CN117143911A - 增加大豆磷吸收率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了增加大豆磷吸收率的方法。本发明解决的技术问题是提高根表型、增加磷吸收效率和提高大豆低磷耐受性。具体公开了蛋白质、敲除或抑制或降低或下调所述蛋白质的编码基因表达的物质或敲除或抑制或降低或下调所述蛋白质的活性或含量的物质在提高根表型、增加磷吸收效率和提高大豆低磷耐受性中的应用。敲除大豆的上述蛋白，可提高根表型、增加磷吸收效率和提高大豆低磷耐受性，可见上述蛋白及其编码基因在根表型、磷吸收效率和大豆低磷耐受性中发挥重要作用，可用于制备上述相关产品。

Description

增加大豆磷吸收率的方法
技术领域
本发明具体涉及增加大豆磷吸收率的方法。
背景技术
大豆是世界重要的粮油兼用作物，也是人类优质蛋白及畜牧业饲料蛋白的主要来源。同时大豆是需磷量较大的作物，其籽粒磷含量远远高于水稻、小麦和玉米等作物，缺磷不仅影响大豆的生长发育，还显著影响根瘤的形成，并最终降低产量。土壤缺磷以及磷吸收利用效率低已成为限制我国大豆产量的重要因素。而依靠土壤增施磷肥求高产的传统途径已不适应绿色农业的发展要求。因此，提高大豆对土壤磷素的吸收和利用效率，挖掘耐低磷关键基因，通过分子育种快速培育磷高效大豆新品种是当务之急。
植物对土壤养分的高效吸收主要取决于植物的吸收特性和根系形态。其中，根系形态根对养分吸收，特别是一些难移动性养分(如磷)的吸收具有重要作用。植物建立发达的根系增加与土壤磷的接触面积，提高磷获取能力，是一种非常重要且有效的耐低磷机制。大豆的根系有主、侧根之分，可分为浅根型、中间型和深根型，不同基因型之间根系形态遗传变异显著。因而通过不同磷水平下的遗传分析鉴定调控大豆根系形态相关的基因，是揭示作物耐低磷机理和培育磷高效大豆的重要基础。
因此，如何提高大豆磷吸收率、根表型和提高大豆低磷耐受性是本领域人员代解决的技术问题。
发明内容
本发明解决的技术问题是提升根部表型及提高植物磷吸收率。
为了将解决上述问题，本申请提供了一种增加大豆磷吸收率和/或根表型的方法。
所述方法通过包括M1、M2或M3的步骤来增加大豆磷吸收率和/或根表型
M1、敲除大豆中的基因，
M2、抑制或降低或下调大豆中所述基因的表达，
M3、抑制或降低或下调所述基因编码蛋白质的活性和/或含量；
所述基因编码如下任一种蛋白质：
B1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
B2)将B1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具相同功能的蛋白质；
B3)将B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述蛋白质中，序列2(SEQ ID No.2)由229个氨基酸残基组成。将其命名为GmYC4蛋白或蛋白质GmYC4或蛋白GmYC4。其编码基因为GmYC4基因。
本申请中，所述调控可为抑制或降低或下调。
上文中，所述敲除或抑制或降低或下调上述蛋白质的编码基因表达或上述蛋白的活性或含量使植物具有下述任一种效果：
C1)增加植物根部表面积；
C2)增加植物根体积；
C3)增加植物根长；
C4)增加植物根尖数；
C5)增加植物根干重；
C6)提高植物磷吸收率；
C1)提高植物低磷耐受性。
上述的方法中，所述蛋白来源于大豆。
上述的方法中，其特征在于，所述M1包括向所述大豆中导入以序列3的第137-156位为靶序列的基因敲除载体。
上文中，所述基因敲除载体可为表达cas9和靶向所述蛋白质编码基因的gRNA的重组表达载体。所述gRNA的靶标序列可为5′-TCGGGACCCTACCCCGTCGC-3′。
本发明中，所述基因敲除载体可为重组载体GmYC4-sgRNA。所述重组载体GmYC4-sgRNA是先将pUC57-SgRNA1-SpCas9载体的NHeI和BbsI限制性内切酶识别位点之间的片段替换为靶序列(序列3第137-156位)得到重组载体pUC57-SgRNA2-SpCas9。
将pUC57-SgRNA2-SpCas9质粒使用限制性内切酶PacI和PmeI进行酶切，获得小片段(586bp)，记作酶切片段1。将PTF101-SpCas质粒9使用限制性内切酶PacI和PmeI进行酶切，获得大片段(14232bp)，记作酶切片段2。
将酶切片段1和酶切片段2连接获得的重组载体GmYC4-sgRNA；将含有重组载体GmYC4-sgRNA的大肠杆菌DH5α命名为DH5α/重组载体GmYC4-sgRNA。
上述的方法中，所述基因敲除载体为表达cas9和靶向所述蛋白质编码基因的gRNA的重组表达载体。。
为了将解决上述问题，本申请还提供了一种增加大豆根表型和/或磷吸收率的方法。
所述方法为将目的大豆的基因组进行如下任一操作：
K1)将目的大豆基因组序列表中序列3的第149位至153位进行缺失突变；
K2)将目的大豆基因组序列表中序列3的第148位的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸缺失突变。
所述根表型为根部表面积、根体积、根长、根尖数、根干重、磷吸收率、低磷耐受性中的至少一种。
为了将解决上述问题，本申请还提供了下述应用。
上述蛋白质相关的生物材料在下述任一种的应用：
P1)增加植物磷吸收率和/或制备增加植物磷吸收率的产品中的应用；
A1)增加植物根部表面积和/或制备增加植物根部表面积的产品中的应用；
A2)增加植物根体积和/或制备增加植物根部体积的产品中的应用；
A3)增加植物根长和/或制备增加植物根长的产品中的应用；
A4)增加植物根尖数和/或制备增加植物根尖数的产品中的应用；
A5)增加植物根干重和/或制备增加植物根干重的产品中的应用；
所述生物材料为下述任一种物质：
N1、敲除所述蛋白质的编码基因的物质；
N2、抑制或降低或下调所述蛋白质的编码基因表达的物质；
N3、敲除或抑制或降低或下调所述蛋白质的活性或含量的物质。
上述的应用中，所述物质为下述任一种：
D1)抑制或降低或下调上述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；
D2)表达D1)所述核酸分子的编码基因；
D3)含有D2)所述基因的表达盒；
D4)含有D2)所述基因的重组载体、或含有D3)所述表达盒的重组载体；
D5)含有D2)所述基因的重组微生物、或含有D3)所述表达盒的重组微生物、或含有D4)所述重组载体的重组微生物；
D6)含有D2)所述基因的转基因植物细胞系、或含有D3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有D4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
D7)含有D2)所述基因的转基因植物组织、或含有D3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有D4)所述重组载体的转基因植物组织；
D8)含有D2)所述基因的转基因植物器官、或含有D3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有D4)所述重组载体的转基因植物器官。
D2)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的抑制或降低或下调蛋白质GmYC4编码基因表达的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的抑制或降低或下调蛋白质GmYC4编码基因表达的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，且具有抑制或降低或下调蛋白质GmYC4编码基因表达的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述D4)中，所述重组载体可为用植物基因编辑载体。所述植物基因编辑载体可为cas9/gRNA载体。
作为一个具体实施例，上述所述重组载体为重组载体GmYC4-sgRNA。
重组载体GmYC4-sgRNA是先将pUC57-SgRNA1-SpCas9载体的NHeI和BbsI限制性内切酶识别位点之间的片段替换为靶序列(序列3第137-156位)得到重组载体pUC57-SgRNA2-SpCas9。
将pUC57-SgRNA2-SpCas9质粒使用限制性内切酶PacI和PmeI进行酶切，获得小片段(586bp)，记作酶切片段1。将PTF101-SpCas质粒9使用限制性内切酶PacI和PmeI进行酶切，获得大片段(14232bp)，记作酶切片段2。
将酶切片段1和酶切片段2连接获得的重组载体GmYC4-sgRNA；将含有重组载体GmYC4-sgRNA的大肠杆菌DH5α命名为DH5α/重组载体GmYC4-sgRNA。
上述D5)所述的微生物可为农杆菌。所述农杆菌为EHA105。
上文中，所述抑制或降低或下调上述蛋白质的编码基因表达的核酸分子可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上述的应用中，D1)所述核酸分子为靶向上述蛋白质编码基因的gRNA。
上文中，所述gRNA的靶标序列可为序列3的第137-156位。
上述的应用中，所述植物为如下任一种：
G1)双子叶植物；
G2)豆科植物；
G3)大豆属植物；
G4)大豆。
上蛋白质或其相关的生物材料：
所述蛋白质是氨基酸序列是序列5所示的蛋白质；
所述生物材料为权利要求7所述的核酸分子、编码基因、表达盒、重组载体、重组微生物、植物细胞系、植物细组织或植物细器官。
上文中，所述大豆可为大豆品种Jack。
有益效果
本发明构建了GmYC4基因敲除载体：重组载体GmYC4-sgRNA。重组载体GmYC4-sgRNA是先将pUC57-SgRNA1-SpCas9载体的NHeI和BbsI限制性内切酶识别位点之间的片段替换为靶序列(序列3第137-156位)得到重组载体pUC57-SgRNA2-SpCas9。
将pUC57-SgRNA2-SpCas9质粒使用限制性内切酶PacI和PmeI进行酶切，获得小片段(586bp)，记作酶切片段1。将PTF101-SpCas质粒9使用限制性内切酶PacI和PmeI进行酶切，获得大片段(14232bp)，记作酶切片段2。
将酶切片段1和酶切片段2连接获得的重组载体GmYC4-sgRNA；将含有重组载体GmYC4-sgRNA的大肠杆菌DH5α命名为DH5α/重组载体GmYC4-sgRNA。
将重组载体GmYC4-sgRNA导入农杆菌EHA105感受态细胞。得农杆菌EHA105/重组载体GmYC4-sgRNA。使用农杆菌EHA105/重组载体GmYC4-sgRNA侵染大豆获得一株GmYC 4基因敲除的纯合植株yc4。将其自交获得yc4 T2代纯合植株幼苗。yc4 T2代纯合植株幼苗的两条染色体中均存在下述突变：序列表中序列3第149-153位缺失。以Jack为对照，将其进行正常磷和低磷处理，结果表明与野生型大豆(Jack)，在低磷胁迫条件下，yc4 T2代纯合植株幼苗(实验组)的根长、根表面积、根体积、根尖数、根干重，磷吸收效率显著增加，其中磷吸收效率分别增加了3.76倍和1.11倍。
附图说明
图1为gmyc4突变体的突变类型。
图2为gmyc4突变体根系表型。
图3为gmyc4突变体根系表型统计。“*”表示与CK相比，具有显著性差异(P＜0.05)，“**”表示与CK相比，具有极显著差异(P＜0.01)，“***”表示与CK相比，具有非常显著性差异(P＜0.001)。
图4为GmYC4的基因表达水平。GmYC4在yc4 T2代纯合植株的表达水平非常显著地(P＜0.001)低于野生型大豆(Jack)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-wayANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有非常显著性差异。
栽培大豆Jack，记载在如下文献中：Chen L,CaiY,Liu X,Yao W,Guo C,Sun S,WuC,Jiang B,Han T,Hou W(2018),Improvement of soybean Agrobacterium-mediatedtransformation efficiency by adding glutamine and asparagine into the culturemedia.International Journal ofMolecular Sciences 19,3039，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
根癌农杆菌EHA105，记载在如下文献中：Cai Y,Chen L,Liu X,Guo C,Sun S,WuC,Jiang B,Han T and Hou W(2018a),CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis ofGmFT2a delays flowering time in soya bean.Plant Biotechnol J 16,176-185，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
MS盐：Phyto Tech，目录号：M524。
MS有机：Phyto Tech，目录号：M533。
B5有机：Phytotech公司，目录号：G219。
B5盐：Phytotech公司，目录号：G768。
YEP固体培养基由溶剂和溶剂组成；各溶质及其在YEP固体培养基中的浓度为：NaCl5g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，15g/L琼脂；溶剂为水。YEP固体培养基的pH为7.0。
发芽培养基(pH5.8)：3.12g/L B5盐、1ml/L B5有机、20g/L蔗糖、7.5g/L琼脂，，溶剂为ddH2O。
液体培养基(pH5.4)：0.43g/L MS盐、1ml/LB5有机、40mg/L乙酰丁香酮、150mg/L二硫苏糖醇、100mg/L L-半胱氨酸、30g/L蔗糖、3.9mg/L 2-吗啉乙磺酸，，溶剂为ddH2O。
共培养培养基(pH5.4)：0.43g/L MS盐、1ml/LB5有机、40mg/L乙酰丁香酮、150mg/L二硫苏糖醇、100mg/L L-半胱氨酸、30g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、3.9mg/L 2-吗啉乙磺酸，，溶剂为ddH2O。
恢复培养基(pH5.4)：3.1g/L B5盐、1ml/LB5有机、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、1mg/L 6-BA、0.98g/L 2-吗啉乙磺酸、7.5g/L琼脂、4ml/LFe盐(200×)、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，，溶剂为ddH2O。
筛选培养基(pH5.4)：3.1g/L B5盐、1ml/L B5有机、0.98g/L 2-吗啉乙磺酸、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、1mg/L 6-BA、6mg/L草丁膦、7.5g/L琼脂、4ml/LFe盐(200×)、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，，溶剂为ddH2O。
伸长培养基(pH5.6)：4.0g/LMS盐、1ml/LB5有机、0.6g/L 2-吗啉乙磺酸、30g/L蔗糖、150mg/L头孢霉素、150mg/L特美汀、0.1mg/L IAA、0.5mg/L GA、1mg/L 6-BA、6mg/L草丁膦、7.5g/L琼脂、4ml/LFe盐(200×)、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，，溶剂为ddH2O。
生根培养基(pH5.7)：2.165g/LMS盐、1ml/LB5有机、0.6g/L 2-吗啉乙磺酸、20g/L蔗糖、7.5g/L琼脂、50mg/L L-天冬酰胺、50mg/L L-谷氨酰胺，，溶剂为ddH2O。
改良的霍格兰营养液：5mmol/L硝酸钾、5mmol/L硝酸钙、2mmol/L硫酸镁，0.046mmol/L硼酸、0.009mmol/L四水氯化锰、0.0008mmol/L七水硫酸锌、0.0003mmol/L五水硫酸铜、0.0001mmol/L一水钼酸钠、0.02mmol/L七水硫酸亚铁、0.02mmol/L EDTA.Na，溶剂为ddH2O。
水培正常磷处理用1/2霍格兰营养液添加0.5mmol/L磷酸二氢钾(又称正常供磷营养液)：2.5mmol/L硝酸钾、2.5mmol/L硝酸钙、1mmol/L硫酸镁，0.023mmol/L硼酸、0.0045mmol/L四水氯化锰、0.0004mmol/L七水硫酸锌、0.00015mmol/L五水硫酸铜、0.00005mmol/L一水钼酸钠、0.01mmol/L七水硫酸亚铁、0.01mmol/L EDTA.Na、0.5mmol/L磷酸二氢钾，溶剂为ddH2O。
低磷处理用缺磷营养液：2.5mmol/L硝酸钾、2.5mmol/L硝酸钙、1mmol/L硫酸镁，0.023mmol/L硼酸、0.0045mmol/L四水氯化锰、0.0004mmol/L七水硫酸锌、0.00015mmol/L五水硫酸铜、0.00005mmol/L一水钼酸钠、0.01mmol/L七水硫酸亚铁、0.01mmol/L EDTA.Na、0.01mmol/L磷酸二氢钾，pH为5.8-6.0，溶剂为ddH2O。
实施例1GmYC4基因编辑CRISPR载体的构建
一、gRNA的获得
从Phytozome数据库获得大豆GmYC4基因组序列(序列3)。GmYC4位于6号染色体。利用CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)在线网页工具进行GmYC4 sgRNA靶位点序列的选择。靶点位于GmYC4的外显子区，靶序列为TCGGGACCCTACCCCGTCGC(序列3的第137-156位)。
大豆GmYC4基因组序列如序列3所示，具体如下：
ATCGGGTCTTTACTCTCTTACCCAACCCACACACACTCTTTCTCTCTCTCTCTTTCCCTGATCATCAAAATCAGAAAAAATTGGGGGAATGGAGACCAACAACCAGCAACAACAACAACAAGGAGCTCAAGCCCAATCGGGACCCTACCCCGTCGCCGGCGCCGGCGGCAGTGCAGGTGCAGGTGCAGGCGCTCCTCCCCCTTTCCAGCACCTTCTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCTCCAGATGTTCTGGTCTTACCAGCGTCAAGAAATCGAGCACGTGAACGACTTTAAGAATCACCAGCTCCCTCTTGCCCGCATCAAGAAGATCATGAAGGCCGACGAGGATGTCCGCATGATCTCCGCCGAGGCCCCCATCCTCTTCGCCAAGGCCTGCGAGCTCTTCATCCTCGAGCTCACCATCCGCTCCTGGCTCCACGCCGAGGAGAACAAGCGCCGCACCCTCCAGAAGAACGACATCGCCGCCGCCATCACCCGCACCGACATTTTCGA
CTTCCTCGTTGATATTGTCCCCCGCGACGAGATCAAGGACGACGCTGCTCTTGTGGGGGCCACCG
CCAGTGGGGTGCCTTACTACTACCCGCCCATTGGACAGCCTGCCGGGATGATGATTGGCCGCCCC
GCCGTCGATCCCGCCACCGGGGTTTATGTCCAGCCGCCCTCCCAGGCATGGCAGTCCGTCTGGCA
GTCCGCTGCCGAGGACGCTTCCTATGGCACCGGCGGGGCCGGTGCCCAGCGGAGCCTTGATGGC
CAGAGGTAACTGACTCACTCACTCACTATTTACCAAAAAGAAAAAACTCACTCCCTCACTGACT
TCTCACTTAAATTTGTGTTTGTGCTGAGGTTGGGTTTTAATTGTGTCATGCAATTGTTTGAACTCT
ACTATAATGGTTTGGTTTGACTATAGACGTTTTGTGTTGTGTTGTTTTTATCATATTGGTACGTGAG
GGCTTATTAGAATTTGTAATGTGTAAATGGAATGTTCTTTTTAAGGGTTTTTAAGGGAGCGTTTGT
CTCAGAATTTGCAAATTGCAAGGGCAATTTGACACGTTGACATGATGAAGTTTTGCAAAGCGTGA
TGAAACATATCACATTGTCATATATCATTTGACGTTGAACGATAACTTGGATGTCCTTTTTATGGGT
TGTTGTTGTCTTGGTCATGGGAATTATGTGAAAGTTGCAGGGGTGTTTTTTTTCTTGCAAACTACC
TTTGGACTGTTAGAAGTCGTTGTCTCTTAAAAATTTAATTTGCCTGAGGAATTTGTGCTGCTAATG
AGTATCTATTTCAGCTAGCTATTTGGATGTGAATGTGATACCTTAAACTAGGAATATCTGAATTTGG
GGAGGATTGGAATAGTTTTTTTTCTATAAATATAGTATTGGAATTTGATATAGTTCGACCAAGAAAT
GAGTCTCTCCCCCTTTTGTTTTGGGTGAACCTAGGATATCCCCTAGCCGAGAGCTAGAGACTAAT
CCTTCAAGGTACTTAGATCCATGTAAGAGGATGACTTCTCCCAATAGATGTTCTTCCATCCGTCTA
TTCTATTTAAAACATGCTAGTAGTAGGCGTGAGCTCTTGTGCATGAGATCGGGCAAAGTAGAGCT
GATGCAAATGATAAGTCTCTCCCCCTCTTCCCACAAAATGGACCTATCTTTCTAGGGAGGTCAAA
CTATGATGAAATGAACTTAGAGATTCTCAACAGGGTTAAACAAGCTTTAAAATTTTTAGCGTGGCT
AAGGTTCTTTATATTCCCTCATACTTTAGACTTTCAAAATGTGTGCAAGTTGGTACTTGGAATATGG
TAAAAGAAAGTAGGGCGATTCCACATTGTAATTATTAAGCCCAATCGGACCCAATTCATTTATTGT
GTCAGACTTACAATTGAGCCAGTGTTTGGCTAACCCGACAAGAGTTTTATTTGACTTGGGAGGTT
CTTTTCCTACCATATCAACTTTTGACCTTTGTTTCGGTAAATCAATTTTGCTAGTTAATAGCTGAGA
GTGAGACACCACAAATCAATTTTTTTAGCTCCCAAAGTAAGGACCAAGGATGACGTCAATGTTTG
ACACTTGCAAGGCTATAATAATTGAGGTAGCTGGAGGAGGTTGCCTATATGAAGTGGGGGCAAAC
TAGTTCCGTTTTATTAGCAGGCAATGTGGGCCATGTCCTCCATATGATTATTAGTTTAAGGTATCTTA
TAAGTTGATTGAATATTTAATCTGAATGTTAATTACTCACAGCCTGTTAGAAAACAATGTTTCATAT
TTTTCAATCATATGCTCTTTAATATGTATATTGTTATAAATATATATACTCGATTACTAAATTTTCAGA
ACTAGTGTCCTATTGACCCAATGCCTCAATCAAGTTGATTGATATGTGGTCCAAGTTTAATAACTAT
GTTTCGTTAGTAAAGATAATTAGATATTGCGTATGTTTGTATTCCTACATGCCCAAATCTGATGAGA
CAATGAAAGAATGCATCTCTTGGCCTTTAAATATAGATATTATGAAGATTGTTTGGTTTGGTTTAAC
AGGTATTGAATATATTACATGAGAAAATGTAAGATGGTGAATATGATGCACTCTGTTTTATTGTCAT
ATTTTATGGCAATGATGTTGCTTGATTGCTTCTGATCTGGTAGCATAAGCTCTCACTCCATTTAATG
TGCTTTACCTTGGCAAATTGTTGGAGTTGGAGCTCCTTAAGTCATTAATTAGTTTACTTGATTCCC
CAGTCTGTTAGGATATTATTTCTGTTGCATCTTGGTATGGGTGGATTATAGTAGAGGTACAGTTTGC
CTCGACAATTAGTTGAAAATTAGCAACCTTACAGACCATAAATTCGTCATTCCATTTCTGTTTTATA
TTTACCTTTTTATGGGGGGAGAGAGGAAGAAGGAAGTTTTCAAATTTTATGAACAGAAGTCAGA
AAGGATGTAGCACATTGGTAACTGTTTTAGGAATTAATTGATGGATTTGTTTTCTGAGCTATATATA
AGTCATATCAATTAACATTTCTACCTGCACAGTCTTGTAAATATGGCTTCAACTTAAATCATGTTGC
TACGTTAATGTGTTTTCAGTTTCCTTCCTTTAAAGCCATTATGAAATACTCGCTTAATGTCTTTTCT
GAAATTTTTGCCATTACTACATTTAAGTTCAGGATATTTGATTACTGATTAACACACGAAATGTGA
AAATTTATGAAGTTTTCAAATTTTATAAACAGAAAGGCTGTAGCTCATTGGTAACTAATTTATTTTA
TGGCTTAATTGATGGATTCATTTTCCGAGCACTATATCAACTAACAGTTTTACTCACTTAATCTTGT
AAATATGGCTTCAACTTAAATCCAGTTGCATTTTTAATGTGTCTTTATTCATCTCAAGTAACACCAA
CTTATGCCCTTAGTGATGTCCACATTGGAAATATTGAATTCTAGTGTGAGGTTTATAAGACCTGGG
CTCTCCAACTACAATAGCTAGCTTTTGTGGTTTGTTGCTCTCAAGGCTCTTATCAATTGGTTTGAG
AGGCAAAAACCATGATTCTGATCTGTAAATCAGTGGTGTGAGTGGCGATGCTGGCATTGCTTGAG
ATTAGTCATCCCACGTGGTGGCCGTTGGCCAGGGCTGCGAAGTGTGTTGGAATGTTAGATCCAAT
TGAAAGGTATGGGACTTAAGTCCCACATTAGAAACGTGAGATTATAGTGTGGGGGTTTGTAAGAC
CTTGAACTTTCCAACTATAACAGTTATCTTCTGTGGTGTGGCTCTTTCTAGATTCTTATCATGTTAC
AACAACAACTAAGCTTTTTTTCATTAGGCAGGTGGGGTTGGCAACATGGACCATATAAACGCCAT
AAATTTGTCATGTATTAAGTACAATGATATATCATTTACCTCTGAATCTCTAAATTTCTGTCATTAGC
ACATGTAATGTGAAAATTTGAATGCAACTTCCCAAAACTATGACCTGTTGTTCTGCATGATATTAA
GAGTTGTAAGCCAGAAGTTAACACCTCTGCTAATGCACAGAGGTGATGTTATAATAGACTGTTGA
CCATTGCCCTGCTACAACTGCCGCTGGGAATGTTAATTTATGATTATTAAAGTAGCTAAATTATTTT
ATATCCATCTGAAATATGTTTTATTTGCATGTGTAGTTTTTTTTGTTTATCGTGTATACTAATCTATGA
AAATTGGAAATGTGGTTTTGATGTATCCTGTGGTTTGCTCTTATGCAGTTGAGTGACATCGATGCC
GATGATGGACAGTCAGGAGTTATGAAGATTCTGAACTTGCTGCAATTTAGAAATGGTTTTGTTTA
CTAAATTTTTATGGGATGACACTGTGAACCTGTTAACTCGATGAACAGCATGATTTAACTACTTTT
GTACAAAAATTTAAAACTAAACACTGATCCTTCTGTGTGAAACATGTATGATCATCTGCCAATACT
GTTTATTTCCTCATAAGTCATGATACCACTCGTATACTTTGCTATGTGCTTCGATTCATAGTATTTGATATCCGGTATCTGATATCTATAGCTGTTTCTTTT。
大豆GmYC4基因组编码的蛋白序列如序列2所示，将其命名为GmYC4蛋白。
序列2具体如下：
METNNQQQQQQGAQAQSGPYPVAGAGGSAGAGAGAPPPFQHLLQQQQQQLQMFWSYQRQEIEHVNDFKNHQLPLARIKKIMKADEDVRMISAEAPILFAKACELFILELTIRSWLHAEENKRRTLQKNDIAAAITRTDIFDFLVDIVPRDEIKDDAALVGATASGVPYYYPPIGQPAGMMIGRPAVDPATGVYVQPPSQAWQSVWQSAAEDASYGTGGAGAQRSLDGQS。
GmYC4蛋白的编码序列(CDS)如序列1所示。
序列1具体如下：
ATGGAGACCAACAACCAGCAACAACAACAACAAGGAGCTCAAGCCCAATCGGGACCCTACCCCGTCGCCGGCGCCGGCGGCAGTGCAGGTGCAGGTGCAGGCGCTCCTCCCCCTTTCCAGCACCTTCTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCTCCAGATGTTCTGGTCTTACCAGCGTCAAGAAATCGAGCACGTGAACGACTTTAAGAATCACCAGCTCCCTCTTGCCCGCATCAAGAAGATCATGAAGGCCGACGAGGATGTCCGCATGATCTCCGCCGAGGCCCCCATCCTCTTCGCCAAGGCCTGCGAGCTCTTCATCCTCGAGCTCACCATCCGCTCCTGGCTCCACGCCGAGGAGAACAAGCGCCGCACCCTCCAGAAGAACGACATCGCCGCCGCCATCACCCGCACCGACATTTTCGACTTCCTCGTTGATATTGTCCCCCGCGACGAGATCAAGGACGACGCTGCTCTTGTGGGGGCCACCGCCAGTGGGGTGCCTTACTACTACCCGCCCATTGGACAGCCTGCCGGGATGATGATTGGCCGCCCCGCCGTCGATCCCGCCACCGGGGTTTATGTCCAGCCGCCCTCCCAGGCATGGCAGTCCGTCTGGCAGTCCGCTGCCGAGGACGCTTCCTATGGCACCGGCGGGGCCGGTGCCCAGCGGAGCCTTGATGGCCAGAGTTGA。
靶点设计好后，需要整合到载体上。首先，合成sgRNA的靶点引物，引物序列为：GmYC4-F：
5′-TCGAAGTAGTGATTGTCGGGACCCTACCCCGTCGCGTTTTAGAGCTAGAA-3′
GmYC4-R：5′-TTCTAGCTCTAAAACGCGACGGGGTAGGGTCCCGACAATCACTACTTCGA-3′
在25ul体系中各加入GmYC4-F及GmYC4-R引物5ul，水15ul，95℃3min，0.1℃/s退火至16℃，16℃保持10min，完成退火，获得gRNA退火产物。
二、表达sgRNA的载体的制备
(1)用限制性内切酶NHeI和BbsI，在50ul体系和37℃条件下双酶切载体pUC57-SgRNA1-SpCas9(序列7)3小时，1％的琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收目的条带(大小约3201bp)。
(2)取3.5μL gRNA退火产物与1.5μL酶切后的pUC57-SgRNA1-SpCas9载体胶回收产物，用Ultra One Step Cloning Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号C115-02)进行连接，冻融法转化大肠杆菌DH5α，涂于LB+Amp的固体培养基上，倒置在37℃培养箱中过夜。挑取单克隆，摇菌，进行测序分析。测序引物为pSgRNA-CX：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′进行单向测序，测序结果正确的菌液用于质粒提取，测序正确的质粒命名为pUC57-SgRNA2-SpCas9质粒。
(3)用限制性内切酶PacI和PmeI，在50ul体系和37℃条件下分别双酶切已连接上靶序列的pUC57-SgRNA2-SpCas9质粒和PTF101-SpCas9质粒(序列8)3小时，分别胶回收约586bp和约14232bp的目的片段，随后用T4 DNA连接酶(NEB，货号M0202V)进行连接，冻融法转化大肠杆菌DH5α，涂于LB+Spe的固体培养基上，倒置在37℃培养箱中过夜。挑取单克隆，摇菌，测序验证是否连接成功。确定插入正确的片段的质粒命名为重组质粒GmYC4-sgRNA。
重组载体GmYC4-sgRNA是先将pUC57-SgRNA1-SpCas9载体的NHeI和BbsI限制性内切酶识别位点之间的片段替换为靶序列(序列3第137-156位)得到重组载体pUC57-SgRNA2-SpCas9。
将pUC57-SgRNA2-SpCas9质粒使用限制性内切酶PacI和PmeI进行酶切，获得小片段(586bp)，记作酶切片段1。将PTF101-SpCas质粒9使用限制性内切酶PacI和PmeI进行酶切，获得大片段(14232bp)，记作酶切片段2。
将酶切片段1和酶切片段2连接获得的重组载体GmYC4-sgRNA；将含有重组载体GmYC4-sgRNA的大肠杆菌DH5α命名为DH5α/重组载体GmYC4-sgRNA。
序列7pUC57-SgRNA1-SpCas9载体序列如下：
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCAC
AGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGG
CGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGC
GGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAG
GCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAA
GGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA
AAACGACGGCCAGTGTTTAAACGGCGCGCCCCAATGTCCCTAGGTTCGTTGAACAACGGAAACT
CGACTTGCCTTCCGCACAATACATCATTTCTTCTTAGCTTTTTTTCTTCTTCTTCGTTCATACAGTT
TTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAACTTTCCATT
CGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAA
GAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGA
ATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCA
TTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTAT
ATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTGCTAGCGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACC
GGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCA
GCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGT
CCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTT
CGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCAGAAGACCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAAT
AAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTACTAGTTTAATTA
AGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACA
TACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATT
GCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGG
CCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCG
CTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATC
CACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGA
ACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAA
AAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCC
CCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTT
TCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGG
TCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCC
GGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTG
GTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAA
CTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAA
AAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGC
AAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGT
CTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGAT
CTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACT
TGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCA
TCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCC
AGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCC
AGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATT
GTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCT
ACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATC
AAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCG
TTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTA
CTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAAT
AGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGC
AGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACC
GCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTT
CACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGC
GACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTAT
TGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACA
TTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAAT
AGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC
序列8PTF101-SpCas9载体序列如下：
AGTACTTTAAAGTACTTTAAAGTACTTTAAAGTACTTTGATCCAACCCCTCCGCTGCTATAGTGCAGTCGGCTTCTGACGTTCAGTGCAGCCGTCTTCTGAAAACGACATGTCGCACAAGTCCTAAGTTACGCGACAGGCTGCCGCCCTGCCCTTTTCCTGGCGTTTTCTTGTCGCGTGTTTTAGTCGCATAAAGTAGAATACTTGCGACTAGAACCGGAGACATTACGCCATGAACAAGAGCGCCGCCGCTGGCCTGCTGGGCTATGCCCGCGTCAGCACCGACGACCAGGACTTGACCAACCAACGGGCCGAACTGCACGCGGCCGGCTGCACCAAGCTGTTTTCCGAGAAGATCACCGGCACCAGGCGCGACCGCCCGGAGCTGGCCAGGATGCTTGACCACCTACGCCCTGGCGACGTTGTGACAGTGACCAGGCTAGACCGCCTGGCCCGCAGCACCCGCGACCTACTGGACATTGCCGAGCGCATCCAGGAGGCCGGCGCGGGCCTGCGTAGCCTGGCAGAGCCGTGGGCCGACACCACCACGCCGGCCGGCCGCATGGTGTTGACCGTGTTCGCCGGCATTGCCGAGTTCGAGCGTTCCCTAATCATCGACCGCACCCGGAGCGGGCGCGAGGCCGCCAAGGCCCGAGGCGTGAAGTTTGGCCCCCGCCCTACCCTCACCCCGGCACAGATCGCGCACGCCCGCGAGCTGATCGACCAGGAAGGCCGCACCGTGAAAGAGGCGGCTGCACTGCTTGGCGTGCATCGCTCGACCCTGTACCGCGCACTTGAGCGCAGCGAGGAAGTGACGCCCACCGAGGCCAGGCGGCGCGGTGCCTTCCGTGAGGACGCATTGACCGAGGCCGACGCCCTGGCGGCCGCCGAGAATGAACGCCAAGAGGAACAAGCATGAAACCGCACCAGGACGGCCAGGACGAACCGTTTTTCATTACCGAAGAGATCGAGGCGGAGATGATCGCGGCCGGGTACGTGTTCGAGCCGCCCGCGCACGTCTCAACCGTGCGGCTGCATGAAATCCTGGCCGGTTTGTCTGATGCCAAGCTGGCGGCCTGGCCGGCCAGCTTGGCCGCTGAAGAAACCGAGCGCCGCCGTCTAAAAAGGTGATGTGTATTTGAGTAAAACAGCTTGCGTCATGCGGTCGCTGCGTATATGATGCGATGAGTAAATAAACAAATACGCAAGGGGAACGCATGAAGGTTATCGCTGTACTTAACCAGAAAGGCGGGTCAGGCAAGACGACCATCGCAACCCATCTAGCCCGCGCCCTGCAACTCGCCGGGGCCGATGTTCTGTTAGTCGATTCCGATCCCCAGGGCAGTGCCCGCGATTGGGCGGCCGTGCGGGAAGATCAACCGCTAACCGTTGTCGGCATCGACCGCCCGACGATTGACCGCGACGTGAAGGCCATCGGCCGGCGCGACTTCGTAGTGATCGACGGAGCGCCCCAGGCGGCGGACTTGGCTGTGTCCGCGATCAAGGCAGCCGACTTCGTGCTGATTCCGGTGCAGCCAAGCCCTTACGACATATGGGCCACCGCCGACCTGGTGGAGCTGGTTAAGCAGCGCATTGAGGTCACGGATGGAAGGCTACAAGCGGCCTTTGTCGTGTCGCGGGCGATCAAAGGCACGCGCATCGGCGGTGAGGTTGCCGAGGCGCTGGCCGGGTACGAGCTGCCCATTCTTGAGTCCCGTATCACGCAGCGCGTGAGCTACCCAGGCACTGCCGCCGCCGGCACAACCGTTCTTGAATCAGAACCCGAGGGCGACGCTGCCCGCGAGGTCCAGGCGCTGGCCGCTGAAATTAAATCAAAACTCATTTGAGTTAATGAGGTAAAGAGAAAATGAGCAAAAGCACAAACACGCTAAGTGCCGGCCGTCCGAGCGCACGCAGCAGCAAGGCTGCAACGTTGGCCAGCCTGGCAGACACGCCAGCCATGAAGCGGGTCAACTTTCAGTTGCCGGCGGAGGATCACACCAAGCTGAAGATGTACGCGGTACGCCAAGGCAAGACCATT
ACCGAGCTGCTATCTGAATACATCGCGCAGCTACCAGAGTAAATGAGCAAATGAATAAATGAGTA
GATGAATTTTAGCGGCTAAAGGAGGCGGCATGGAAAATCAAGAACAACCAGGCACCGACGCCG
TGGAATGCCCCATGTGTGGAGGAACGGGCGGTTGGCCAGGCGTAAGCGGCTGGGTTGTCTGCCG
GCCCTGCAATGGCACTGGAACCCCCAAGCCCGAGGAATCGGCGTGAGCGGTCGCAAACCATCC
GGCCCGGTACAAATCGGCGCGGCGCTGGGTGATGACCTGGTGGAGAAGTTGAAGGCCGCGCAG
GCCGCCCAGCGGCAACGCATCGAGGCAGAAGCACGCCCCGGTGAATCGTGGCAAGCGGCCGCT
GATCGAATCCGCAAAGAATCCCGGCAACCGCCGGCAGCCGGTGCGCCGTCGATTAGGAAGCCGC
CCAAGGGCGACGAGCAACCAGATTTTTTCGTTCCGATGCTCTATGACGTGGGCACCCGCGATAGT
CGCAGCATCATGGACGTGGCCGTTTTCCGTCTGTCGAAGCGTGACCGACGAGCTGGCGAGGTGA
TCCGCTACGAGCTTCCAGACGGGCACGTAGAGGTTTCCGCAGGGCCGGCCGGCATGGCCAGTGT
GTGGGATTACGACCTGGTACTGATGGCGGTTTCCCATCTAACCGAATCCATGAACCGATACCGGG
AAGGGAAGGGAGACAAGCCCGGCCGCGTGTTCCGTCCACACGTTGCGGACGTACTCAAGTTCT
GCCGGCGAGCCGATGGCGGAAAGCAGAAAGACGACCTGGTAGAAACCTGCATTCGGTTAAACA
CCACGCACGTTGCCATGCAGCGTACGAAGAAGGCCAAGAACGGCCGCCTGGTGACGGTATCCG
AGGGTGAAGCCTTGATTAGCCGCTACAAGATCGTAAAGAGCGAAACCGGGCGGCCGGAGTACAT
CGAGATCGAGCTAGCTGATTGGATGTACCGCGAGATCACAGAAGGCAAGAACCCGGACGTGCTG
ACGGTTCACCCCGATTACTTTTTGATCGATCCCGGCATCGGCCGTTTTCTCTACCGCCTGGCACGC
CGCGCCGCAGGCAAGGCAGAAGCCAGATGGTTGTTCAAGACGATCTACGAACGCAGTGGCAGC
GCCGGAGAGTTCAAGAAGTTCTGTTTCACCGTGCGCAAGCTGATCGGGTCAAATGACCTGCCGG
AGTACGATTTGAAGGAGGAGGCGGGGCAGGCTGGCCCGATCCTAGTCATGCGCTACCGCAACCT
GATCGAGGGCGAAGCATCCGCCGGTTCCTAATGTACGGAGCAGATGCTAGGGCAAATTGCCCTA
GCAGGGGAAAAAGGTCGAAAAGGTCTCTTTCCTGTGGATAGCACGTACATTGGGAACCCAAAGC
CGTACATTGGGAACCGGAACCCGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGTCACA
CATGTAAGTGACTGATATAAAAGAGAAAAAAGGCGATTTTTCCGCCTAAAACTCTTTAAAACTTA
TTAAAACTCTTAAAACCCGCCTGGCCTGTGCATAACTGTCTGGCCAGCGCACAGCCGAAGAGCT
GCAAAAAGCGCCTACCCTTCGGTCGCTGCGCTCCCTACGCCCCGCCGCTTCGCGTCGGCCTATCG
CGGCCGCTGGCCGCTCAAAAATGGCTGGCCTACGGCCAGGCAATCTACCAGGGCGCGGACAAG
CCGCGCCGTCGCCACTCGACCGCCGGCGCCCACATCAAGGCACCCTGCCTCGCGCGTTTCGGTG
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TGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGC
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实施例2、gmyc4突变体的获得及表型鉴定
一、重组菌的制备
提取DH5α/重组载体GmYC4-sgRNA中的重组载体GmYC4-sgRNA，用电转法将重组载体GmYC4-sgRNA转化根癌农杆菌EHA105，提取质粒进行测序验证，将测序验证正确的重组菌株命名EHA-GmYC4-sgRNA(含有重组载体GmYC4-sgRNA)。
二、农杆菌介导转化
利用农杆菌介导法将构建好的EHA-GmYC4-sgRNA转化大豆品种Jack(简称Jack，以下又称野生型大豆或野生型大豆Jack，Jack记载于中国作物种植信息网)，具体方法为：
1、种子灭菌
1)、取无病虫害和斑点、饱满、均一、干燥的大豆品种Jack(又称Jack)种子，完全平铺在培养皿中，然后将培养皿放入干燥器中。
2)、完成步骤1)后，在所述干燥器中放入100ml容量的烧杯，在烧杯中倒入80ml12M次氯酸钠水溶液，再慢慢加入4ml浓盐酸，然后迅速盖上干燥器，用凡士林密封，放置16h，进行氯气灭菌。
2、制备侵染菌液
1)、28℃，培养上述一得到的EHA-GmYC4-sgRNA菌液，用液体培养基重悬，得到OD600nm＝0.6的侵染菌液。
2)、将1处理后的种子放入超净台中，在显微镜下，剥去种皮，沿长轴将两个子叶分开，保留带完整胚轴的那片子叶，在其胚轴和子叶连接处进行划伤，一般一个子叶划伤3-5刀，然后在28℃培养箱中，浸染2h。
3)、将子叶内面(平滑面)向上，平铺于已铺有无菌滤纸的共培养培养基上，温度22℃，暗培养5d。
4)、共培养5d后，外植体胚轴伸长到2cm，切掉部分胚轴，使其保留0.5cm。将处理后的外植体放到恢复培养基中，28℃，16h光照/8h黑暗条件下，培养7d。
5)、从恢复培养基中取出外植体，去除新芽，切除部分胚轴，保留0.5cm的胚轴，再将修整后外植体转入到筛选培养基中，28℃，16h光照/8h黑暗条件下培养21d。
6)、经过21d的筛选诱导，外植体产生大量不定芽，剥除子叶和棕色的叶子，将剩余的部分转入伸长培养基中培养，28℃，16h光照/8h黑暗条件下培养。
7)、在伸长培养基中，当丛生芽抽出5-8cm幼茎时，从不定芽基部剪下来；茎基部在1mg/LIBA溶液中沾1min，然后转入生根培养基中培养，28℃，16h光照/8h黑暗条件下培养一周，在茎基部产生大量根后，移栽到盆中，长成的植株为T0代转化大豆。
三、编辑植株的分子检测
提取T0代转化大豆叶片的DNA作为模板进行PCR分子检测，以野生型大豆(Jack)为对照。
在GmYC4基因靶位点附近设计PCR引物，进行PCR扩增并测序。其中，引物FMA-F：5′-GAGACCAACAACCAGCAACA-3′和FMA-R：5′-GGGACAATATCAACGAGGAAG-3′扩增GmYC4基因。PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer 12.5ul，dNTP Mix(10mM)0.5ul，DNA(200ng/ul)1ul，F(10pmol/ul)1ul，R(10pmol/ul)1ul，Super-Fidelity DNAPolymerase 0.5ul，ddH2O8.5ul，总体积25ul。扩增反应体系：95℃3min；95℃30sec，58℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃5min。PCR产物送公司测序验证。
在靶点位置附近出现套峰为杂合编辑植株，命名为T0代转GmYC4大豆。
将T0代转GmYC4大豆播种后自交收获T1代转GmYC4大豆的种子，培育，得到T1代转GmYC4大豆，共12株，分别命名为T1-yc4-1，T1-yc4-2，T1-yc4-3，T1-yc4-4，T1-yc4-5，T1-yc4-8，T1-yc4-9，T1-yc4-10，T1-yc4-11，T1-yc4-12，T1-yc4-15，T1-yc4-18。
采用上述步骤三的编辑植株的分子检测方法检测T1代转GmYC4大豆，测序结果显示，在T1代转GmYC4大豆中，突变体植株(T1-yc4-18)在靶位点附近产生如下突变，使蛋白翻译提前终止，蛋白质序列突变为METNNQQQQQQGAQAQSGPYRRRRRQCRCRCRRSSPFPAPSPAAAAAAPDVLVLPASRNR ARERL(序列5)，且为纯合型，将其命名为T1代大豆gmyc4纯合突变体植株。
T1代大豆gmyc4纯合突变体植株[(T1-yc4-18),(gmyc4(5-bp deletion)]中GmYC4基因突变类型为：-5bp(图1)。T1代大豆gmyc4纯合突变体植株植株(gmyc4(5-bpdeletion))与野生型大豆Jack(GmYC4-WT)相比，大豆基因组中GmYC4基因发生了如下突变：两条同源染色体中，核苷酸序列是序列表中序列3的GmYC4的基因组基因均发生了如下变化：缺失了序列表中序列3的第149-153位的5个核苷酸，使蛋白翻译提前终止，从而将GmYC4基因敲除。GmYC4的基因组基因序列突变为序列6，其CDS序列突变为序列4。T1代大豆gmyc4纯合突变体植株以下简称yc4 T1代植株。
序列6具体如下：
ATCGGGTCTTTACTCTCTTACCCAACCCACACACACTCTTTCTCTCTCTCTCTTTCCCTGATCATCAAAATCAGAAAAAATTGGGGGAATGGAGACCAACAACCAGCAACAACAACAACAAGGAGCTCAAGCCCAATCGGGACCCTACCGCCGGCGCCGGCGGCAGTGCAGGTGCAGGTGCAGGCGCTCCTCCCCCTTTCCAGCACCTTCTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCTCCAGATGTTCTGGTCTTACCAGCGTCAAGAAATCGAGCACGTGAACGACTTTAAGAATCACCAGCTCCCTCTTGCCCGCATCAAGAAGATCATGAAGGCCGACGAGGATGTCCGCATGATCTCCGCCGAGGCCCCCATCCTCTTCGCCAAGGCCTGCGAGCTCTTCATCCTCGAGCTCACCATCCGCTCCTGGCTCCACGCCGAGGAGAACAAGCGCCGCACCCTCCAGAAGAACGACATCGCCGCCGCCATCACCCGCACCGACATTTTCGACTTCCTCGTTGATATTGTCCCCCGCGACGAGATCAAGGACGACGCTGCTCTTGTGGGGGCCACCGCCAGTGGGGTGCCTTACTACTACCCGCCCATTGGACAGCCTGCCGGGATGATGATTGGCCGCCCCGCCGTCGATCCCGCCACCGGGGTTTATGTCCAGCCGCCCTCCCAGGCATGGCAGTCCGTCTGGCAGTCCGCTGCCGAGGACGCTTCCTATGGCACCGGCGGGGCCGGTGCCCAGCGGAGCCTTGATGGCCAGAGGTAACTGACTCACTCACTCACTATTTACCAAAAAGAAAAAACTCACTCCCTCACTGACTTCTCACTTAAATTTGTGTTTGTGCTGAGGTTGGGTTTTAATTGTGTCATGCAATTGTTTGAACTCTACTATAATGGTTTGGTTTGACTATAGACGTTTTGTGTTGTGTTGTTTTTATCATATTGGTACGTGAGGGCTTATTAGAATTTGTAATGTGTAAATGGAATGTTCTTTTTAAGGGTTTTTAAGGGAGCGTTTGTCTCAGAATTTGCAAATTGCAAGGGCAATTTGACACGTTGACATGATGAAGTTTTGCAAAGCGTGATGAAACATATCACATTGTCATATATCATTTGACGTTGAACGATAACTTGGATGTCCTTTTTATGGGTTGTTGTTGTCTTGGTCATGGGAATTATGTGAAAGTTGCAGGGGTGTTTTTTTTCTTGCAAACTACCTTTGGACTGTTAGAAGTCGTTGTCTCTTAAAAATTTAATTTGCCTGAGGAATTTGTGCTGCTAATGAGTATCTATTTCAGCTAGCTATTTGGATGTGAATGTGATACCTTAAACTAGGAATATCTGAATTTGGGGAGGATTGGAATAGTTTTTTTTCTATAAATATAGTATTGGAATTTGATATAGTTCGACCAAGAAATGAGTCTCTCCCCCTTTTGTTTTGGGTGAACCTAGGATATCCCCTAGCCGAGAGCTAGAGACTAATCCTTCAAGGTACTTAGATCCATGTAAGAGGATGACTTCTCCCAATAGATGTTCTTCCATCCGTCTATTCTATTTAAAACATGCTAGTAGTAGGCGTGAGCTCTTGTGCATGAGATCGGGCAAAGTAGAGCTGATGCAAATGATAAGTCTCTCCCCCTCTTCCCACAAAATGGACCTATCTTTCTAGGGAGGTCAAACTATGATGAAATGAACTTAGAGATTCTCAACAGGGTTAAACAAGCTTTAAAATTTTTAGCGTGGCTAAGGTTCTTTATATTCCCTCATACTTTAGACTTTCAAAATGTGTGCAAGTTGGTACTTGGAATATGGTAAAAGAAAGTAGGGCGATTCCACATTGTAATTATTAAGCCCAATCGGACCCAATTCATTTATTGTGTCAGA
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CAACTAAGCTTTTTTTCATTAGGCAGGTGGGGTTGGCAACATGGACCATATAAACGCCATAAATTT
GTCATGTATTAAGTACAATGATATATCATTTACCTCTGAATCTCTAAATTTCTGTCATTAGCACATGT
AATGTGAAAATTTGAATGCAACTTCCCAAAACTATGACCTGTTGTTCTGCATGATATTAAGAGTTG
TAAGCCAGAAGTTAACACCTCTGCTAATGCACAGAGGTGATGTTATAATAGACTGTTGACCATTG
CCCTGCTACAACTGCCGCTGGGAATGTTAATTTATGATTATTAAAGTAGCTAAATTATTTTATATCCA
TCTGAAATATGTTTTATTTGCATGTGTAGTTTTTTTTGTTTATCGTGTATACTAATCTATGAAAATTG
GAAATGTGGTTTTGATGTATCCTGTGGTTTGCTCTTATGCAGTTGAGTGACATCGATGCCGATGAT
GGACAGTCAGGAGTTATGAAGATTCTGAACTTGCTGCAATTTAGAAATGGTTTTGTTTACTAAATT
TTTATGGGATGACACTGTGAACCTGTTAACTCGATGAACAGCATGATTTAACTACTTTTGTACAAA
AATTTAAAACTAAACACTGATCCTTCTGTGTGAAACATGTATGATCATCTGCCAATACTGTTTATTT
CCTCATAAGTCATGATACCACTCGTATACTTTGCTATGTGCTTCGATTCATAGTATTTGATATCCGGTATCTGATATCTATAGCTGTTTCTTTT。
序列4具体如下：
ATGGAGACCAACAACCAGCAACAACAACAACAAGGAGCTCAAGCCCAATCGGGACCCTACCGCCGGCGCCGGCGGCAGTGCAGGTGCAGGTGCAGGCGCTCCTCCCCCTTTCCAGCACCTTCTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCTCCAGATGTTCTGGTCTTACCAGCGTCAAGAAATCGAGCACGTGAACGACTTTAAGAATCACCAGCTCCCTCTTGCCCGCATCAAGAAGATCATGAAGGCCGACGAGGATGTCCGCATGATCTCCGCCGAGGCCCCCATCCTCTTCGCCAAGGCCTGCGAGCTCTTCATCCTCGAGCTCACCATCCGCTCCTGGCTCCACGCCGAGGAGAACAAGCGCCGCACCCTCCAGAAGAACGACATCGCCGCCGCCATCACCCGCACCGACATTTTCGACTTCCTCGTTGATATTGTCCCCCGCGACGAGATCAAGGACGACGCTGCTCTTGTGGGGGCCACCGCCAGTGGGGTGCCTTACTACTACCCGCCCATTGGACAGCCTGCCGGGATGATGATTGGCCGCCCCGCCGTCGATCCCGCCACCGGGGTTTATGTCCAGCCGCCCTCCCAGGCATGGCAGTCCGTCTGGCAGTCCGCTGCCGAGGACGCTTCCTATGGCACCGGCGGGGCCGGTGCCCAGCGGAGCCTTGATGGCCAGAGTTGA。
将yc4 T1代植株进行筛选得到不含转基因元件的大豆纯合突变体，并使其种子种植得到T2代大豆纯合突变体(yc4 T2代纯合植株)，yc4 T2代纯合植株的两条染色体中均存在下述突变：序列表中序列3第149-153位缺失，使蛋白翻译提前终止，从而将GmYC4基因敲除。并进行表型鉴定。
yc4 T2代纯合植株与野生型大豆Jack(GmYC4-WT)相比，大豆基因组中GmYC4基因发生了如下突变：两条同源染色体中，核苷酸序列是序列表中序列3的GmYC4的基因组基因均发生了如下变化：缺失了序列表中序列3的第149-153位的5个核苷酸，使GmYC4的基因组基因序列突变为序列6，，其CDS序列突变为序列4，使蛋白翻译提前终止，从而将GmYC4基因敲除。
四、突变体根系表型鉴定
改良的霍格兰营养液：5mmol/L硝酸钾、5mmol/L硝酸钙、2mmol/L硫酸镁，0.046mmol/L硼酸、0.009mmol/L四水氯化锰、0.0008mmol/L七水硫酸锌、0.0003mmol/L五水硫酸铜、0.0001mmol/L一水钼酸钠、0.02mmol/L七水硫酸亚铁、0.02mmol/L EDTA.Na，溶剂为ddH2O。
正常供磷营养液(又称水培正常磷处理用1/2霍格兰营养液，0.5mmol/L磷酸二氢钾)：2.5mmol/L硝酸钾、2.5mmol/L硝酸钙、1mmol/L硫酸镁，0.023mmol/L硼酸、0.0045mmol/L四水氯化锰、0.0004mmol/L七水硫酸锌、0.00015mmol/L五水硫酸铜、0.00005mmol/L一水钼酸钠、0.01mmol/L七水硫酸亚铁、0.01mmol/L EDTA.Na、0.5mmol/L磷酸二氢钾，溶剂为ddH2O。
缺磷营养液：2.5mmol/L硝酸钾、2.5mmol/L硝酸钙、1mmol/L硫酸镁，0.023mmol/L硼酸、0.0045mmol/L四水氯化锰、0.0004mmol/L七水硫酸锌、0.00015mmol/L五水硫酸铜、0.00005mmol/L一水钼酸钠、0.01mmol/L七水硫酸亚铁、0.01mmol/L EDTA.Na、0.01mmol/L磷酸二氢钾(磷浓度为0.01mmol/L，为正常营养液磷浓度的1/50)，pH为5.8-6.0，溶剂为ddH2O。
实验重复3次，每次重复将实验分为2组，即实验组(LP)和对照组(NP)，实验组和对照组各分别挑选颗粒饱满的yc4 T2代纯合植株(将yc4 T1代植株进行筛选得到不含转基因元件的大豆纯合突变体，并使其种子种植得到T2代大豆纯合突变体)和野生型大豆(Jack)种子各6粒，种植于潮湿的蛭石中，待种子萌发后13天，选取长势一致的yc4 T2代纯合植株幼苗和野生型大豆(Jack)幼苗，通过RT-qPCR检测GmYC4的基因表达水平(上游引物q-NFYC4-1F：CGGGTCTTTACTCTCTTACCCA；下游引物为q-NFYC4-1R：TAGGGTCCCGATTGGGCTT)，内参基因为GmActin(上游引物为qGmActin-F：CGGTGGTTCTATCTTGGCATC；下游引物为qGmActin-R：GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA)，GmYC4在yc4 T2代纯合植株的表达水平非常显著地(P＜0.001)低于野生型大豆(Jack)(图4，CK为野生型大豆Jack，yc4为yc4 T2代纯合植株)。幼苗随后移入正常供磷营养液中培养3天后，进行如下处理。：
实验组继续进行以下低磷胁迫处理：
将实验组的各3株yc4 T2代纯合植株幼苗和3株野生型大豆(Jack)幼苗更换于低磷营养液中，进行低磷胁迫处理(LP)，每隔3天换一次低磷营养液，处理后的第14天后，测定并记录生长状态和相关表型数据(包括根长，根表面积、根体积、根尖数、根干重和磷吸收效率等性状)。
对照组继续进行以下正常磷处理：
将对照组各的3株yc4 T2代纯合植株幼苗和3株野生型大豆(Jack)幼苗更换于改良的霍格兰营养液中，进行正常磷处理(NP)，每隔3天换一次改良的霍格兰营养液，处理后的第14天后，测定并记录生长状态和相关表型数据(包括根长，根表面积、根体积、根尖数、根干重和磷吸收效率等性状)。
根长检测：
使用EPSONV800双面扫描仪(1600，Japan)进行扫描，然后用WinRHIZO(2009Pro,RegentInstruments,Canada)根系构型分析系统分析根长。本研究所有试验数据通过Microsoft Excel 2003(Microsoft公司，美国)进行录入，计算和统计，数据的统计分析均采用SPSS(11.5版本)(SPSS公司，美国)分析系统进行方差分析。
根表面积检测：
使用EPSONV800双面扫描仪(1600，Japan)进行扫描，然后用WinRHIZO(2009Pro,RegentInstruments,Canada)根系构型分析系统分析根表面积。本研究所有试验数据通过Microsoft Excel 2003(Microsoft公司，美国)进行录入，计算和统计，数据的统计分析均采用SPSS(11.5版本)(SPSS公司，美国)分析系统进行方差分析。
根体积检测：
使用EPSONV800双面扫描仪(1600，Japan)进行扫描，然后用WinRHIZO(2009Pro,RegentInstruments,Canada)根系构型分析系统分析根体积。本研究所有试验数据通过Microsoft Excel 2003(Microsoft公司，美国)进行录入，计算和统计，数据的统计分析均采用SPSS(11.5版本)(SPSS公司，美国)分析系统进行方差分析。
根尖数检测：
使用EPSONV800双面扫描仪(1600，Japan)进行扫描，然后用WinRHIZO(2009Pro,RegentInstruments,Canada)根系构型分析系统分析根尖数。本研究所有试验数据通过Microsoft Excel 2003(Microsoft公司，美国)进行录入，计算和统计，数据的统计分析均采用SPSS(11.5版本)(SPSS公司，美国)分析系统进行方差分析。
根干重检测：
将植株根系放入烘箱中105℃杀青30min，80℃烘干2天至恒重，用精密度为0.001的天平称量根干重。本研究所有试验数据通过Microsoft Excel 2003(Microsoft公司，美国)进行录入，计算和统计，数据的统计分析均采用SPSS(11.5版本)(SPSS公司，美国)分析系统进行方差分析。
磷吸收效率检测：
磷吸收效率的计算公式为：磷吸收效率＝根干重*磷浓度。
其中植物磷浓度的测定方法如下：
所需试剂：硫酸(GB/T 625)；30％过氧化氢((GB 6684)；硝酸(GB/T 626)；
钒钼酸铵溶液：A液:称取25.0g钼酸铵(GB 657)溶于400mL水中；B液:称取1.25g偏矾酸铵(HG 3-941)溶于300mL沸水中，冷却后加250mL硝酸，冷却。在搅拌下将A液缓缓注入B液中，用水稀释至IL，混匀，贮于棕色瓶中；氢氧化钠(GB/T 629):10％(m/V)溶液；二硝基酚指示剂：0.2％(m/V)溶液：称取0.2g 2,6-二硝基酚或2,4-二硝基酚溶于100ml水中；
磷标准溶液：50mg/L，0.2195g(干燥的KH2PO4(分析纯)溶于水，加入5ml浓HNO3，转移到1000mL的容量瓶中，然后用水定容；硫酸：5％(V/V)溶液。
仪器、设备
通常实验室用仪器设备和消煮管：50mL或100mL；消煮炉或可调电炉：1000W；弯颈小漏斗：2cm；分光光度计；分析天平：感量为0.1mg；移液管：5，10mL；容量瓶:50，100，1000mL。
试样溶液制备
称取试样0.5g，精确至0.001g，置于50ml消煮管中(勿将样品粘附在瓶颈上)。先滴入少些水湿润样品，然后加8mL硫酸，轻轻摇匀并放置过夜。在管口放一弯颈小漏斗，在消煮炉上先250℃消煮(温度稳定后计时，时间约30min)，待H2SO4分解冒出大量白烟后再升高温度至400℃，当溶液呈均匀的棕黑色时取下。(时间约3h)，稍冷后加10滴H2O2，摇匀，再加热至微沸，消煮约5min，取下稍冷后，重复加H2O25-10滴，再消煮。如此重复3-5次，每次添加的H2O2的量应逐次减少，消煮到溶液呈无色或清亮后(应该为水的颜色)，再加热约5-10min,以除尽剩余的H2O2。将消煮管取下，冷却。并用少量水冲洗弯颈漏斗，洗液流入消煮管。将消煮液无损的洗入100mL容量瓶中，用水定容，摇匀。过滤或放置澄清后供磷的测定。
空白溶液制备
除不加试样外，应用的试剂和操作步骤同上。
标准曲线绘制
吸取磷标准溶液0，1.00，2.50，5.00，7.00，10.00，12.50，15.00mL分别置于8个50mL容量瓶中，加入与吸取试样溶液等体积的空白溶液，加水至30mL左右，加2滴二硝基酚指示剂，用氢氧化钠溶液和硫酸调节溶液呈微黄色，加10mL钒钼酸铵溶液摇匀，用水定容。此溶液磷含量为0，1.00，2.50，5.00，7.50，10.00，12.50，15.00mg/L的标准溶液系列。在室温15℃以上条件下放置20min后(最长不超过4h)，在分光光度计波长440nm处用lcm光径比色皿，以空白溶液调节仪器零点，进行比色，读取吸光度。根据磷浓度和吸光度绘制标准曲线或求出直线回归方程。
准确吸取定容，过滤或澄清后的消煮液10.00ml放入50ml容量瓶中，加水至30mL左右，与标准系列同条件显色、比色，读取吸光度。
结果计算：计算公式：全磷(P)＝c*V*D*10-3/m，结果如图3所示。
结果如图2和3所示，图2上半部为对照组(NP组)，对照组前三个样本WT为对照组的野生型大豆(Jack)幼苗，后三个样本yc4为对照组的yc4 T2代纯合植株幼苗；下半部为实验组(LP组)，实验组前三个样本WT为实验组的野生型大豆(Jack)幼苗，后三个样本yc4为实验组的yc4 T2代纯合植株幼苗；图3分别记录了跟表面积(cm2)、根体积(cm3)、根长(cm)、根尖数(个)、根干重(g/plant)和磷吸收效率(mg/plant)，NP为对照组，LP为实验组，CK为野生型大豆(Jack)幼苗，yc4为yc4 T2代纯合植株幼苗。与野生型大豆(Jack)相比，在正常磷和低磷胁迫条件下，yc4 T2代纯合植株幼苗(实验组)的根长、根表面积、根体积、根尖数、根干重，磷吸收效率显著增加，其中磷吸收效率分别增加了3.76倍和1.11倍。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种增加大豆磷吸收率和/或根表型的方法，其特征在于，所述方法通过包括M1、M2或M3的步骤来增加大豆磷吸收率和/或根表型；
M1、敲除大豆中的基因；
M2、抑制或降低或下调大豆中所述基因的表达；
M3、抑制或降低或下调所述基因编码蛋白质的活性和/或含量；
所述基因编码如下任一种蛋白质：
B1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
B2)将B1)所述蛋白质的经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与B1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具相同功能的蛋白质；
B3)将B1)或B2)的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白来源于大豆。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述M1包括向所述大豆中导入以序列3的第137-156位为靶序列的基因敲除载体。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因敲除载体为表达cas9和靶向所述蛋白质编码基因的gRNA的重组表达载体。
5.一种增加大豆根表型和/或磷吸收率的方法，将目的大豆的基因组进行如下任一操作：
K1)将目的大豆基因组序列表中序列3的第149位至153位进行缺失突变；
K2)将目的大豆基因组序列表中序列3的第148位的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸缺失突变。
6.权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在下述任一种的应用：
A1)增加植物磷吸收率和/或制备增加植物磷吸收率的产品中的应用；
A2)增加植物根部表面积和/或制备增加植物根部表面积的产品中的应用；
A3)增加植物根体积和/或制备增加植物根部体积的产品中的应用；
A4)增加植物根长和/或制备增加植物根长的产品中的应用；
A5)增加植物根尖数和/或制备增加植物根尖数的产品中的应用；
A6)增加植物根干重和/或制备增加植物根干重的产品中的应用；
所述生物材料为下述任一种物质：
N1、敲除所述蛋白质的编码基因的物质；
N2、抑制或降低或下调所述蛋白质的编码基因表达的物质；
N3、敲除或抑制或降低或下调所述蛋白质的活性或含量的物质。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述物质为下述任一种：
D1)抑制或降低或下调权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因表达的核酸分子；
D2)表达D1)所述核酸分子的编码基因；
D3)含有D2)所述基因的表达盒；
D4)含有D2)所述基因的重组载体、或含有D3)所述表达盒的重组载体；
D5)含有D2)所述基因的重组微生物、或含有D3)所述表达盒的重组微生物、或含有D4)所述重组载体的重组微生物；
D6)含有D2)所述基因的转基因植物细胞系、或含有D3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有D4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
D7)含有D2)所述基因的转基因植物组织、或含有D3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有D4)所述重组载体的转基因植物组织；
D8)含有D2)所述基因的转基因植物器官、或含有D3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有D4)所述重组载体的转基因植物器官。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，D1)所述核酸分子为靶向权利要求1中所述蛋白质编码基因的gRNA。
9.如权利要求1-5中任一所述方法或6-8任一所述应用中，其特征在于，所述植物为如下任一种：
G1)双子叶植物；
G2)豆科植物；
G3)大豆属植物；
G4)大豆。
10.蛋白质或其相关的生物材料：
所述蛋白质是氨基酸序列是序列5所示的蛋白质；
所述生物材料为权利要求7所述的核酸分子、编码基因、表达盒、重组载体、重组微生物、植物细胞系、植物细组织或植物细器官。
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