CN115746112A - 一种诺卡菌特异性抗原蛋白、血清学诊断试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学和诊断技术领域，具体涉及一种诺卡菌特异性抗原蛋白、血清学诊断试剂盒及其应用。本发明通过对诺卡菌全基因组序列分析，选择诺卡菌特异性基因，通过克隆表达分析，确定该蛋白为诺卡菌特异性的免疫显性蛋白，应用全菌血清进一步验证了该蛋白能够特异性的识别诺卡菌感染的小鼠和人血清，从而表明其是一种新的具有高度诊断价值和应用前景的抗原蛋白。采用本发明技术方案制备相应诊断产品，能够显著节约临床鼻疽诺卡菌诊断的时间；且检测方法简单易学，无需专业技术或经验，其应用范围广，具有良好的实际应用之价值。

Description

一种诺卡菌特异性抗原蛋白、血清学诊断试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物医学和诊断技术领域，具体涉及一种诺卡菌特异性抗原蛋白、血清学诊断试剂盒及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

诺卡菌是一种需氧、部分抗酸以及革兰氏阳性杆菌，其被认为是急性或慢性肺部感染或化脓性疾病患者中较为常见的条件致病菌。其中，鼻疽诺卡菌(Nocardiafarcinica)是引起肺诺卡菌病的最常见病原体之一。将诺卡菌鉴定到种水平在临床诊治中具有重要意义，因为不同种诺卡菌具有不同的耐药谱。此外，鼻疽诺卡菌与分枝杆菌等在表型上有一些相似之处，这也有可能导致对感染病原体的误判，进而导致误诊情况的发生。而对于诺卡菌病患者来说，误诊则会使得病程延误或治疗不当，从而导致疾病的高死亡率。

临床上现有的诺卡菌诊断主要是分离培养，耗时耗力，一般需要至少一周时间，严重耽误临床及时用药。此外，该细菌分离培养难度较高，一般非常有经验的专业技术人员才能容易分离到细菌，基层医院分离培养技术不够熟练，及其容易分离培养失败，造成检验诊断报告错误，耽误疾病治疗最佳时间。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种诺卡菌特异性抗原蛋白、血清学诊断试剂盒及其应用。本发明首次发现一种鼻疽诺卡菌的免疫原性蛋白，应用疑似临床诺卡菌感染病人的血清，通过ELISA等方法检测血清中的抗体，从而达到快速诊断鼻疽诺卡菌感染的目的。

具体地，本发明的技术方案如下所示：

本发明的第一个方面，提供一种诺卡菌特异性抗原蛋白，所述诺卡菌特异性抗原蛋白是如下(a1)或(a2)：

(a1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)由(a1)衍生，且其含有SEQ ID NO.1所示的部分氨基酸序列，即抗原表位多肽。

本发明的第二个方面，提供编码上述诺卡菌特异性抗原蛋白的基因。

本发明的第三个方面，提供含有上述编码基因的重组表达载体和/或含有上述编码基因的转化细胞亦在本发明的保护范围之内。

本发明的第四个方面，提供上述诺卡菌特异性抗原蛋白在制备诺卡菌诊断试剂、诺卡菌诊断试纸和/或诺卡菌诊断试剂盒的应用。

本发明的第五个方面，提供一种诺卡菌诊断试剂、诺卡菌诊断试纸和/或诺卡菌诊断试剂盒，所述诺卡菌诊断试剂、诺卡菌诊断试纸和/或诺卡菌诊断试剂盒包含上述诺卡菌特异性抗原蛋白。

本发明的第六个方面，提供一种检测诺卡菌或诊断诺卡菌感染的方法，所述方法包括：采集受试者血清，采用上述诺卡菌特异性抗原蛋白、诺卡菌诊断试剂、诺卡菌诊断试纸和/或诺卡菌诊断试剂盒进行检测。

上述一个或多个技术方案的有益效果为：

上述技术方案通过对诺卡菌全基因组序列分析，选择诺卡菌特异性基因，通过克隆表达分析，确定该蛋白为诺卡菌特异性的免疫显性蛋白，应用全菌血清进一步验证了该蛋白能够特异性的识别诺卡菌感染的小鼠和人血清，从而表明其是一种新的具有高度诊断价值和应用前景的抗原蛋白。

采用上述技术方案制备相应诊断产品，能够显著节约临床鼻疽诺卡菌诊断的时间；且检测方法简单易学，无需专业技术或经验，其应用范围广，具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中纯化后的目的蛋白；

图2为本发明实施例中通过Western blot验证该蛋白与血清的特异性反应结果图；

图3为本发明实施例中ELISA验证验证该蛋白与血清的特异性反应结果图；

图4为本发明实施例中人血清特异性验证结果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种诺卡菌特异性抗原蛋白，所述诺卡菌特异性抗原蛋白是如下(a1)或(a2)：

(a1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)由(a1)衍生，且其含有SEQ ID NO.1所示的部分氨基酸序列，即抗原表位多肽。

SEQ ID NO.1由224个氨基酸残基组成；其具体氨基酸序列如下：

MSENRTKGLRHGVRAAGVGAAAAVAMGLLSTGAANADTFVPLPDGQKVGPGVTVTRTGEHAIVSPSMAANGAGRVVWVSGNASADVTVTPEGEVGPNNGPTGNPGSNNSSTHGASQLNTGYIVGCQVSIGDDAISAGLAGGIDLNGGSIGGSIGLDLGPGEVKFVQIDYKDILKPGVYSVEYQDVEIEIQGCAGYAQARSYTVVEIIGDHYSKTTLYGMPFSIG。

本发明的又一具体实施方式中，提供编码上述诺卡菌特异性抗原蛋白的基因。

本发明的又一具体实施方式中，提供含有上述编码基因的重组表达载体和/或含有上述编码基因的转化细胞亦在本发明的保护范围之内。

本发明的又一具体实施方式中，所述重组表达载体通过上述基因有效地连接到表达载体上获得，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体或人工染色体中的任意一种或多种；病毒载体可包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体，人工染色体包括细菌人工染色体、噬菌体P1衍生的载体、酵母人工染色体或哺乳动物人工染色体；进一步优选为质粒；所述质粒包括pET30。

本发明的又一具体实施方式中，所述转化细胞是细菌细胞中的任意一种或多种；

其中所述细菌细胞为埃希氏菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属或葡萄球菌属内的任何种。

更具体的，所述细菌细胞为大肠杆菌(如BL21(DE3))、根癌农杆菌(如GV3101)、发根农杆菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或荧光假单胞菌。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述诺卡菌特异性抗原蛋白在制备诺卡菌诊断试剂、诺卡菌诊断试纸和/或诺卡菌诊断试剂盒的应用。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种诺卡菌诊断试剂、诺卡菌诊断试纸和/或诺卡菌诊断试剂盒，所述诺卡菌诊断试剂、诺卡菌诊断试纸和/或诺卡菌诊断试剂盒包含上述诺卡菌特异性抗原蛋白。

本发明的又一具体实施方式中，所述诺卡菌诊断试剂和/或诺卡菌诊断试剂盒为血清学诺卡菌诊断试剂、诺卡菌诊断试纸和/或诺卡菌诊断试剂盒。本发明可通过试验验证，上述诺卡菌特异性抗原蛋白为诺卡菌特异性的免疫显性蛋白，并应用全菌血清进一步验证了该蛋白能够特异性的识别诺卡菌感染的小鼠血清和人血清，从而可以基于上述诺卡菌特异性抗原蛋白特异性检测诺卡菌，从而可用于制备相应诺卡菌诊断试剂、诺卡菌诊断试纸或诺卡菌诊断试剂盒。

需要说明的是，上述诺卡菌诊断试剂或诊断试剂盒可以为ELISA相关诊断试剂或诺卡菌诊断试剂盒，所述诊断试纸可以为胶体金法制备的诺卡菌诊断试纸。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种检测诺卡菌或诊断诺卡菌感染的方法，所述方法包括：采集受试者血清，采用上述诺卡菌特异性抗原蛋白、诺卡菌诊断试剂、诺卡菌诊断试纸和/或诺卡菌诊断试剂盒进行检测。

需要说明的是，上述诺卡菌为鼻疽诺卡菌。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例

1、首先克隆表达和纯化了鼻疽诺卡菌抗原蛋白。应用pET30质粒表达载体，克隆表达并纯化目的蛋白。

1)根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站中提供的鼻疽诺卡菌IFM10152基因全长。在基因上下游加入的酶切位点分别为NdeI和HindIII，将带有酶切位点的基因插入到经过双酶切的质粒pET30a(+)中，并导入BL21(DE3)感受态大肠杆菌中进行表达

2)挑取重组大肠杆菌单菌落至20ml LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)中，37℃，220rpm培养，加入IPTG使其终浓度为0.2mM，分别在30℃条件诱导16小时。

3)将重组表达的菌体通过超声裂解后，应用HIS纯化柱进行蛋白纯化。

如图1为纯化后的目的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、应用鼻疽诺卡菌感染模型小鼠的血清(一抗)(1：2000)，模拟临床诺卡菌感染病人的血清，通过Western blot验证该蛋白与血清的特异性反应；

1)蛋白电泳(SDS-PAGE)蛋白加入蛋白loading buffer后混匀，煮沸8分钟后，上样，上样量为5μg，电泳条件为80V(30分钟)、120V(1小时)；

2)转膜应用半干转膜仪，转膜条件为15V，1小时；

3)一抗孵育：应用鼻疽诺卡菌全菌小鼠血清，按照1：2000比例稀释至5％脱脂奶粉的PBS缓冲液中，4℃过夜孵育；

4)二抗孵育：应用山羊抗鼠IgG血清，按照1：6000比例稀释至5％脱脂奶粉的PBS缓冲液中，室温孵育2小时；

5)显影：应用化学发光方法显影。

3、ELISA验证

1)用碳酸盐包被缓冲液稀释重组蛋白，包被96孔ELISA板，4℃过夜；

2)弃包被缓冲液，用PBST洗板3次，拍干，加入封闭液，每孔100μl，置于37℃温箱中封闭1小时，后弃封闭液，用PBST洗板3次，拍干；

3)将鼻疽诺卡菌感染模型小鼠血清用封闭液以1：1000和1：2000比例稀释后加到孔中，每孔100μl，37℃孵育2小时；

4)弃上清，用PBST洗板3次；

5)用PBST将二抗以1:5000比例稀释，加入到孔中，每孔100μl，37℃孵育1小时；

6)弃二抗，用PBST洗板3次；

7)加入底物显色试剂TMB50μl，置于37℃温箱中避光10min，加入50μl2M H₂SO₄终止反应，用酶标仪读取450nm处波长。

应用实例：

以该蛋白为目的抗原，包被96孔板，研发成ELISA检测试剂盒或者胶体金快速诊断试纸。

4、人血清特异性验证

收集临床诺卡菌病人血清以及对照血清，包括同源性较近的细菌病人血清和临床常见其他细菌或真菌感染病人血清，如：结核病人、肺炎病人和曲霉菌感染等病人血清。通过Western blot验证NFA_RS24595抗原蛋白的特异性。

一抗孵育：病人血清，将病人血清按照1：50比例稀释至5％脱脂奶粉的PBS缓冲液中；

二抗孵育：山羊抗人IgG血清，按照1：6000比例稀释至5％脱脂奶粉的PBS缓冲液中；

其余步骤参考内容2，结果证明该NFA_RS24595抗原蛋白对诺卡菌具有良好的特异性。

应注意的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实施例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种诺卡菌特异性抗原蛋白，其特征在于，所述诺卡菌特异性抗原蛋白是如下(a1)或(a2)：

(a1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)由(a1)衍生，且其含有SEQ ID NO.1所示的部分氨基酸序列，即抗原表位多肽。

2.编码权利要求1所述诺卡菌特异性抗原蛋白的基因。

3.含有权利要求2所述编码基因的重组表达载体。

4.含有权利要求2所述编码基因的转化细胞。

5.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体通过权利要求2所述的基因有效地连接到表达载体上获得，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体或人工染色体中的任意一种或多种；病毒载体包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体，人工染色体包括细菌人工染色体、噬菌体P1衍生的载体、酵母人工染色体或哺乳动物人工染色体；进一步优选为质粒；所述质粒包括pET30。

6.如权利要求4所述的转化细胞，其特征在于，所述转化细胞是细菌细胞中的任意一种或多种；

其中所述细菌细胞为埃希氏菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属或葡萄球菌属内的任何种；

优选的，所述细菌细胞为大肠杆菌(包括BL21(DE3))、根癌农杆菌、发根农杆菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或荧光假单胞菌。

7.权利要求1所述诺卡菌特异性抗原蛋白在制备诺卡菌诊断试剂、诺卡菌诊断试纸和/或诺卡菌诊断试剂盒的应用。

8.一种诺卡菌诊断试剂、诺卡菌诊断试纸和/或诺卡菌诊断试剂盒，其特征在于，所述诺卡菌诊断试剂、诺卡菌诊断试纸和/或诺卡菌诊断试剂盒包含权利要求1所述诺卡菌特异性抗原蛋白。

9.如权利要求8所述诺卡菌诊断试剂、诺卡菌诊断试纸和/或诺卡菌诊断试剂盒，其特征在于，所述诺卡菌诊断试剂或诊断试剂盒为ELISA相关诊断试剂或诺卡菌诊断试剂盒，所述诊断试纸为胶体金法制备的诺卡菌诊断试纸。

10.一种检测诺卡菌或诊断诺卡菌感染的方法，其特征在于，所述方法包括：采集受试者血清，采用权利要求1所述诺卡菌特异性抗原蛋白、权利要求8或9所述诺卡菌诊断试剂、诺卡菌诊断试纸和/或诺卡菌诊断试剂盒进行检测。

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