KR20190035542A

KR20190035542A - 메르스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 n-말단 도메인 단편 및 c-말단 도메인 단편을 포함한 nc 융합 단백질 및 이를 이용한 메르스 코로나바이러스 감염 진단용 키트

Info

Publication number: KR20190035542A
Application number: KR1020180112836A
Authority: KR
Inventors: 정대균; 윤선우; 김혜권; 송대섭; 노지영; 안민주
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2017-09-26
Filing date: 2018-09-20
Publication date: 2019-04-03
Also published as: KR102103857B1; WO2019066389A1

Abstract

본 발명은 메르스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단 및 C-말단 도메인 단편을 포함하는 NC 융합 단백질 및 이를 이용한 메르스 코로나바이러스 감염 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 NC 융합 단백질은 대장균에서 뉴클레오캡시드 전장 단백질보다 훨씬 더 안정하게 대량 생산이 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 서열번호 8로 표시되는 NC 융합 단백질을 항원으로 하였을 때, 메르스 코로나바이러스에 특이적인 항체를 효과적으로 생산할 수 있다. 또한, 상기 NC 융합 단백질은 메르스 코로나바이러스에 의해 유도되는 항체에 반응을 하므로, 상기 NC 융합 단백질은 메르스 코로나바이러스 진단 키트에 활용될 수 있다.

Description

메르스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단 도메인 단편 및 C-말단 도메인 단편을 포함한 NC 융합 단백질 및 이를 이용한 메르스 코로나바이러스 감염 진단용 키트{NC FUSION PROTEIN COMPRISING N-TERMINUS DOMAIN FRAGMENTS AND C-TERMINUS DOMAIN FRAGMENTS OF MERS-COV NUCLEOCAPSID PROTEIN AND KIT FOR DIAGNOSING INFECTION OF MERS-COV USING THE SAME}

본 발명은 메르스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid protein)의 N-말단 도메인 단편 및 C-말단 도메인 단편을 포함한 NC 융합 단백질 및 이를 이용한 메르스 코로나바이러스 감염 진단용 키트에 관한 것이다.

메르스(middle east respiratory syndrome, MERS)는 메르스 코로나바이러스 감염으로 인한 중증 급성 호흡기 질환이다. 메르스 코로나바이러스(MERS coronavirus, MERS-CoV)는 2012년 사우디아라비아에서 새로 발견된 신종 베타코로나 바이러스이다(Azhar EI, et al., 2014). MERS-CoV의 명칭은 2013년 5월 국제바이러스 분류 위원회에 의해 명명되었으며, 이전에는 신종 코로나 바이러스, SARS 유사 바이러스, 중동 사스, 또는 사우디 사스라고 불렸다. 이러한 MERS-CoV의 감염경로는 박쥐로부터 낙타와 사람에게 전염되는 것으로 알려져 있다. 또한, MERS-CoV는 사람 간의 전염이 가능하며 40%의 치사율을 보이고 있다.

MERS-CoV의 유전체는 비분절 형태이며 크기는 약 30 kb로 11개의 단백질을 암호화하고 있다. 상기 11개의 단백질은 2개의 복제 다단백질, 4개의 구조 단백질, 및 5개의 비구조적(non-structural) 단백질로 구성되어 있다.

현재, 사스 코로나바이러스의 연구를 기반으로, 영장류 모델에서 메르스 코로나바이러스 백신을 개발하고 있다. 개발중인 메르스 코로나 바이러스 백신은 재조합된 수용체 결합 도메인(RBD)을 기반으로 한 백신으로, 접종을 통해 체액성 및 세포성 면역반응을 증가시키는 것으로 나타났다. 그 외에도 다양한 메르스 바이러스 백신이 개발 중에 있다.

또한, MERS-CoV의 신속 진단을 위해 안티젠 래피드 사에서 제품이 개발되었다. 그러나, 안티젠 래피드 사 제품의 경우, 뉴클레오캡시드 단백질의 일부 펩타이드를 대장균에서 발현시킨 후 이를 정제함으로써 단일 클론 항체를 만들어 이용하고 있다. Antigen Rapid MERS-CoV Ag Test 제품은 현재 낙타의 메르스 진단을 위하여 사용이 승인되어 사우디아라비아와 아랍에미리트에서 사용 중이다.

높은 치사율을 보인 MERS는 감염시 호흡기뿐만 아니라 폐렴 또는 급성신부전 등의 합병증을 동반하기 때문에 빠른 진단을 통한 초기 치료가 매우 중요하다. 그러나 아직 인체용으로 승인된 MERS 신속 진단 키트가 없어, 개발이 필요한 실정이다.

Azhar EI, Hashem AM, El-Kafrawy SA, Sohrab SS, Aburizaiza AS, Farraj SA, Hassan AM, Al-Saeed MS, Jamjoom GA, Madani TA. 2014. Detection of the middle east respiratory syndrome coronavirus genome in an air sample originating from a camel barn owned by an infected patient. mBio 5(4):e01450-14. doi:10.1128/mBio.01450-14.

본 발명의 목적은 MERS-CoV 진단을 위한 항원을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항원을 포함한 MERS-CoV를 진단할 수 있는 MERS-CoV 감염 진단용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단 도메인 단편 및 C-말단 도메인 단편을 포함하는 융합 단백질(이하, NC 융합 단백질)을 제공한다.

또한, 본 발명은 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드 단백질의 NC 융합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드 단백질의 NC 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질감염된 숙주세포로부터 NC 융합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 NC 융합 단백질 제조방법을 제공한다.

또한, (a) MERS-CoV의 뉴클레오캡시드 단백질의 NC 융합 단백질을 항원으로서 실험동물에 주입하여 면역반응을 유도하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계의 실험동물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는 MERS-CoV 항체 제조 방법을 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드 단백질의 NC 융합 단백질을 포함하는 MERS-CoV 감염 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 MERS-CoV 감염 진단용 키트에 진단 대상으로부터 분리한 시료를 첨가하는 단계를 포함하는 MERS-CoV 감염 정보제공 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 서열번호 8로 표시되는 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드 단백질의 NC 융합 단백질은 대장균에서 대량 생산이 가능하다. 또한, 개체 내에서 생성된 MERS-CoV의 항체에 특이적으로 결합하여 MERS-CoV 진단에 널리 활용될 수 있다.

도 1은 NC 융합 단백질을 발현 시킬 수 있는 대장균 발현 벡터 pET28a-MERS-CoV_NP_NC를 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2c는 SDS-PAGE를 이용하여 N-말단 도메인(a), C-말단 도메인(b) 및 NC 융합 단백질 도메인(c)을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 이때, Sup은 상층액, ppt는 펠렛, FT는 통과액(flow through), HS-W는 고염도 워시(high salt wash), 그리고 7%-W는 7% 이미다졸 워시(imidazole wash)를 의미한다.
도 2d는 N-말단, C-말단, 및 NC 융합 단백질을 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제하여 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 이때, 5 ug은 로딩한 각 단백질의 양을 의미한다.
도 3은 마우스를 이용하여 NC 융합 단백질의 면역 항체 형성 효과를 ELISA 테스트를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다. 이때, OD는 흡광도(optical density)를 의미한다.
도 4는 기존에 상용화 되어있는 MERS-CoV 진단 키트인 euroimmun사의 키트와 본 발명의 NC 융합 단백질을 이용한 키트의 검출 감도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-229E 및 HCoV-OC43 단백질의 NC 융합 단백질 크로마토그래피로 정제하여 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 이때, 5 ug은 로딩한 각 단백질의 양을 의미한다.
도 6은 MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-229E 및 HCoV-OC43 단백질의 인간 CoV 항체와의 교차 반응성을 확인한 것이다.

본 발명은 일 측면으로, 메르스(middle east respiratory syndrome, MERS) 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단 도메인 단편 및 C-말단 도메인 단편의 융합 단백질을 제공한다.

상기 메르스 코로나바이러스(이하, MERS-CoV 라고 한다)의 뉴클레오캡시드는 MERS 유전체가 암호화하는 총 11개의 단백질(2개의 복제 다단백질, 4개의 구조 단백질, 및 5개의 비구조적 단백질) 중 구조 단백질에 속한다. 이러한 뉴클레오캡시드는 MERS-CoV가 세포 밖에 있을 때 유전물질을 보호하고 새로운 숙주세포에 침투할 때 유전자가 그 세포 내로 유입되도록 도와주는 기능을 한다.

구체적으로, 상기 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 이때, 상기 단백질은 서열번호 3의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 N-말단 도메인의 단편은 서열번호 4의 36번 위치의 아미노산부터 169번 위치의 아미노산 서열 중 1개 내지 134개, 10개 내지 120개, 30개 내지 100개, 또는 50개 내지 80개의 연속된 아미노산 서열일 수 있다.

상기 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드 단백질의 C-말단 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 이때, 상기 단백질은 서열번호 5의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 C-말단 도메인의 단편은 서열번호 6의 246번 위치의 아미노산부터 362번 위치의 아미노산 서열 중 1개 내지 117개, 10개 내지 100개, 20개 내지 80개, 또는 30개 내지 50개의 연속된 아미노산 서열일 수 있다.

상기 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드 단백질의 NC 융합 단백질은 서열번호 8의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 NC 융합 단백질은 서열번호 7의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면으로, MERS-CoV의 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단 도메인 단편 및 C-말단 도메인 단편을 포함하는 융합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 제공한다.

상기 용어 "항체"는 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 성분으로서 특정한 항원과 특이적으로 결합하여 림프와 혈액을 떠돌며 항원-항체반응을 일으키는 단백질이다. 항원-항체 반응은 각 항원에 대하여 높은 특이성을 갖는다. 이는 림프구의 B세포에서 항체가 만들어질 때 특정항원에 의해 생성된 항체는 원칙적으로 다른 항원과 반응하지 않는다. 이러한 높은 특이성은 면역, 알레르기, 각종 병, 및 감염 바이러스의 종류 및 유형의 결정 등의 검사에 사용된다.

이때, 상기 벡터는 pET28a일 수 있으며, 상기 형질전환체는 대장균 속(Escherichia) 미생물일 수 있다. 본 발명은 일 실시예에서는, 서열번호 4로 표시되는 MERS-CoV 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단 도메인의 아미노산 잔기 36-169를 pET28a 벡터의 NdeI과 BamHI 부위에 서브클론하고 대장균 균주를 이용하여 과발현하였다. 또한, 서열번호 6으로 표시되는 MERS-CoV 뉴클레오캡시드 단백질의 C-말단 도메인의 아미노산 잔기 246-362를 pET28a의 EcoRI과 XhoI 부위에 서브클론하고 대장균 균주를 이용하여 과발현하였다. 이후, 각각의 단백질을 대장균에 접종하고 배양하였다.

상기 용어 "항원"은 바이러스의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 성분으로서 바이러스가 발현하는 단백질이다. 본 발명의 일 실시예에서는, 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 MERS-CoV 뉴클레오캡시드 단백질의 NC 융합 단백질 도메인이 개체에 투여되었을 때 면역 항체 형성을 유도하는 항원으로 작용하였다.

또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하며, 상기 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 형질감염된 숙주세포로부터 NC 융합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 NC 융합 단백질 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서는, MERS-CoV 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단 및 C-말단 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드를 pET28a 벡터에 서브클론하고, 이를 대장균에 접종하여 배양함으로써 NC 융합 단백질을 수득하였다.

본 발명은 또 다른 측면으로, (a) MERS-CoV의 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단 도메인 단편 및 C-말단 도메인 단편의 융합 단백질을 항원으로서 실험동물에 주입하여 면역반응을 유도하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계의 실험동물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는 메르스 코로나바이러스 항체 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 MERS-CoV의 뉴클레오캡시드 단백질의 NC 융합 단백질을 포함하는 MERS-CoV 감염 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 MERS-CoV 뉴클레오캡시드 단백질의 NC 융합 단백질은 메르스 코로나바이러스에 대한 항체와 특이적으로 결합할 수 있어, MERS-CoV 감염 진단 키트에 적용될 수 있다. 항원-항체 반응을 유도하여 기존에 시판되고 있는 MERS-CoV 감염 진단 키트에 비해 낮은 농도의 항원으로도 효과적으로 MERS-CoV 감염 여부를 진단할 수 있었다. 특히, MERS-CoV에 감염된 개체에서 생성된 항체는 본 발명의 NC 융합 단백질과 결합할 수 있으므로, 개체가 MERS-CoV에 감염되었는지 여부를 용이하게 진단할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 MERS-CoV 감염 진단용 키트에 진단 대상에서 분리된 시료를 첨가하는 단계를 포함하는 메르스 코로나바이러스 감염 정보제공 방법을 제공한다.

상기 용어 "MERS-CoV 감염 진단용 키트"는 MERS-CoV 감염 및 이에 의한 질병을 신속하게 진단할 수 있는 키트이다. 본 발명의 일 실시예에서는, 환자로부터 추출한 검체에 항원이 코팅되어 있는 스트립을 담가 항원-항체 반응을 통한 발색반응을 확인할 수 있다. 이러한 키트를 이용한 검사들은 10분 내지 15분 이내에 검사 결과를 알 수 있으며, 전문가 또는 진단을 위한 장비가 필요하지 않아 누구나 쉽게 MERS-CoV 감염에 의한 질병을 진단할 수 있다는 장점이 있다.

상기 "메르스 코로나바이러스 감염에 의한 질병"은 호흡기 질환일 수 있으며, 바이러스 감염 후 2일 내지 14일의 잠복기를 거친 뒤 38℃ 이상의 고열, 기침 또는 호흡곤란 등의 심한 호흡기 증상이 나타날 수 있다. 설사 또는 변비 등의 소화기 증상을 보이는 경우도 있으며, 만성질환 또는 면역 저하자의 경우 폐렴 또는 급성신부전 등의 합병증이 동반되어 사망에 이를 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. MERS - CoV 뉴클레오캡시드 N-말단 단편 및 C-말단 단편을 결합한 NC 융합 단백질의 제조

진단 키트 개발을 위한 항원으로 사용될 수 있는 MERS-CoV 뉴클레오캡시드 단백질의 서열을 정립하기 위하여, 뉴클레오캡시드 단백질의 구조를 분석하였다. 상기 구조 분석을 통해 안정한 형태의 2차 구조를 갖는 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노산 서열을 결정하였다. 이때, 상기 MERS-CoV(Human betacoronavirus 2cEMC/2012)의 뉴클레오캡시드 단백질(413개 아미노산)의 합성은 바이오니아에서 수행되었으며, 이의 염기서열은 서열번호 1에 나타내었다.

상기 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단 및 C-말단 도메인 단편을 결합한 뉴클레오캡시드 융합 단백질을 제조하기 위하여, 서열번호 4로 표시되는 MERS-CoV 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단 도메인의 아미노산 잔기 36-169를 코딩하는 뉴클레오티드를 pET28a 벡터의 NdeI과 BamHI 부위에 서브클론하고 대장균(Escherichia coli BL21(DE3) pLysS Rosetta) 균주를 이용하여 N-말단의 36-169 부분을 코딩하는 뉴클레오티드를 과발현하였다. 뉴클레오캡시드 단백질의 또 다른 부위로서 서열번호 6으로 표시되는 C-말단 도메인의 아미노산 잔기 246-362를 코딩하는 뉴클레오티드를 pET28a의 EcoRI과 XhoI 부위에 서브클론하고 대장균(Escherichia coli BL21(DE3) pLysS Rosetta) 균주를 사용하여 C-말단의 246-362 부분을 코딩하는 뉴클레오티드를 과발현하였다. 또는, N-말단의 36-169를 코딩하는 뉴클레오티드 및 C-말단의 246-362 부분을 코딩하는 뉴클레오티드를 각각 NdeI/BamHI 및 EcoRI/XhoI를 pET28a 벡터에 도입하였다.

각각의 단백질을 코딩하는 벡터를 대장균에 접종하여 OD 600 nm에서 0.2 mM의 IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) 시약을 넣고 18시간 동안 291K에서 배양하였다. 상기에서 사용된 대장균 발현 벡터 pET28a-MERS-CoV_NP_NC를 도 1에 나타내었다.

His-태그(tag)된 N-말단, C-말단 및 NC 융합 단백질은 니켈-친화성 크로마토그래피로 일차 정제하였다. NC 융합 단백질의 경우, 2배 농도의 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 사용하여 HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR 겔-여과 크로마토그래피로 한번 더 정제하였다. 상기 과정을 통해, 정제된 N-말단, C-말단 및 NC 융합 단백질 도메인을 얻었다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2a 내지 도 2c에 나타난 바와 같이, N-말단 도메인(a), C-말단 도메인(b) 및 NC 융합 단백질 도메인(c)이 SDS-PAGE 상에서 확인되었다. 또한, 도 2d에 나타난 바와 같이, 상기 각 도메인은 크로마토그래피에 의하여 순도 95% 이상으로 정제되었다. 이때, NC 융합 단백질 도메인의 염기 서열을 서열번호 7에 나타내었고, 이에 의해 제조되는 276개의 아미노산 서열을 서열번호 8에 나타내었다.

실험예 1. NC 융합 단백질의 항체 생성 확인

상기 실시예 1에서 제조된 NC 융합 단백질이 효과적으로 항체 생성을 유도하는지 여부를 확인하기 위하여, 이의 항체 생성 효과를 확인하였다.

먼저, 정제된 NC 융합 단백질 도메인의 항원을 마우스(코아텍, 한국)에 주사하기 전에 전-면역 혈청(pre-immune serum)을 채취하여 이를 음성 대조군으로 사용하였다). 일차적 면역화(Primary immunize)를 위하여 항원 100 ug을 프로인트 어주번트(freund's adjuvant)와 혼합하여 4마리의 마우스에 각각 근육주사하고, 2주 후 프로인트 어주번트와 혼합하여 1차 부스팅(boosting)을 진행하였다. 2주 후, 1차 혈액을 채취하여 ELISA 테스트 및 2차 부스팅을 진행하였다. 2주 후, 각 마우스를 채혈하고 최종 혈청을 분리하여 최종 ELISA 테스트를 수행하였다. 이때, ELISA 테스트에서 항원은 웰(well) 당 100 ng을 사용하였다. 또한, 면역 혈청은 1XPBS로 1:100 내지 1:1,000,000 비율로 희석하였고, 2차 확인을 위하여 항-마우스 IgG-HRP(ABC5001)을 1:5,000 비율로 희석하여 사용하였다. ELISA reader를 이용하여 광학 밀도 405 nm에서 발색을 검출하여 최종적으로 면역 항체 생성 여부를 확인하였으며, 이를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, NC 융합 단백질은 상기 실험에 사용한 4마리의 마우스에서 모두 면역 항체 형성 효과를 나타내었다. 이는 NC 융합 단백질 도메인이 개체 내에서 항원으로 작용하여 항체를 효과적으로 유도할 수 있다는 것을 의미한다. 이를 통해, MERS-CoV 감염을 진단하기 위한 항체를 제작하기 위해 NC 융합 단백질을 항원으로서 사용할 수 있음을 확인하였다.

실험예 2. NC 융합 단백질을 이용하여 개발한 MERS - CoV 진단 키트 및 시판 되고 있는 키트의 진단능 비교

상기 실시예 1에서 제조된 NC 융합 단백질을 이용하여 개발한 MERS-CoV 진단 키트의 우수성을 시판되고 있는 MERS-CoV 진단 키트와 비교하여 확인하였다.

400 ng의 NC 융합 단백질 항원을 코팅한 플레이트(plate)에 40배 희석한 인간 혈청을 이용하여 ELISA를 수행하였으며, 플레이트에 2차 항체 HRP conjugated goat anti-human IgG를 PBS와 1:100 (12 ug/ml)으로 희석하여 indirect ELISA을 수행하였다.

시판되고 있는 MERS-CoV 진단 키트로서 euroimmun사의 키트를 사용하였다. 상기 키트에 들어있는 항원이 코팅된 플레이트에 인간 혈청을 이용하여 제조사의 메뉴얼대로 ELISA를 수행하였으며, 제조사 프로토콜에 따라 키트에 들어있는 플레이트에 사람 혈청을 샘플 버퍼와 1:100으로 희석하여 ELISA를 수행하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, NC 융합 단백질 항원을 코팅한 플레이트를 이용하여 제작된 MERS-CoV 진단 키트가 시판되는 MERS-CoV 진단 키트인 euroimmun사의 키트에 비해 4배 정도 더 높은 진단능을 나타냈다. 이는 NC 융합 단백질 항원이 코팅된 플레이트를 이용한 MERS-CoV 진단 키트가 MERS-CoV 감염 초기 또는 회복기에 이르러 체내 바이러스의 양이 적은 환자에게서도 효과적인 진단이 가능함을 의미한다.

실험예 3. 인간 CoV NC 융합 단백질 항체의 교차반응성 확인

실험예 3.1. 인간 CoV NC 융합 단백질의 제조

MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-229E 및 HCoV-OC43 뉴클레오캡시드 단백질을 대장균 발현 시스템을 통해 제조하였다. 이때, SARS-CoV 뉴클레오캡시드 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있으며, 상기 단백질은 서열번호 10의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다. 또한, HCoV-229E 뉴클레오캡시드 단백질은 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있으며, 상기 단백질은 서열번호 12의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다. 또한, HCoV-OC43 뉴클레오캡시드 단백질은 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있으며, 상기 단백질은 서열번호 14의 염기서열에 의해 코딩될 수 있다. 상기 각 인간 CoV 뉴클레오캡시드 단백질의 전체 유전자를 pET28a 벡터의 NdeI 및 BamHI 부위에 서브클론한 후, 대장균(Escherichia coli BL21(DE3) pLysS Rosetta) 균주를 이용하여 각 인간 CoV 뉴클레오캡시드 단백질을 과발현 하였다. 이때, 상기 각각의 인간 CoV 뉴클레오캡시드 단백질을 과발현 및 정제하는 방법은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 상기 과정을 통해, SARS-CoV, HCoV-229E 및 HCoV-OC43 뉴클레오캡시드 단백질의 정제된 NC 융합 단백질 도메인을 수득하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-229E 및 HCoV-OC43 뉴클레오캡시드 단백질의 NC 융합 단백질 도메인은 크로마토그래피에 의하여 순도 95% 이상으로 정제되었다.

실험예 3.2. 인간 CoV 항체와의 교차반응성 측정

상기 실험예 3.1에서 수득한 MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-229E 및 HCoV-OC43 단백질의 NC 융합 단백질이 인간 CoV 항체와 교차반응성(cross activity)을 일으키는지 확인하였다. 구체적으로, 96 웰 플레이트 표면 코팅에 사용된 단클론 항체는 MERS-CoV 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단 특이 항체로, 100 ng/웰의 농도로 코팅하여 4℃, O/N 코팅 진행하였다. 코팅된 96 웰 플레이트는 PBST 버퍼로 1회 세척한 후, 2% BSA로 37℃에서 1시간 동안 블로킹(blocking) 진행하였다. 블로킹 진행 후, 정제된 MERS-CoV, SARS-CoV, HCoV-229E 및 HCoV-OC43 뉴클레오캡시드 재조합 단백질을 100 ng/웰 내지 0.8 ng/웰까지 2배 희석하여 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, PBST로 5분씩 3회 세척한 후 HRP 컨쥬게이션된 MERS-CoV 뉴클레오캡시드 C-말단 특이 단클론 항체를 200 ng/웰의 농도로 처리하여 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, PBST로 5분씩 5회 세척한 후, TMB 용액으로 발색 반응을 진행하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, SARS-CoV, HCoV-229E 및 HCoV-OC43 뉴클레오캡시드 단백질의 NC 융합 단백질과 다르게, MERS-CoV 뉴클레오캡시드 NC 융합 단백질은, 낮은 단백질 농도에서도 인간 CoV 항체와 교차 반응이 잘 이루어졌다. 이는 상기 항체가 MERS-CoV를 진단하기 위한 항체로서 사용할 수 있음을 의미한다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> NC FUSION PROTEIN COMPRISING N-TERMINUS DOMAIN FRAGMENTS AND C-TERMINUS DOMAIN FRAGMENTS OF MERS-COV NUCLEOCAPSID PROTEIN AND KIT FOR DIAGNOSING INFECTION OF MERS-COV USING THE SAME <130> FPD/201809-0026 <150> KR 10-2017-0124394 <151> 2017-09-26 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1242 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS-CoV nucleocapsid protein <400> 1 atggcatccc ctgctgcacc tcgtgctgtt tcctttgccg ataacaatga tataacaaat 60 acaaacctat ctcgaggtag aggacgtaat ccaaaaccac gagctgcacc aaataacact 120 gtctcttggt acactgggct tacccaacac gggaaagtcc ctcttacctt tccacctggg 180 cagggtgtac ctcttaatgc caattctacc cctgcgcaaa atgctgggta ttggcggaga 240 caggacagaa aaattaatac cgggaatgga attaagcaac tggctcccag gtggtacttc 300 tactacactg gaactggacc cgaagcagca ctcccattcc gggctgttaa ggatggcatc 360 gtttgggtcc atgaagatgg cgccactgat gctccttcaa cttttgggac gcggaaccct 420 aacaatgatt cagctattgt tacacaattc gcgcccggta ctaagcttcc taaaaacttc 480 cacattgagg ggactggagg caatagtcaa tcatcttcaa gagcctctag cttaagcaga 540 aactcttcca gatctagttc acaaggttca agatcaggaa actctacccg cggcacttct 600 ccaggtccat ctggaatcgg agcagtagga ggtgatctac tttaccttga tcttctgaac 660 agactacaag cccttgagtc tggcaaagta aagcaatcgc agccaaaagt aatcactaag 720 aaagatgctg ctgctgctaa aaataagatg cgccacaagc gcacttccac caaaagtttc 780 aacatggtgc aagcttttgg tcttcgcgga ccaggagacc tccagggaaa ctttggtgat 840 cttcaattga ataaactcgg cactgaggac ccacgttggc cccaaattgc tgagcttgct 900 cctacagcca gtgcttttat gggtatgtcg caatttaaac ttacccatca gaacaatgat 960 gatcatggca accctgtgta cttccttcgg tacagtggag ccattaaact tgacccaaag 1020 aatcccaact acaataagtg gttggagctt cttgagcaaa atattgatgc ctacaaaacc 1080 ttccctaaga aggaaaagaa acaaaaggca ccaaaagaag aatcaacaga ccaaatgtct 1140 gaacctccaa aggagcagcg tgtgcaaggt agcatcactc agcgcactcg cacccgtcca 1200 agtgttcagc ctggtccaat gattgatgtt aacactgatt ag 1242 <210> 2 <211> 546 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MERS-CoV nucleocapsid protein <400> 2 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 35 40 45 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 50 55 60 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 85 90 95 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 100 105 110 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 130 135 140 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 145 150 155 160 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 165 170 175 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 180 185 190 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 195 200 205 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 210 215 220 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 225 230 235 240 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 245 250 255 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 275 280 285 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 290 295 300 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 305 310 315 320 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 325 330 335 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 340 345 350 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 355 360 365 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 370 375 380 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 385 390 395 400 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 405 410 415 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 420 425 430 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 435 440 445 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 450 455 460 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 465 470 475 480 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 485 490 495 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 500 505 510 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 515 520 525 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 530 535 540 Ala Ala 545 <210> 3 <211> 546 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminus of MERS-CoV nucleocapsid protein <400> 3 atgggcagca gccatcatca ttatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60 atggcaccaa ataacactgt ctcttggtac actgggctta cccaacacgg gaaagtccct 120 cttacctttc cacctgggca gggtgtacct cttaatgcca attccacccc tgcgcaaaat 180 gctgggtatt ggcggagaca ggacagaaaa attaataccg 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Phe Gly Met Ser Arg 305 310 315 320 Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly 325 330 335 Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Gln Phe Lys Asp Asn Val Ile 340 345 350 Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu 355 360 365 Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro 370 375 380 Gln Arg Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp 385 390 395 400 Met Asp Asp Phe Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser 405 410 415 Ala Asp Ser Thr Gln Ala 420 <210> 10 <211> 1269 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV nucleocapsid protein <400> 10 atgtctgata atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga 60 cccacagatt caactgacaa taaccagaat ggaggacgca atggggcaag gccaaaacag 120 cgccgacccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcacagctct cactcagcat 180 ggcaaggagg aacttagatt ccctcgaggc cagggcgttc caatcaacac caatagtggt 240 ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc 300 aaaatgaaag 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aaagaagcag cccactgtga ctcttcttcc tgcggctgac 1200 atggatgatt tctccagaca acttcaaaat tccatgagtg gagcttctgc tgattcaact 1260 caggcataa 1269 <210> 11 <211> 389 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCoV-229E nucleocapsid protein <400> 11 Met Ala Thr Val Lys Trp Ala Asp Ala Ser Glu Pro Gln Arg Gly Arg 1 5 10 15 Gln Gly Arg Ile Pro Tyr Ser Leu Tyr Ser Pro Leu Leu Val Asp Ser 20 25 30 Glu Gln Pro Trp Lys Val Ile Pro Arg Asn Leu Val Pro Val Asn Lys 35 40 45 Lys Asp Lys Asn Lys Leu Ile Gly Tyr Trp Asn Val Gln Lys Arg Phe 50 55 60 Arg Thr Arg Lys Gly Lys Arg Val Asp Leu Ser Pro Lys Leu His Phe 65 70 75 80 Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro His Lys Asp Ala Lys Phe Arg Glu Arg 85 90 95 Val Glu Gly Val Val Trp Val Ala Val Asp Gly Ala Lys Thr Glu Pro 100 105 110 Thr Gly Tyr Gly Val Arg Arg Lys Asn Ser Glu Pro Glu Ile Pro His 115 120 125 Phe Asn Gln Lys Leu Pro Asn Gly Val Thr Val Ala Glu Glu Pro Asp 130 135 140 Ser Arg Ala Pro Ser Arg Ser Gln Ser Arg Ser Gln Ser Arg Ser Arg 145 150 155 160 Val Glu 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Glu Pro Val Arg Asp Glu Val Ser Ile Glu Thr Asp Ile 370 375 380 Ile Asp Glu Val Asn 385 <210> 12 <211> 1170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCoV-229E nucleocapsid protein <400> 12 atggctacag tcaaatgggc tgatgcatct gaaccacaac gtggtcgtca gggtagaata 60 ccttactctc tttatagccc tttgcttgtt gatagtgaac aaccttggaa ggtgatacct 120 cgtaatttgg tacccgtcaa caagaaagac aaaaataagc ttataggcta ttggaatgtt 180 caaaaacgtt tcagaactag aaagggcaaa cgggtggatt tgtcacccaa gttacatttc 240 tattatcttg gcacaggacc tcataaagat gcaaaattta gagagcgtgt tgaaggtgtt 300 gtctgggttg ctgttgatgg tgctaaaact gaacctacag gttacggtgt taggcgcaag 360 aattcagaac cagagatacc acacttcaat caaaagctcc caaatggtgt tactgttgct 420 gaagaacctg actcccgtgc tccttcccgt tctcagtcaa ggtctcagag tcgcagtcgt 480 gttgaatcca aatctcaatc tcgtaatcct tcaagtgaca gaaaccataa cagtcaggat 540 gacatcatga aggcagtcgc tgcggctctt aaatctttag gttttgacaa gcctcaggaa 600 aaagacaaaa agtcagcgaa aacgggtacc cctaagcctt ctcgtaatca gagtcctgct 660 tcttctcaat ctgctgccaa gattcttgct 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Gln Lys Gly Lys Glu Phe Glu Phe 65 70 75 80 Ala Glu Gly Gln Gly Val Pro Ile Ala Pro Gly Val Pro Ala Thr Glu 85 90 95 Ala Lys Gly Tyr Trp Tyr Arg His Asn Arg Arg Ser Phe Lys Thr Ala 100 105 110 Asp Gly Asn Gln Arg Gln Leu Leu Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu 115 120 125 Gly Thr Gly Pro His Ala Lys Asp Gln Tyr Gly Thr Asp Ile Asn Gly 130 135 140 Val Tyr Trp Val Ala Ser Asn Gln Ala Asp Val Asn Thr Pro Ala Asp 145 150 155 160 Ile Val Asp Arg Asp Pro Ser Ser Asp Glu Ala Ile Pro Thr Arg Phe 165 170 175 Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Gln Gly Tyr Tyr Ile Glu Gly Ser Gly 180 185 190 Arg Ser Ala Pro Asn Ser Arg Ser Thr Ser Arg Thr Ser Ser Arg Ala 195 200 205 Ser Ser Ala Gly Ser Arg Ser Arg Ala Asn Ser Gly Asn Arg Thr Pro 210 215 220 Thr Ser Gly Val Thr Pro Asp Met Ala Asp Gln Ile Ala Ser Leu Val 225 230 235 240 Leu Ala Lys Leu Gly Lys Asp Ala Thr Lys Pro Gln Gln Val Thr Lys 245 250 255 His Thr Ala Lys Glu Val Arg Gln Lys Ile Leu Asn Lys Pro Arg Gln 260 265 270 Lys Arg Ser Pro Asn Lys Gln Cys Thr Val Gln Gln Cys Phe Gly Lys 275 280 285 Arg Gly Pro Asn Gln Asn Phe Gly Gly Gly Glu Met Leu Lys Leu Gly 290 295 300 Thr Ser Asp Pro Gln Phe Pro Ile Leu Ala Glu Leu Ala Pro Thr Ala 305 310 315 320 Gly Ala Phe Phe Phe Gly Ser Lys Leu Glu Leu Ala Lys Val Gln Asn 325 330 335 Leu Ser Gly Asn Pro Asp Glu Pro Gln Lys Asp Val Tyr Glu Leu Arg 340 345 350 Tyr Asn Gly Ala Ile Arg Phe Asp Ser Thr Leu Ser Gly Phe Glu Thr 355 360 365 Ile Met Lys Val Leu Ser Glu Asn Leu Asn Ala Tyr Gln Gln Gln Asp 370 375 380 Gly Met Met Asn Met Ser Pro Lys Pro Gln Arg Gln Arg Gly His Lys 385 390 395 400 Asn Gly Gln Gly Glu Asn Asp Asn Ile Ser Val Ala Val Pro Lys Ser 405 410 415 Arg Val Gln Gln Asn Lys Ser Ile Glu Leu Thr Ala Glu Asp Ile Ser 420 425 430 Leu Leu Lys Lys Met Asp Glu Pro Phe Thr Glu Asp Thr Ser Glu Ile 435 440 445 <210> 14 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCoV-OC43 nucleocapsid protein <400> 14 atgtctttta ctcctggtaa gcaatccagt agtagagcgt cctctggaaa tcggtctggt 60 aatggcatcc tcaagtgggc cgatcagtcc gaccagttta gaaattttca aaccaggggt 120 agaagagctc aacccaagca aactgctact tctcagcaac catcaggagg gaatgttgta 180 ccccactatt cttggttctc tggaattact cagtttcaaa agggaaagga gtttgagttt 240 gcagaaggac aaggtgtgcc tattgcacca ggagtcccag ctactgaagc taaggggtac 300 tggtacagac acaacagacg ttcttttaaa acagccgatg gcaaccagcg tcaactgctg 360 ccacgatggt atttttacta tctgggaacc ggaccgcatg ctaaagacca gtatggcacc 420 gatattaacg gagtctactg ggtcgctagc aaccaggctg atgtcaatac cccggctgac 480 attgtcgatc gggacccaag tagcgatgag gctattccga ctaggtttcc gcctggcacg 540 gtactccctc agggttacta tattgaaggc tcaggaaggt ctgctcctaa ttccagatct 600 acttcgcgca catccagcag agcctctagt gcaggatcgc gtagtagagc caattctggc 660 aatagaaccc ctacctctgg tgtaacacct gacatggctg atcaaattgc tagtcttgtt 720 ctggcaaaac ttggcaagga tgccaccaaa cctcagcaag taactaagca tactgccaaa 780 gaagtcagac agaaaatttt gaataaaccc cgccagaaga ggagccccaa taaacaatgc 840 actgttcagc agtgttttgg taagagaggc cctaatcaga attttggtgg tggagaaatg 900 ttaaaacttg gaactagtga cccacagttc cccattcttg cagaactcgc acccacagct 960 ggtgcgtttt tctttggatc aaaattagag ttggccaaag tgcagaattt atctgggaat 1020 cctgatgagc ctcagaagga tgtttatgaa ttgcgctata acggcgcaat taggtttgac 1080 agtacacttt caggctttga gaccataatg aaggtgctga gtgagaattt gaatgcctat 1140 caacaacaag atggtatgat gaatatgagt ccaaaaccac agcgtcagcg tggtcataag 1200 aatggacaag gagaaaatga taatataagt gttgcagtgc ccaaaagccg cgtgcagcaa 1260 aataagagta tagagttgac tgcagaggac atcagccttc ttaagaagat ggatgagccc 1320 tttactgaag acacctcaga aatataa 1347

Claims

메르스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 N-말단 도메인 단편 및 C-말단 도메인 단편을 포함하는 NC 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 N-말단 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는, NC 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 N-말단 도메인 단편은 서열번호 4의 36번 위치의 아미노산부터 169번 위치의 아미노산 서열 중 50개 내지 134개의 연속된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, NC 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 C-말단 도메인은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는, NC 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 C-말단 도메인 단편은 서열번호 6의 246번 위치의 아미노산부터 362번 위치의 아미노산 서열 중 50개 내지 117개의 연속된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, NC 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 NC 융합 단백질은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, NC 융합 단백질.
제6항에 있어서,
상기 NC 융합 단백질은 서열번호 7의 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는, NC 융합 단백질.
제1항에 따른 NC 융합 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론 항체.
제1항의 NC 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제9항의 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포.
제10항의 형질감염된 숙주세포로부터 NC 융합 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 NC 융합 단백질 제조방법.
(a) 제1항 내지 제7항에 따른 융합 단백질을 항원으로서 실험동물에 주입하여 면역반응을 유도하는 단계; 및
(b) 상기 (a)단계의 실험동물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는 메르스 코로나바이러스 항체 제조 방법.
제1항에 따른 NC 융합 단백질을 포함하는 메르스 코로나바이러스 감염 진단용 키트.
제13항에 따른 진단용 키트에 진단 대상으로부터 분리한 시료를 첨가하는 단계를 포함하는 메르스 코로나바이러스 감염 정보제공 방법.