CN104263844A - 一种用于检测诺卡氏菌的核苷酸序列及应用 - Google Patents

一种用于检测诺卡氏菌的核苷酸序列及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种核苷酸序列及所述核苷酸序列在细菌鉴别诊断中的应用，本发明所提供的探针序列及检测方法可以快速、特异、灵敏地检测诺卡氏菌，有效地避免了其它细菌的非特异性扩增。

Description

一种用于检测诺卡氏菌的核苷酸序列及应用
技术领域
本发明涉及TaqMan探针在细菌检测中的应用，特别是诺卡氏菌鉴别诊断中的应用，属于分子生物学和微生物学领域。
背景技术
诺卡氏菌(Nocardiaceae)是一种需氧的革兰氏阳性棒状杆菌，1890年Eppinger报道了由诺卡菌引起的第一例人类感染病例，它引起的诺卡菌病是一种急性或慢性化脓性或肉芽肿性的病变。免疫力低下的人群最易感染，主要引起肺部疾病、皮肤性疾病以及全身播散性疾病，临床病症复杂多样，主要有菌血症、积脓症、心包炎、感染性心内膜炎等，严重时甚至能够引起病人的死亡。诺卡氏菌是条件致病菌，内源性感染的几率较小，很少发生人传人的现象。根据国内外的报道，目前至少有6种诺卡氏菌能够同时感染人与动物，研究学者通过大量的调查研究发现诺卡氏菌病的感染几率正在逐年增加，而且诺卡氏菌经常会侵袭脑部，形成脓肿，造成致死性感染，传统的鉴定诺卡氏菌的方法如分离培养、表型鉴定等较为费时费力，易延误病情，难以满足目前的临床诊断需求。
实时荧光TaqMan PCR技术(real time TaqMan PCR，TaqMan是罗氏公司(Roche Molecular System,Inc.)的注册商标)最近几年广泛应用于病原体微生物的检测，普通PCR方法只能将产物从大小上进行区分，实时荧光TaqMan PCR技术在普通PCR的基础上又加入一条特异的荧光探针，并且该技术对引物与模板的同源性要求也高于普通PCR。实时荧光TaqMan PCR中的探针序列必须与目标序列完全匹配，荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭剂则在3'末端。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；但在PCR扩增时，随着引物的延伸Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此比普通PCR法具有更高的特异性。但是在荧光TaqMan PCR技术的应用中，探针的选择是一个重要因素，因为其涉及到与引物的匹配，以及最关键的检测特异性的问题。本发明旨在应用实时荧光TaqManPCR技术，建立一种针对诺卡氏菌的灵敏、特异、快速的核酸检测体系，用于模临床标本的检测
发明内容
本发明的目的在于提供一种应用能够应用于细菌检测，特别是荧光TaqMan PCR技术的检测探针序列，更进一步提供于荧光TaqMan PCR技术检测诺卡氏菌方法，以及用于该方法的试剂盒。
基于上述目的，本发明首先提供了一种用于细菌检测的探针序列，所述序列含有如SEQ ID NO:3所示的序列。
其次，本发明提供了一种用于非诊断目的的荧光TaqMan PCR检测方法，所述方法包括：
(1)被检测物种的基因组DNA的抽提；
(2)以步骤(1)获得的DNA为模板进行TaqMan PCR扩增，其中上游引物为SEQ ID NO:1所示的序列，下游引物为SEQ ID NO:2所示的序列，探针序列为SEQ ID NO:3所示的序列；
(3)对扩增结果进行检测分析。
在本发明一个优选实施方案中，所述步骤(2)的PCR反应条件为：
在另一个优选实施方案中，所述步骤(2)和(3)在ABI7500Fast实时荧光定量PCR仪中进行。
优选地，所述物种为细菌。
更为优选地，所述细菌选自下述细菌：诺卡氏菌、嗜肺军团菌、肺炎克雷伯、肺炎链球菌、百日咳杆菌、分枝杆菌、小肠耶尔森菌、艰难梭菌。
最为优选地，所述细菌为诺卡氏菌。
本发明提供的检测方法的结果判断方法为：(1)若样品有明显的S型扩增，且Ct值≤34，则判定样品为诺卡氏菌阳性；(2)若有S型扩增，且34<Ct≤40，判定为不确定样品，需重新提取核酸检测；若复检的样品仍有S型扩增，且Ct<40，则判定为诺卡氏菌阳性，否则为阴性；(3)若无明显的S型扩增曲线，但报告仍有荧光值、Ct值，为非特异性扩增，可能为探针降解所释放的非特异性荧光信号。
最后，本发明还提供了一种用于细菌检测的TaqMan PCR试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)热启动Taq DNA聚合酶；
(2)实时荧光定量PCR缓冲液；
(3)序列为SEQ ID NO:1的上游引物为和序列为SEQ ID NO:2的下游引物；
(4)序列为SEQ ID NO:3的探针。
本发明建立的诺卡氏菌实时荧光PCR方法对质粒标准品的检测下限为23拷贝/反应体系，对痰液模拟标本菌量的检测下限为2.0×102cfu/ml。
在被检测的22种菌株中，所有的诺卡氏菌(96株)荧光信号强，均有明显的S型扩增，且Ct值都<30；其他的对照菌株虽然也有荧光信号、Ct值，但是没有明显的S型，且Ct值都>34。
本发明建立的实时荧光TaqMan PCR方法对样本检测所需时间短，整个反应在2h内完成。
因此，本研究初步建立的诺卡氏菌Taqman荧光定量PCR方法，灵敏度高、简单快速，对临床病人的早期诊断和治疗具有重要的意义。
附图说明
图1诺卡氏菌TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线图。
图2TaqMan荧光定量PCR方法检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
本发明Taqman荧光定量PCR方法所应用的设备、试剂、菌株和序列。
1.主要仪器设备与试剂
ABI Fast7500荧光定量PCR仪及SENSO PCR仪，台式高速离心机，核酸浓度测定仪。TIANGEN小量质粒提取试剂、TIANGEN核酸提取试剂盒、QIAGEN核酸纯化试剂盒，PMD18-T Vector、JM109感受肽细胞、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)均购自大连宝生物工程有限公司。
2菌株
实验用诺卡氏菌DSM43003购自德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)，其余诺卡氏标准菌株95株同样购自DSMZ，诺卡氏临床分离菌株(CDC25-CDC68)由中国疾控中心传染病所结核室提供。特异性对照的核酸包括嗜肺军团菌、肺炎克雷伯、肺炎链球菌、百日咳杆菌、分枝杆菌、小肠耶尔森菌、艰难梭菌，由中国疾病预防控制中心传染病所结核室、呼吸室、应急室、院感室提供。具体菌株信息见表1。
表1实验用菌株信息
3引物与探针合成
根据诺卡氏菌rpoB基因的保守区域应用软件Express2.0设计引物与探针，具体信息见表1。引物与探针均委托上海基康生物公司合成。
表2诺卡氏菌引物及探针序列信息
其中，HEX表示在rpoB探针5’端标记有荧光报告基团5’-六氯荧光素氨基磷酸酯(5'-Hexachloro-Fluorescein，简写HEX，Genelink产品，产品货号26-6432，详细信息:http://www.genelink.com/newsite/products/mod_detail.asp？modid＝34)，
BHQ表示在探针3’端标记有荧光淬灭基团BHQ(Black HoleQuencher,Biosearch Technologies产品，详细信息:https://www.biosearchtech.com/bhq)。
实施例1Taqman荧光定量PCR方法标准曲线的建立
1 质粒标准品的制备
①以鼻疽诺卡菌标准菌株DSM43003提取的DNA为模板，rpoB-F和rpoB-R为引物，扩增目的基因rpoB；
②切胶回收，纯化PCR产物；
③连接到pMD-18T载体；
④导入JM109感受肽细胞；
⑤筛选阳性克隆子，普通PCR验证，进一步测序验证；
⑥提取质粒，-20℃保存，含有重组子的阳性菌-80℃保存。
2 质粒拷贝数浓度换算
测定质粒浓度为34.8ng/ul，根据公式计算拷贝数浓度(copies/ul)＝质粒浓度(ng/ul)×(6.02×1023)×10-9/(660×质粒碱基数)，其中6.02×1023为阿伏伽德罗常数，即每摩尔的分子个数；660是每个碱基的平均分子量，质粒碱基数＝T载体的碱基数+质粒的碱基数。计算得出的拷贝数的浓度为1.15×1010拷贝/ml。
3 TaqMan探针荧光定量PCR反应体系及反应条件
TaqMan探针荧光定量PCR反应体系为20ul，在TaKaRa Premix ExTaqTM(Probe qPCR)推荐的反应体系基础上进行优化，经反复试验，最优的反应体系为：Premix10ul、上下游引物(10umol/L)各0.8ul，探针(10umol/L)0.4ul，DyeII0.2ul，DNA模板2ul，去离子水加至20ul。反应条件采用两步法：95℃预变性20s、95℃3s、60℃延伸30s，共40个循环。
4.标准曲线的建立
将上述质粒10×倍比稀释后，质粒的浓度为1.15×109～1.15×102拷贝/ul，共8个浓度梯度，每个浓度同时做3个平行样品。对1.15×109～1.15×102拷贝/ul共8个浓度梯度的诺卡氏菌质粒标准品重复检测3次，对应的Ct值显示的结果如表3(Ct值：指PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数)。当质粒标准品的浓度为1.15×109～1.15×102拷贝/ul时，质粒浓度的对数值与其Ct值之间有良好的线性关系，相关系数R2＝0.998，Eff％＝98.96％，TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线图见图1。图2为对浓度为1.15×109(A)～1.15×102(H)拷贝/ul的质粒样本的TaqMan荧光定量PCR方法检测结果图，纵坐标ΔRn表示相对信号强度,即样品信号强度与内参信号强度之差，当ΔRn为0.255088以上时，扩增信号强度呈线性增长，因此，检测阈值为0.255088。所有标本的扩增荧光信号都高于检测阈值，扩增曲线有明显的S型。依据每反应体系加2ul模板计算得出，本研究建立的诺卡氏菌实时荧光PCR体系对质粒标准品的检测下限为23拷贝/反应体系。
表3质粒浓度对数值与其对应的Ct值
实施例2方法的特异性评价
在与实施例1同样的反应体系和反应条件下，用嗜肺军团菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、百日咳杆菌、分枝杆菌、小肠耶尔森菌、艰难梭菌的核酸验证引物和探针的特异性。
本实验检测表1中列出的22种菌株中，所有的诺卡氏菌(96株)荧光信号强，均有明显的S型扩增，且Ct值都<30，具体结果见表4；其他的对照菌株虽然也有荧光信号、Ct值，但是没有明显的S型，且Ct值都>34。
表4多种诺卡氏菌与其对应的Ct值
实施例3.痰液模拟标本检测
1.痰液模拟标本的制备及核酸提取：①诺卡氏标准菌株DSM43003接种于脑心浸液(BHI)液体培养液中，37℃振荡过夜培养。取过夜培养的菌液50ul接种至5ml BHI液体培养液中，37℃摇菌至OD(600nm)值约为0.8，平板计数为2.0×108cfu/ml；②用BHI液体培养液连续10倍稀释至2.0×100～2.0×107cfu/ml；③无菌痰液用生理盐水1:10稀释后，取100ul/管，其中一管加入100ul的BHI液体培养液作为对照组，其余各管加入10×倍比稀释的菌液100ul制成2.0×100～2.0×107cfu/ml梯度的痰液模拟标本；④13000～13500rpm/min离心10min，弃上清，加入180ul终浓度为20mmol/ml的溶菌酶，37℃水浴30min以上，然后按照TIANGEN试剂盒法提取核酸，每个菌量浓度取3份痰液模拟标本，同时提取DNA。
2.在与实施例1同样的反应体系和反应条件下进行痰液模拟标本检测当检测痰液模拟标本含菌量为2.0×102～2.0×108cfu/ml的核酸时，所有模拟标本的荧光信号均高于检测阈值，扩增曲线有明显的S型；当标本含菌量为2.0×101cfu/ml时，未出现明显的S型特异性扩增。因此，本研究建立的诺卡氏菌Taqman荧光定量PCR方法对痰液模拟标本菌量的检测下限为2.0×102cfu/ml。

Claims (8)

1.一种用于细菌检测的探针序列，所述序列为SEQ ID NO:3所示。
2.一种用于非诊断目的的荧光TaqMan PCR检测方法，所述方法包括：
(1)被检测物种的基因组DNA的抽提；
(2)以步骤(1)获得的DNA为模板进行TaqMan PCR扩增，其中上游引物为SEQ ID NO:1所示的序列，下游引物为SEQ ID NO:2所示的序列，探针序列为SEQ ID NO:3所示的序列；
(3)对扩增结果进行检测分析。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)的PCR反应条件为：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)和(3)在ABI 7500Fast实时荧光定量PCR仪中进行。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述物种为细菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细菌选自下述细菌：诺卡氏菌、嗜肺军团菌、肺炎克雷伯、肺炎链球菌、百日咳杆菌、分枝杆菌、小肠耶尔森菌、艰难梭菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细菌为诺卡氏菌。
8.一种用于细菌检测的TaqMan PCR试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)热启动Taq DNA聚合酶；
(2)实时荧光定量PCR缓冲液；
(3)序列为SEQ ID NO:1的上游引物为和序列为SEQ ID NO:2的下游引物；
(4)序列为SEQ ID NO:3的探针。
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