CN111455113A - 一种rt-lamp法检测口蹄疫病毒的引物组和试剂盒及其应用 - Google Patents

一种rt-lamp法检测口蹄疫病毒的引物组和试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种RT‑LAMP法检测口蹄疫病毒的引物组和试剂盒及其应用。所述引物组的6条引物位于口蹄疫病毒高度保守的3D蛋白基因内，全基因组的7776‑8050 bp处，本发明同时提供一种RT‑LAMP法检测口蹄疫病毒的试剂盒，检测应用时可根据颜色反应读取结果，绿色或黄绿色为口蹄疫病毒核酸阳性，橙黄色或棕红色为阴性；或者通过核酸电泳分析是否出现梯形条带，如果出现梯状条带，说明样品为阳性，否则为阴性。本发明具有高特异性、高敏感性、操作简便、对仪器设备要求低的特点，能够较好满足目前对口蹄疫病毒现场检测的迫切需要，适合基层兽医、进出口检疫部门、养殖场、屠宰场等现场快速可视化检出口蹄疫病毒。

Description

一种RT-LAMP法检测口蹄疫病毒的引物组和试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物诊断检测技术领域，具体涉及一种检测口蹄疫病 毒的群特异性RT-LAMP检测引物组、试剂盒和方法。
技术背景
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的重大动物疫病之一，主要感染猪、 牛、羊等偶蹄类动物，感染动物发病率和死亡率均较高，世界动物卫 生组织(OIE)将其归为A类动物疫病之首，我国也将其列为一类动物 疫病。口蹄疫病毒属小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，共7个血清型(O、 A、Asia-1、C、SAT1、SAT2、SAT3型)，70多个亚型，血清型间无交 叉保护作用。口蹄疫的预防和控制是世界性难题，全球每年因该病造 成的直接经济损失到数百亿美元。近年来，我国存在的口蹄疫病毒主 要为口蹄疫O型、A型、Asia-1型。
目前口蹄疫病毒诊断技术方面存在的问题主要包括：风险监视手 段单一，综合感知能力不足；一线检测试剂匮乏，早期发现能力不足。 导致口蹄疫疫情往往是大范围流行时才被发现，防控措施的实施严重 滞后，与我国畜牧业大国地位极不相符。早期及时发现动物疫情是动 物疫病防控的关键，目前常用的口蹄疫病毒检测方法为PCR检测法， 这需要一定的技术水平和硬件条件，然而与动物疫病早期接触的往往 是基层兽医和养殖场技术员，他们对动物疫病的确诊技术水平相对较 低，且受到基层地区简陋条件的制约，会造成一些隐性带毒或早期处 于潜伏期的感染动物无法及时甄别、漏检。
2000年日本学者Notomi等发明了一种基因恒温扩增方法，命名为 环介导等温扩增技术(LAMP)。它针对靶基因的6个区域设计4条特异 性引物(FIP、F3、BIP、B3)，在具有链置换活性的Bst DNA聚合酶 作用下，60～65℃等温高效特异性的扩增目的基因。2002年，Nagae 等在此基础上添加了2条环状引物：上游环状引物(LF)和下游环状 引物(LB)，提高了反应速度，进一步缩短了反应时间。LAMP技术具有 操作简便、可视化、高敏感性、高特异性、仪器设备要求低等诸多优 点，该技术自产生之后已经在转基因食品检测、动物疫病诊断及动物 胚胎的性别鉴定等领域得到广泛的推广及应用，因此建立口蹄疫病毒 群特异性RT-LAMP检测方法，实现对口蹄疫病毒的早期现场快速检出， 对于口蹄疫疫情防控和畜牧业健康发展具有重要意义。
目前实践中关于口蹄疫RT-LAMP检测主要是M.Madhanmohan等 2013年建立的，是分别针对O型口蹄疫病毒、A型口蹄疫病毒、Asia-1 型口蹄疫病毒设计了3套引物进行检测，并且O型口蹄疫毒株仅针对中 东南亚毒株，还没有实现用一套引物检出3个血清型，而且对于中国 和东南亚国家流行的毒株未报到检出情况，由于口蹄疫病毒变异性较 强，不同毒株间存在较大差异，现在这种口蹄疫RT-LAMP检测不一定 适用于中国和东南亚国家毒株。Da-Rae Lim等2018年针对O型口蹄疫 病毒VP3基因序列建立的改良的RT-LAMP，敏感性为104半数细胞感染 量(TCID50/mL)或者105拷贝数/μL。近年来在国内也有关于口蹄 疫病毒RT-LAMP方法的研究，但也普遍存在着对不同血清型的敏感性 不同、检测敏感性不够、覆盖面不全，不能实现现场可视化检出等问 题。特别是，目前口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法存在的问题是：1、口 蹄疫病毒群特异性片段高度保守片段未找到，多数研究成果仅针对口 蹄疫病毒1个血清型(主要为O型)，少数已建立的通用型检测方法不 能实现主要流行毒株的全覆盖，或者敏感性较低；2、已有的实现可 视化的研究成果，在反应完成后均需要打开反应管盖子添加荧光染 料，易造成反应产物污染环境，再次检测时出现假阳性检测结果。
发明内容
为了实现口蹄疫病毒快速简便、可视化的检出，本发明提供了一 组口蹄疫病毒群特异性的RT-LAMP引物组及一种口蹄疫病毒群特异性 的RT-LAMP检测试剂盒和应用方法，可以特异性检出口蹄疫病毒，通 过观察颜色反应确定样品中口蹄疫病毒的阴性或阳性。
本发明提供一种RT-LAMP法检测口蹄疫病毒的引物组，所述引物 组包括6条引物，分别为：两条外引物：正向外引物F3、反向外引物 B3；两条内引物：正向内引物FIP、反向内引物BIP；两条环引物：上 游环引物LF、下游环引物LB，所述6条引物具体序列如下：
正向外引物F3：5'-GACAAAAGYGACAAAGGTT-3'；
反向外引物B3：5'-TAAAGTGATCTGTAGCTTGG-3'；
正向内引物FIP：
5'-CGTGCAAAGGAGAGGATAGCCTC-CYGATGTCACTTTCCTCAAAAG-3'；
反向内引物BIP：
5'-GACCATACAGGAGAAGTTGA-AAGAGRCCCTGGAAGGGCTCRAA-3'；
上游环引物LF：5'-TAAAACCCAGTTCCATA-3'；
下游环引物LB：5'-CTCGCCGTCCACTCTGG-3'；
所述6条引物位于口蹄疫病毒高度保守的3D蛋白基因内，全基因 组的7776-8050bp处，所述序列如SEQ ID NO:1所示，其中所述反向 外引物B3、反向内引物BIP和下游环引物LB为该基因片段的互补基因 序列。
进一步，所述6条引物在所述全基因组的7776-8050bp处的具体位 置为：
正向外引物F3：7776bp～7794bp；
反向外引物B3：8031bp～8050bp；
正向内引物FIP：7899bp～7921bp、7816bp～7837bp；
反向内引物BIP：7928bp～7947bp、8001bp～8023bp；
上游环引物LF：7854bp～7870bp；
下游环引物LB：7962bp～7978bp。
本发明同时提供一种RT-LAMP法检测口蹄疫病毒的试剂盒，该试 剂盒内包含RT-LAMP反应管、阳性对照样品、阴性对照样品、比色卡， 所述RT-LAMP反应管内包括扩增反应体系和显色体系，扩增反应体系 位于RT-LAMP反应管底部，显色体系位于RT-LAMP反应管管盖处；所述 扩增反应体系中引物组为权利要求1所述的引物组。
进一步，该试剂盒中引物组的正向外引物F3和反向外引物B3为外 引物、正向内引物FIP和反向内引物BIP为内引物、上游环引物LF和下 游环引物LB为环引物，所述外引物：内引物：环引物的摩尔含量比为 1:8:2。
进一步，所述扩增反应体系共23μL，具体包括：
Figure BDA0002502273040000041
Figure BDA0002502273040000051
进一步，所述显色体系是用石蜡油封闭的荧光染料，所述荧光染 料为PicoGreen；密封荧光染料的方式为：制备成品试剂盒时在 RT-LAMP反应管管盖中滴加4μL PicoGreen，随后滴加15μL石蜡油， 把PicoGreen封闭于反应管管盖处。
进一步，所述阳性对照样品为含有目的基因片段的质粒DNA，阴 性对照样品为DEPC水。
进一步，所述的试剂盒的检测应用包括如下步骤：
步骤(1)提取组织样品中的病毒RNA；
步骤(2)取2μL病毒RNA加入到RT-LAMP反应管的扩增反应体系 中，同时另取2个RT-LAMP反应管分别加入2μL试剂盒提供的阳性对照 和阴性对照；
步骤(3)对病毒RNA进行反转录和扩增，反应条件包括但不限于： 50℃条件下反应10分钟，再在63-65℃条件下反应1小时；
步骤(4)反应结束后立即晃动RT-LAMP反应管，使管盖上的 PicoGreen荧光染料与反应液充分混匀；
步骤(5)根据颜色反应读取结果，绿色或黄绿色为口蹄疫病毒 核酸阳性，橙黄色或棕红色为阴性；或者通过核酸电泳分析是否出现 梯形条带，如果出现梯状条带，说明样品为阳性，否则为阴性。阳性 对照反应管应呈现绿色或黄绿色，或电泳出现梯形条带；阴性对照反 应管应呈现橙黄色或棕红色，或电泳无显著梯形条带。
进一步，试剂盒中的比色卡设置4种颜色，便于肉眼比对判定结 果，分别为口蹄疫病毒核酸阳性时呈现的绿色、黄绿色，口蹄疫病毒 核酸阴性时呈现的橙黄色、棕红色条带。
本发明提供的引物组可应用在口蹄疫病毒检测中。
本发明提供的试剂盒可应用在口蹄疫病毒检测中。
本发明的有益效果如下：
所述引物具有高度特异性，可实现有效反转录产物的高效扩增， 反转录和扩增针对口蹄疫病毒3D蛋白基因的模板RNA。
1)高特异性：引用6条特异性引物对靶序列8个区域进行识别， 保证了LAMP扩增的高度特异性，针对牛、猪、羊常见病毒进行的特 异性检测结果见图2，均无交叉反应。
2)高敏感性：本发明通过对107条O型、A型、Asia-1型口蹄疫病 毒3D蛋白基因组序列进行比对分析，截取通用高度保守基因片段设计 引物，保证了其对口蹄疫病毒不同血清型和亚型的敏感性，以及对样 本低病毒含量的灵敏度，验证结果显示本发明的RT-LAMP检测为阳性 的最低RNA浓度为3.4×10-6ng/μL，见图3。
3)操作简便：提取病毒RNA后，取出1μL加入反应管中，按照 要求和温度反应即可，检测结果通过与用比色卡比较进行可视化结果 判定。
4)对仪器设备要求低：不需要昂贵复杂的仪器设备，仅需要水 浴锅、温度计或温箱或PCR仪等可将温度调至所需温度的设施，能够 较好满足目前对口蹄疫病毒现场检测的迫切需要，适合基层兽医、进 出口检疫部门、养殖场、屠宰场等现场快速可视化检出口蹄疫病毒。
附图说明
图1为口蹄疫病毒RT-LAMP检测法荧光染料加入方式的试验结果；
图2为口蹄疫病毒RT-LAMP检测法特异性试验结果；
图3为口蹄疫病毒RT-LAMP检测法敏感性试验结果；
图4为qRT-PCR法检测口蹄疫病毒敏感性试验结果；
图5为RT-PCR法检测口蹄疫病毒敏感性试验结果；
图6为批内可重复性试验电泳图；
图7为批间可重复性试验电泳图。
具体实施方式
本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解为本发明的保 护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明所阐述的方法，应理解为不限于本发明所述的具体方法和 实验条件，因为该方法和条件可作适当改变。进一步，本文使用的术 语仅是用于描述具体实施方案，而不是用来限制。
本发明在实践或测试过程中可使用与本文类似或相同的材料和 方法，但本文所述为优选的材料和方法。
本发明所使用的材料和材料的质量控制均为本领域专业技术人 员一般性认可的。
1材料与方法
1.1病毒及核酸
O型、A型和Asia-1型口蹄疫病毒标准株，均购自中国农业科学 院兰州兽医研究所试剂盒中阳性对照；BTV-1型病毒、BTV-16型病毒、 鹿流行性出血热病毒(Epizootichaemorrhagic disease virus， EHDV)、阿卡斑病毒(Akabane virus，AKV)，猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)，猪呼吸与繁殖综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)，中山病 毒(Chuzan virus，CHUV)由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验 室分离鉴定并保存。口蹄疫临床样品为云南省边境地区外来牛保存口 咽(OP)液样品RNA。阳性对照为购自中国农业科学院兰州兽医研究 所试剂盒中阳性对照样品，阴性对照为超纯水。
1.2材料
RNA核酸提取试剂盒及PicoGreen dsDNA荧光染料购自 Invitrogen公司；Bst2.0WarmStart DNA聚合酶、10×等温扩增 反应液和100mmol MgSO4购自New EnglandBiolabs公司；AMV反 转录酶和dNTP混合液均购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.3引物
利用MEGA 6.0软件对GenBank上下载的107条O型、A型、Asia-1 型口蹄疫病毒全基因组序列，进行比对分析，截取高度保守基因片段， 即口蹄疫病毒高度保守的3D蛋白基因内，全基因组的7776-8083bp处， 利用在线软件PrimerExplorer V5(http://primerexplorer.jp/ elamp 4.0.0/index.html)设计多套LAMP引物，每套包括1对外引物(F3、B3)、1对内引物(FIP、BIP)和1对环引物(LF、LB)。所有引 物由Invitrogen公司合成并经PAG纯化。qRT-PCR参考已发表的文献 的引物和探针，RT-PCR参考已发表的文献的引物。由Invitrogen公司 合成并PAG纯化。对已知O型、A型和Asia-1型口蹄疫病毒核酸进行扩 增检测，确定扩增效果最好的一套群特异性引物用于后续研究。
1.4RT-LAMP反应体系的确立和反应条件的优化
以O型、A型和Asia-1型口蹄疫病毒核酸RNA为模板，25μL反应 体系为基础，固定应用10×等温扩增反应液2.5μL、Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(8U)1μL、AMV反转录酶(5U)1μL、 正向外引物F3(10μmol)和反向外引物B3(10μmol)各0.5μL、上 游和下游环引物口蹄疫病毒RNA模板2μL，固定反转录反应条件为 50℃10分钟，反应结束后加入4μL PicoGreen。在此反应体系和反 应条件的基础上，硫酸镁(100mmol)设置0.5、1、1.5、2、2.5μL 的用量，dNTP(100mmol)设置2、2.5、3、3.5、4μL的用量，内引物 设置(10mmol)1、2、3、4、5μL的用量，反应温度分设置61℃、63℃、 65℃、67℃，反应时间分别设置30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、 70分钟、80分钟，优化反应体系和反应条件。
1.5荧光染料加入方式的优化
设计试验方案摸索合适的荧光染料预加方案，选择最佳的免开盖 荧光染料添加方式。
方案1：反应体系液面上滴加15μL石蜡油，凝固后滴加4μL PicoGreen；
方案2：反应管盖直接滴加4μL PicoGreen，不加石蜡油；
方案3：将PicoGreen 4μL滴加至反应管管盖，随后将固体石蜡 融化，吸取石蜡油15μL滴加至反应管盖，将PicoGreen密封在管盖 处；
方案4：口蹄疫病毒阳性对照，反应完成后打开反应管管盖添加 荧光染料；
方案5：阴性对照(超纯水)，反应完成后打开反应管管盖添加 荧光染料。
1.6特异性试验
试剂盒提取O型口蹄疫病毒、A型口蹄疫病毒、Asia-1型口蹄疫病 毒、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、阿 卡斑病毒(AKAV)、1型蓝舌病病毒(BTV-1)、6型蓝舌病病毒(BTV-16)、 流行性出血热病毒(EHDV)、中山病毒(CHUV)核酸。并用本发明提供的方法分别做RT-LAMP反应，验证所建方法的特异性。
1.7敏感性试验结果和不同检测方法比对
核酸定量仪测定口蹄疫病毒核酸阳性样品浓度，然后将其10倍倍 比稀释7个稀释度(10-1～10-7)，比较本试验建立的RT-LAMP检测方法 与已经建立的针对口蹄疫3D基因片段的qRT-PCR方法、RT-PCR方法的 检测效果，确定其敏感性。
1.8RT-LAMP方法的可重复性和稳定性试验
对O型口蹄疫病毒3份已知阳性样品和3份已知阴性样品分别提取 RNA，应用编号为20191001、20191201、20200201的3批次RT-LAMP试 剂盒进行批内和批间可重复性和稳定性试验。应用20191201批次试剂 盒随机抽取3个对上述样品分别进行检测，验证批内可重复性和稳定 性；应用上述3批次试剂盒，每批次抽取1个试剂盒对上述样品分别进 行检测，验证批间可重复性和稳定性。
1.9RT-LAMP与其它方法的符合性试验
对采集自云南省边境地区外来牛OP液样品94份，利用本研究建立 的RT-LAMP法和RT-qPCR、RT-PCR方法同时对样品的RNA进行检测，对 比方法的相符率。
2结果
2.1引物的筛选
应用设计并合成好的17套引物对O型、A型、Asia-1型口蹄疫病毒 核酸分别进行检测，检测结果见表1，检测结果显示P8这套引物可完 全检出O型、A型、Asia-1型FMDV，选定P8套引物应用于本发明，引物 序列见表2。
表1应用17套引物分别检测O型、A型、Asia-1型FMDV结果
Figure BDA0002502273040000111
注：“+”表示检出口蹄疫病毒核酸，“-”表示未检出口蹄疫病毒核酸。
表2口蹄疫病毒RT-LAMP引物序列
Figure BDA0002502273040000112
2.2口蹄疫病毒群特异性RT-LAMP反应体系及反应条件的优化结果
对反应的关键试剂配方、引物配比、反应温度进行矩阵交叉对比 试验，依据产物经Picogreen显色后阳性产物呈显著的黄绿色，阴性 样品呈棕红色；琼脂糖凝胶电泳检测结果阳性样品呈现LAMP反应特有 的高亮清晰的瀑布状条带未判定标准，获得最佳试剂配比的反应体系 和反应条件，见表3。
表3口蹄疫群特异性RT-LAMP最佳试剂配比和反应条件
名称 规格 用量或条件
10×等温扩增RT-LAMP反应液 新英格兰公司产品 2.5μL
Bst 2.0WarmStart DNA聚合酶 8U/μL 1.0μL
dNTP混合液 10mmol 3.5μL
硫酸镁 100mmol 1.0μL
AMV反转录酶 5U 1.0μL
正向外引物F3 10μmol 0.5μL
反向外引物B3 10μmol 0.5μL
正向内引物FIP 10μmol 4.0μL
反向内引物BIP 10μmol 4.0μL
上游环引物LF 10μmol 1.0μL
下游环引物LB 10μmol 1.0μL
ddH<sub>2</sub>O - 3.0μL
RNA模板 - 2.0μL
反转录条件 - 50℃，10分钟
等温扩增条件 - 65℃，1小时
2.3RT-LAMP荧光染料添加方式优化的结果
结果见图1，本发明的RT-LAMP法最后采用可视化荧光反应，反应 管内溶液为绿色或黄绿色的为口蹄疫病毒阳性，橙黄色或棕红色为口 蹄疫病毒阴性，经验证，方案1和阴性对照5都为橙黄色或棕红色(图 1为黑白色，因此在图1中显示为深色)，说明方案1的荧光染料添加 方式不行，核酸未实现扩增；方案2的为透明色(图1为黑白色因此只 能看出方案2为浅色，但方案2的颜色实际是透明色，与方案3的差别 一目了然)，说明染料成分被分解；方案3和阳性对照4都为黄绿色(图1为黑白色因此只能看出方案3和4为浅色，但方案3和4的颜色实际是 黄绿色，与方案2的差别一目了然)，说明方案3的荧光染料添加方式 可用，即：制备RT-LAMP反应管时在管盖中滴加4μL PicoGreen，随 后滴加15μL石蜡油，把PicoGreen封闭于石蜡和管盖之间，反应结 束后，甩动RT-LAMP反应管将荧光染料与反应体系混合，便可直接观 察检测结果实验。图1A为可视化结果，图1B为电泳检测结果，M为电 泳检测时的DNA标尺，分子量为2000，从图1中可看出，A和B高度吻合。
2.4特异性试验结果
特异性试验结果见图2，应用RT-LAMP对O型口蹄疫病毒(1)、A 型口蹄疫病毒(2)、Asia-1型口蹄疫病毒(3)、BTV-1(4)、BTV-16 (5)、PRV(6)、PRRSV(7)、EHDV(8)、AKV(9)和CHUV(10) 的RNA样品进行检测，并用电泳检测验证，M为电泳检测时的DNA标尺， 分子量为2000，结果表明仅有O型口蹄疫病毒(1)、A型口蹄疫病毒 (2)、Asia-1型口蹄疫病毒(3)检测结果为阳性,反应液由棕红色 变为黄绿色(图2A中为浅色)，反应产物电泳有瀑布状条带(图2B)， 其他4-10的病毒，可视化反应为橙黄或棕红色(图2A中为深色)，反 应产物电泳没有瀑布状条带(图2B)，说明采用本发明的方法其他病 毒核酸(BTV-1、BTV-16、PRV、PRRSV、EHDV、AKV和CHUV)检测结果 均为阴性。结果表明该方法可特异性检出O型口蹄疫病毒、A型口蹄疫 病毒、Asia-1型口蹄疫病毒核酸，不能检出其他7种病毒核酸，特异 性较好。
2.5敏感性试验结果和不同检测方法比对
核酸定量仪(NanoVue Plus超微量分光光度计，美国GE公司)测 定口蹄疫病毒RNA样品的浓度为34ng/μL，RT-LAMP和qRT-PCR、 RT-PCR对10倍比稀释的核酸样品进行检测，结果显示RT-LAMP阳性 的最低RNA浓度为3.4×10-6ng/μL(表4)，3.4×10-6ng/μL的组7 通过荧光染料的可视化反应中肉眼可清晰辨别(图3A)，与电泳结果高 度吻合(图3B)；相对应的，qRT-PCR阳性的最低RNA浓度为 3.4×10-5ng/μL(表4，图4)，采用qRT-PCR检测时，图4中1-6号样品 能检出，7-8号为3.4×10-6ng/μL和3.4×10-7ng/μL的两组，并未检 出，图4中未标示；RT-PCR为阳性的最低RNA浓度为 3.4×10-4ng/μL(表4，图5)，图5中1-5号样品能检出，6-8号并未检 出。因此，RT-LAMP较qRT-PCR高出10倍，RT-LAMP较RT-PCR高出100 倍，RT-LAMP法更为敏感。
表4敏感性试验结果和不同检测方法比对
Figure BDA0002502273040000141
注：“+”表示检出口蹄疫病毒核酸，“-”表示未检出口蹄疫病毒核酸。
2.6RT-LAMP的重复性
2.6.1批内重复性20191201批次试剂盒随机抽取3个对O型口蹄疫病 毒3份已知阳性样品(P1/P2/P3)和3份已知阴性样品(N1/N2/N3)分 别提取RNA进行RT-LAMP检测，验证批内可重复性和稳定性，检测结 果表明批内3次检测结果一致，电泳结果见图6和表5，M为DNA标尺， 分子量为2000，P为阳性对照，N为阴性对照，图6中可见阳性样品 (P1/P2/P3)均出现典型的瀑布状条带，阴性样品(N1/N2/N3)结果 均未检出，说明本发明提供的试剂盒批内重复性好，可批量生产。
表5批内可重复性研究检测结果
试剂盒 P1 P2 P3 N1 N2 N3
1 + + + - - -
2 + + + - - -
3 + + + - - -
符合率 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％
注：P为已知口蹄疫病毒核酸阳性样品，N为已知口蹄疫病毒核酸阴性样品。
2.6.2批间重复性对O型口蹄疫病毒3份已知阳性样品(P1/P2/P3) 和3份已知阴性样品(N1/N2/N3)分别提取RNA，用3批次试剂分别进 行RT-LAMP检测，验证批间可重复性和稳定性，检测结果表明3批次 间检测结果一致，电泳结果见图7和表6，M为DNA标尺，分子量为2000， P为阳性对照，N为阴性对照，图7可见，阳性样品(P1/P2/P3)均出 现典型的瀑布状条带，阴性样品(N1/N2/N3)结果均未检出，说明批 间重复性好，满足基层检测需求。
表6批间可重复性研究检测结果
试剂盒批次 P1 P2 P3 N1 N2 N3
20191001 + + + - - -
20191201 + + + - - -
20200201 + + + - - -
符合率 100％ 100％ 100％ 100％ 100％ 100％
注：P为已知口蹄疫病毒核酸阳性样品，N为已知口蹄疫病毒核酸阴性样品。
2.7临床样品试验检测结果
利用本发明建立的RT-LAMP检测法对云南省边境地区外来牛OP液 样品94份进行检测。RT-LAMP可视化检测结果表明：RT-LAMP检出12 份核酸阳性样品，阳性率为12.8％(12/94)。qRT-PCR检出10份核酸 阳性样品，阳性率为10.6％(10/94)。RT-PCR检出10份核酸阳性样品， 阳性率为10.6％(10/94)。RT-LAMP方法与RT-PCR和荧光RT-PCR方法 的检测结果符合率均为82.8％(表7)。说明采用本发明的RT-LAMP检 测法，可以高效地检测出PCR法未能检测到的携带口蹄疫病毒的牛只， 进一步提高了基层兽医疫病防控的效率。
表7临床样品检测结果
Figure BDA0002502273040000161
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例 的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其 他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例 看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求 而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和 范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标 记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非 每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅 仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实 施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解 的其他实施方式。
序列表
<110> 云南省畜牧兽医科学院
<120> 一种RT-LAMP法检测口蹄疫病毒的引物组和试剂盒及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 275
<212> DNA
<213> 口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)
<400> 1
gacaaaagcg acaaaggttt tgttcttggt cactccatca ccgacgtcac tttcctcaaa 60
agacatttcc acatggacta tggaactggg ttttacaaac ctgtgatggc ctcgaagacc 120
ctcgaggcca tcctctcctt tgcacgccgt gggaccatac aggagaagtt gatctccgtg 180
gcaggactcg ccgtccactc tggacctgac gagtaccggc gtctctttga accctttcag 240
ggtctctttg agattccaag ctacagatca cttta 275

Claims (10)

1.一种RT-LAMP法检测口蹄疫病毒的引物组，所述引物组包括6条引物，分别为：两条外引物：正向外引物F3、反向外引物B3；两条内引物：正向内引物FIP、反向内引物BIP；两条环引物：上游环引物LF、下游环引物LB，其特征在于，所述6条引物具体序列如下：
正向外引物F3：5'-GACAAAAGYGACAAAGGTT-3'；
反向外引物B3：5'-TAAAGTGATCTGTAGCTTGG-3'；
正向内引物FIP：
5'-CGTGCAAAGGAGAGGATAGCCTC-CYGATGTCACTTTCCTCAAAAG-3'；
反向内引物BIP：
5'-GACCATACAGGAGAAGTTGA-AAGAGRCCCTGGAAGGGCTCRAA-3'；
上游环引物LF：5'-TAAAACCCAGTTCCATA-3'；
下游环引物LB：5'-CTCGCCGTCCACTCTGG-3'；
所述6条引物位于口蹄疫病毒高度保守的3D蛋白基因内，全基因组的7776-8050bp处，所述序列如SEQ ID NO:1所示，其中所述反向外引物B3、反向内引物BIP和下游环引物LB为该基因片段的互补基因序列。
2.根据权利要求1所述RT-LAMP法检测口蹄疫病毒的引物组，其特征在于：所述6条引物在所述全基因组的7776-8050bp处的具体位置为：
正向外引物F3：7776bp～7794bp；
反向外引物B3：8031bp～8050bp；
正向内引物FIP：7899bp～7921bp、7816bp～7837bp；
反向内引物BIP：7928bp～7947bp、8001bp～8023bp；
上游环引物LF：7854bp～7870bp；
下游环引物LB：7962bp～7978bp。
3.一种RT-LAMP法检测口蹄疫病毒的试剂盒，该试剂盒内包含RT-LAMP反应管、阳性对照样品、阴性对照样品、比色卡，其特征在于：所述RT-LAMP反应管内包括扩增反应体系和显色体系，扩增反应体系位于RT-LAMP反应管底部，显色体系位于RT-LAMP反应管管盖处；所述扩增反应体系中引物组为权利要求1所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，该试剂盒中引物组的正向外引物F3和反向外引物B3为外引物、正向内引物FIP和反向内引物BIP为内引物、上游环引物LF和下游环引物LB为环引物，其特征在于：所述外引物：内引物：环引物的摩尔含量比为1:8:2。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述扩增反应体系共23μL，具体包括：
Figure FDA0002502273030000021
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述显色体系是用石蜡油封闭的荧光染料，所述荧光染料为PicoGreen；密封荧光染料的方式为：制备成品试剂盒时在RT-LAMP反应管管盖中滴加4μL PicoGreen，随后滴加15μL石蜡油，把PicoGreen封闭于反应管管盖处。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照样品为含有目的基因片段的质粒DNA，阴性对照样品为DEPC水。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的检测应用包括如下步骤：
步骤(1)提取组织样品中的病毒RNA；
步骤(2)取2μL病毒RNA加入到RT-LAMP反应管的扩增反应体系中，同时另取2个RT-LAMP反应管分别加入2μL试剂盒提供的阳性对照和阴性对照；
步骤(3)对病毒RNA进行反转录和扩增，反应条件包括但不限于：50℃条件下反应10分钟，再在63-65℃条件下反应1小时；
步骤(4)反应结束后立即晃动RT-LAMP反应管，使管盖上的PicoGreen荧光染料与反应液充分混匀；
步骤(5)根据颜色反应读取结果，绿色或黄绿色为口蹄疫病毒核酸阳性，橙黄色或棕红色为阴性；或者通过核酸电泳分析是否出现梯形条带，如果出现梯状条带，说明样品为阳性，否则为阴性。阳性对照反应管应呈现绿色或黄绿色，或电泳出现梯形条带；阴性对照反应管应呈现橙黄色或棕红色，或电泳无显著梯形条带。
9.权利要求1-2任一所述的引物组在口蹄疫病毒检测中的应用。
10.权利要求3-8任一所述的试剂盒在口蹄疫病毒检测中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113005227A (zh) * 2021-03-12 2021-06-22 长沙海关技术中心 一种高效二联检测口蹄疫和小反刍兽疫的引物以及试剂盒
CN113564276A (zh) * 2021-05-19 2021-10-29 中国农业科学院兰州兽医研究所 口蹄疫病毒可视化rt-lamp检测体系和方法的建立

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101294225A (zh) * 2008-02-29 2008-10-29 上海大学 用于检测o型口蹄疫病毒的lamp试剂盒及其建立方法和应用
CN101358246A (zh) * 2008-08-28 2009-02-04 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 用于检测猪瘟病毒的lamp试剂盒及其制备方法
CN103388034A (zh) * 2013-07-22 2013-11-13 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心 检测口蹄疫a型病毒的rt-pcr引物及试剂盒
CN103627817A (zh) * 2013-09-30 2014-03-12 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心 检测口蹄疫病毒通用型的rt-pcr引物及试剂盒
CN105483286A (zh) * 2015-12-10 2016-04-13 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种鸭黄病毒的rt-lamp检测方法
CN206014913U (zh) * 2016-08-15 2017-03-15 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 口蹄疫病毒rt－lamp检测试剂盒
CN106893787A (zh) * 2017-04-20 2017-06-27 广西壮族自治区兽医研究所 鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重荧光rt‑lamp检测引物组、试剂盒及其应用
CN108796131A (zh) * 2018-06-29 2018-11-13 广西壮族自治区兽医研究所 可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光rt-lamp检测组、试剂盒及其应用
CN110106284A (zh) * 2019-01-30 2019-08-09 宁波大学 一种用于检测动物疫病的高通量定量检测试剂盒

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101294225A (zh) * 2008-02-29 2008-10-29 上海大学 用于检测o型口蹄疫病毒的lamp试剂盒及其建立方法和应用
CN101358246A (zh) * 2008-08-28 2009-02-04 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 用于检测猪瘟病毒的lamp试剂盒及其制备方法
CN103388034A (zh) * 2013-07-22 2013-11-13 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心 检测口蹄疫a型病毒的rt-pcr引物及试剂盒
CN103627817A (zh) * 2013-09-30 2014-03-12 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心 检测口蹄疫病毒通用型的rt-pcr引物及试剂盒
CN105483286A (zh) * 2015-12-10 2016-04-13 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种鸭黄病毒的rt-lamp检测方法
CN206014913U (zh) * 2016-08-15 2017-03-15 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 口蹄疫病毒rt－lamp检测试剂盒
CN106893787A (zh) * 2017-04-20 2017-06-27 广西壮族自治区兽医研究所 鉴别口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重荧光rt‑lamp检测引物组、试剂盒及其应用
CN108796131A (zh) * 2018-06-29 2018-11-13 广西壮族自治区兽医研究所 可视化鉴别口蹄疫病毒和蓝舌病病毒的二重荧光rt-lamp检测组、试剂盒及其应用
CN110106284A (zh) * 2019-01-30 2019-08-09 宁波大学 一种用于检测动物疫病的高通量定量检测试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NOTOMI T等: "Loop-mediated isothermal amplification: principle features and future prospects.", 《JOURNAL OF MICROBIOLOGY》 *
王韦华等: "口蹄疫病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立", 《西北农业学报》 *
袁彩虹: "基于RT-LAMP的口蹄疫病通用型快速检测方法构建", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113005227A (zh) * 2021-03-12 2021-06-22 长沙海关技术中心 一种高效二联检测口蹄疫和小反刍兽疫的引物以及试剂盒
CN113564276A (zh) * 2021-05-19 2021-10-29 中国农业科学院兰州兽医研究所 口蹄疫病毒可视化rt-lamp检测体系和方法的建立

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