CN1231338A

CN1231338A - 抑制棉籽中棉毒素形成的基因工程方法

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Publication number: CN1231338A
Application number: CN 98122875
Authority: CN
Inventors: 陈晓亚; 周向军; 贾军伟; 林芝萍
Original assignee: SHANGHAI INST OF PLANT PHYSIOL
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 1998-12-25
Filing date: 1998-12-25
Publication date: 1999-10-13
Anticipated expiration: 2018-12-25
Also published as: CN1289679C

Abstract

本发明提供了一种抑制棉籽中棉毒素形成的基因工程方法,即在种子特异启动子的驱动下,将杜松烯合成酶基因两个cDNA(cad1-A和cad1-C)的反义顺序导入棉花中,这些反义顺序在种子中转录后产生反义RNA,抑制正常杜松烯合成酶基因的表达,从而获得棉籽中的棉毒素含量大幅降低、而其它组织器官中棉毒素含量保持不变的基因工程棉花。该技术方案具有特异性强和效率高的显著优点,在理论研究和实践生产中具有广泛的应用前景和实用价值。

Description

抑制棉籽中棉毒素形成的基因工程方法

本发明涉及棉花基因工程，尤其是关于一种利用反义RNA技术抑制棉籽中棉毒素形成的基因工程方法。

以棉酚为代表的棉花酚性倍半萜毒素(以下简称棉毒素)，集中存在于棉花的腺体中，能抑制包括棉铃虫在内的害虫以及棉花致病菌的生长，是棉花复杂的防御系统的重要组成部分。棉毒素均为倍半萜衍生物，其生物合成的前体是杜松烯。棉花的倍半萜环化酶，(+)-δ-杜松烯合成酶(CAD)，是棉毒素生物合成途径中的关键酶。该酶以法尼基焦磷酸(FPP)为底物，催化形成环状的杜松烯，后者再经P450等酶的催化，形成包括棉酚在内的酚性倍半萜衍生物(Chen,X.Y.et al.,Arch.Biochem.Biophys.1995,324(2):255-266)。实验证明，用黄萎病菌感染棉苗，可诱导杜松烯合成酶基因的表达，导致棉毒素的大量合成与积累。此外，棉花杜松烯合成酶与棉花腺体也直接相关。如果没有杜松烯合成酶(或其基因不表达)，棉花的腺体就会大大减少，而棉毒素的含量也就相应降低。

棉花的杜松烯合成酶cDNA和基因已经克隆，cDNA克隆cad1-C以及cad1-A已经发表(Chen,X.Y.et al.,Arch.Biochem.Biophys.1995,324(2):255-266；Chen,X.Y.et al.,J.Nat.Prod.1996,59(10):944-951)。

棉毒素对哺乳动物，包括人，有毒害作用，对单胃动物毒性尤其严重。我国年产棉籽约900万吨。棉籽营养丰富，蛋白与油脂含量高，但由于倍半萜毒素的存在，未经处理的棉籽及其产品不能食用，也难作饲料，造成大量的蛋白和油料资源浪费(刘毓湘，当代世界棉业，1995.中国农业出版社，pp238-256)。因此，理想的棉花品种应当是种子无毒素，而其它器官含有正常量的棉毒素。目前已有的低酚棉品种，其整个棉株的棉毒素含量均很低，因而鼠害、病虫害比较严重，难以推广；而另一方面，一些野生棉属种植物，如比克棉(Gossypium bickii)，种子无毒素而植株有毒素，但它的种子不具有被称为棉纤维的表皮毛，常规育种难以定向地将种子无毒素这一性状引入栽培棉品种中。所以，运用基因工程的方法结合常规育种来选育新品种也就十分必要和迫切了。

1983年，在细菌中首次发现调控基因的转录和翻译的天然存在的反义RNA(Simons,R.W.et al.,Cell.1983,34:683-691)，随即科学家便开始设计人工的反义RNA来控制细胞内靶基因的表达，从而定向控制某些生物性状(Green,P.J.et al.,Ann.Rev.Biochem.1986,55:567-597)，这就是反义RNA技术。目前，反义RNA技术已成为分子生物学中一种较重要的方法，不仅被广泛应用于动、植物基因表达调控的基础研究中，同时也越来越多应用于肿瘤病、病毒病的治疗、农业上果实保鲜、抗性育种和花卉生产等各个领域。因此，一旦知道某个植物基因的序列，便可以用反义RNA技术抑制这个基因的表达。如果该反义顺序为某个组织或器官特异的启动子驱动，就可以抑制该基因在特定组织或器官中的表达(Shimada,H.et al.,Theor.Appl.Genet.1993,86:665-672)。所以，本发明利用反义RNA技术，将两个杜松烯合成酶cDNA的反义顺序同时导入棉花中，并结合组织特异启动子来调控棉毒素代谢途径中杜松烯合成酶的表达，从而专一抑制棉籽中棉毒素的形成。这项工作在国内外尚未见报导。

本发明目的是提供一种抑制棉籽中棉毒素形成的基因工程方法，即在种子特异启动子的驱动下，将棉毒素合成途径中关键酶-杜松烯合成酶基因两个cDNA(cad1-A和cad1-C)的反义顺序导入棉花中，这些反义顺序在种子中转录后产生反义RNA，抑制正常杜松烯合成酶基因的表达，从而使棉籽中的棉毒素含量大幅降低。而其它组织器官中棉毒素含量保持不变。

本发明提供一种抑制棉籽中棉毒素形成的基因工程方法，采用棉花杜松烯合成酶的反义顺序，即在种子特异启动子的驱动下，将棉毒素合成途径中关键酶-杜松烯合成酶基因的cDNA(cad1-A和cad1-C)的反义顺序在种子中转录，抑制正常杜松烯合成酶基因的表达，从而使种子中的棉毒素含量大幅降低。棉花杜松烯合成酶是棉毒素生物合成途径中的关键酶，与棉花腺体形成也直接相关。如果没有杜松烯合成酶(或其基因不表达)，棉花的腺体就会大大减少，而棉毒素的含量也就相应降低。如果在特定组织中杜松烯合成酶基因表达下降，杜松烯合成酶含量降低，就会使该组织中棉毒素含量相应降低。鉴于棉花杜松烯合成酶基因和cDNA已经克隆测序，本发明利用反义RNA技术，并结合种子特异启动子，将两个杜松烯合成酶cDNA的反义顺序构建转基因载体，同时导入棉花，使反义顺序插入棉花染色体并表达形成反义RNA，抑制种子中棉花杜松烯合成酶基因的表达，从而专一地抑制棉籽中倍半萜毒素的形成。具体内容如下：

首先获得cad1-C和cad1-A的反义顺序。将棉花杜松烯合成酶cDNA克隆cad1-C(本实验室克隆并保存)用限制性内切酶EcoRⅠ和EcoRⅤ(购自Promega公司)切开，取出约1kb的DNA片段，接入用同样酶切开的pBluescriptSK(+)(购自Stratagene公司，以下简称pBSK(+))中，形成中间载体Ⅰ，构建过程如图1所示，将cad1-C的EcoRⅤ和EcoRⅠ酶切片段(浅色部分)，重组到pBSK(+)中。酶切、PCR检测电泳图见图2，鉴定结果表明，EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切后，重组质粒中插入了一条1kb大小的DNA片段(1行)，大小与pcad1-C用相同酶切形成的cad1-C片段(2行)一致，而pBSK(+)(3行)中无此带。在cad1-C中有多个HindⅢ位点，所以HindⅢ酶切后，pcad1-C会形成1.1kb和3kb的片段(6行)，而在重组质粒中，则只能形成520bp的DNA片段(5行)。另外，以T₃和96t1600为引物做PCR，重组质粒(7行)与pcad1-C(8行)均可形成一条大小相同的特异DNA带，证明cad1-C片段确实插入了pBSK(+)中形成了中间载体Ⅰ。棉花杜松烯合成酶cDNA克隆cad1-A(本实验室克隆并保存)用EcoRⅠ和EcoRⅤ切开，取出约1.3kb的片段，接入用SmalⅠ和EcoRⅠ切开的中间载体Ⅰ中，形成中间载体Ⅱ。此时在中间载体Ⅱ中，从XbaⅠ到SmaⅠ,cad1-C和cad1-A的DNA片段是反向的。构建过程见图3，即将cad1-A的EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切片段(浅色部分)，插入已构建好的中间载体Ⅰ的EcoRⅠ和SmaⅠ位点中。酶切、PCR检测电泳图见图4。由于EcoRⅤ和SmaⅠ均为平端，它们连接后，这两个酶切位点就消失，所以检测时以BamHⅠ代替EcoRⅤ/SmaⅠ。鉴定结果表明，EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后，重组质粒中插入了一条1.3kb大小的DNA片段(2行)，大小与pcad1-A用EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切形成的cad1-A片段一致(3行)，而中间载体Ⅰ(1行)中无此带。以BamHⅠ和EcoRⅤ酶切中间载体Ⅱ，形成2.9kb和2.3kbDNA片段(7行)，而pBSK(+)则只形成2.9kbDNA片段(8行)。以T₃和93t550为引物做PCR，中间载体Ⅱ(5行)和pcad1-A(6行)均工作，但大小不同。说明cad1-C和cad1-A片段已如图3插入形成重组质粒中间载体Ⅱ。

构建转基因载体。构建所用载体pJL123为本实验室构建并保存，它含有Phaseolin启动子Pph，终止子Tph，在Pph和Tph之间依次有XbaⅠ,SmaⅠ,EcoRⅠ,KpnⅠ等位点。该载体还含有35S启动子驱动的GUS报导基因。将中间载体Ⅱ用XbaⅠ和SmaⅠ切开，取XbaⅠ-SmaⅠ片段，接入用同样酶切开的pLJ123中，形成转基因载体。该载体含有Pph驱动的cad1-C和cad1-A的cDNA片段的反向序列。构建过程见图5，即将cad1-c和cad1-A片段(浅色部分)以反向插入pLJ123中Pph和Tph之间，形成转基因载体。(箭头示基因原转录方向)。酶切、PCR检测电泳图见图6。鉴定结果表明，XbaⅠ和EcoRⅠ酶切，由于pLJ123上有2个EcoRⅠ位点，酶切形成三条带(1行，其中一条太小看不到)，重组质粒有三个EcoRⅠ位点，酶切形成4条带(2行)，其中两条与pLJ123酶切片段一致，而其中两条应为cad1-C(1kb)和cad1-A(1.3kb)片段，cad1-A片段与XbaⅠ-EcoRⅠ酶切中间载体Ⅱ形成的cad1-A片段相同(3行)。PCR结果也表明cad1-C和cad1-A片段同时插入pLJ123中形成转基因载体。PCR检测电泳图见图7。以Phaseolin启动子中正向引物(1400)与cad1-C的正向引物做PCR(1行)，可以扩增出大小为700bp的特异带，证明启动子与cad1-C方向相反。而cad1-C的反向引物和cad1-A正向引物做PCR，可以扩增出1.5kb的带，表明cad1-C和cad1-A的方向相同(4行)。而负对照pLJ123均未扩增出特异条带(3、5行)，更进一步证明在转基因载体中，在Pph启动子驱动下，cad1-C和cad1-A为反向的。

在棉花开花受精后，立即用微注射法将转基因载体质粒注入子房。棉花品种为协作9236、石运321和泗棉3号。收回的种子灭菌后，在MS培养基(配方参见文献Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1982,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)上萌发，取根尖进行GUS染色。GUS染色结果见图8，转基因植株根尖被染成蓝色，而对照则未被染成蓝色。结果证明反义顺序已导入棉花中。GUS染色阳性的植株转入土中继续培养。

选取转基因和未转基因的棉花，分别提取种子总蛋白，用抗棉花杜松烯合成酶的兔血清作Western blotting分析。转基因棉花中反义顺序转录出的反义RNA发挥调控作用，干扰正常杜松烯合成酶的合成，因此，在转基因棉花中杜松烯合成酶的含量应明显减少。Western blotting检测结果见图9，可以看到转基因棉花棉籽中杜松烯合成酶Western blotting的特定条带比未转基因的较细、较弱，说明在所采用的几个棉花品种中，转基因棉花棉籽中杜松烯合成酶含量均大大低于未转基因棉花的棉籽。

测定转基因棉花棉籽中酚性倍半萜含量。反义RNA抑制棉籽中杜松烯合成酶的正常表达，棉毒素代谢途径就受到影响，不能正常合成棉毒素，因此棉籽中的棉毒素会比未转基因的棉籽有大幅降低，而棉花其它组织和器官中的棉毒素含量保持不变。结果见图10。结果表明，转基因棉花的棉籽比未转基因棉花棉籽中的棉酚含量明显下降，下降幅度一般在40％左右。而检测其它组织和器官时，转基因与未转基因棉花的棉酚含量无变化。

本发明抑制棉籽中棉毒素形成的基因工程方法，如果采用其它组织或器官的特异启动子，就可同样特异抑制棉花中该组织或器官中棉毒素的形成。

优点与效果

目前已有的低酚棉品种，整个棉株的棉毒素含量均很低，因而鼠害、病虫害比较严重，难以推广。而另一方面，一些种子无毒素而植株有毒素的野生棉属种植物，如比克棉(Gossypium bickii)，不具有被称为棉纤维的表皮毛，常规育种难以定向地将种子无毒素这一性状引入栽培棉品种。

因此，本发明采用基因工程方法，由已克隆的杜松烯合成酶cDNA获得其反义顺序，在种子特异表达启动子驱动下，将其反义顺序导入棉花，可以产生棉籽低棉毒素的基因工程棉花。这个技术方案具有特异性强和效率高两个显著优点。特异性强在于反义顺序的表达具有组织特异性，特异地抑制棉花种子中的杜松烯合成酶的表达，从而抑制倍半萜毒素合成，克服了过去育种中棉毒素合成调控无组织器官特异性的缺点。效率高是指反义RNA抑制作用的效率较高，本发明同时导入两个杜松烯合成酶的反义顺序，可以较大程度地抑制杜松烯合成酶的表达。研究结果显示，转基因棉籽中的棉毒素含量下降了40％，而棉花其它组织和器官中的棉毒素含量正常，充分说明本发明的优点和可行性。应用本发明可以获得棉籽中棉毒素含量大大下降，而棉花其它组织和器官中的棉毒素含量正常的棉花，作为在棉区推广种植棉籽低棉毒素的基因工程棉花品种；也可为棉花常规育种提供棉籽低棉毒素的基因工程棉花材料和棉毒素生物合成基因工程调控研究提供材料，因此，本发明具有广泛的应用前景和实用价值。

附图说明图1是中间载体Ⅰ的构建图。图2是中间载体Ⅰ的酶切、PCR检测电泳图。

图中：1．EcoRⅠ-EcoRⅤ酶切中间载体Ⅰ；

2．EcoRⅠ-EcoRⅤ酶切pcad1-C质粒；

3．EcoRⅠ-EcoRⅤ酶切pBSK(+)质粒；

4．PCR分子量标准；

5．HindⅢ酶切中间载体Ⅰ；

6．HindⅢ酶切pcad1-C质粒；

7．中间载体Ⅰ的PCR检测结果(引物为T₃,96t1600)；

8．pcad1-C质粒的PCR检测结果(引物为T₃,96t1600)。图3是中间载体Ⅱ的构建图。图4是中间载体Ⅱ的酶切、PCR检测电泳图。

图中：1．BamHⅠ-EcoRⅠ酶切中间载体Ⅰ；

2．EcoRⅠ-EcoRⅤ酶切pcad1-A质粒；

3．BamHⅠ-EcoRⅠ酶切中间载体Ⅱ；

4．1Kb DNA分子量标准；

5．中间载体Ⅱ的PCR检测结果(引物为T3,93t550)；

6．pcad1-A质粒的PCR检测结果(引物为T3,93t550)；

7．BamHⅠ-EcoRⅤ酶切中间载体Ⅱ；

8．BamHⅠ-EcoRⅤ酶切pBSK(+)质粒。图5是转基因载体的构建图。图6是转基因载体的酶切、PCR检测电泳图。

图中：1．XbaⅠ-EcoRⅠ酶切pLJ123质粒；

2．XbaⅠ-EcoRⅠ酶切转基因载体；

3．XbaⅠ-EcoRⅠ酶切中间载体Ⅱ；

4．1Kb DNA分子量标准；

5．转基因载体的PCR检测结果(引物为96t1600,9310)；

6．对照：pLJ123质粒的PCR检测结果(引物为96t1600,9310)。图7是转基因载体的PCR检测电泳图。

图中：1．1kb DNA分子量标准；

2．转基因载体的PCR检测结果(引物为1400,93460)；

3．负对照：pLJ123的PCR检测结果(引物为1400,93460)；

4．转基因载体的PCR检测结果(引物为9310,96t1600)；

5．负对照：pLJ123的PCR检测结果(引物为9310,96t1600)。图8是转基因与未转基因棉花的GUS染色结果图。

图中：上．未转基因棉花；下．转基因棉花。图9是转基因棉花的Western blotting检测结果图。

图中：1-2．石运321, 1．未转基因棉花。2．转基因棉花

3-5．泗棉3号，3．未转基因棉花。4-5．转基因棉花

6-7．协作9236,6．未转基因棉花。7．转基因棉花。图10是转基因棉花棉籽中棉酚含量检测图。

图中：1-2．石运321, 1．未转基因棉花。2．转基因棉花

3-5．泗棉3号，3．未转基因棉花。4-5．转基因棉花

6-7．协作9236,6．未转基因棉花。7．转基因棉花。

实施例1．中间载体Ⅰ的构建

提取质粒pcad1-C。质粒的少量提取采用碱裂解法，参考文献(Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1982,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York)。

挑单克隆菌落于1.5ml LB，振摇培养12-16hr。8,000rpm-10,000rpm离心1min收菌，弃去上清液。加入100μl溶液Ⅰ，混匀。加入200μl溶液Ⅱ，上下颠倒混匀。加入150-180μl溶液Ⅲ，温和混匀，10,000rpm离心5min。取上清液，加入1ml无水冷乙醇，混匀，-20℃放置10min。10,000rpm离心5min，倾去上清液，干燥。加入150RNase/TE(30μg/ml),37℃，放置20-30min。取出，加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，振荡30s,10,000rpm离心5min。吸上层溶液至新的Eppendorf管中，加入1/10体积的醋酸钠，再加总体积2-3倍的无水冷乙醇，-20℃放置10min。10,000rpm离心5min，弃上清。加入1ml 70％乙醇冲洗后，干燥。将沉淀溶于30μlTE，紫外定量并电泳检查。

取1ug上述质粒DNA用EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切1hr。参考文献(Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1982,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York)。

酶切反应系统包括：

质粒DNA： 1μg

10×反应缓冲液： 2μl

EooRⅠ： 1-5Unit

EeoRⅤ： 1-5Unit

水： to 20μl

37℃保温1-2hr。反应完毕后，电泳检测。

回收约1Kb的DNA片段(cad1-C片段)，DNA片段回收采用玻璃奶法(北京原平公司试剂盒操作步骤)。

从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段(体积不超过100μl)，在Eppendorf管中捣碎。加入3倍体积的溶胶液，60℃水浴5min。期间轻摇Eppendoff管数次使胶完全融化。加入10μl玻璃奶，用加样枪混匀。室温静置5min。8,000rpm离心数秒，吸弃上清。加入125μl漂洗液，混匀。离心弃上清。重复第五步两次。加适量无菌蒸馏水或TE(10-30μl)，混匀。60℃水浴中放置5min。5,000rpm离心数秒，回收上清液备用。

另外提取质粒pBSK(+)(方法同上)，用EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切1hr，回收约3Kb的片段作为载体。取200ngDNA片段与50ng载体连接。

T₄ DNA连接酶反应按Crouse等的方法(Crouse,G.E.et al.,Methods inEnzvmology,1983.101:78.)进行。

载体DNA： 50ng

外源片段： 200ng

10×连接缓冲液： 2μl

T4连接酶： 1Unit

加水至总体积20μl,16-18℃保温12-18hr。

连接产物转化大肠杆菌。大肠杆菌感受态细胞的制备及转化参考文献(Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1982,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York.)。

从平板上挑取单菌落，接种于5ml LB培养基中，37℃振荡培养过夜。按2％的量转接于50ml新鲜LB培养液中，37℃振荡培养至OD₆₀₀=0.3～0.5(约需2-3hr)。冰浴10min后，4℃,5,000rpm离心5min，收集细胞。将细胞悬浮于1/2体积100mmol/L CaCl₂中，冰浴20min。4℃,3,000rpm离心3min。将细胞重新悬浮于1/10体积的含15％甘油的100mM CaCl₂中，分装后立即储存于-70℃。加连接产物(体积≤10μl,DNA≤50ng)于200μl感受态细胞中，冰浴20-30min。42℃热激处理90s，冰浴冷却2min。加入1ml SOC培养基(配方参见文献Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1982,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York),37℃培养45-60min。离心去部分上清，将适量的菌液涂平板，37℃培养12-16hr，可获转化菌落。长出单菌落后，接菌经酶切鉴定(结果见图2)，得到重组质粒，即为中间载体Ⅰ。实施例2．聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA

参考文献(Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1982,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York.)。

在亚克隆过程中，本发明又利用PCR技术进行检测，确保目的片段以正确的方向与载体连接。本发明所用引物及其核苷酸顺序：

T₃: AATTAACCCTCACTAAAGGG

96t1600: TTGGACTGAATCAATGAAG

93460: ATGCGACGTATTCAACAAG

93t550: AGGAAGCTTCATAAAGTTC

9310: GATGAGGCAGGGAACTTCA

1400: CATCCATCCATCCAGA

引物由上海生工公司合成，每管5OD₂₆₀，加无菌双蒸水溶解至终浓度为20μmol/L。PCR反应体系：

MgCl₂(10×) 3μl

缓冲液(10×) 3μl

dNTPs(各2.5μM) 3μl

5’端引物(20μM) 1μl

3’端引物(20μM) 1μl

模板(0.1μg/μl) 1μl

牛血清白蛋白(10mg/ml) 0.3μl

Taq DNA聚合酶(5U/μl) 0.3μl

最后加水至30μlPCR参数设置：

94℃预变性60s；然后94℃变性30s,47℃复性30s，延伸25s，

共30个循环；最后，72℃延伸5min。反应完毕，取5μl电泳观察，结果见图2、4、6、7。实施例3．中间载体Ⅱ的构建(cad1-C和cad1-A反义顺序的获得)

方法参见实施例1、2。

提取质粒pcad1-A，取1ug质粒DNA用EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切1hr，回收约1.3Kb的DNA片段；另外提取质粒中间载体Ⅰ,SmaⅠ和EcoRⅤ酶切1hr，回收约4Kb的片段作为载体。取200ngDNA片段与50ng载体连接，转化大肠杆菌。长出单菌落后，接菌经酶切鉴定结果见图4，得到重组质粒，即为中间载体Ⅱ。实施例4．转基因载体的构建

方法参见实施例1、2。

提取质粒pLJ123，取1μg用SmaⅠ和XbaⅠ切开，回收DNA片段；中间载体Ⅱ1ug用EcoRⅤ和XbaⅠ切开，回收约2.3kb的片段，连接，转化，鉴定得到重组质粒，即为转基因载体。酶切、PCR检测电泳图结果见图6和图7。实施例5．棉花转基因

方法参见文献(龚蓁蓁等，中国科学(B辑).1988,18(6):612-614)。

大量提取转基因载体质粒，用PEG纯化，溶于无菌水。棉花开花的当天，以微量加样器吸质粒溶液注射到棉花子房内，每个子房注射约1-5ug质粒DNA。实施例6．转基因棉花的GUS组织化学染色

GUS组织化学染色按文献(顾红雅等编著，植物基因与分子操作．北京．北京大学出版社．1995)进行。转基因后，收回的种子灭菌，在MS培养基上萌发。取棉花根尖浸泡于GUS染色液中，37℃温育4hr以上，加入70％乙醇脱色后观察。所用缓冲液如下：

磷酸缓冲液：

0.2M Na₃PO₄ 25ml

0.2M Na₂HPO₄ 6.2ml

0.2M NaH₂PO₄ 28ml pH7.0

GUS染色液：

磷酸缓冲液 25ml

0.1M K₃[Fe(CN)₆] 0.25ml

0.1M K₄[Fe(CN)₆] 0.25ml

0.5M Na₂EDTA 1ml

ddH₂O 23.5ml

X-GLucururonide 50mg

结果见图8，转基因棉花根尖被染成蓝色，而未转基因棉花则未被染成蓝色。实施例7．转基因棉花的Western blotting检测

按文献(Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1982,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)进行。

取一粒棉籽，加液氮充分研磨后，加入适量的蛋白提取缓冲液(Tris/HCl50mmol,pH8.0,EDTA 10mmol pH8.0，巯基乙醇1％),4℃,15000rpm，离心10分钟后，取上清液，按考马斯亮兰测定蛋白含量。各取5ug总蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后用Bio-Rad电转移装置(美国Bio-Rad公司出品)转移到硝酸纤维素膜上(4℃,50mA，过夜)。兔抗棉花倍半萜合成酶多克隆抗体以1∶300稀释使用，第二抗体为碱性磷酸酶联羊抗兔单克隆抗体(购自Promega公司)，以1∶2500稀释使用。显色剂为BCIP和NBT(购自Promega公司)。结果见图9，可以看到转基因棉花棉籽中杜松烯合成酶Western blotting的特定条带比未转基因的较细、较弱，说明在所采用的几个棉花品种中，转基因棉花棉籽中杜松烯合成酶含量均大大低于未转基因棉花的棉籽。实施例8．转基因棉花的棉毒素含量检测

按文献(Bell,A.A.Phytopathology.1967,57:759-764)进行。

取0.5g-1.0g植物组织，用液氮充分研磨后转至5ml离心管中，加入4ml70％丙酮萃取1hr，其间不断摇动。离心后取2ml上清液加入到2ml棉酚显色液(2N HCl/1％间苯三酚的乙醇溶液)中，50-55℃温育5min，用紫外分光光度计(UNICAM)测定555nm的光吸收值。结果见图10。转基因棉花的棉籽比未转基因棉花棉籽中的棉酚含量明显下降，下降幅度一般在40％左右。而检测其它组织和器官时，转基因与未转基因棉花的棉酚含量无变化。

Claims

1．一种抑制棉籽中棉毒素形成的基因工程方法，其特征在于该方法采用棉花杜松烯合成酶的反义顺序。

2．如权利要求1所述的基因工程方法，其特征在于在种子特异启动子的驱动下，将所述棉花杜松烯合成酶基因cDNA的反义顺序导入棉花，产生抑制正常杜松烯合成酶基因表达的反义RNA。