CN117866960A - 一种受病原物诱导的柑橘启动子PCsFAO3及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种受病原物诱导的柑橘启动子PCsFAO3及其在柑橘抗性育种中的应用。通过本发明获得了如序列SEQ ID NO:3所示的柑橘病原物诱导型启动子PCsFAO3，将其与抗病基因组成表达框转入柑橘后，抗病基因的表达量在溃疡病菌的诱导下保持一个合理的水平，既能充分发挥抗病基因对柑橘溃疡病的抗病性效果，同时避免了转基因柑橘因始终过量表达抗性基因而对自身造成损伤。
Description
技术领域
本发明涉及一种受病原物诱导的柑橘启动子PCsFAO3，属于植物基因工程技术领域。具体涉及柑橘病原物诱导型启动子PCsFAO3的克隆、功能验证及其在抗性育种中的应用。
背景技术
柑橘是我国南方地区重要的果树种类之一，在其栽培过程中经常会受到各种病原（包括溃疡病菌、黄龙病菌、褐腐病菌以及黄脉病毒等）的侵害。目前，利用基因工程的手段在柑橘中导入抗病基因是提高柑橘对病害抗性的一种有效的方法。利用此方法获得了抗黄龙病、抗溃疡病、抗褐腐病的柑橘。例如，利用基因工程的手段，在柑橘中超量表达抗菌肽基因（Penget al.2015）、CsBZIP基因（Liet al. 2019）和对柑橘体内的感病基因CsLOB1（Penget al. 2017）进行CRISPR/Cas9介导的基因编辑，均获得了溃疡病抗性增强的转基因柑橘植株。
中国专利申请CN114561397A公开了CsCaBP1基因诱导柑橘溃疡病抗性中的应用，通过研究发现过量表达柑橘CsCaBP1基因能有效增强转基因植株对柑橘溃疡病的抗性。该专利使用的启动子为35S启动子。
中国专利申请CN110819607A公开了CsLYK基因及其编码蛋白在提高柑橘溃疡病抗性的应用，将柑橘LysM类受体蛋白磷酸激酶编码基因CsLYK基因通过超表达载体整合到柑橘中,有效提高柑橘对细菌性溃疡病的抗性。该专利使用的启动子为花椰菜花叶病毒启动子（CaMV 35S启动子）。
中国专利申请CN116445484A公开了基于基因干扰提高柑橘对溃疡病抗性的方法，通过将柑橘属植物中长链脂肪醇氧化酶CsFAO3基因的部分编码序列，作为干扰序列,导入干扰载体中，通过农杆菌介导的遗传转化法整合到柑橘基因组中，有效提高柑橘对溃疡病的抗性。该专利使用的启动子为花椰菜花叶病毒启动子（CaMV 35S启动子）。
以上专利申请都是通过对柑橘溃疡病相关基因或其部分编码序列的过量表达或者干扰其表达来实现对柑橘溃疡病的抗性，这些基因或其部分编码序列的过量表达会导致相关编码蛋白的大量产生，干扰其表达也大大影响其实际含量，除对柑桔溃疡病的抗性产生影响外，可能还对柑橘本身的品质和性能等带来无法预期的不良影响。
而且在这些抗病的转基因植株中，抗病基因都是利用组织特异性启动子或组成型启动子例如花椰菜花叶病毒启动子（CaMV 35S启动子）驱动。组成型启动子持续过量地表达外源基因会竞争植物在正常生长条件下需要的能源并且阻碍蛋白质或者RNA的合成，继而阻碍植物的生长并且减少其产量，对于植物的正常生长是不利的。
中国专利申请CN114774415A公开了受黄龙病菌和脱落酸诱导的植物启动子及其应用，其具有明显的黄龙病菌和脱落酸诱导启动活性，能使细胞在受到黄龙病菌感染和脱落酸诱导时启动外源基因的表达。
尽管该专利申请声称获得了诱导型启动子，但其诱导物仅限于黄龙病菌和脱落酸，而对于其他柑橘病例如溃疡病菌、褐腐病菌以及黄脉病毒等并不适用。而且更为重要的是，该专利仅验证了该启动子对GUS基因（即β-葡萄糖苷酸酶基因）的诱导表达量增加，该基因并非柑橘抗病基因，故其并无实际验证对柑橘植株中常见病抗性的改善。
发明内容
本发明的目的在于提供一种受病原物诱导的柑橘启动子PCsFAO3及其应用。从柑橘中克隆受病原物诱导的启动子PCsFAO3，并利用转基因技术进行功能验证，进一步利用该启动子驱动抗病基因在柑橘中表达，分析抗病基因对病害的抗病性效果，为利用病原物诱导型启动子驱动抗病基因表达改良柑橘病害提供技术资源。
本发明的目的是通过以下措施实现的：
本发明提供了一种受病原物诱导的柑橘启动子PCsFAO3，其核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。
本发明还提供了含有所述柑橘启动子PCsFAO3的重组表达载体。
优选地，所述重组表达载体为pPCsFAO3:GUS载体，其中所含GUS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供了所述柑橘启动子PCsFAO3或其重组表达载体在柑橘抗性育种中的应用。
优选地，所述应用为受病原物诱导的抗病基因表达。
更优选地，所述病原物选自柑橘溃疡病菌、黄龙病菌、褐腐病菌和黄脉病毒中的一种或多种。
优选地，所述抗病基因为CiNPR4基因。
本发明还提供了利用诱导型表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，所述方法包括以下步骤：
1）获得所述柑橘启动子PCsFAO3并构建其重组表达载体；
2）将溃疡病抗病基因引入步骤1）所述的重组表达载体中；
3）用步骤2）所得包含抗性基因的重组表达载体转化柑橘，得到转基因植株，对转基因植株进行溃疡病抗性评价。
优选地，所述方法包括以下步骤：
1）获得所述重组表达载体pPCsFAO3:GUS载体；
2）将抗病基因CiNPR4基因引入步骤1）所述的重组表达载体中，得到pPCsFAO3:CiNPR4载体；
3）用步骤2）所得pPCsFAO3:CiNPR4载体通过冻融法转化农杆菌菌株EHA105，再利用根癌农杆菌介导法转化柑橘上胚轴外植体，得到转基因植株，利用实时荧光定量PCR进行CiNPR4基因表达量检测，柑橘Actin基因为内参基因。
有益效果
本发明提供了一种受病原物诱导的柑橘启动子PCsFAO3及其应用。通过本发明获得了柑橘病原物诱导型启动子PCsFAO3，将PCsFAO3启动子与抗病基因组成表达框转入柑橘后，抗病基因的表达量在溃疡病菌的诱导下保持一个合理的水平，既能充分发挥抗病基因对柑橘溃疡病的抗病性效果，同时避免了转基因柑橘因始终过量表达抗性基因而对自身造成损伤，从而避免了组成型启动子因始终启动目标基因表达造成生长发育受阻和产量减少等一系列致命的缺陷。
目前，关于诱导型启动子的研究已成为国内外研究的热点。将功能明确的病原物诱导型启动子成功应用到转基因植物中调控抗病基因的表达是植物抗病基因工程的研究方向。因此，利用柑橘来源的病原物诱导型启动子驱动抗病基因的表达是提升柑橘抗病性的有效途径之一。
通过本发明的实验数据证实，本发明诱导型启动子PCsFAO3可以在接种柑橘病原物例如溃疡病菌后，诱导植株中转基因GUS、CiNPR4的表达量显著高于对照；且转基因植株的发病情况，包括病斑面积、病情指数等均显著优于对照。
附图说明
图1提供了本发明所述 pPCsFAO3:GUS载体的构建示意图。
图2提供了在溃疡病菌诱导0、3、6和9 d的条件下PCsFAO3:GUS转基因植株中GUS基因相对表达量和GUS酶活性。其中PCsFAO3-1、PCsFAO3-2、PCsFAO3-3、PCsFAO3-4和PCsFAO3-5分别代表含有本发明所述PCsFAO3启动子的其中5株转基因植株编号。与接种溃疡病菌0 d相比，含有本发明所述PCsFAO3启动子的PCsFAO3-1、PCsFAO3-3和PCsFAO3-5转基因植株中GUS基因的表达水平从接种溃疡病菌3 d 开始显著上升；PCsFAO3-2和PCsFAO3-4转基因植株中GUS基因的表达水平从接种溃疡病菌后6 d开始显著上升。与接种溃疡病菌0 d相比，含有本发明所述PCsFAO3启动子的PCsFAO3-1、PCsFAO3-2、PCsFAO3-3、PCsFAO3-4和PCsFAO3-5转基因植株中GUS酶活性从接种溃疡病菌3 d 开始显著上升。
图3提供了本发明所述pPCsFAO3:CiNPR4载体的构建示意图。
图4提供了PCsFAO3:CiNPR4转基因植株中CiNPR4基因在溃疡病菌诱导10 d后的表达分析。其中WT代表野生型植株，CiNPR4-1、CiNPR4-2和CiNPR4-3分别代表含有本发明所述PCsFAO3启动子转基因植株的其中3株转基因植株编号。在溃疡病菌诱导10 d后，含有本发明所述PCsFAO3启动子的转基因植株中CiNPR4基因的表达量显著高于野生型植株中CiNPR4基因的表达量；而转基因植株本身之间的差异不明显。
图5提供了PCsFAO3:CiNPR4转基因植株离体接种溃疡病菌10 d后的发病情况。其中WT代表野生型植株，CiNPR4-1、CiNPR4-2和CiNPR4-3分别代表含有本发明所述PCsFAO3启动子的转基因植株的其中3株转基因植株编号。含有本发明所述PCsFAO3启动子的转基因植株在接种溃疡病菌后的发病情况与野生型植株相比具有肉眼可见的显著差异，而转基因植株本身之间的差异不明显。
图6提供了PCsFAO3:CiNPR4转基因植株接种溃疡病菌10 d后的病斑面积情况，病斑面积单位为mm2。其中WT代表野生型植株，CiNPR4-1、CiNPR4-2和CiNPR4-3分别代表含有本发明所述PCsFAO3启动子的转基因植株的其中3株转基因植株编号。含有本发明所述PCsFAO3启动子的转基因植株的病斑面积与野生型植株相比显著降低，而转基因植株本身之间的差异不明显。
图7提供了PCsFAO3:CiNPR4转基因植株接种溃疡病菌10 d后的病情指数，病情指数单位为百分比（%）。其中WT代表野生型植株，CiNPR4-1、CiNPR4-2和CiNPR4-3分别代表含有本发明所述PCsFAO3启动子转基因植株的其中3株转基因植株编号。含有本发明所述PCsFAO3启动子的转基因植株接种溃疡病菌10 d的病情指数与野生型植株相比具有统计学意义上的显著差异，而转基因植株本身之间的差异不明显。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明。但需要指出的是，本发明以下所举实施例仅仅是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不代表本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围，以所附权利要求的保护范围为准。
本发明使用的材料、试剂、工具和条件仅为例证性说明，本领域技术人员还可以选择具有同样或类似功能的其他材料、试剂、工具和条件。
本发明选取的柑橘晚锦橙为中国农业科学院柑桔研究所于20世纪80年代初至2010年期间，从普通锦橙（Citrus sinensis）中选育获得的晚熟锦橙优系，审定编号为“渝审柑桔2011001”。
本发明使用的引物均由北京六合华大基因科技有限公司合成。
本发明中未特别指明的实验试剂均为本申请人单位市购获得的常规试剂。
本发明所使用的术语“CsFAO3基因”是指长链脂肪醇氧化酶基因，已知它是催化长链烃类和长链脂肪酸氧化的重要酶之一，参与长链脂肪酸或烷烃的ω-氧化途径，为微生物的生长提供碳源，而对植物特别是对柑橘品质和性能的影响并无深入研究。
本发明所使用的术语“CiNPR4基因”为耐黄龙病的“Jackson”葡萄柚（Citrus paradisi）中的NPR1-like基因。已知NPR1基因即病程相关基因非表达子1（non-expressorof pathogenesis-related gene 1, NPR1），是水杨酸介导的系统获得性抗性信号转导途径中一个重要的转录因子，在调节植物的抗病方面发挥着关键性的作用。
本发明所使用的术语“载体（Vector）”是指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子，包括细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。本发明中所述的载体特指质粒载体，因此二者是可互换使用的术语。本发明中提及的T克隆载体为常用的商业化载体pGEM-T，购自Promega公司。
本发明所使用的术语“启动子”是指位于结构基因上游区域的一段DNA序列，它能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。在这段DNA序列中，含有与RNA聚合酶结合的TATA框。RNA聚合酶结合在TATA框上形成转录起始复合体，调控基因的表达。
根据基因表达情况, 可将启动子分为两类：组成型启动子和特异性启动子。特异性启动子又可分为组织特异性启动子和诱导型启动子。组织特异性启动子能够限制基因在某一特定的组织中持续的表达，部分地解决了植物在正常生长条件下能源的浪费问题。而诱导型启动子平时不启动转录或转录活性很低，在某些特定的逆境信号的刺激下才会启动外源基因的转录，这样不仅会获得目的产物、达到预定目标，而且也不会产生副作用。
目前植物基因工程中常用的是组成型启动子，例如在双子叶植物中表达效率较高的烟草花椰菜病毒（CaMV 35S）启动子，而在单子叶植物中常用的启动子有来自于水稻的RbcS、Actin1和OsCc1启动子及玉米的RUBQ1和RUBQ2启动子等。
本发明所述启动子从CsFAO3基因的转录起始点上游中扩增得到，故命名为PCsFAO3启动子。
实施例1、克隆柑橘PCsFAO3启动子序列
选取柑橘晚锦橙的嫩叶0.1g，利用DNA快速提取试剂盒（艾德莱，CAT：DN15）提取晚锦橙基因组DNA。
使用分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物PCsFAO3-F和PCsFAO3-R从上述DNA中扩增CsFAO3基因转录起始点上游1500 bp的启动子序列。扩增的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳后，用Biospin胶回收试剂盒（BSC02M1，波尔公司）回收，回收产物与T-克隆载体连接，连接产物用PCsFAO3-F和PCsFAO3-R扩增，扩增出相应片段的菌液进行测序，获得正确的PCsFAO3序列（其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示）。
扩增体系为：2 × PCR mix：25 μL；引物PCsFAO3-F和PCsFAO3-F（100 μmol/L）各1μL；DNA约100 ng；加ddH2O至50 μL。扩增程序：94℃，5 min；94℃，30 s，60℃，30 s，72℃，1min，32个循环；72℃延伸5 min。
实施例2、构建pPCsFAO3:GUS载体并转化农杆菌
载体构建流程图如图1所示，所有限制性内切酶购自THERMO公司，按照使用说明操作。
利用GenElute™质粒提取试剂盒（Sigma，PLN350）提取含有PCsFAO3序列的T-克隆质粒和含有GUS基因的常规质粒，利用Hind 和BamH/>分别对上述2个质粒进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后回收，其中，T-克隆质粒回收PCsFAO3启动子片段，pGNGM1300质粒回收大片段，回收产物利用T4-DNA酶连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂布在附加50mg/L卡那霉素（Km）的LB固体培养基上。挑起LB培养基上长出的单菌落放入附加50 mg/L Km的LB液体培养基中过夜；利用质粒提取试剂盒提取菌液的质粒，利用Hind/>和BamH/>对质粒进行双酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带中含有1500 bp的质粒确定为pPCsFAO3:GUS质粒（其中所含GUS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示）。利用冻融法将pPCsFAO3:GUS质粒导入农杆菌菌株EHA105中，菌液保存在‒80℃的低温冰箱中。
实施例3、晚锦橙遗传转化
将晚锦橙果实洗净，用75％酒精表面消毒，在无菌的条件下取出种子，剥掉种皮，接种在添加30 g/L蔗糖和8 g/L琼脂的MS培养基（PhytoTechnology Laboratories™，M519）上，28℃下暗培养2周，然后在16 h光照/8 h黑暗的光周期下培养1周。无菌条件下取萌发幼苗的上胚轴切成1 cm左右的茎段，用于根癌农杆菌介导的柑橘遗传转化。
转化前2 d，将含有pPCsFAO3:GUS质粒的农杆菌菌液涂布在添加50 mg/L Km的LB固体培养基上。挑取农杆菌单菌落，接种于10 mL含有相同抗生素的LB液体培养基中，28℃、220rmp的条件下震荡培养过夜。利用分光光度计测量菌液的OD值，将菌液用上述LB液体培养基稀释成OD值为0.1的菌液，在上述相同的条件下继续震荡培养，监测菌液的OD值，待其达到0.5时，用50 mL的无菌离心管收集菌液，在5000 r/min的条件下离心10 min，弃上清，用pH 5.4的MS液体培养基重新悬浮后用于柑橘遗传转化。
将切成1 cm左右的晚锦橙上胚轴茎段在农杆菌菌液中浸泡12 min，期间轻微晃动。取出茎段后将表面的菌液用无菌滤纸吸干；将茎段转移到附加1mg/L的N6-异戊烯基腺嘌呤、0.5 mg/L吲哚乙酸（IAA）、1mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、100 μM乙酰丁香酮、30 g/L蔗糖和8 g/L琼脂的MS固体培养基上；在26℃的黑暗条件下共培养3 d。
共培养完成后，将上胚轴转移到添加2 mg/L的6-苄氨基嘌呤、0.5 mg/L IAA、50mg/L Km、500 mg/L头孢霉素、30g/L蔗糖和8 g/L琼脂的MS固体培养基中，28℃暗培养7 d后，转移至28℃、16 h光照/8 h黑暗的光周期下培养，每两周继代一次。
对上胚轴茎段两端伤口上萌发的不定芽进行绿色荧光蛋白（GFP）荧光检测；具有绿色荧光的不定芽，确定为GFP阳性芽。
待GFP阳性芽的茎长约0.5 cm时，水平切下，在无菌的条件下微嫁接在枳橙砧木上；待嫁接口充分愈合后，从枳橙砧木的基部水平切下GFP阳性芽，按照田间切接的方法将其嫁接在田间枳橙砧木上，用塑料袋保湿2周，待其成活后去除塑料袋。
实施例4、转基因植株的PCR检测
GFP阳性芽嫁接到田间3个月后，采取叶片100 mg，使用DNA快速提取试剂盒提取基因组DNA，PCR检测GFP基因的整合。PCR反应条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃30 s，32次循环；72℃ 5 min。检测引物为GFP-F和GFP-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示。阳性植株可以得到654 bp的扩增片段，而野生型晚锦橙（WT）植株无相应的扩增条带。
实施例5、溃疡病菌诱导下的GUS基因表达和GUS酶活性分析
选取转基因植株的成熟叶片，用自来水清洗干净，再用无菌水清洗5次。擦干叶片表面和无菌培养皿中多余的水分，平铺放入培养皿保持叶片背面向上并悬空，将棉花用无菌水打湿后覆盖在叶柄处保湿。将无菌的滤纸条浸泡在OD600值为0.5的溃疡病菌（菌种为XccYN1 株系，由西南大学柑桔研究所胡军华博士馈送）菌液中，滤纸条充分浸透后，将其平铺在整个叶片的背面。溃疡病菌接种0、3、6、9 d时收集叶片。每个时间节点的叶片分成两份，一份用于GUS基因的诱导表达分析，另一份用于GUS酶活性分析。试验重复3次。
使用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（艾德莱，CAT：RN09）提取叶片总RNA，用琼脂糖凝胶电泳验证RNA质量，用NanoDrop 2000 Thermo浓度计测定其浓度。使用500 ng的RNA利用iScript™ cDNA Synthesis Kit （Bio-Rad,Hercules, CA, USA）合成10 μLcDNA，cDNA稀释5倍。
利用实时荧光定量PCR进行GUS基因表达量的检测，采用的引物为qGUS-F和qGUS-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。定量PCR内参为柑橘Actin基因，采用引物为Actin-F和Actin-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。
反应体系为：iTaqTMUniversal SYBR®6 μL，100 μmol/L的 qGUS-F和qGUS-R引物各0.3 μL，cDNA 50 ng，加ddH2O至12 μL。反应条件：95℃ 3 min，94℃ 10 s；56℃ 10 s，72℃10 s，40次循环；72℃ 10 min。
实验重复三次。以WT植株为参照，采用2-△△Ct法计算转基因植株中GUS基因的相对表达量。GUS酶活性的测定参照β-葡萄糖苷酸酶试剂盒（格锐思，CAT：G0579F）说明书进行。
检测结果见图2。
与0 d相比，PCsFAO3:GUS转基因植株受溃疡病菌侵染后GUS基因的表达水平在第3d时上升或者显著上升，在第6 d后上升程度都达到显著水平；在第9 d时，PCsFAO3:GUS转基因植株PCsFAO3-1、PCsFAO3-2、PCsFAO3-3、PCsFAO3-4和PCsFAO3-5中GUS基因的表达水平分别是0 d的5.22、3.94、6.13、5.91和6.62倍，表明PCsFAO3启动子在溃疡病菌诱导后的转录活性增强。
同样，与0 d相比，PCsFAO3:GUS转基因植株受溃疡病菌诱导后GUS酶活性在第3 d后显著上升； PCsFAO3-1、PCsFAO3-2、PCsFAO3-3、PCsFAO3-4和PCsFAO3-5转基因植株在第9d时GUS酶活性分别是0 d的2.70、3.07、2.96、4.80和2.88倍，进一步说明PCsFAO3启动子在溃疡病菌诱导后的转录活性增强。
上述这些结果表明，PCsFAO3启动子能够响应溃疡病菌的侵染。
实施例6、CiNPR4基因的克隆
以pGNCiNPR质粒（Peng A, et al. Overexpressing aNPR1-like genefromCitrus paradisienhanced Huanglongbing resistance inC. sinensis. PlantCell Rep. 2021 Mar;40(3):529-541.）为模板，利用CiNPR4-F和CiNPR4-R引物（其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示）扩增CiNPR4基因，产物长度为1188 bp。扩增产物进行T-克隆测序，获得正确的CiNPR4基因序列（其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示）。
实施例7、构建pPCsFAO3:CiNPR4载体并转化农杆菌
载体构建流程图如图3所示。
利用Sac 和Xba/>分别双酶切pPCsFAO3:GUS质粒（实施例2中获得的）和含有CiNPR4序列的T-克隆质粒，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后回收，其中，T-克隆质粒回收CiNPR4基因片段，pPCsFAO3:GUS质粒回收大片段。片段回收后参照实施例2中的方法构建pPCsFAO3:CiNPR4载体并转化农杆菌。
实施例8、晚锦橙遗传转化
参照实施例3中的方法进行晚锦橙遗传转化。在实施例8中，用于转化的载体为pPCsFAO3:CiNPR4。
实施例9、PCsFAO3:CiNPR4转基因植株的PCR检测
参照实施例4中的方法进行转基因植株中GFP基因的PCR检测。PCR检测引物与实施例4中相同。
实施例10、PCsFAO3:CiNPR4转基因植株中CiNRP4基因在溃疡病菌诱导下的表达分析
选取PCsFAO3:CiNPR4转基因植株和野生型晚锦橙的成熟叶片，用自来水清洗干净，再用无菌水清洗5次。擦干叶片表面的水分，平铺放入培养皿，保持叶片背面向上并悬空，将棉花用无菌水打湿后覆盖在叶柄处保湿。用直径0.5 mm的针头针刺叶片，在叶中脉的左右两边针刺相同孔数，在针孔处接种1 µL溃疡病菌菌液（5 ×108CFU/mL）。针刺完成后叶片培养在温度为28℃，湿度为85%的光照培养箱中。接种10 d后，以针刺点为圆心，用直径为0.25mm的打孔器取下叶圆片，10个叶圆片组成一个样品，参照实施例5中的方法检测转基因植株中CiNPR4的表达水平。CiNPR4表达水平的检测引物为qCiNPR4-f和qCiNPR4-r（其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示），内参基因以及内参基因的检测引物与实施例5中相同。
如图4所示，PCsFAO3:CiNPR4转基因植株CiNRP4-1、CiNRP4-2和CiNRP4-3受溃疡病菌侵染后，与野生型植株相比，CiNPR4基因的表达水平在接种溃疡病菌10 d后显著上升。其中WT、CiNRP4-1、CiNRP4-2和CiNRP4-3中CiNPR4基因的相对表达量分别为1.09 ± 0.38、18.82 ± 4.05、17.35 ± 6.61和23.47 ± 2.84 。
实施例11、PCsFAO3:CiNPR4转基因植株的溃疡病抗性评价
参照实施例10中的方法接种溃疡病菌。接种10 d后拍照记录，使用Image J软件统计病斑面积，单位为mm2。按照病斑面积将病情分为7个等级。以字母R表示病斑面积，1级（R﹤= 0.75 mm2），2级（0.75 mm2﹤R﹤= 1.25 mm2），3级（1.25 mm2﹤R﹤= 1.75 mm2），4级（1.75 mm2﹤R﹤=2.25 mm2），5级（2.25 mm2﹤R﹤= 2.75 mm2），6级（2.75 mm2﹤R﹤= 3.25 mm2），7级（R﹥3.25mm2）。病情指数=100×Σ[各级病斑数×相应级数值]/（病斑总数×最大级数）。试验重复3次。
如图5所示，离体接种溃疡病菌10天后，观察发现野生型植株发病较为严重，而PCsFAO3:CiNPR4转基因植株CiNPR4-1、CiNPR4-2和 CiNPR4-3虽均有不同程度发病，但与野生型植株相比，CiNPR4-1、CiNPR4-2和 CiNPR4-3转基因植株的病斑较小。
如图6所示，对离体接种溃疡病菌的叶片的病斑大小进行统计，分析发现CiNRP4-1、CiNRP4-2和CiNRP4-3的病斑面积均显著小于野生型植株，其中WT、CiNRP4-1、CiNRP4-2和CiNRP4-3的病斑面积分别为2.06 ± 0.17 mm2、1.27 ± 0.25 mm2、1.21 ± 0.24 mm2和1.07 ± 0.06 mm2。
如图7所示，对转基因植株进行病情指数统计发现，CiNRP4-1、CiNRP4-2和CiNRP4-3转基因植株的病情指数显著小于野生型植株，其中WT、CiNRP4-1、CiNRP4-2和CiNRP4-3的病情指数分别为61.31%、39.93%、39.28%和33.44%。CiNRP4-3的病情指数仅为野生型对照组的54.55%。
综上所述，PCsFAO3启动子在溃疡病菌诱导下能够有效地驱动抗病基因CiNRP4的表达，使转基因植株减轻溃疡病的症状，降低病斑面积和病情指数。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的技术常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日之前发明所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本申请给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知技术不应当成为所属领域普通技术人员实施本申请的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干调整和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种受病原物诱导的柑橘启动子PCsFAO3，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.含有如权利要求1所述的柑橘启动子PCsFAO3的重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：其为pPCsFAO3:GUS载体，其中所含GUS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.权利要求1所述的柑橘启动子PCsFAO3在柑橘抗性育种中的应用。
5.权利要求2或3所述的重组表达载体在柑橘抗性育种中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述应用为受病原物诱导的抗病基因表达。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述病原物选自柑橘溃疡病菌、黄龙病菌、褐腐病菌和黄脉病毒中的一种或多种。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述抗病基因为CiNPR4基因。
9.利用诱导型表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1）获得权利要求1所述的柑橘启动子PCsFAO3并构建其重组表达载体，或者直接获得权利要求2或3所述的重组表达载体；
2）将溃疡病抗病基因引入步骤1）所述的重组表达载体中；
3）用步骤2）所得包含抗性基因的重组表达载体转化柑橘，得到转基因植株，对转基因植株进行溃疡病抗性评价。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1）获得权利要求3所述的重组表达载体pPCsFAO3:GUS载体；
2）将抗病基因CiNPR4基因引入步骤1）所述的重组表达载体中，得到pPCsFAO3:CiNPR4载体；
3）用步骤2）所得pPCsFAO3:CiNPR4载体通过冻融法转化农杆菌菌株EHA105，再利用根癌农杆菌介导法转化柑橘上胚轴外植体，得到转基因植株，利用实时荧光定量PCR进行CiNPR4基因表达量检测，柑橘Actin基因为内参基因。
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