CN113481235A - 一种简化的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化方法 - Google Patents

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CN113481235A CN202110941957.6A CN202110941957A CN113481235A CN 113481235 A CN113481235 A CN 113481235A CN 202110941957 A CN202110941957 A CN 202110941957A CN 113481235 A CN113481235 A CN 113481235A
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Abstract

本发明涉及一种简化的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化方法，属于农业生物技术领域。斜切胚芽鞘下部与伸长区的分界位置获得玉米茎尖转化受体；将玉米茎尖转化受体在农杆菌液OD600为0.65，真空渗透压为0.050MPa，真空处理时间为3min，乙酰丁香酮最终浓度为150μM的条件下进行侵染，培养3周，经除草剂Basta初筛获得抗性苗或者经PCR检测证明外源基因已转入玉米基因组DNA中。经PCR检测T1代转化植株，证明外源基因可遗传至后代。本发明首次针对玉米建立简化的不依赖于组织培养的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化体系，对玉米遗传转化技术具有重要意义，可以有效推进玉米分子育种进程。

Description

一种简化的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化方法
一、技术领域
本发明涉及一种简化的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化的方法，属于农业生物技术领域。
二、背景技术
玉米是世界三大主粮之一，同时也是重要的工业原料和饲料来源。随着我国经济不断发展及人口大规模化和城市化，肉类和乳制品消费需求不断增加，以及玉米乙醇燃料产业的蓬勃发展，玉米的种植面积及产量逐渐增加。传统的玉米育种主要依赖于玉米杂交育种，但是传统杂交育种过程缓慢，同时我国玉米种质资源狭窄等突出问题也限制我国玉米育种。随着转基因技术的发展，通过转基因技术提高玉米产量和品质成为玉米育种的重要途径。
自1975年以来，通过从玉米幼胚、未成熟花序、雌雄幼穗等外植体诱导诱导成愈伤组织，再经过植物组织培养过程，诱导成植株。但是由于玉米遗传背景复杂、愈伤诱导率低、基因组较大，再生植株成活率低等问题，玉米遗传转化仍然受到许多因素的限制。目前在玉米遗传转化中主要采用幼胚作为外植体的转化方法。玉米幼胚通过植物组织培养诱导愈伤组织，进而再生分化出植株，但幼胚作为受体材料的缺点在于受体材料的获取受季节限制严重，幼胚诱导愈伤组织的过程受基因型影响较大，并且在组织培养过程中存在着无菌操作环境要求严格、操作时间长、工作量大、植物材料易出现褐化、玻璃化等问题。因此，建立一种不依赖于植物组织培养的玉米遗传转化的方法对加快玉米分子育种具有十分重要的意义。
玉米茎尖的取材方便，基因型的依赖性小，并且玉米茎尖分生组织具有高度的分裂和分化能力、高效再生潜力等特点，因此可以做为遗传转化的材料。1996年Zhong等通过基因枪转化法对玉米的茎尖分生组织进行轰击，诱导丛生芽后得到了遗传转化玉米植株，证明玉米茎尖分生组织可以作为玉米遗传转化的受体材料。Zhang等对玉米自交系B73进行茎尖组织培养，并通过基因枪转化法实现了玉米茎尖的转化。但是基因枪的转化频率与受体种类、微弹大小、轰击压力、制止盘与金颗粒的距离、受体预处理、受体轰击后培养有直接关系，由于影响因素较多，因此转化效果不稳定，成功率低，实际运用中难以获得转化玉米植株。Sidorov等采用玉米茎尖分生组织诱导胚型愈伤组织，再经农杆菌侵染方法获得了转基因植株。张举仁等采用农杆菌侵染茎尖分生组织，并经过组织培养方法来获得转基因植株。虽然以上两种方法采用农杆菌侵染玉米茎尖分生组织，然而都需要经过时间漫长的组织培养过程，存在着对无菌操作环境要求严格、工作量大、获得转基因植株时间长等问题。因此建立一种操作简单不依赖于组织培养的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化方法对玉米遗传转化技术具有重要意义，从而有效推进玉米分子育种进程。
三、发明内容
技术问题
本发明的目的是针对玉米转化中存在着基因型依赖性强、转化受体季节时间限制高、组织培养过程中出现的存在着对无菌操作环境要求严格、工作量大、获得转基因植株时间长等问题，专门对玉米茎尖遗传转化进行了系统深入研究，建立一种简化的不依赖于组织培养的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化方法，为玉米遗传转化技术和推进玉米分子育种进程奠定基础。
技术方案
一种简化的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化的方法，其特征在于，斜切玉米胚芽鞘下部与伸长区的分界位置，获得玉米茎尖转化受体。具体步骤包括：
1)玉米茎尖转化受体的准备
取成熟的玉米种子，浸泡后避光萌芽，待玉米胚芽长至0.8-1.5cm时，斜切胚芽鞘下部与伸长区的分界位置，切面肉眼看到白色倒三角形，即为获得的玉米茎尖转化受体；
2)带有目的基因的植物双元表达载体的农杆菌转化
带有目的基因的植物双元表达载体转化农杆菌感受态菌株，于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃和48h，挑取单克隆于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平液体培养基震荡培养，培养条件为28℃和12h，震荡速度200r·min-1，采用碱裂解法提取质粒并进行PCR检测，经验证后含有载体的农杆菌菌液则可用于下一步，添加终浓度20％(体积比)的甘油至农杆菌菌液，-80℃长期保存；
取出存放在-80℃保存的农杆菌菌液，置于冰中融解，在无菌超净台中，于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃和48h，在无菌超净台中，用接种环挑取活化的农杆菌菌株，均匀地划线于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固体培养基平板中，培养条件为28℃和48h；
3)农杆菌重悬液的制备
取生长的转化的农杆菌的YEP固体培养基平板，倒入蒸馏水，重悬菌体至烧杯中，获得农杆菌重悬液；
4)真空渗透法转入目的基因
将玉米茎尖转化受体放在农杆菌重悬液中，在真空条件下进行农杆菌侵染，侵染后覆土进行常规培养；
5)转基因植株的获得
3周后，待玉米植株长至3-4叶期，取新叶，CTAB法提取DNA进行PCR鉴定，鉴定完成后，移栽，待T0转化植株结种；
取T0代转化植株种子，种于基质中，出苗后取T1代转化玉米植株叶片，提取DNA进行PCR鉴定。
所述带有目的基因的植物双元表达载体可以为载体pCUN-NHF或载体pCAMBIA1300-221-3×Flag：
根据载体pCUN-NHF中膦丝菌素乙酰转移酶基因bar序列设计特异性反应引物bar-F和bar-R：
bar-F：5’-ATCGAGACAAGCACGGTCAAC-3’
bar-R：5’-AAACCCACGTCATGCCAGTTC-3’；
转化载体pCUN-NHF的玉米植株，分别以转化植株和野生玉米植株的DNA为模板，以bar-F和bar-R为引物，进行PCR扩增，PCR鉴定结果表明，野生玉米植株没有扩增任何条带，而转化植株在404bp处扩增出一条清晰的条带，扩增产物经测序分析表明与膦丝菌素乙酰转移酶基因bar核苷酸序列一致，证明外源基因已转入到玉米基因组DNA中；
或根据载体pCAMBIA1300-221-3×Flag的氨基葡糖苷磷酸转移酶基因HygR序列，设计特异性反应引物HygR-F和HygR-R：
HygR-F：5’-GGATTGATGTGATAACATGGTGG-3’
HygR-R：5’-GCAAACTGTGATGGACGACA-3’
转化载体pCAMBIA1300-221-3×Flag的玉米植株，分别以转化植株和野生玉米植株的DNA为模板，以HygR-F和HygR-R为引物，进行PCR扩增，结果表明，野生玉米植株没有扩增任何条带，而转化植株在1352bp处扩增出一条清晰的条带，扩增产物经测序分析表明与氨基葡糖苷磷酸转移酶基因HygR核苷酸序列一致，证明外源基因已转入到玉米基因组DNA中。
所述农杆菌为LBA4404。所述玉米的品种可以为自交系或杂交种。
有益效果
本发明提供的农杆菌介导的玉米茎尖转化方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：
1.不同的材料、不同的方法对茎尖受体的取材方法不同。本发明现有技术针对玉米茎尖做了大量的研究，在遗传转化的方法上存在各种缺陷。大多数没有公开玉米茎尖分生组织受体的取材方法。因此本发明首先针对玉米茎尖受体取材进行了大量的摸索，发现玉米茎尖组织结构比较复杂特殊，通过大量的试验摸索，偶然找到玉米胚芽长至0.8-1.5cm时的胚芽鞘下部与伸长区的明显分界位置。并通过大量试验摸索了农杆菌介导的玉米茎尖转化方法中对玉米茎尖转化受体应该斜切，位置必须是胚芽鞘下部与伸长区的明显分界位置，切口切面应该有肉眼可见白色倒三角形，这样最大程度裸露出茎尖分生组织做受体，才能获得成功用于后续遗传转化。
本发明长期摸索试验表明，玉米胚芽鞘过短(小于0.8cm)或过长(大于1.5cm)，切割方式为横切或者纵切，则无法成功获得转基因植株。本发明经过无数次试验发现，若斜切位置偏离胚芽鞘下部与伸长区的明显分界位置：斜切位置偏上(图5A-B)，在转化侵染后，无法成功获得转基因植株，见图5E所示；而斜切位置偏下(图5C-D)，在覆土培养过程中无法长出植株。
2.本发明并通过试验摸索研究得出，无需配方复杂的农杆菌重悬液，用蒸馏水替代，可获得成功转化植株，减少转化过程中试剂成本。
3.本发明首次针对玉米建立操作简单不依赖于组织培养的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化体系，并对其转化条件进行了摸索和系统深入研究，对玉米遗传转化技术具有重要意义，为后续的玉米分子育种工作提供了最基本的方法。
4.遗传转化体系建立中，对影响玉米遗传转化条件如农杆菌浓度OD600、真空渗透压、真空处理时间、乙酰丁香酮浓度进行了优化，获得了最佳遗传转化条件。
5.在遗传后代效果上，针对T1代玉米转化植株进行追踪检测，证明外源基因可遗传至后代，可为玉米分子育种工作提供了依据。
四、附图说明
图1植物双元表达载体pCUN-NHF和pCAMBIA1300-221-3×Flag的T-DNA区
图2农杆菌介导的自交系玉米茎尖遗传转化过程
A：玉米种子萌发；B：挑选玉米种子；C：暴露玉米茎尖分生组织；
D：侵染后玉米种植；E：长至3-4叶期玉米植株；F：阳性转化玉米植株移栽；
G：玉米授粉；H：玉米收种。
图3玉米茎尖斜切示意图
1：胚芽鞘；2：分界位置；3：伸长区；4：斜切切面。
图4不同除草剂Basta浓度下玉米表型与存活率统计
A：不同Basta浓度下玉米表型；B：不同Basta浓度下玉米存活率统计
图5斜切位置偏离茎尖生长点及PCR鉴定
图6T0代转pCUN-NHF载体玉米植株的PCR鉴定
M：DNAmarker；P：阳性对照；H2O：空白对照；WT：野生型；1-18：玉米转化植株
图7T1代转pCUN-NHF载体转基因玉米植株PCR鉴定
M：DNAmarker；P：阳性对照；H2O：空白对照；WT：野生型；1-10：T1代玉米转化植株
图8农杆菌介导的杂交种玉米茎尖遗传转化过程
A：玉米种子萌发；B：暴露玉米茎尖分生组织；
D：侵染后玉米种植；E：长至3-4叶期玉米植株；F：T0代转pCAMBIA1300-221-3×Flag载体转基因玉米植株PCR鉴定
图9T1代转pCAMBIA1300-221-3×Flag载体转基因玉米植株PCR鉴定
M：DNAmarker；P：阳性对照；H2O：空白对照；WT：野生型；1-6：T1代玉米转化植株
五、具体实施方式
下面结合实施例，对本发明做进一步的详细说明。
实施例1：采用本方法获得自交系转基因玉米植株
1)自交系玉米茎尖转化受体的准备
取成熟的自交系‘B73’(公知公用)玉米种子，将玉米种子浸泡24h后，放入装有铺有吸水纸的盘中，加入适量的水，用黑色塑料袋包好，放置室温环境中避光萌芽2d。待玉米胚芽长至0.8-1.5cm时，斜切胚芽鞘下部与伸长区的明显分界位置，切面有肉眼可见白色倒三角形，去掉切除的胚芽鞘，即可获得玉米茎尖转化受体。见图2A-C和图3所示。
本发明在长期摸索过程中经过无数次试验发现，若斜切位置偏离胚芽鞘下部与伸长区间的分界位置：斜切位置偏上(图5A-B)，在转化侵染后，无法成功获得转基因植株，见图5E所示；而斜切位置偏下(图5C-D)，在覆土培养过程中无法长出植株。玉米胚芽鞘过短(小于0.8cm)或过长(大于1.5cm)，或者切割方式为横切或者纵切，则无法成功获得转基因植株。
2)植物双元表达载体的农杆菌转化
植物双元表达载体pCUN-NHF[Xiang Yang，Sun Xiujuan，Bian Xiangli，etal.The transcription factor ZmNAC49 reduces stomatal density and improvesdrought tolerance in maize.Journal of Experimental Botany，2021，72(4)：1399-1410]，载体见图1A，采用液氮冷冻法转化农杆菌LBA4404感受态菌株，于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃和48h，挑取单克隆于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平液体培养基震荡培养，培养条件为28℃和12h，震荡速度200r·min-1，采用碱裂解法提取质粒[提取步骤参照康为世纪质粒小提试剂盒(Cat.#CW0500)说明书]并进行PCR检测，经验证后含有质粒pCUN-NHF的农杆菌菌液则可用于下一步。添加终浓度20％(体积比)的甘油至农杆菌菌液，-80℃长期保存。
取出存放在-80℃保存的农杆菌菌液，置于冰中融解。在无菌超净台中，于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃和48h。在无菌超净台中，用接种环挑取少量活化的农杆菌菌株，均匀地划线于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固体培养基中，培养条件为28℃和48h。
3)农杆菌重悬液的制备
拆开上述固体培养基平板的封口膜，倒入少许蒸馏水，用涂布棒将平板上生长的农杆菌均匀地刮下，重悬菌体至烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌重悬。用紫外分光光度计调整农杆菌菌液OD600，获得OD600为0.60、0.65、0.70、0.75、0.80的农杆菌重悬液，并加入乙酰丁香酮，使其最终浓度为50、100、150、200、250μM，用于后续侵染。
4)真空渗透法转入目的基因
将玉米茎尖转化受体放入含有上述浓度的乙酰丁香酮和农杆菌重悬液中侵染，然后放入0.045、0.050、0.055、0.060、0.065MPa各种真空环境，侵染时间为1、3、5、7、9min，使农杆菌侵染茎尖分生组织细胞，侵染条件见表1所示。侵染完成后，迅速栽入基质中(营养土：蛭石＝1：1)，见图2D所示。覆上基质后，进行常规培养。
5)转基因植株的获得
待玉米植株长至3-4叶期时，见图1E所示。先使用50mg·L-1除草剂Basta涂抹，玉米叶片进行初步筛选，见图2F和图4所示。取存活植株新叶，采用CTAB法[高俊凤，植物生理学实验指导，高等教育出版社，2006，151-152]提取基因组DNA。根据膦丝菌素乙酰转移酶基因bar序列设计特异性反应引物bar-F(正向引物)和bar-R(反向引物)。
bar-F：5’-ATCGAGACAAGCACGGTCAAC-3’
bar-R：5’-AAACCCACGTCATGCCAGTTC-3’
分别以抗性植株和野生玉米植株的DNA为模板，以bar-F和bar-R为引物，进行PCR扩增。
扩增体系(15μL)：
2×M5HiPerTaqPCRmix10μL，10μM正向引物0.5μL，10μM反向引物0.5μL，DNA模板4μL，ddH2O5μL。
扩增程序：
95℃3min；94℃30s，52℃25s，72℃25s，32cycles；72℃5min。4℃保存。
图6所示PCR鉴定结果表明，野生玉米植株没有扩增任何条带，而抗性植株在404bp处扩增出一条清晰的条带，扩增产物经测序分析表明与膦丝菌素乙酰转移酶基因bar核苷酸序列一致，证明外源基因已转入地玉米基因组DNA中。根据PCR鉴定结果，统计不同转化条件下玉米出芽率及阳性转化植株的数量。玉米生长出叶片后统计出芽率，计算公式：出芽率＝(出芽株数/侵染植株数)×100％；玉米鉴定后统计阳性率计算公式：阳性率＝(阳性株数/侵染植株数)×100％。根据单一变量法确定，农杆菌菌液浓度OD600为0.65，真空渗透压为0.050MPa、真空处理时间为3min、乙酰丁香酮浓度为150μM时为农杆菌遗传转化最佳条件，出芽率可达10.64％，阳性率可达8.71％，见表1所示。鉴定完成后炼苗移栽至条件适宜的环境下进行生长，常规肥水管理，收获T0代玉米种子，见图2G-H所示。
表1不同侵染条件对玉米遗传转化效率的影响
Figure BDA0003215414650000071
6)转基因植株T1的鉴定
将转化植株收获T0代玉米种子，种植在基质中，剪取叶片，采用CTAB法提取基因组DNA，以bar-F和bar-R为引物，进行PCR扩增。图7所示结果表明，T1代抗性玉米植株在404bp处扩增出一条清晰的条带，而野生型没有扩增出任何条带，证明导入T-DNA可遗传至后代，成功获得转基因玉米植株。
实施例2：采用本方法获得杂交种转基因玉米植株
1)杂交种玉米茎尖转化受体的准备
取成熟的杂交种‘农大108’(公知公用)玉米种子，将玉米种子浸泡24h后，放入装有铺有吸水纸的盘中，加入适量的水，用黑色塑料袋包好，放置室温环境中避光萌芽2d。待玉米胚芽长至0.8-1.5cm时，斜切胚芽鞘下部与伸长区的明显分界位置，切面有肉眼可见白色倒三角形，去掉切除的胚芽鞘，即可获得玉米茎尖转化受体，见图8A-B所示。
2)植物双元表达载体的农杆菌转化
植物双元表达载体pCAMBIA1300-221-3×Flag[Liu Weijuan，Xiang Yang，ZhangXiaoyun，et al.Over-expression of a maize N-acetylglutamate kinase gene(ZmNAGK)improves drought tolerance in tobacco.Frontiers in Plant Science，2018，9：1902]，载体见图1B，采用液氮冷冻法转化农杆菌LBA4404感受态菌株，于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃和48h，挑取单克隆于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平液体培养基震荡培养，培养条件为28℃和12h，震荡速度200r·min-1，采用碱裂解法提取质粒[提取步骤参照康为世纪质粒小提试剂盒(Cat.#CW0500)说明书]并进行PCR检测，经验证后含有质粒pCAMBIA1300-221-3×Flag的农杆菌菌液则可用于下一步。添加终浓度20％(体积比)的甘油至农杆菌菌液，-80℃长期保存。
取出存放在-80℃保存的农杆菌菌液，置于冰中融解。在无菌超净台中，于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃和48h。在无菌超净台中，用接种环挑取少量活化的农杆菌菌株，均匀地划线于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固体培养基中，培养条件为28℃和48h。
3)农杆菌重悬液的制备
拆开上述固体培养基平板的封口膜，倒入少许蒸馏水，用涂布棒将平板上生长的农杆菌均匀地刮下，重悬菌体至烧杯中，用玻璃棒均匀搅拌重悬。用紫外分光光度计调整农杆菌菌液OD600，获得OD600为0.65的农杆菌重悬液，并加入乙酰丁香酮，使其最终浓度为150μM，用于后续侵染。
4)真空渗透法转入目的基因
将玉米茎尖转化受体放入含有上述浓度的乙酰丁香酮和农杆菌重悬液中侵染，然后放入0.050MPa真空环境，真空处理时间为3min，使农杆菌侵染茎尖分生组织细胞。侵染完成后，迅速栽入基质中(营养土：蛭石＝1：1)，见图8C所示。覆上基质后，进行常规培养。
5)转基因植株的获得
待玉米植株长至3-4叶期时，见图8D所示。取玉米植株新叶，采用CTAB法提取基因组DNA。根据载体pCAMBIA1300-221-3×Flag的氨基葡糖苷磷酸转移酶基因HygR序列，设计特异性反应引物HygR-F(正向引物)和HygR-R(反向引物)。
HygR-F：5’-GGATTGATGTGATAACATGGTGG-3’
HygR-R：5’-GCAAACTGTGATGGACGACA-3’
分别以转化植株和野生玉米植株的DNA为模板，以HygR-F和HygR-R为引物，进行PCR扩增。结果表明，野生玉米植株没有扩增任何条带，而转化植株在1352bp处扩增出一条清晰的条带，见图8E所示。扩增产物经测序分析表明与氨基葡糖苷磷酸转移酶基因HygR核苷酸序列一致，证明外源基因已转入地玉米基因组DNA中。
扩增体系(15μL)：
2×M5 HiPer Taq PCR mix 10μL，10μM正向引物0.5μL，10μM反向引物0.5μL，DNA模板4μL，ddH2O 5μL。
扩增程序：
95℃3min；94℃30s，52℃25s，72℃1min30s，32cycles；72℃5min。4℃保存。
鉴定完成后炼苗移栽至条件适宜的环境下进行生长，常规肥水管理，收获T0代玉米种子。
6)转基因植株T1的鉴定
将转化植株收获T0代玉米种子，种植在基质中，剪取叶片，采用CTAB法提取基因组DNA，以HygR-F和HygR-R为引物，进行PCR扩增。图9所示结果表明，T1代抗性玉米植株在1352bp处扩增出一条清晰的条带，而野生型没有扩增出任何条带，证明导入T-DNA可遗传至后代，成功获得转基因玉米植株。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种简化的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化方法
<141> 2021-06-21
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atcgagacaa gcacggtcaa c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aaacccacgt catgccagtt c 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ggattgatgt gataacatgg tgg 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gcaaactgtg atggacgaca 20

Claims (5)

1.一种简化的农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化的方法，其特征在于，斜切玉米胚芽鞘下部与伸长区的分界位置，获得玉米茎尖转化受体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤包括：
1)玉米茎尖转化受体的准备
取成熟的玉米种子，浸泡后避光萌芽，待玉米胚芽长至0.8-1.5cm时，斜切胚芽鞘下部与伸长区的分界位置，切面肉眼看到白色倒三角形，即为获得的玉米茎尖转化受体；
2)带有目的基因的植物双元表达载体的农杆菌转化
带有目的基因的植物双元表达载体转化农杆菌感受态菌株，于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃和48h，挑取单克隆于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平液体培养基震荡培养，培养条件为28℃和12h，震荡速度200r·min-1，采用碱裂解法提取质粒并进行PCR检测，经验证后含有载体的农杆菌菌液则可用于下一步，添加终浓度20％(体积比)的甘油至农杆菌菌液，-80℃长期保存；
取出存放在-80℃保存的农杆菌菌液，置于冰中融解，在无菌超净台中，于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固体培养基划板培养，培养条件为28℃和48h，在无菌超净台中，用接种环挑取活化的农杆菌菌株，均匀地划线于YEP+50mg·L-1卡那霉素+50mg·L-1利福平固体培养基平板中，培养条件为28℃和48h；
3)农杆菌重悬液的制备
取生长的转化的农杆菌的YEP固体培养基平板，倒入蒸馏水，重悬菌体至烧杯中，获得农杆菌重悬液；
4)真空渗透法转入目的基因
将玉米茎尖转化受体放在农杆菌重悬液中，在真空条件下进行农杆菌侵染，侵染后覆土进行常规培养；
5)转基因植株的获得
3周后，待玉米植株长至3-4叶期，取新叶，CTAB法提取DNA进行PCR鉴定，鉴定完成后，移栽，待T0转化植株结种；
取T0代转化植株种子，种于基质中，出苗后取T1代转化玉米植株叶片，提取DNA进行PCR鉴定。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述带有目的基因的植物双元表达载体为载体pCUN-NHF或载体pCAMBIA1300-221-3×Flag：
根据载体pCUN-NHF中膦丝菌素乙酰转移酶基因bar序列设计特异性反应引物bar-F和bar-R：
bar-F：5’-ATCGAGACAAGCACGGTCAAC-3’
bar-R：5’-AAACCCACGTCATGCCAGTTC-3’；
转化载体pCUN-NHF的玉米植株，分别以转化植株和野生玉米植株的DNA为模板，以bar-F和bar-R为引物，进行PCR扩增，PCR鉴定结果表明，野生玉米植株没有扩增任何条带，而转化植株在404bp处扩增出一条清晰的条带，扩增产物经测序分析表明与膦丝菌素乙酰转移酶基因bar核苷酸序列一致，证明外源基因已转入到玉米基因组DNA中；
或根据载体pCAMBIA1300-221-3×Flag的氨基葡糖苷磷酸转移酶基因HygR序列，设计特异性反应引物HygR-F和HygR-R：
HygR-F：5’-GGATTGATGTGATAACATGGTGG-3’
HygR-R：5’-GCAAACTGTGATGGACGACA-3’
转化载体pCAMBIA1300-221-3×Flag的玉米植株，分别以转化植株和野生玉米植株的DNA为模板，以HygR-F和HygR-R为引物，进行PCR扩增，结果表明，野生玉米植株没有扩增任何条带，而转化植株在1352bp处扩增出一条清晰的条带，扩增产物经测序分析表明与氨基葡糖苷磷酸转移酶基因HygR核苷酸序列一致，证明外源基因已转入到玉米基因组DNA中。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述农杆菌为LBA4404。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述玉米的品种为自交系或杂交种。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060005273A1 (en) * 2004-06-10 2006-01-05 University Of Toledo Novel maize split-seed explant and methods for in vitro regeneration of maize
CN102934607A (zh) * 2012-11-12 2013-02-20 四川农业大学 以单倍体玉米茎尖为受体的转基因育种方法
CN103074365A (zh) * 2012-04-17 2013-05-01 吉林师范大学 一种玉米遗传转化的方法
US20150344897A1 (en) * 2012-08-22 2015-12-03 Hebei Academy Of Agriculture And Forestry Sciences, Institute Of Genetics And Physiology Monocotyledon transgenic method for invading growing points of seed buds minimally and fully
CN106119281A (zh) * 2016-04-05 2016-11-16 贵州大学 一种快速高效的农杆菌介导的小麦茎尖遗传转化方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060005273A1 (en) * 2004-06-10 2006-01-05 University Of Toledo Novel maize split-seed explant and methods for in vitro regeneration of maize
CN103074365A (zh) * 2012-04-17 2013-05-01 吉林师范大学 一种玉米遗传转化的方法
US20150344897A1 (en) * 2012-08-22 2015-12-03 Hebei Academy Of Agriculture And Forestry Sciences, Institute Of Genetics And Physiology Monocotyledon transgenic method for invading growing points of seed buds minimally and fully
CN102934607A (zh) * 2012-11-12 2013-02-20 四川农业大学 以单倍体玉米茎尖为受体的转基因育种方法
CN106119281A (zh) * 2016-04-05 2016-11-16 贵州大学 一种快速高效的农杆菌介导的小麦茎尖遗传转化方法

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WEIJUAN LIU, YANG XIANG, XIAOYUN ZHANG, GAOQIANG HAN, XIUJUAN SUN, YU SHENG, JINGWEI YAN, HENRIK VIBE SCHELLER, AYING ZHANG: "Over-expression of a maize N-acetylglutamate kinase gene(ZmNAGK)improves drought tolerance in tobacco" *
YANG XIANG, XIUJUAN SUN, XIANGLI BIAN, TIANHUI WEI, TONG HAN, JINGWEI YAN, AYING ZHANG: "The transcription factor ZmNAC49 reduces stomatal density and improves drought tolerance in maize" *
巩健;杨芳;: "单子叶植物表达载体的构建及农杆菌介导的玉米遗传转化的研究" *
张笑寒;仇志浪;赵德刚;: "农杆菌介导McCHIT1基因遗传转化水稻茎尖研究" *
方永丰;李永生;彭云玲;王芳;王威;穆延召;王汉宁;: "农杆菌介导Chi-linker-Glu融合基因和bar基因转化玉米茎尖的研究" *
汪婷婷;季静;王罡;关春峰;张烈;金超;: "农杆菌侵染玉米芽尖导入psy基因的研究" *
王碧微;秦利军;赵德刚;: "转TfdA基因提高玉米抗除草剂2,4-D的能力" *
邢小龙;常纪苹;付忠军;胡德升;杨慧丽;付小康;钟立华;胡彦民;: "根癌农杆菌介导GUS基因转化玉米芽尖生长点的研究" *

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