CN107043826A - Hpv高危18型恒温检测试剂盒 - Google Patents

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CN107043826A CN201611214262.3A CN201611214262A CN107043826A CN 107043826 A CN107043826 A CN 107043826A CN 201611214262 A CN201611214262 A CN 201611214262A CN 107043826 A CN107043826 A CN 107043826A
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刘淑园
陈华云
肖湘文
丁渭
张天海
陆同山
邓利琼
刘孝礼
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GUANGZHOU HESHI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
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Abstract

本发明公开了一种HPV高危18型恒温检测试剂盒，其使用的扩增反应试剂包括有Tris‑HCl（pH8.3）、KCl、二硫苏糖醇、甜菜碱、海藻糖、PEG、BSA、dNTPs、聚合酶Bsu、单链结合蛋白、重组酶（E.coli RecT）、氯化镁各适量。本发明的恒温扩增体系，不依赖于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，相对现有的恒温扩增体系，其组成更为简单，成本更为低廉，使用更为方便。本发明的恒温扩增体系适用于复杂模板的扩增，扩增速度快且稳定，可以在30 min以内完成扩增反应，扩增的灵敏度和准确性高，不易出现错配，扩增效果好。

Description

HPV高危18型恒温检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种HPV高危18型恒温检测试剂盒，特别涉及一种不依赖于高能能量分子的恒温扩增技术。
背景技术
1983年，Mullis等发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，30多年间，PCR技术得到长足发展，由于其在灵敏度和特异性方面的优势，PCR技术被迅速运用到科学研究和临床研究的各个方面。这种类似于DNA的天然复制过程的PCR技术，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
与传统的PCR技术相比，恒温扩增技术主要利用重组酶的活性，不进行核酸解链和退火即可在恒温条件下（如37℃）进行核酸的扩增，因此不需要昂贵的仪器，也避免了高温对酶的损耗。同时恒温扩增技术在体系中不需要加入过量的引物，降低了引物与模板错配或生成引物二聚体的可能性。恒温扩增技术日益受到重视。
人乳头瘤病毒（HPV）被分类成“高风险”病毒，可引起细胞变异，并且可以导致生殖器官癌症，子宫颈癌、阴道癌、肛门和阴茎的癌症都有可能由HPV引起的。其中子宫颈癌是人体最常见的癌瘤之一，不但在女性生殖器官癌瘤中占首位，而且是女性各种恶性肿瘤中最多见的癌瘤。根据29个省、市，自治区回顾调查我国宫颈癌死亡率占总癌症死亡率的第四位，占女性癌的第二位。因此人乳头瘤病毒的检测对于筛查子宫颈癌有着重要意义。
本发明HPV高危18型恒温检测试剂盒将恒温扩增技术应用到HPV高危18型的检测上，缩短了反应时间，降低了体系对反应条件的要求，大大地提高了检测的效率，有利于临床的诊断及治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种HPV高危18型恒温检测试剂盒，包括反应液，启动液，反应酶系，HPV高危18型特异性引物。
HPV高危18型恒温检测试剂盒反应液的具体成分如下：
Tris-HCl（pH8.3） 50mM
KCl 60mM
二硫苏糖醇 2mM
甜菜碱 1M
海藻糖 5.5%
PEG 5.5%
BSA 0.1mg/mL
HPV高危18型恒温检测试剂盒启动液的具体组分如下：
氯化镁 10mM
HPV高危18型恒温检测试剂盒反应酶系的具体组分如下：
dNTPs 200uM
聚合酶Bsu 50U
单链结合蛋白 262ng/ul
重组酶（E.coli RecT） 360ng/ul
上游引物 200nM
下游引物 200nM
HPV高危18型恒温检测试剂盒特异性引物序列如下：
上游引物：GGACCGAAAACGGTGTATATAAAAGATGTGAG
下游引物：ATCAGGTAGCTTGTAGGGTCGCCGTGTTGGA
本发明的有益效果：本发明的恒温扩增结果好，特异性好，灵敏度高。
附图说明
图1为实施例1的电泳结果图。
具体实施方式
下面结合具体的实验，进一步说明HPV高危18型恒温检测试剂盒的优势。
实施例1：本实施例用hela细胞作为样本，用人基因组DNA作为阴性对照。取两个200ul反应管，分别标记为反应管1和反应管2。在分别加入20ul反应液、5ul反应酶系到反应管1和2中，在反应管1中加入2ul hela细胞，在反应管2中加入2ul 人基因组DNA作为阴性对照，用灭菌水补足体系到45ul，混匀后再分别加入5ul启动液。
选择恒温水浴锅提供反应所需要的恒温环境，设置恒温水浴锅温度为37℃，反应时间为30min。
反应结束后，取10ul产物，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳。
从图中可以看出，在250bp处有清晰的电泳条带，为样本的目的条带，阴性对照泳道干净，说明本发明的恒温扩增结果好，特异性好，灵敏度高。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州和实生物技术有限公司
<120> HPV高危18型恒温检测试剂盒
<130> 2016
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggaccgaaaa cggtgtatat aaaagatgtg ag 32
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atcaggtagc ttgtagggtc gccgtgttgg a 31

Claims (8)

1.一种HPV高危18型恒温检测试剂盒，其反应液组成如下：
Tris-HCl（pH8.3） 50mM
KCl 60mM
二硫苏糖醇 2mM
甜菜碱 1M
海藻糖 5.5%
PEG 5.5%
BSA 0.1mg/mL。
2.一种HPV高危18型恒温检测试剂盒，其启动液组成如下：
氯化镁 10mM。
3.一种HPV高危18型恒温检测试剂盒，其反应酶系组成如下：
dNTPs 200uM
聚合酶Bsu 50U
单链结合蛋白 262ng/ul
重组酶（E.coli RecT） 360ng/ul
上游引物 200nM
下游引物 200nM
重组酶为不依赖于能量分子的重组酶。
4.根据权利要求3所述的HPV高危18型恒温检测试剂盒所采用的上游引物跟下游引物，其特征在于上游引物的序列为GGACCGAAAACGGTGTATATAAAAGATGTGAG；下游引物的序列为ATCAGGTAGCTTGTAGGGTCGCCGTGTTGGA。
5.根据权利要求1所述的HPV高危18型恒温检测试剂盒，其特征在于：Tris-缓冲液的pH为7～9，优选pH为8.3。
6. 根据权利要求3任意一项所述的HPV高危18型恒温检测试剂盒，其特征在于：重组酶选自E.coli RecT蛋白；λ噬菌体β蛋白；啤酒酵母SepΙ/STPβ；啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STPα蛋白；粟酒裂殖酵母p140/Exoǁ蛋白以及RrpΙ、HPP-Ι、v-SEP、ICP8蛋白。
7.根据权利要求1-6所述的HPV高危18型恒温检测试剂盒，其特征在于：恒温扩增的温度为37～42℃，优选扩增温度为37℃。
8.根据权利要求1-3所述的HPV高危18型恒温检测试剂盒，其特征在于用氯化镁作为反应的启动液，浓度为5mM~20mM，优选浓度为10mM。
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