CN117327838A - PEDV、PDCoV和RV-A三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒 - Google Patents
PEDV、PDCoV和RV-A三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔型冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒A型(RV‑A)同时进行三重荧光定量RT‑qPCR检测试剂盒，该试剂盒包括：用于扩增PEDV目标基因片段的引物组、用于检测PEDV的探针；用于扩增PDCoV目标基因片段的引物组、用于检测PDCoV的探针；以及用于扩增RV‑A目标基因片段的引物组、用于检测RV‑A的探针。实验表明，本发明的三重RT‑qPCR试剂的检测灵敏度与单重RT‑qPCR试剂的检测结果无差异，具备高灵敏性、高特异性、低污染和实时检测的优势，可为一线猪场临床腹泻病毒病的预警、早期诊断和防治监测提供可靠的技术和产品。
Description
技术领域
本发明涉及猪病毒的检测，更具体地讲，本发明涉及一种PDEV(猪流行性腹泻病毒)、PDCoV(猪德尔塔冠状病毒)、RV-A(猪轮状病毒A型)三重荧光定量RT-qPCR检测方法及检测试剂盒。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是Nidovirales冠状病毒科α冠状病毒属的一种，可引起新生仔猪急性腹泻、呕吐、脱水和高死亡率。PEDV是具有包膜的单股正链RNA病毒，基因组大小约28kb，直径为95-190nm。PEDV对小肠造成损伤，产生消化和吸收不良，最终导致腹泻和脱水，引起哺乳仔猪死亡。该病毒感染率高，造成的仔猪死亡率高。在过去的30年里，这种疾病在欧洲和亚洲的养猪业被报道，1970年代末，该病毒首次出现在英格兰(Wood,E.N.,1977.An apparently new syndrome of porcineepidemic diarrhoea.Vet.Rec.100(12),243-244)和比利时(Pensaert,M.B.,de Bouck,P.,1978.A new coronavirus-like particle associated with diarrhea inswine.Arch.Virol.58(3),243-247)。PEDV于2013年在美国首次报道(Stevenson,G.W.,Hoang,H.,Schwartz,K.J.,Burrough,E.B.,Sun,D.,Madson,D.,Cooper,V.L.,Pillatzki,A.,Gauger,P.,Schmitt,B.J.,Koster,L.G.,Killian,M.L.,Yoon,K.J.,2013.Emergenceof Porcine epidemic diarrhea virus in the United States:clinical signs,lesions,and viral genomic sequences.J.Vet.Diagn.Investig.25(5),649-654)。几个月内，病毒在全美国范围内迅速传播(Cima,G.,2013.Fighting a deadly pigdisease.J.Am.Vet.Med.Assoc.243(4),467-470)，造成重大经济损失。2010来我国各地猪场发生流行性腹泻，以爆发式的发展席卷我国10多个南方省份，给我国养猪业造成巨大经济损失(Dang Wang,Liurong Fang,Shaobo Xiao.Porcine epidemic diarrhea inChina.Virus Res.2016 Dec 2；226:7-13)。
2014年在美国腹泻猪中检测到一种新型猪德尔塔型冠状病毒(porcinedeltacoronavirus,PDCoV)，其临床表现与PEDV相似(Wang,L.,Byrum,B.,Zhang,Y.,2014a.Detection and genetic characterization of delta-coronavirus in pigs,Ohio,USA,2014.Emerg.Infect.Dis.20(7),1227-1230)，也可以对哺乳仔猪小肠造成损伤，产生消化和吸收不良，最终导致腹泻和脱水，引起哺乳仔猪死亡，但死亡率比PEDV感染所导致的哺乳仔猪死亡率低(30％-40％)。
轮状病毒属呼肠病毒科，可以引起猪只腹泻，是一种双链RNA病毒。其双链RNA基因组可以编码六个结构蛋白(VP1-VP4，VP6，VP7)和五个非结构蛋白(NSP1-NSP5/6)。根据VP6蛋白的抗原关系，轮状病毒可以分为10型(A-J)(Estes,M.；Greenberg,H.B.Rotaviruses.In Fields Virology,5 ed.；Knipe,D.M.,Howley,P.,Eds.；WoltersKluwer Health/Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia,PA,USA,2013；pp.1347-1395；Matthijnssens,J.,Otto,P.H.,Ciarlet,M.,et al.VP6-sequence-based cutoffvalues as a criterion for rotavirus species demarcation.Arch.Virol.2012,157,1177-1182)。其中，引起猪只腹泻的最常见轮状病毒是RVA，其发病率为3.3％-67.3％，无明显季节性(Marthaler,D.,Homwong,N.,Rossow,K.,et al.Rapid detection and highoccurrence of porcine rotavirus A,B,and C by RT-qPCR in diagnosticsamples.J.Virol.Methods 2014,209,30-34)。
上述三种猪肠道冠状病毒的流行传播可以对养猪业造成巨大损失，其引起的临床症状难以区分，而且经常存在混合感染、继发感染的问题，故增加了猪群的发病率和死亡率，严重危害养猪业的健康发展。进一步加强病原监测，做好疫苗免疫、饲养管理、生物安全等综合防控，是持续降低猪群病毒性腹泻的有效途径。因此，鉴别诊断是控制猪病毒性流行性腹泻的关键。
腹泻常规PCR检测方法存在通量低、耗时长和检出率低等缺点。可以实现高通量分析的毛细管电泳法，通过引物设计，不同的病原体可扩增不同长度的DNA片段，将扩增产物从PCR仪取出后转移至毛细管电泳分析仪中分析扩增片段长度，不同长度DNA片段电泳速度不同，可在同一反应体系内直接对样本进行多种腹泻病原体的同步检测和分析，从而区分不同的病原体。但是该方案的不足之处为：1.引物设计复杂；2.检测过程耗时较长，需先提取核酸，再PCR扩增，再毛细管电泳分析片段长度进而分析可能感染的病原体；3.如若引物设计不够合理，不同目的基因扩增片段长度相差过小，则会因为电泳中的漂移问题，无法有效判断扩增片段的大小，进而带来检测误差。
单重实时荧光定量PCR只能针对单个靶基因进行检测，存在效率低、成本高，不能经济高效地提供临床需要的检测结果。
PDEV(猪流行性腹泻病毒)、PDCoV(猪德尔塔冠状病毒)、RV-A(猪轮状病毒A型)都可以引起猪腹泻，但常规的病原学和血清学检测很难将这些疾病同时加以区别鉴定。常规检测方法存在操作繁琐、费时费力、灵敏度低、检测成本高等缺陷，尤其是多种病毒感染时，难以有效进行早期检测鉴别，容易产生误判错判。特别是当多种猪腹泻病毒混合感染时，更需要一个准确有效的方法来区分不同病毒。
因此，有必要提供一种多重RT-qPCR检测试剂盒，其能在单一反应体系中同时对多个靶标基因进行检测，从而大大减少检测工作量，提高效率，降低成本，同时也可降低反复多次加样可能带来的污染。
发明内容
本发明的发明目的是在保证检测特异性、灵敏性和重复性的基础上，建立一套针对PDEV、RV-A、PDCoV的多重荧光定量RT-qPCR检测方法，以有助于提升对腹泻病毒感染的检测效率。
一方面，为了实现上述的发明目的，本发明设计了一种对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔型冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒A型(RV-A)同时进行三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，该试剂盒包括：用于扩增PEDV目标基因片段的引物组、用于检测PEDV的探针；用于扩增PDCoV目标基因片段的引物组、用于检测PDCoV的探针；和用于扩增RV-A目标基因片段的引物组、用于检测RV-A的探针；
其中，用于扩增PEDV目标基因片段的引物组和用于检测PEDV的探针为选自于如下设计方案中的至少一种：
PEDV方案1：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
PEDV方案2：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
PEDV方案3：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
其中，用于扩增PDCoV目标基因片段的引物组和用于检测PDCoV的探针为选自于如下设计方案中的至少一种：
PDCoV方案1：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
PDCoV方案2：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；
PDCoV方案3：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；
其中，用于扩增RV-A目标基因片段的引物组和用于检测RV-A的探针为选自于如下设计方案中的至少一种：
RV-A方案1：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；
RV-A方案2：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；
RV-A方案3：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。
在本发明的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒中，用于扩增PEDV目标基因片段的引物组和用于检测PEDV的探针可以优选为PEDV方案2；用于扩增PDCoV目标基因片段的引物组和用于检测PDCoV的探针可以优选为PDCoV方案3；用于扩增RV-A目标基因片段的引物组和用于检测RV-A的探针可以优选为RV-A方案1。
最优选地，在本发明的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒中，各引物组和检测探针的设计方案为：PEDV方案2+PDCoV方案3+RV-A方案1。
在本发明的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒中，各探针的5’端修饰有荧光报告基团，3’端修饰有淬灭基团。报告基团可以选自但不限于FAM、HEX、JOE、CY3、CY5、ROX，淬灭基团可以选自但不限于DABCYL、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3。
作为本发明的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒的具体实施方式，用于检测PEDV的探针的报告基团可以为FAM，淬灭基团可以为BHQ1；用于检测PDCoV的探针的报告基团可以为CY5，淬灭基团可以为BHQ3；用于检测RV-A的探针的报告基团可以为ROX，淬灭基团可以为BHQ2。
本发明的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒还包括酶反应液、腹泻三重PCR反应液、腹泻三重阳性对照、腹泻三重阴性对照。其中，腹泻三重阳性对照为带有PEDV N基因、PDCoV M基因和RV-A NSP5基因片段的阳性重组质粒标准品模板；腹泻三重阴性对照为ThermoFisher公司的UltraPureTM无DNase/RNase蒸馏水。上述术语中，腹泻三重是指三种猪腹泻病毒，即：猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔型冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒A型(RV-A)。
另一方面，为了实现上述的发明目的，本发明还公开了一种制备上述猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒A型三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒的方法以及使用其的检测方法。
本发明所设计的三种猪腹泻病毒的多重RT-PCR引物探针组，可以对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔型冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒A型(RV-A)进行多重荧光定量检测，具备高灵敏性、高特异性、低污染和实时检测的优势，为一线猪场临床腹泻病毒病的预警、早期诊断和防治监测提供可靠的技术和产品，在腹泻疾病诊断、防治及食品安全等方面具有重要应用前景。
下面，结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明，但这些具体实施方式只是针对本发明某些特定的具体实施方式的说明而已，并非是对本发明的限定。
附图说明
图1(a)-(c)分别为PDCoV、PEDV以及RV-A的阳性质控品的测序结果图；
图2-图4分别显示了PEDV方案1、PEDV方案2、PEDV方案3的扩增曲线；
图5-图7分别显示了RV-A方案1、RV-A方案2、RV-A方案3的扩增曲线；
图8-图10分别显示了PDCoV方案1、PDCoV方案2、PDCoV方案3的扩增曲线；
图11为PEDV扩增曲线；
图12为PEDV定量标准曲线；
图13为RV-A扩增曲线；
图14为RV-A定量标准曲线；
图15为PDCoV扩增曲线；
图16为PDCoV定量标准曲线。
具体实施方式
阳性标准品的制备
根据PEDV目的片段、PDCoV目的片段和RV-A目的片段位置，在PEDV N基因、PDCoV M基因、RV-A NSP5基因设计引物，以PEDV、PDCoV、RV-A阳性样品为模板，扩增目的片段，连接至pMD-18T，并转化至感受态，选用天根生物质粒小提试剂盒(DP103)提取阳性质粒。-80℃保存。同时，送生工测序。
其中，阳性质控品扩增引物如下表1所示：
表1
| PEDV-F | GTAATCCGAGTGCGGTTCT |
| PEDV-R | TAGCCCAGCAGCCAAGTC |
| PDCoV-F | CCGACGACCAACCAACAC |
| PDCoV-R | AGCCAGCCCTAGTTTGCA |
| RV-A-F | ATGCTTAATAGGGATCCAGAAG |
| RV-A-R | TTACATGTCTTCAATTAGTTGA |
测序结果如图1(a)-(c)所示。从图1(a)可见，将序列进行BLAST分析，分析显示为猪Delta冠状病毒核酸；从图1(b)可见，将序列进行BLAST分析，分析显示为猪流行性腹泻病毒核酸；从图1(c)可见，将序列进行BLAST分析，分析显示为A型猪轮状病毒核酸。
本发明设计了实时荧光定量检测三种猪腹泻病毒的多重RT-PCR引物探针组，包括：引物：YT-PEDV-F、YT-PEDV-R、YT-PDCoV-F、YT-PDCoV-R、YT-RV-A-F、YT-RV-A-R；探针：YT-PEDV-Pro、YT-PDCoV-Pro、YT-RV-A-Pro，引物和探针对应于猪流行性腹泻病毒N基因、猪德尔塔冠状病毒M基因和猪轮状病毒A型NSP5基因的高度保守片段。表2所示为根据PEDV、PDCoV、RV-A相应目的基因序列，设计出的相应引物及探针:
表2
| 名称 | 序列 | 对应的序列号 |
| YT-PEDV-F1 | GTCTCGTAACCAGTCCAAGAACAG | SEQ ID NO:1 |
| YT-PEDV-R1 | AGATTTAAGGGCATCCTTGACAG | SEQ ID NO:2 |
| YT-PEDV-Pro1 | FAM-CAGCCACCAGATCATCGCGTGATGT-BHQ1 | SEQ ID NO:3 |
| YT-PEDV-F2 | GTGGCTCTCAAACTGTTTTACGTTG | SEQ ID NO:4 |
| YT-PEDV-R2 | GACACCACAATCTGAAGCACAACAC | SEQ ID NO:5 |
| YT-PEDV-Pro2 | FAM-ACGGCGTCCTATGCTTTGTACTAAGTGTG-BHQ1 | SEQ ID NO:6 |
| YT-PEDV-F3 | GATACTTTGGCCTCTTGTGT | SEQ ID NO:7 |
| YT-PEDV-R3 | CACAACCGAATGCTATTGACA | SEQ ID NO:8 |
| YT-PEDV-Pro3 | FAM-TTCAGCATCCTTATGGCTTGCATC-BHQ1 | SEQ ID NO:9 |
| YT-PDCoV-F1 | ATCGACCACATGGCTCCAA | SEQ ID NO:10 |
| YT-PDCoV-R1 | CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT | SEQ ID NO:11 |
| YT-PDCoV-Pro1 | CY5-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCT-BHQ3 | SEQ ID NO:12 |
| YT-PDCoV-F2 | ATTTGGACCGCAGTTGACA | SEQ ID NO:13 |
| YT-PDCoV-R2 | TTGGCCCAGGATATGAAGGTC | SEQ ID NO:14 |
| YT-PDCoV-Pro2 | CY5-TAAGAAGGACGCAGTTTTCATTGTG-BHQ3 | SEQ ID NO:15 |
| YT-PDCoV-F3 | CACCTGAGAGTAGACTCCTTGCAG | SEQ ID NO:16 |
| YT-PDCoV-R3 | ATTCTAACTGATATGCCATTGGC | SEQ ID NO:17 |
| YT-PDCoV-Pro3 | CY5-GGATCCAATGGGTACATGGAGGTGCATTC-BHQ3 | SEQ ID NO:18 |
| YT-RV-A-F1 | ACTCACCAGCTTTTCGATTAGATC | SEQ ID NO:19 |
| YT-RV-A-R1 | AATCCACTTGATCGCACCCA | SEQ ID NO:20 |
| YT-RV-A-Pro1 | ROX-TAAGACAAATGCAGACGCTGGCGTG-BHQ2 | SEQ ID NO:21 |
| YT-RV-A-F2 | ATGTCTCTCAGCATTGACGTAAC | SEQ ID NO:22 |
| YT-RV-A-R2 | GTATTATTGAATGCTTCTGCATCT | SEQ ID NO:23 |
| YT-RV-A-Pro2 | ROX-GAGTCTTCCCTCAATTTCTTCTAGTATCTTTAAAAATG-BHQ2 | SEQ ID NO:24 |
| YT-RV-A-F3 | AGATGCAGAAGCATTCAATAAATACA | SEQ ID NO:25 |
| YT-RV-A-R3 | GTCTTAACTGCATTCGATCTAATCG | SEQ ID NO:26 |
| YT-RV-A-Pro3 | ROX-GTCGAAGTCTCCAGAGGATATTGGACCATC-BHQ2 | SEQ ID NO:27 |
以下，将上表中的YT-PEDV-F1+YT-PEDV-R1+YT-PEDV-Pro1称为PEDV方案1，将YT-PEDV-F2+YT-PEDV-R2+YT-PEDV-Pro2称为PEDV方案2，将YT-PEDV-F3+YT-PEDV-R3+YT-PEDV-Pro3称为PEDV方案3；将YT-PDCoV-F1+YT-PDCoV-R1+YT-PDCoV-Pro1称为PDCoV方案1，将YT-PDCoV-F2+YT-PDCoV-R2+YT-PDCoV-Pro2称为PDCoV方案2，将YT-PDCoV-F3+YT-PDCoV-R3+YT-PDCoV-Pro3称为PDCoV方案3；将YT-RV-A-F1+YT-RV-A-R1+YT-RV-A-Pro1称为RV-A方案1，将YT-RV-A-F2+YT-RV-A-R2+YT-RV-A-Pro2称为RV-A方案2，将YT-RV-A-F3+YT-RV-A-R3+YT-RV-A-Pro3称为RV-A方案3。
在本发明中，所采用的PDCoV阳性标准品具有如下的序列2390bp：CCGACGACCAACCAACACCGTCCTTTAAGTTTAAGGAATGGTAGTCGACGACTGGGCTGTTACCATCCCTGGACAATATATTATTGCTATACTAGTTGTCATCTGCATTGGTGTGGCACTACTTTTTATTAACACTTGCTTAGCTTGTGTTAAATTATTTTACAAGTGCTACCTAGGGGCAGCATATCTTGTTAGGCCTATTATAGTGTACTACTCCAAGCCGAACCCCGTACCTGAGGATGAGTTTGTAAAAGTACACCAATTTCCTAGAAACACTCACTATGTCTGACGCAGAAGAGTGGCAAATTATTGTTTTCATTGCGATCATATGGGCGCTTGGCGTTATCCTCCAAGGAGGCTATGCCACGCGTAATCGTGTGATCTATGTTATTAAACTTATTCTGCTTTGGCTGCTCCAACCCTTCACCCTAGTGGTGACCATATGGACCGCAGTTGACAGATCATCTAAGAAGGACGCAGTTTTCATTGTGTCCATAATTTTTGCCGTACTGACCTTCATATCCTGGGCCAAGTACTGGTATGACTCAATTCGTTTATTAATGAAAACCAGATCTGCATGGGCACTCTCACCTGAGAGTAGACTCCTTGCAGGGATTATGGATCCAATGGGTACATGGAGGTGCATTCCCATCGACCACATGGCTCCAATACTCACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCTCAAGCTACATGGGCAAGAGCTGGCCAATGGCATATCAGTTAGAAATCCGCCACAGGATATGGTGATAGTGTCACCAAGTGACACCTTTCACTACACTTTTAAGAAACCTGTGGAATCAAACAACGATCCAGAATTCGCTGTTCTGATATACCAGGGTGACCGTGCTTCAAACGCTGGACTTCACACCATAACCACTTCAAAGGCCGGTGACGCTCGCCTGTATAAGTATATGTAATGTGCAACTGCCATCTGCAGCTGCGAGATTTATATAGATTGTGCAATAAGCGGCACATCCGAAGAGAGGATGTTCCTGAGCTTATTGACCCTCTCGTTAAAACTCGCTGTTTTGCTTACAGTCTCGTGGTTCTTGCTAATGCTAATCCAATTGCATTTAGCATACTACCTCGGAAAATTCTTATCAATGGTGAGCCTTTACTGCTTGAATATGGTAGCATATATGGTAAAGACTTTATCATTCGACCATCGCTCCAAGTCATTCTTGAAGATGAATTAAATTAAAGTTTTGACACCAATCTATCATGGCCGCACCAGTAGTCCCTACTACTGACGCGTCTTGGTTTCAGGTGCTCAAAGCTCAAAACAAAAAGGCTACTCATCCTCAGTTTCGTGGCAATGGAGTTCCGCTTAACTCCGCCATCAAACCCGCTGAAAACCATGGCTACTGGCTGCGTTACACCAGACAAAAGCCAGGTGGTACTCCGATTCCTCCATCCTATGCCTTTTATTATACTGGCACAGGTCCCAGAGGAAATCTTAAGTATGGTGAACTCCCTCCTAATGATACCCCAGCAACCACTCGTGTTACTTGGGTTAAGGGTTCGGGAGCTGACACTTCTATTAAGCCTCATGTTGCCAAACGCAACCCCAACAATCCTAAACATCAGCTGCTACCTCTCCGATTTCCAACCGGAGATGGCCCAGCTCAAGGTTTCAGAGTTGACCCCTTCAACGCTAGAGGAAGACCTCAGGAGCGTGGAAGTGGCCCAAGATCTCAATCTGTTAACTCCAGAGGCACAGGCAATCAGCCCAGGAAACGCGACCAATCTGCACCAGCTGCGGTACGTCGTAAGACCCAGCATCAAGCTCCCAAGCGGACTTTACCCAAGGGTAAAACCATTTCTCAGGTATTTGGCAACCGGTCTCGCACTGGTGCCAATGTCGGCTCTGCAGACACTGAGAAGACGGGTATGGCTGATCCTCGCATCATGGCTCTAGCCAGACATGTGCCTGGTGTTCAGGAAATGCTTTTCGCTGGCCACCTTGAGAGCAACTTTCAGGCGGGGGCAATTACTCTTACCTTCTCTTACTCAATCACAGTCAAGGAGGGTTCTCCTGACTATGAGAGACTTAAGGATGCGCTCAATACGGTCGTTAACCAGACCTATGAACCACCCACCAAACCAACTAAGGACAAGAAGCCTGACAAACAAGACCAGTCTGCTAAACCCAAACAGCAGAAGAAACCTAAAAAGGTAACTCTGCCAGCAGACAAACAGGATTGGGAGTGGGATGATGCTTTTGAGATAAAGCAGGAATCAGCAGCGTAGACATCAATCTATGTCTGTGAAACCCACCCAACTCCACTCAAATATCTCTTTGGTTCCAGAGAGTCGTAGTGTATAGCCAGAGAGCCAGTCAGAGGGCGCTATCATGCAAACTAGGGCTGGCT
在本发明中，所采用的PEDV阳性标准品具有如下的序列1485bp：GTAATCCGAGTGCGGTTCTCACAGATAGTGAGAAAGTGCTTCATTTAGTCTAAACAGAAACTTTATGGCTTCTGTCAGCTTTCAGGATCGTGGCCGCGAACGGGTGCCATTATCCCTCTATGCCCCTCTTAGGGTTACTAATGACAAACCCCTTTCTAAGGTACTCGCAAACAACGCTGTACCCACTAATAAGGGGAATAAGGACCAGCAAATTGGATACTGGAATGAGCAAATTCGCTGGCGCATGCGCCGTGGTGAGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCATTTCTACTACCTCGGAACAGGACCTCACGCCGACCTCCGTTATAGGACTCGTACTGAGGGTGTTTTCTGGGTTGCTAAAGAAGGCGCAAAGACTGAACCCACTAACTTGGGTGTCAGAAAGGCGTCTGAAAAGCCAATTATTCCAAAATTCTCTCAACAGCTCCCCAGTGTAGTTGAGATTGTTGAACCTAACACACCTCCTGCTTCACGTACAAATTCGCGTAGCAGGAGTCGTGGCAATGGCAACAACAGGTCCAGATCCCCGAGTAACAACAGAGGCAACAACCAGTCCCGTGGTAATTCACAGAATCGTGGAAATAACCAGGGTCGTGGAGCTTCTCAGAACAGAGGAGGCAATAATAATAACAATAACAAGTCTCGTAACCAGTCCAAGAACAGGAACCAGTCAAATGACCGTGGTGGAATGACATCACGCGATGATCTGGTGGCTGCTGTCAAGGATGCCCTTAAATCTTTGGGTATTGGAGAAAATCCTGACAGGCATAAGCAACAGCAGAAGCCTAAGCAGGAAAAGTCTGACAACAGCGGAAAAAATACACCTAAGAAGAACAAATCCAGGGCCACTTCGAAGGAACGTGACCTCAAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAATTCCCAAGGGCGAAAATAGCGTAGCAGCTTGCTTCGGACCCAGGGGGGGCTTCAAAAATTTTGGAGATGCGGAATTTGTCGAAAAAGGTGTTGATGCGTCAGGCTATGCTCAGATCGCCAGTTTGGCACCAAATGTTGCAGCATTGCTCTTTGGTGGTAATGTGGCTGTTCGTGAGCTAGCGGACTCTTACGAGATTACATATAACTATAAAATGACTGTGCCAAAGTCTGATCCAAATGTTGAGCTTCTTGTTTCACAGGTGGATGCATTTAAAACTGGGAATGCAATACCCCAGAGAAAGAAGGAAAAGAAGAACAAGCGTGAAACCACGCAGCAGCAGAATGAAGAGGCCATCTACGATGATGTGGGTGTGCCATCTGATGTGACCCATGCCAATCTGGAATGGGACACAGCTGTTGATGGTGGTGACACGGCCGTTGAAATTATCAACGAGATCTTCGACACAGGAAATTAAACAATGTTTGACCGGCTTATCCTGGCTATGTTCCAGGGTAGTGCCATTACACTGTTATTACTGAGTGTTTTTCTAGTGACTTGGCTGCTGGGCTA
在本发明中，所采用的RV-A阳性标准品具有如下的序列504bp：ATGCTTAATAGGGATCCAGAAGACATTGGACCATCTGATTCAGCATCAAATGACTTACCCACTAAATTTGCTATTAAATCAAATGCAGTTAAATCAAATGCTAATGTTGGCGTGTCGTTGGATACTAGCTCAGCAGATCGCGAGACAGGAGGTAATACAAAAGATGAAGTCGATTTTTCATTCGCTAAAGGAGTAAAGATGAAGTCAGATGTTGCTGCATCTTTCACTATTGATACTACAAACGTAAAATCTTCAATTTCAGATCCAGGCTCATTAGCTAAATTAACACATTGTACAGATACAATTAAATCAAGATCAAAATCGAGAAATAAATCAAATAAGAATGATCAGAAATGGCCTAGAATAGAATATCAATCTGACGAAGAGGAATTCGTATTAAGTGATGAAGATGCTCAATGTTGTAGTTGTATTTATAAGAGAAAGTATTTTGAACTAAGAAAACGTATGAAACTAGTAGCAATTCAACTAATTGAAGACATGTAA
引物探针比较实验：
将检测PEDV阳性的核酸，进行10倍梯度稀释，再分别用三种PEDV检测方案进行验证。引物终浓度范围是200～300nM，探针的终浓度范围是100～200nM。本品使用2×Multiplex Probe One-Step Reaction Mix，Multiplex Probe One-Step Enzyme MIXUDG。
将检测RV-A阳性的核酸，进行10倍梯度稀释，再分别用三种RV-A检测方案进行验证。引物终浓度范围是200～300nM，探针的终浓度范围是100～200nM。本品使用2×Multiplex Probe One-Step Reaction Mix，Multiplex Probe One-Step Enzyme MIXUDG。
将检测PDCoV阳性的核酸，进行10倍梯度稀释，再分别用三种PDCoV检测方案进行验证。引物终浓度范围是200～300nM，探针的终浓度范围是100～200nM。本品使用2×Multiplex Probe One-Step Reaction Mix，Multiplex Probe One-Step Enzyme MIXUDG。
使用的RT-qPCR扩增体系为：
在60℃阶段收集荧光信号。
PEDV方案1、PEDV方案2、PEDV方案3的扩增曲线(10-1到10-6倍)分别见图2-图4；表3显示了PEDV引物探针筛选结果：
表3
RV-A方案1、RV-A方案2、RV-A方案3的扩增曲线(10-1到10-6倍)分别见图5-图7；表4显示了RV-A引物探针筛选结果:
表4
PDCoV方案1、PDCoV方案2、PDCoV方案3的扩增曲线(10-1到10-6倍)分别见图8-图10；表5显示了PDCoV引物探针筛选结果：
表5
根据上述结果，从PEDV、RV-A、PDCoV的设计方案各筛选出一个方案，例如可以为PEDV方案1、RV-A方案3、PDCoV方案1，制作检测试剂盒。根据各方案的目的片段位置，设计阳性标准品引物，扩增目的片段，连接至pMD-18T载体，送至生工生物工程(上海)股份有限公司广州测序部进行一代测序。
三重荧光定量PCR检测试剂盒
(一)三重荧光定量PCR检测试剂盒组成
在本发明的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒A型(RV-A)三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒中，各组分的含量可为：
酶反应液80μL；腹泻三重反应液760μL；腹泻三重阳性对照100μL；腹泻三重阴性对照100μL。
试剂盒使用2×Multiplex Probe One-Step Reaction Mix，Multiplex ProbeOne-Step Enzyme MIX UDG。
(二)实施例
1.选取猪流行性腹泻病毒N基因、猪德尔塔冠状病毒M基因和猪轮状病毒A型NSP5基因的高度保守片段设计三组引物与探针(见表2中的序列)，分别对其靶基因进行扩增，筛选扩增效率、探针信噪比以及扩增曲线形态最佳的一组，作为腹泻三重反应液的引物与探针；合成编号为pMD-18T的重组克隆质粒，该重组克隆质粒含有上述PEDV/PDCOV/RV-A阳性标准品序列中的靶基因，该靶基因可以通过阳性标准品相应的引物及探针(见表1的序列)进行扩增。将提取纯化后的重组克隆质粒用蛋白核酸测定仪进行定量，将定量后的上述重组克隆质粒通过TE缓冲溶液进行稀释，得到浓度不同的多组重组克隆质粒，分别作为上述PEDV/PDCOV/RV-A-阳性对照和PEDV/PDCOV/RV-A-定量参考品。所得到的PEDV/PDCoV/RV-A阳性标准品的浓度分别为：132.1ng/μL,371.1ng/μL和116.9ng/μL,。将上述3种阳性标准品进行10倍梯度稀释，取10-5到10-11倍采用腹泻三重RT-qPCR试剂盒进行检测。
2.上述腹泻三重反应液中，引物YT-PEDV-F、YT-PEDV-R、YT-PDCoV-F、YT-PDCoV-R、YT-RV-A-F、YT-RV-A-R的终浓度范围是200～300nM，探针：YT-PEDV-Pro、YT-PDCoV-Pro、YT-RV-A-Pro的终浓度范围是100～200nM，以使检测效率更高。
3.验证腹泻三重RT-qPCR试剂灵敏度，结果如表6、图11-16。腹泻三重RT-qPCR检测试剂盒可检测PEDV核酸灵敏度低至2.9copies/μL；PDCoV核酸核酸灵敏度低至66.9copies/μL；RV-A的核酸核酸灵敏度低至3.82copies/μL。
4.腹泻三重RT-qPCR试剂与单重RT-qPCR试剂灵敏度比较：分别将PEDV/PDCoV/RV-A标准品核酸进行10倍梯度稀释，再按照1:1:1混匀。分别用单重和三重试剂盒进行检测。检测结果见表7、表8。显示：三重RT-qPCR试剂与单重RT-qPCR试剂检测结果无差异。
表6
表7
| 稀释度 | RV-A(Texas Red) | PDCOV(cy5) | PEDV(fam) |
| -1 | 22.58 | 24.26 | 23.80 |
| -2 | 25.82 | 27.53 | 27.06 |
| -3 | 29.30 | 30.84 | 30.61 |
| -4 | 32.15 | 33.59 | 33.82 |
| -5 | 36.04/- | - | 36.04 |
表8
| 稀释度 | RV-A(Texas Red) | PDCOV(cy5) | PEDV(fam) |
| -1 | 22.62 | 24.43 | 23.80 |
| -2 | 25.52 | 27.64 | 27.06 |
| -3 | 29.06 | 30.71 | 30.82 |
| -4 | 32.37 | 34.02 | 34.11 |
| -5 | - | - | 37.57/- |
实验过程中所涉及的处理方法如下：
1.组织样品处理
组织样品的采集：选取肠道在病变和健康组织交界处部位，用剪刀剪碎置于2mlEP管中，共约300～500mg组织(注意剔除结缔组织和脂肪组织等)，并标记组织名称。
组织样品的研磨：在装有组织样品的EP管中按照1:3(体积比)的比例加入灭菌的PBS(或生理盐水)和2颗高压灭菌的钢珠，进行捣碎研磨处理。研磨后12,000x g，室温离心5min，取上清液200μL于新的灭菌1.5mL离心管中编号备用。
2.拭子样品处理
新鲜的咽或肛拭子加入1mL灭菌PBS(或生理盐水)，充分振荡之后，12,000x g离心5min，取上清液200μL于新的灭菌1.5mL离心管中编号备用。
3.样品保存
采集或处理的样品在2～8℃保存不超过24小时，若需长期保存，应放置-70℃，反复冻融不超过5次。
4.样品核酸提取及反应体系配制
按照核酸提取说明书提取样品核酸，并按照三重反应体系进行PCR反应配制
待检核酸：4μL
2×Multiplex Probe One-Step Reaction Mix：10μL
H2O2:6μL
按如下程序进行PCR反应：
5.检测成立条件
阳性对照Ct值＜35，阴性对照无Ct值，且扩增曲线。
6.结果判定
样品FAM通道Ct值<35,则判定为PEDV阳性；
样品Texas Red通道Ct值<35,则判定为RV-A阳性；
样品CY5通道Ct值<35,则判定为PDCOV阳性。
35<样品Ct值<40属于可疑，可疑样品需要重检，如若重检仍是可疑，则判断为阳性；
无Ct值、无扩增曲线判定为阴性。
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Claims (9)
1.一种对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔型冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒A型(RV-A)同时进行三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，该试剂盒包括：用于扩增PEDV目标基因片段的引物组、用于检测PEDV的探针；用于扩增PDCoV目标基因片段的引物组、用于检测PDCoV的探针；以及用于扩增RV-A目标基因片段的引物组、用于检测RV-A的探针；
其中，用于扩增PEDV目标基因片段的引物组和用于检测PEDV的探针为选自于如下设计方案中的至少一种：
PEDV方案1：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO:2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
PEDV方案2：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO:5所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
PEDV方案3：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO:8所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
其中，用于扩增PDCoV目标基因片段的引物组和用于检测PDCoV的探针为选自于如下设计方案中的至少一种：
PDCoV方案1：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
PDCoV方案2：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；
PDCoV方案3：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；
其中，用于扩增RV-A目标基因片段的引物组和用于检测RV-A的探针为选自于如下设计方案中的至少一种：
RV-A方案1：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；
RV-A方案2：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；
RV-A方案3：上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示。
2.如权利要求1所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，用于扩增PEDV目标基因片段的引物组和用于检测PEDV的探针为PEDV方案2。
3.如权利要求1所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，用于扩增PDCoV目标基因片段的引物组和用于检测PDCoV的探针为PDCoV方案3。
4.如权利要求1所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，用于扩增RV-A目标基因片段的引物组和用于检测RV-A的探针为RV-A方案1。
5.如权利要求1所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，所述各探针的5’端修饰有荧光报告基团，3’端修饰有淬灭基团。
6.如权利要求5所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，所述报告基团选自但不限于FAM、HEX、JOE、CY3、CY5、ROX，所述淬灭基团选自但不限于DABCYL、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3。
7.如权利要求6所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，用于检测PEDV的探针的报告基团为FAM，淬灭基团为BHQ1；用于检测PDCoV的探针的报告基团为CY5，淬灭基团为BHQ3；用于检测RV-A的探针的报告基团为ROX，淬灭基团为BHQ2。
8.如权利要求1所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，所述试剂盒还包括酶反应液、腹泻三重PCR反应液、腹泻三重阳性对照、腹泻三重阴性对照。
9.如权利要求8所述的三重荧光定量RT-qPCR检测试剂盒，其中，所述的腹泻三重阳性对照为带有PEDVN基因、PDCoVM基因和RV-ANSP5基因片段的阳性重组质粒标准品模板。
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| CN117512225A (zh) * | 2024-01-04 | 2024-02-06 | 南京农业大学三亚研究院 | 一种能检测猪流行性腹泻和猪德尔塔冠状病毒引物探针组合、冻干小球及其应用 |
-
2023
- 2023-07-25 CN CN202310916923.0A patent/CN117327838A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
| CN117512225A (zh) * | 2024-01-04 | 2024-02-06 | 南京农业大学三亚研究院 | 一种能检测猪流行性腹泻和猪德尔塔冠状病毒引物探针组合、冻干小球及其应用 |
| CN117512225B (zh) * | 2024-01-04 | 2024-04-02 | 南京农业大学三亚研究院 | 一种能检测猪流行性腹泻和猪德尔塔冠状病毒引物探针组合、冻干小球及其应用 |
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