CN113106164B - 一种用于预测丹参花色的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种预测丹参花色的SNP分子标记及其应用。基于丹参基因组F3′5′H基因的全长cDNA序列，所述SNP分子标记位点在该基因序列的1230bp位点；本发明还提供一种用于检测所述分子标记的引物和使用所述分子标记预测丹参花色的方法及其应用。使用基于该基因设计的全长扩增引物对，从逆转录获得的cDNA模板中扩增基因全长，经测序证明该引物能特异性的扩增F3′5′H的正确序列。经过序列对比，筛选而得到与丹参花色性状相关的SNP位点。本发明所述的分子标记与丹参花色具有显著关联性，基于所述分子标记的本发明技术能方便快捷检测丹参花色，用于判断丹参花色，紫花丹参F3′5′H基因参考序列的1230bp处的碱基为C，与此相比，白花丹参中的该基因对应位置的变异碱基为T，浅紫花丹参在该为点可为C或T。通过该SNP分子标记，可以快捷地对丹参花色性状进行鉴定，适用于以丹参花色为育种目标的丹参的种植与选育。
Description
技术领域
本发明属于生物标记技术领域，具体涉及一种用于预测和鉴别丹参花色的分 子标记及其技术应用。
背景技术
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)属于双子叶唇形科鼠尾草属，是异花传粉植物，自然界中存在白花、紫花或其混杂色，其花色是植物的在花期的一个表现性 状，通过丹参花色相关的SNP分子标记位点，在以花色为培育目标的育种中具 有指导作用，在丹参花色的研究领域也具有一定意义。
花色的成色物质是丹参花瓣中的一类黄酮类化合物，并由黄酮类的羟化模式 决定了它们呈现的颜色。花青素形成中的羟化过程，类黄酮-3′，5′-羟基化酶 (F3′5′H)是一类关键酶。其中F3′5′H催化B环3′和5′位置的羟化反应，形成不 同的物质，如羟基化黄酮醇，花青素和PA，在花瓣中花青素的羟化模式强烈影 响花的颜色。据研究报道，在一些观赏植物如玫瑰康乃磬中，缺乏F3′5′H的表 达，导致蓝色和紫色不能形成。
为了验证丹参F3′5′H基因的表达与花色相关，通过获取丹参转录组信息， 对测序结果进行分析比对，统计在该基因上的SNP位点，筛选得到花色表达相 关的SNP位点，具有简便快捷的特点。
发明内容
为了解决现有技术中对花色鉴定时的局限性，本发明提供一种新的SNP分 子标记，该分子可以对丹参花色进行预测，从而快速提供的预测结果。
本发明人在对丹参基因组的SNP进行研究的过程中发现，在丹参F3′5′H基 因全长的1230碱基位置的C/T突变与丹参花色显著相关。
本发明提供了一种与丹参花色相关的SNP分子标记，该分子标记基于丹参 花色基因MH447665(in the GENBANK)，位于该基因序列的第1230位点。
本发明提供了一种用于检测丹参基因的引物组，所述引物组包括用作PCR 扩增的正向引物F3′5′HF：5′-ATGCAAGGTGAAGAATGT-3′，和反向引物F3′5′HR： 5′-CTAGCTAGCTGCATAACAATG-3′。
本发明提供一种试剂盒，包括扩增该基因需要的引物组，所需的试剂、标准 的阳性模板、和可选的使用说明书。
本发明提供了一种基于所述SNP分子标记位点的实施方式，包括PCR扩增 体系一种PCR反应体系：其反应总体系为25μL，其中cDNA 1μL、PCR Buffer 2.5μL、dNTP 2μL、正向引物和反向引物各1μL、pyrobest DNA Taq酶0.25μL和 ddH2O 17.25μL；和PCR仪程序设置：95℃ 5min；30cycles：94℃ 30s，56℃ 30s， 72℃ 2min；72℃ 10min。
本发明提供了上述SNP分子标记、引物组、试剂盒以及该检测方法的应用。
附图说明：
为了更清楚地说明本发明技术在运用过程中具体实施步骤，下面将具体所需 要的附图做简单地介绍。
图1所示为白花丹参和紫花丹参花色对照图。
图2所示为丹参F3′5′H基因在本发明所述的SNP分子标记位点的对比图，“*” 标记为本发明所述的SNP位点。
具体实施方式
为了详细了解本发明在实际情况中的运用步骤，在此结合实施例，进一步阐 述本发明。
在运用本发明阐述的实验方法中，有多种实施方案，本说明是书中使用的方 法仅作为参考，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中运用主要材料的与试剂均可从商业途径获得。
下述实施例中的材料来源为：采集的紫花白花丹参花序样品共计42株，其 中白花17株，浅紫花3株，紫花22株。采至中国医学科学院药用植物研究所药 用植物园。
10×PCR Buffer与pyrobest DNA聚合酶购自TAKARA公司，反转cDNA使 用的试剂盒PrimeScriptTM II lst strand cDNA Synthesis Kit购自promega公司。
实施例1
丹参F3′5′H基因SNP分子标记的获得
针对测序所得的42个丹参样品的F3′5′H基因全长序列，利用codoncode进 行拼接矫正后，使用DNAMAN对比全长序列中所有SNP位点。发现与丹参花 色关联的位点在第1230位。
实施例2
引物设计
根据丹参F3′5′H基因全长序列，运用Primer 6设计扩增引物，合成得到扩增 全长的引物，将正向引物F3′5′HF和反向引物F3′5′HR进行预实验，验证该引物 的敏度和特异性较好，将其用于丹参基因扩增，能得到特异性扩增的正确序列。
F3′5′HF：ATGCAAGGTGAAGAATGT；
F3′5′HR：CTAGCTAGCTGCATAACAATG；
各条引物以粉末形式独立包装，使用时以溶液形式加入到PCR反应体系转 给你，使用时引物的初始浓度为10OD。
实施例3
模板获取
(1)取干净的植物材料液氮研磨，按照RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒【购自天根生化科技(北京)有限公司】方法提取植物RNA。
(2)按照PrimeScriptTM II lst strand cDNA Synthesis Kit【购自promega公司】方法操作，获得cDNA。
(3)按照PCR反应体系为25μL，1μL cDNA模板，正向引物和反向引物各 1μL，10×PCR Buffer 5μL，dNTP 2μL，pyrobest DNA聚合酶1μL，加水17.5μL。 使用该方法能在cDNA质量较好的情况下，获得大量PCR产物。
(4)当cDNA质量较差，或使用普通PCR体系获得的PCR产物质量较差， 可以采用优化反应体系。优化反应体系为反应体系为25μL，1μL cDNA模板， 正向引物和反向引物各0.8μL，10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP 0.8μL，pyrobest DNA 聚合酶1μL，加水19μL。
反应在PCR仪上进行，反应程序为95℃10min；30cycles：94℃ 30s，56℃ 30s， 2℃2min；72℃ 10min。
实施例4
信息分析及结果
将检查合格的PCR产物，进行一代Sanger测序，获得正向测序结果和反向 测序结果，原始数据均以AB1格式和SEQ格式储存。原始数据中，包含差质量 的包含低质量的接头片段，低质量碱基和未测出的碱基。为排除这些干扰，应去 掉不可读的信息，获得质量可靠的测序结果。使用Codoncode处理原始数据，包 含以下步骤；
(1)将正反两条序列的AB1文件打开，Contig拼接。
(2)当正反两条序列所得的测序结果不一致时，如低质量碱基和未测出的碱 基，则以测序质量高的一条的测序结果为准。
(3)当同一条序列在某一位点出现套峰，则以轴正峰高的峰图为准。
去除干扰信息后的序列，为最终的有效数据，将其与原始序列MH447665(in theGENBANK)对比发现，采集的42株丹参样品在本发明所述的SNP突变位点的 统计结果如下：17株白花样品在该位点碱基均为C，3株浅紫花为C或T，22 株紫花样品在该位点碱基均为T。
结果显示使用该SNP位点，能有效鉴定丹参的花色。
以上是本发明使用的实施方案，而非限制性使用方案。应当指出，与本发明 技术原理相似的实施方案均在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种预测丹参花色的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)提取待测丹参花瓣的转录组RNA；
(2)以提取的RNA为模板，利用引物组，进行qPCR扩增，得到cDNA；
所述引物组的引物序列如下：
正向引物F3′5′HF：5′-ATGCAAGGTGAAGAATGT-3′；
反向引物F3′5′HR：5′-CTAGCTAGCTGCATAACAATG-3′；
(3)以qPCR扩增得到的cDNA为模板，利用所述引物组，进行PCR扩增，得到DNA；
(4)分析PCR扩增产物，从而对SNP分子标记位点，与提供的标准序列进行比对，进而判定花色；
所述SNP分子标记基于丹参基因F3′5′H，所述分子标记位于该基因的1230位点，此处碱基为T，则鉴定为紫花或浅紫花，此处碱基为C，则鉴定为白花或浅紫花。
2.根据权利要求1所述的一种预测丹参花色的方法，其特征在于，步骤(3)所述PCR扩增反应总体系为25μL，其中cDNA 1μL、PCRBuffer2.5μL、dNTP2μL、正向引物和反向引物各1μL、pyrobest DNATaq酶0.25μL和ddH2O17.25μL。
3.根据权利要求1所述的一种预测丹参花色的方法，其特征在于，步骤(3)所述PCR扩增程序设置为95℃5min；30cycles：94℃30s，56℃30s，72℃2min；72℃10min。
4.权利要求1-3任一项所述的一种预测丹参花色的方法在丹参花色鉴别中应用。
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