CN100417929C - 棉子携带黄萎病菌的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种棉子携带黄萎病菌的免疫检测方法，其特征在于取种子样品1000粒以上置于网袋中，没有经过药物包衣的种子，用流水搓洗，而经药物包衣的种子反复搓洗至药物包衣完全洗尽后，将种子于阴凉处晾干。然后将晾干的种子样品加入含有适量抑制细菌生长的抗生素的查彼克培养液中培养。将预先处理的种子样品培养液与包被液等体积混合，温育处理；洗板，加入封闭液，温育；洗板，加入抗血清，温育；洗板，加入碱性磷酸酶标记的二抗，温育；洗板，加入底物液，温育；加入终止液终止反应。在405nm波长下，测定各孔的OD值，并计算样品平均OD₄₀₅值与阴性对照平均OD₄₀₅值的比值，判断种子样品是否携带黄萎病菌。本发明样品前处理简单，是一种简便、快速、灵敏、准确、廉价的检测方法，适合于各种子公司、检疫机构、科研单位等进行种子携带黄萎病菌的检测。

Description

棉子携带黄萎病菌的检测方法

技术领域：

本发明涉及一种棉子携带黄萎病菌的免疫检测方法。

背景技术：

棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的一种维管束萎焉病害，该病菌的寄主范围很广，能浸染40个科600多种植物。棉子带菌是远距离传病的主要方式。棉花黄萎病最先在美国发现，二十世纪30年代随美国棉种传入我国，后扩散到河南、山东、新疆等20多个省(区、市)，1995年再一次被列为全国植物检疫对象。自上世纪90年代后期，我国棉花黄萎病的危害逐年加重，原因除了缺乏较强的抗耐性棉花品种、适宜的气候条件之外，其中一个重要原因是棉子带菌。由于棉花黄萎病菌在病田中存活时间长，一旦扩散，将给棉花生产带来毁灭性灾害。目前，对棉花黄萎病菌的检测除常规的平板培养检测外，主要采用PCR方法及免疫技术，但多是针对培养好的黄萎病菌，而对棉子带菌的检测还远未实现。

棉花黄萎病菌的常规检测方法操作复杂、费时，特异性也不高。直接利用菌体作抗原，制备抗血清进行免疫检测，又可能会出现抗血清效价偏低以及与其他具有相同抗原成分的病原菌引起交叉反应的缺陷。棉花黄萎病菌产生的毒素蛋白是感病棉花品种致萎的主要原因，因此利用毒素制备抗血清就可以检测出棉花黄萎病菌。刘凤权等用毒素抗血清在病菌培养滤液、人工接种幼苗和大田病株中已能成功检测出黄萎病菌，另外，齐俊生等的研究表明，毒素抗血清具备一定生理型特异性，用强致病力菌系V₉₉₁毒素制备的抗血清对强致病力菌系毒素具有更强的结合力，能够检测出强致病力落叶型菌系，但还没有利用毒素抗血清检测棉子携带黄萎病菌的报道。

目前市场上流通的棉花种子大多是包衣子，而所用的包衣剂大多是针对苗病，而不是黄萎病，包衣还不能完全杀死黄萎病菌，包衣子并不是无菌子。当前急需一套行之有效的棉子检测技术尤其是对“药物包衣”棉子的检测技术来检测棉子是否携带黄萎病菌。只有通过该检测技术才能做到既坚决保护无病区，严防病菌传播，又能保证良种的合理推广流动。

发明内容：

本发明的目的在于：针对目前棉子携带黄萎病菌检测中存在的实际问题，提供一种新的棉子携带黄萎病菌的免疫检测方法。

本发明的目的是这样实现的：一种棉子携带黄萎病菌的检测方法，其特征在于：

a、所述的棉子样品应取1000粒以上置于网袋中，没有经过药物包衣的棉子，用流水搓洗，而经药物包衣的棉子反复搓洗至药物包衣完全洗尽，然后将棉子于阴凉处晾干。

b、将晾干的棉子样品加入含有适量抑制细菌生长的抗生素的查彼克培养液中，25℃振荡培养3d后取培养液5000r·min^-1，离心30min后的上清液，作为待测棉子样品的培养液，进行后序测试。

c、将待测棉子样品的培养液用包被液1∶1稀释后，取100μL加至酶标板的反应孔中4℃过夜或37℃下孵育2h；并以标准抗原为阳性对照，空白培养液为阴性对照。

d、取出酶标板，弃去包被液，用PBST洗板3次，甩干，并在每孔中加入300μL封闭液，37℃保温1h；

e、取出酶标板，弃去封闭液，用PBST洗板3次，甩干，每孔加入100μL用封闭液稀释的抗血清，37℃下保温1h；

f、取出酶标板，弃去用封闭液稀释的抗血清，用PBST洗板3次，甩干，每孔加入100μL用封闭液稀释的碱性磷酸酶标记的二抗(IgG-AP)，于37℃下保温1h；

g、取出酶标板，弃去用封闭液稀释的二抗，用PBST洗板3次，甩干，每孔加入100μL新配制的含1g·L^-1对硝基苯磷酸盐底物显色液37℃下显色；

h、每孔加入50μL终止液终止反应。终止反应后，用吸水纸吸干酶标板底部，将酶标板置于酶标仪上，在405nm波长下，测定各孔的OD值。

i、按公式：P/N＝样品平均OD₄₀₅值/阴性对照平均OD₄₀₅值，计算ELISA检测的P/N值。

j、以P/N≥2判为阳性，认定该棉子样品携带有黄萎病菌。

k、所述的标准抗原是用棉花黄萎病菌培养后获得的毒素蛋白。

l、所述的抗血清是用标准抗原免疫小鼠或新西兰兔制成的多克隆抗血清或单克隆抗血清。

本发明的优点在于：是以棉花黄萎病菌培养液中的毒素蛋白作为抗原制备抗血清，建立的可特异性检测棉花黄萎病菌的间接ELISA方法。具有样品前处理简单，操作简便、快速、灵敏、准确、廉价的优点。采用碱性磷酸酶标记的二抗，有效避免了植物体内过氧化物酶及酚类的干扰。本发明适合于各种子公司、检疫机构、科研单位等进行种子携带黄萎病菌的检测。

具体实施方式：

下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1  毒素抗血清的制备

将活化后的棉花黄萎病菌菌株Bp₂接种于查彼克培养液中，25℃振荡培养16d后，5000r·min^-1，离心30min，取上清，0.45μm微孔滤膜过滤后，装入超滤离心管(Millipore公司，截留分子量为10000Da)中，反复离心直到毒素蛋白浓缩达0.1mg·L^-1以上，用生理盐水4℃透析后作为标准抗原。将标准抗原与福氏不完全佐剂以1∶1混合充分乳化后，按腹腔注射法共4次免疫BALB/C小白鼠，每次免疫间隔3周。眼球采血法采血，获得毒素的抗血清。

实施例2  毒素抗血清的鉴定

将标准抗原用包被液(碳酸盐缓冲液)稀释后，取100μL加至酶标板的反应孔中37℃下孵育2h或4℃过夜后，用PBST洗板3次，然后加入300μL封闭缓冲液(含1％脱脂奶粉的PBST)37℃保温1h，PBST洗板3次，每孔加入100μL用封闭缓冲液稀释的抗血清于37℃下保温1h，再用PBST洗板3次后，每孔加入100μL用封闭缓冲液稀释6000倍的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗血清(IgG-AP)于37℃下保温1h，再用PBST洗板3次后，每孔加入100μL新配制的含1g·L^-1对硝基苯磷酸盐底物显色液37℃下显色，最后加入50μL终止液(0.2mol·L^-1EDTA)终止反应。在酶标仪上测出405nm处的OD值。按公式：P/N＝样品平均OD₄₀₅值/阴性对照平均OD₄₀₅值计算ELISA检测P/N值(positive/negative)。以P/N≥2判为阳性。

将毒素抗血清从1∶6400开始倍比稀释至1∶819200，以免疫前的健康血清为阴性对照，按上述间接ELISA程序测定抗血清的效价。当毒素抗血清稀释至1∶204800时，测定的OD₄₀₅值与阴性对照OD值之比(P/N)＞2，而当抗血清稀释至1∶409600时，P/N＜2，表明制备的毒素抗血清的效价为1∶204800。

将毒素抗原从2mg·L^-1开始逐步稀释至0.0039mg·L^-1，按上述间接ELISA程序检测灵敏度。以判为阳性的最大抗原稀释倍数作为检测灵敏度。当毒素抗原稀释至7.81μg·L^-1时，测定的OD₄₀₅值与阴性对照OD值之比(P/N)＞2，而当毒素抗原稀释至3.91μg·L^-1时，P/N＜2。因此，建立的间接ELISA方法对毒素抗原的最低检测量达7.81μg·L^-1。

以建立的间接ELISA方法测定抗血清与棉花黄萎病菌菌株T₉、02SY₃、02XZH₃、02GY₃、02YD₅、VD₈、02NJ₂、V₁₅₁、02FN₈、02DT₆、02XY₃和02CS₃以及棉花立枯病菌、棉花红腐病菌、小麦赤霉病菌、油菜菌核病菌、稻瘟病菌培养液的反应，以确定抗血清的特异性。结果如表1所示，棉花黄萎病菌的美国标准菌株T₉以及从江苏省各地采集的棉花黄萎病菌菌株的培养液均可与毒素抗血清发生阳性反应，而抗血清与非黄萎病菌的培养液的反应呈阴性。由此认为该抗血清对棉花黄萎病菌的培养液有较高的特异性，可用于毒素的检测。

表1  毒素抗血清特异性的测定

实施例3  培养滤液中毒素的测定

将活化的菌株Bp₂和T₉分别接种于查彼克培养液中，25℃振荡培养，分别在1、3、5、7、9、11d后取培养液，按上述间接ELISA程序测定培养液中的毒素，以未接菌的培养液为阴性对照。菌株Bp₂、T₉在培养1d后就可从培养液中检测到毒素。在培养至3d后，OD₄₀₅值已分别达到1.407、1.371，P/N值分别为9.05、8.82，并且在11d内，OD₄₀₅值都保持较高的数值。表明所建立的间接ELISA方法能够快速检测棉花黄萎病菌培养液中的毒素。

实施例4  在棉子检测上的应用

对江苏省植保站送检的81份怀疑带菌的棉子样品进行测定。其程序为：每份棉子样品分别取100g置于网兜中，分开浸泡清洗。毛子用流水搓洗两至三遍，药物包衣的棉子反复搓洗至药物包衣完全洗尽，然后将种子于阴凉处晾干。将晾干的每份棉子样品平均分成五份分别加入150mL含有适量氯霉素的查彼克培养液中，25℃振荡培养3d后取培养液5000r·min^-1，离心30min后的上清液，按上述间接ELISA方法进行检测，以菌株Bp₂的毒素抗原为阳性对照，未接菌的培养液为阴性对照。结果表明62份包衣子中4份带菌，17份毛子中8份带菌，2份光子中没有检查出带菌。在带菌的棉子中，也并不是每个三角瓶中(含20g棉子)的培养液中都呈反应阳性，结果如表2所示。根据陈吉棣等的研究，病铃内成熟种子的带菌率为0.025％，本发明对于棉子携带黄萎病菌的检测，采取每个样品随机取棉子100g，即1200粒左右，培养时平均置于5个三角瓶中培养，可能并不是每个三角瓶中都装有携带有黄萎病菌的棉子，因此，间接ELISA检测结果表现出有的三角瓶培养液呈阳性，有的呈阴性。目前棉子所用的包衣剂大多是针对苗病，而不是黄萎病，本发明从包衣子中检测到棉花黄萎病菌，说明包衣还不能完全杀死黄萎病菌，包衣子并不是无菌子。但检测结果也显示出，经硫酸脱绒后的光子和包衣子，其黄萎病菌的带菌率已经明显低于毛子。

将间接ELISA检测为阳性的棉子按照上述方法洗净晾干后，每份各称100g，分别装入600mL含有适量氯霉素的PDB培养基中，阳性对照选用棉花黄萎病菌Bp₂，25℃，150r·min^-1，培养6d后，2000r·min^-1离心10min取上清，用针刺接种的方法接种于2片真叶期的泗棉3号棉苗的茎基部。20d后劈杆调查发病率。本发明采用100g棉子置于同1个三角瓶中培养，用其培养液针刺接种棉苗，以验证间接ELISA检测结果的可靠性。结果表明12份间接ELISA检测为阳性的棉子培养液针刺棉苗，都可使棉苗发病，表明本发明的研究结果可靠。

表2检测出的带菌棉子举例

Claims (2)

1. 一种棉子携带黄萎病菌的检测方法，其特征在于：

a、所述的棉子样品应取1000粒以上置于网袋中，没有经过药物包衣的棉子，用流水搓洗，而经药物包衣的棉子反复搓洗至药物包衣完全洗尽，然后将棉子于阴凉处晾干；

b、将晾干的棉子样品加入含有适量抑制细菌生长的抗生素的查彼克培养液中，振荡培养3d后取培养液，以5000r·min^-1的离心速度进行离心30min后，取上清液作为待测棉子样品的培养液；

c、将待测棉子样品的培养液用包被液1∶1稀释后，取100μL加至酶标板的反应孔中4℃过夜或37℃下孵育2h；并以标准抗原为阳性对照，空白培养液为阴性对照；

d、取出酶标板，弃去包被液，用PBST洗板3次，甩干，并在每孔中加入300μL封闭液，37℃保温1h；

e、取出酶标板，弃去封闭液，用PBST洗板3次，甩干，每孔加入100μL用封闭液稀释的抗血清，37℃下保温1h；

f、取出酶标板，弃去用封闭液稀释的抗血清，用PBST洗板3次，甩干，每孔加入100μL用封闭液稀释的碱性磷酸酶标记的二抗，于37℃下保温1h；

g、取出酶标板，弃去用封闭液稀释的二抗，用PBST洗板3次，甩干，每孔加入100μL新配制的含1g·L^-1对硝基苯磷酸盐底物显色液37℃下显色；

h、每孔加入50μL终止液终止反应，终止反应后，用吸水纸吸干酶标板底部，将酶标板置于酶标仪上，在405nm波长下，测定各孔的OD值；

i、按公式：P/N＝样品平均OD₄₀₅值/阴性对照平均OD₄₀₅值，计算ELISA检测的P/N值；

j、以P/N≥2判为阳性，认定该棉子样品携带有黄萎病菌。

2. 根据权利要求1所述的棉子携带黄萎病菌的检测方法，其特征在于：所述的标准抗原是用棉花黄萎病菌培养后获得的毒素蛋白；所述的抗血清是用标准抗原免疫小鼠或新西兰兔制成的多克隆抗体或单克隆抗体。