit von CNI-1493. Die mit Pfeilen gekennzeichneten Ährchen wurden jeweils mit Wasser ("Kontrolle"), mit einer Suspension aus 200 Fusarium graminearum Wildtyp-Konidien in entweder Wasser ("F. graminearum wt") oder Wasser + DMSO ("F. graminearum wt + DMSO") sowie mit einer Suspension aus 200 Fusarium graminearum Wildtyp-Konidien in Wasser und 10 μM CNI- 1493 (in DMSO gelöst; "F. graminearum wt + CNI-1493") inokuliert. Während sich DMSO auf die Infektion und das Wachstum des Pilzes nicht auswirkt (erkennbar an der Chlorophyllabnahme in der Ähre und dem sichtbaren weißlichen Pilzmyzel) , verhindert die Anwesenheit des Hemmstoffs in der Konidienlösung eine Infektion der Ährchen und ein Wachstum des Pilzes weitgehend (kaum Verfärbungen der Ähre und kein sichtbares Pilzmyzel) . Der Patho- genitätstest wurde für jedes Inokulierungsexperiment fünfzehnfach wiederholt. Die dargestellten Ähren stellen das durchschnittliche Infektionsbild für den jeweiligen Infektionstyp dar. Figur 3 Bestimmung des Einflusses von CNI-1493 auf die Ährenreifung beim Weizen. Es wurden jeweils die durch Pfeile gekennzeichneten zwei zentrale Ährchen pro Ähre (Ähre 2 und 4 in Figur 3) bzw. 4 Ährchenpaare pro Ähre (Ähre 3 und 5 in Figur 3) mit Wasser ("Kontrolle"), Wasser und 1 μl DMSO ("Wasser + DMSO") oder mit CNI-1493 (1 μl gelöst in DMSO) auf 10 μl Wasser ("Wasser + CNI-1493 in DMSO") inokuliert. Die Inokulierung der zwei zentralen Ährchen wurde jeweils zweifach, die Inokulierung der 4 Ährchenpaare wurde jeweils mindestens siebenfach wiederholt. Die Körner aus diesen Ähren, die sich optisch nicht erkennbar unterscheiden, wurden für die Bestimmung des Korngewichts verwendet (siehe Figur 4) .
Figur 4 Einfluß des CNI-1493 auf die Qualität und das Gewicht der Weizenkörner. Die Körner wurden aus den Ähren aus Figur 3 geerntet und wurden in verschiedene Gruppen aufgeteilt: Körner von unbehandelten Ähren ("Kontrolle"), Körner aus inokulierten Ährchen ("DMSO+" bzw. "CNI- 1493+") bzw. Körner von unbehandelten Ährchen, bei denen auf der gleichen Ähre 2 zentrale Ährchen oder 4 Ährchenpaare inokuliert wurden ("DMSO-" bzw. "CNI-1493-") . Optisch besteht kein sichtbarer Unterschied bezüglich der Körnerqualität der einzelnen Gruppen (siehe Figur 4A) . Für die Darstellung in Figur 4B wurden die Körner der einzelnen Gruppen zufällig in Zehnergruppen eingeteilt und gewogen. Durch die Inokulierung mit DMSO war das Korngewicht im Vergleich zur Kontrolle signifikant um ca. 6%, als Folge einer Inokulierung mit CNI-1493 signifikant um ca. 20 % erhöht.
Ein Vergleich der Korngewichte von Körnern der Gruppen "DMSO+" und "DMSO-" untereinander, beziehungsweise von "CNI-1493+" und "CNI-1493-" untereinander ergab keine signifikante Unterschiede. Die Fehlerbalken geben ein Konfidenzintervall mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von α = 0,05 wieder. BEISPIELE
Beispiel 1
Inhibierung der Keimung von Fusarium graminearum in Kultur durch den Hemmstoff CNI-1493
Zur Quantifizierung des inhibitorischen Effekts von CNI-1493 auf die Keimung von Fusarium graminearum wurde ein wie von JANSEN et al . (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (2005) 102:16892- 16897) beschriebener GFP-markierter Fusarium graminearum- Wildtyp-Stamm verwendet. 20 μl Konidiensuspension (400 Konidi- en bei 20 Konidien pro μl) in 180 μl SNA-Medium (0,1 % (w/v) KH2PO4, 0,1 % (w/v) KNO3, 0,05 % (w/v) MgSO4, 0,05 % (w/v) KCl, 0,02 % (w/v) Glucose, 0,02 % (w/v) Saccharose, 0,06 % (v/v) 1 N NaOH) wurden mit jeweils 8 Parallelen in einer PS- Mikrotiterplatte 96 (Firma greiner bio-one GmbH, Frickenhau- sen) mit 96 Vertiefungen in Anwesenheit folgender Substanzen inkubiert :
Kontrolle: kein weiterer Zusatz
Kontrolle + DMSO: Zusatz von 2μl reinem DMSO
CNI-1493: Zusatz von 2 μl CNI-1493 gelöst in DMSO zur
Einstellung der angegebenen Endkonzentration des CNI-1493
Ab einer Endkonzentration von 100 μM fiel der Hemmstoff CNI- 1493 im Kulturmedium aus. Die Mikrotiterplatten wurden bei 150 UpM und 28 °C für die angegebene Zeit inkubiert (12, 24, 36 und 48 h) . Nach Beendigung der Inkubierung wurden die Platten in dem Fluoreszenz-Plattenlesegerät Flouroskan II der Firma Labsystems, Dynex Hybaid Labsystems, Frankfurt, ausgelesen und mittels der Bestimmung der Fluoreszenz der bei Keimung der Konidien aus diesen hervorgehenden Hyphen das Wachstum im vergleich zur Wirkstofffreien Kontrolle bestimmt (siehe Figur 1) . Ein Vergleich der Ergebnisse der Leerkontrolle und der DMSO- Kontrolle zeigen, daß DMSO als Lösungsmittel für den Hemmstoff keinen inhibierenden Effekt auf die Keimung der Konidien hat. Die Keimung von Fusarium graminearum-Konxdien wurde jedoch durch den Hemmstoff beginnend mit einer Endkonzentration von 1 μM deutlich inhibiert, bei einer Endkonzentration von 10 μM CNI-1493 war kein Wachstum mehr nachweisbar. Bei der Inkubie- rung der Konidien in Anwesenheit von 1 μM CNI-1493 konnte nach 72 h nur in 2 der 8 Parallelen ein Myzelwachstum (Symbol "*" in Figur 1) , nach 144 h nur in 3 der 8 Parallelen (Symbol "**" in Figur 1) beobachtet werden.
Beispiel 2
Inhibierung einer Infektion von Weizenährchen mit Fusarium gra- minearum durch CNI-1493
Um die Pathogenität von Fusarium graminearum (F. graminearum) in Anwesenheit des Hemmstoffs zu testen, wurden 2 zentrale Ährchen je Ähre von in der Klimakammer wie in VOIGT et al. (Plant J. 42: 364-375 (2005) beschrieben angezogenen Weizenpflanzen der Sorte Nandu (Lochow-Petkus, Bergen-Wohlde) mit den folgenden Lösungen inokuliert :
"Kontrolle" : 10 μl Wasser
"F. graminearum wt" : 200 Konidien in 10 μl Wasser
"F. graminearum wt + DMSO": 200 Konidien in 9μl Wasser und 1 μl DMSO
"F. graminearum wt + CNI-1493" 200 Konidien in 9 μl Wasser und lμl CNI-1493 in DMSO (Endkonzentration 10 μM)
Die mit Pfeilen gekennzeichneten Ährchen (siehe Figur 2) wurden jeweils entweder mit Wasser ("Kontrolle"), mit einer Suspension aus 200 Fusarium-Konidien in Wasser ("F. graminearum wt") oder Wasser + DMSO ("F. graminearum wt + DMSO") sowie mit einer Suspension aus 200 Fusarium-Konidien in Wasser und 10 μM CNI-1493 (in DMSO gelöst; "F. graminearum wt + CNI-1493") inokuliert. Nach der Inokulierung wurden die Pflanzen weitere 21 Tage in der Klimakammer unter den bei VOIGT et al . (loc. cit.) beschriebenen Bedingungen gehalten, bevor der Pilzbefall visuell begutachtet und ausgewertet wurde (siehe Tabelle 1) . Dazu wurde das Verhältnis aus der Zahl der befallenen Ährchen und der Gesamtzahl der Ährchen bestimmt.
Bei der Auswertung des Versuches, die 3 Wochen nach der Inokulierung erfolgte, wurden teilweise oder vollständig ausgeblichene Ährchen als infiziert bewertet. Ährchen mit nur geringfügigen Veränderungen (kleinen gelben oder braunen Punkten) wurden nicht gezählt. Die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse stellen den Mittelwert von 15 mit jeweils 400 Konidien inokulierten Weizenähren (2 Ährchen pro Ähre mit jeweils 200 Konidien inokuliert) dar.
Tabelle 1 Inhibierung einer Infektion von Weizenährchen mit Fu- sarium graminearum durch CNI-1493
Figure imgf000026_0001
a Versuchswiederholungen ergaben das gleiche Ergebnis b Konfidenzinterval1 mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von α = 0, 05
Während eine Inokulierung mit Konidien in DMSO keine signifikante Auswirkungen auf die Infektion der Ährchen mit dem Pilz und das Wachstum des Pilzes hat (88,6 % Infektion gegenüber 93,1 % in der Kontrolle; in Figur 2 visuell erkennbar an der deutlichen Abnahme des Chlorophyllgehalts in den Ähren und dem gut sichtbaren weißlichen Pilzmyzel) , wird ein Wachstum des Pilzes durch den Hemmstoff CNI-1493 in der Konidienlösung weitgehend unterdrückt (4,3 % Infektion gegenüber 88,6 %; in Figur 2 sind bei den entsprechenden Proben kaum Verfärbungen der Ähre und kein Pilzmyzel erkennbar) . Beispiel 3
Einfluß von CNI-1493 auf die Ährenreifung beim Weizen
In diesem Versuch wurde der Einfluß des Hemmstoffs CNI-1493 auf die Reifung der Ähren untersucht. Mit Ausnahme der unbehandelten Kontrolle wurden pro Ansatz jeweils zwei Ähren parallel behandelt. Bei der einen Ähre wurden zwei zentrale Ährchen, bei der anderen 4 Ährchenpaare pro Ähre an den durch Pfeile bezeichneten Orten mit den folgenden Lösungen inokuliert (siehe Figur 3) :
"Kontrolle": 10 μl Wasser
"Wasser + DMSO" : 9 μl Wasser und 1 μl DMSO
"Wasser + CNI-1493 in DMSO": lμl CNI-1493 in DMSO und 9 μl
Wasser (Endkonzentration 10 μM)
Die Inokulierung der zwei zentralen Ährchen wurde jeweils zweifach, die Inokulierung von 4 Ährchenpaaren wurde jeweils mindestens siebenfach wiederholt. Der in Figur 3 dargestellte Zustand und die Reife der Ähren sind für den jeweiligen Versuch repräsentativ.
Dieser Versuch zeigt, daß durch die Inokulierung der Pflanzen mit dem Lösungsmittel DMSO die Pflanze nicht geschädigt wird bzw. die pflanzliche Entwicklung durch das Lösungsmittel nicht erkennbar negativ beeinflusst wird. Dies wird dadurch deutlich, daß sich die Ähren optisch nicht voneinander unterscheiden.
Beispiel 4
Einfluß des Hemmstoffs CNI-1493 auf die Qualität und das
Gewicht der Weizenkörner
Für die Bestimmung von Veränderungen bei der Qualität und dem Gewicht von Weizenkörnern durch eine Behandlung der Ährchen mit CNI-1493 wurden die Körner aus den Ähren aus Beispiel 3 geerntet und je nach Art der Inokulierung und Lokalisierung der Körner in der Ähre nach dem folgenden Schema aufgeteilt:
"Kontrolle": Körner aus den unbehandelten Ähren
"DMSO+": Körner aus direkt mit DMSO inokulierten Ährchen
"DMSO-": Körner aus Ährchen, die mit DMSO inokulierten
Ährchen benachbart waren
"CNI-1493+" : Körner aus direkt mit CNI-1493 inokulierten Ährchen
"CNI-1493-": Körner aus Ährchen, die mit CNI-1493 inokulierten Ährchen benachbart waren
Durch Betrachtung der Körner aus den Versuchen "DMSO+" und CNI-1493+" wurden die direkte unmittelbaren Wirkungen einer Gabe von DMSO bzw. CNI-1493, durch Betrachtung der Körner "DMSO-" und CNI-1493-" die systemischen Wirkungen einer Gabe von DMSO bzw. CNI-1493 beurteilt.
Wie aus Figur 4A ersichtlich ist, besteht kein sichtbarer Unterschied bei der Körnerqualität Unterschied zwischen den einzelnen Gruppen.
Für eine Bestimmung des Körnergewichts wurden die Körner der einzelnen Körnertypen zufällig in Zehnergruppen eingeteilt und gewogen. Für jede Körnergruppe wurden so mindestens 7 Zehnergruppen erhalten. In Figur 4 ist als Abbildung B das Körnergewicht der einzelnen Typen dargestellt. Durch die Inokulierung der Ährchen mit DMSO bzw. CNI-1493 war das Korngewicht im Vergleich zur Kontrolle erhöht. Die Inokulierung der Ährchen mit DMSO führte zu einer signifikant Steigerung des Korngewichts von ca. 6%. Da zwischen den Proben "DMSO+" und "DMSO-" kein signifikanter Unterschied vorlag, scheint DMSO sowohl direkt als auch systemisch zu einer geringfügigen Steigerung des Korngewichts zu führen.
Eine deutlichere Steigerung wurde durch eine Inokulierung mit CNI-1493 erzielt, die zu einem signifikant um ca. 20 % erhöhten Korngewicht führte . Auch hier zeigt sich kein Unterschied zwischen einer direkter und einer systemischen Wirkung, da sich die Korngewichte der Körner der Typen HCNI-i4y3+i! und "CNI-i493-i! nicht signifikant unterschieden. Die Fehlerbalken in der Abbildung B in Figur 4 geben ein Konfidenzintervall mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von α = 0,05 wieder.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer Substanz, welche die Umwandlung der inaktiven Form des eukaryotischen Initiationsfaktors 5A (elF- 5A) in die aktive Form hemmt, zur Bekämpfung von Phytopa- thogenen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Phytopathogene Phytopathogene von Kulturpflanzen sind.
3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Phytopathogene phytopathogene Pilze sind.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die phytopathogenen Pilze aus der Gruppe bestehend aus den Gattungen Alternaria, Bipolaris, Blumeria, Botrytis, Bre- mia, Calviceps, Cercospora, Cladosporium, Colletotrichum, Corynespora, Diaporthe, Diplocarpon, Drechslera, Elsinoe, Erysiphe, Fusarium, Gaeumannomycetes, Gibberella, Gloeo- des, Gloeosporium, Glomerella, Gymnosporangium, Leptothry- ium, Leveillula, Mycosphaerella, Peronospora, Phaeoisa- riopsis, Phomopsis, Phyllactinia, Physalospora, Phyto- phthora, Plasmopara, Podosphaera, Pseudocercosporella, Pseudoperonospora, Puccinia, Pyricularia, Pythium, Rhizoc- tonia, Sclerotinia, Sphaceloma, Sphaerotheca, Stagonos- pora, Tilletia, Typhula, Uncinula, Uromyces, Ustilago und Verticilliumausgewählt sind.
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die phytopathogenen Pilze Pilze der Gattung Fusarium sind.
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die phytopathogenen Pilze der Gattung Fusarium aus der Gruppe bestehend aus Fusarium dimerium, Fusarium culmorum, Fusarium merismoides, Fusarium decemcellulare, Fusarium chlamydosporum, Fusarium moniliforme, Fusarium prolifera- tum, Fusarium anthophilum, Fusarium subglutinans, Fusarium nygamai , Fusarium sambucinum, Fusarium crookwellense, Fu- sarium graminearum, Fusarium moniliforme, Fusarium oxyspo- rum, Fusarium poae, Fusarium avenaceum spp. avenaceum, Fusarium avenaceum spp. aywerte, Fusarium avenaceum spp. nurragi , Fusarium heterosporum, Fusarium acuminatum spp. acuminatum, Fusarium acuminatum spp. armeniacum, Fusarium longipes , Fusarium compactum, Fusarium equiseti , Fusarium scripi, Fusarium polyphialidicum, Fusarium semitectum, , Fusarium beomiforme, Fusarium tricinctum, Fusarium spo- rotrichioides, Fusarium torulosum, Fusarium sambucinum Fusarium solani, Fusarium verticillioides, Fusarium graminearum, Fusarium pseudograminearum und Fusarium lateritium ausgewählt sind.
7. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die der phytopathogene Pilz das Mutterkorn {Claviceps pur- purea) ist.
8. Verwendung einer Substanz, welche die Umwandlung der inaktiven Form des eukaryotisehen Initiationsfaktors 5A (elF- 5A) in die aktive Form hemmt, zur Wachstumsförderung bei Kulturpflanzen.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein Hemmstoff der Deoxyhy- pusinsynthase (DHS) ist.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Hemmstoff das tetravalente Guanylhydrazon CNI-1493 der Formel
Figure imgf000032_0001
oder ein Salz oder Komplex desselben ist.
11. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Hemmstoff das £>is-diguanylierte Amin N1-guanyl-l, 7- diaminoheptan (GC7) ist.
12. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Hemmstoff der Deoxyhypusinsynthase (DHS) eine IC50 von < 10 μM aufweist.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Hemmstoff der Deoxyhypusinsynthase (DHS) mit einer IC50 von < 10 μM aus der Gruppe bestehend aus 1,3- diaminopropan, 1, 7-Diaminoheptan, 1, 8-Diaminooctan, Sper- midin, N1,N7-Jbis-Guanyl-1, 7-diaminoheptan, N1,N8-Jbis- Guanyl-1, 8-diaminooctan, fc^-Guanyl-l, 8-diaminooctan, N1- Guanylcaldin, N1-Guanylspermidin, N8-Guanylspermidin und bis-guanyliertem Spermidin (Hirudonin) ausgewählt ist.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz eine Kombination von mindestens zwei Hemmstoffen ist.
15. Verwendung nach Ansprüche 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Kombination entweder mindestens zwei Hemmstoffe der Deoxyhypusinsynthase (DHS) gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13 oder die Kombination mindestens einen Hemmstoff der Deoxyhypusinsynthase (DHS) gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13 und mindestens einen Hemmstoff der Deoxyhypusinhydroxy- lase (DHH) umfasst.
16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Hemmstoff der Deoxyhypusinhydroxylase (DHH) aus der Gruppe bestehend aus ß- [N- (3-hydroxy-4-pyridone) ] -α-amino- propionsäure, Ciclopirox, 2, 2' -Dipyridyl, Deferiprone und Deferoxamine ausgewählt ist.
17. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturpflanzen Getreidepflanzen und Mais sind.
18. Zusammensetzung zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Substanz oder mehrere Substanzen, welche die Umwandlung der inaktiven Form des eukaryotischen Initiationsfaktors 5A (eIF-5A) in die aktive Form hemmt oder hemmen, in Kombination mit Formulierungsmitteln umfasst.
19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierungsmittel aus Emulgatoren, Benetzungsmitteln oder Flowables ausgewählt sind.
20. Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein Hemmstoff der Deoxyhypusinsynthase (DHS) gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13 ist.
21. Zusammensetzung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung eine Kombination von entweder mindestens zwei Hemmstoffen der Deoxyhypusinsynthase (DHS) gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13 oder eine Kombination von mindestens einem Hemmstoff der Deoxyhy- pusinsynthase (DHS) gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13 und mindestens einem Hemmstoff der Deoxyhypusinhydroxylase (DHH) urnfasst.
22. Zusammensetzung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Hemmstoff der Deoxyhypusinhydroxylase (DHH) aus der Gruppe bestehend aus ß- [N- (3-hydroxy-4-pyridone) 3 -α- amino-propionsäure, Ciclopirox, 2, 2 ' -Dipyridyl, Deferipro- ne und Deferoxamine ausgewählt ist.
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