CN110872614A - 基于Cas12a/gRNA的快速鉴定分枝杆菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于Cas12a/gRNA的快速鉴定分枝杆菌的方法，包括以下步骤：S1:进行菌种的培养；S2:gRNA探针的设计与制备；S3:DNA制备与PCR扩增；S4：采用FnCas12a/gRNA进行切割，进行荧光检测，从而区分出分枝杆菌。本申请基于Cas12a/gRNA的平台来鉴定MTB和大多数NTM物种。通过设计针对rpoB序列的物种特异性gRNA探针，基于Cas12a/gRNA的平台成功地鉴定了MTB和六种主要NTM物种无交叉反应。采用盲法，73株临床分离的分枝杆菌中有72株被正确鉴定，与以往rpoB测序结果一致。这些结果表明，基于Cas12a/gNRA的平台是快速、准确和经济有效地鉴定MTB和NTM物种的一个有希望的工具。

Description

基于Cas12a/gRNA的快速鉴定分枝杆菌的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于Cas12a/gRNA的快速鉴定分枝杆菌的方法。

背景技术

结核病是十大死亡原因之一，也是单一传染源(高于艾滋病毒/艾滋病)的主要原因。每年仍有数百万人因肺结核而患病。世界卫生组织(世卫组织)的一份报告显示，2017年，结核病估计造成130万人死亡，1000万人患上结核病。近年来，NTM病的发病率和流行率在世界范围内持续上升。尽管NTM疾病的致病因子因地理位置而异，但最常见的肺部NTM病原体是脓肿分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和戈登分枝杆菌。NTM和MTB感染的临床症状往往非常相似。然而，分枝杆菌的种类在治疗效果和抗生素敏感性方面存在显著差异，严重阻碍了结核分枝杆菌和结核分枝杆菌引起的疾病的诊断和治疗。控制分枝杆菌感染最有效的策略是早期诊断和治疗。因此，建立快速、准确地检测和鉴定感染分枝杆菌的方法，对特异性化疗和更好的病人管理具有重要意义。

MTB和NTM的鉴别主要依靠实验室诊断。微生物实验室常规病原学方法复杂、费时费力，特异性和敏感性差，不利于临床治疗的及时指导。近几十年来，分子诊断方法的引入克服了这些缺点，使分枝杆菌的直接检测方法有了显著的改进。为了从临床标本和培养物中鉴定结核分枝杆菌和结核分枝杆菌，人们开发了多种分子技术。主要包括多重PCR、实时PCR、DNA探针分析、PCR限制性片段长度多态性(RFLP)分析、靶基因序列和微阵列技术。其中，微阵列技术能够在短时间内同时分析成千上万个基因，对系统发育分析和物种鉴定具有重要的意义，因此受到了广泛的关注。然而，这些技术大多不具有成本效益，其中一些需要昂贵的设备。此外，这些检测方法大多仅用于检测或定量某些分枝杆菌物种，如结核分枝杆菌，或检测耐药性。

Cas12a(Cpf1)首先被张峰群鉴定为RNA引导的核酸内切酶，能直接结合和切割靶DNA。最近，两个独立的研究小组发现Cas12a具有反式切割DNA活性。这一酶切活性立即发展成为两种基于Cas12a的核酸检测方法，称为HOLMES和DETECTR。两种平台均能实现单碱基分辨的aM级灵敏度。在这里，通过设计多种物种特异性的gRNA探针，我们试图建立基于Cas12a/gRNA的平台快速准确地识别MTB和最常见的NTM物种(脓肿分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌和偶发分枝杆菌)。

发明内容

针对上述技术中存在的不足之处，本发明提供一种基于Cas12a/gRNA的快速鉴定分枝杆菌的方法，能够对MTB和六种主要NTM物种进行快速鉴别，从而对结核分枝杆菌的早期诊断、治疗提供重要帮助。

为实现上述目的，本发明提供一种基于Cas12a/gRNA的快速鉴定分枝杆菌的方法，包括以下步骤：

S1:进行菌种的培养；

S2:gRNA探针的设计与制备；

S3:DNA制备与PCR扩增；

S4：采用FnCas12a/gRNA进行切割，进行荧光检测，从而区分出分枝杆菌。

作为优选，在步骤S1中，将多种不同类型的分歧杆菌均培养在7H9液体培养基中，温度设定在35-40℃进行孵育。

作为优选，在步骤S2中，采用分枝杆菌中的rpoB基因作为gRNA探针的靶序列，基于分枝杆菌中的rpoB基因的差异性设计物种特异性gRNA探针，且每一种分枝杆菌均设计两种特异性gRNA探针，然后使用RNA转录试剂盒通过体外转录制备gRNA探针。

作为优选，针对gRNA探针的靶序列两侧的保守序列，设计一个通用的扩增靶序列的引物对。

作为优选，在步骤S3中，进行DNA的提取制备根据天根细菌DNA提取试剂盒说明书或者热消煮法提取DNA；然后以提取的DNA为模板对ropB靶基因进行PCR扩增，PCR扩增方法为：94℃3min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，72℃5min，4℃冷却，然后用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

作为优选，利用FnCas12a/gRNA进行识别切割，在37℃反应1小时，然后添加2ul的0.25M EDTA终止反应，在激发光波长为535nm，发射光波长为560nm的条件下检测荧光，根据荧光的强弱鉴别出不同的分枝杆菌。

本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明采用了一个基于Cas12a/gRNA的平台来鉴定MTB和大多数NTM物种。通过设计针对rpoB序列的物种特异性gRNA探针，基于Cas12a/gRNA的平台成功地鉴定了MTB和六种主要NTM物种(脓肿分枝杆菌(MAB)、胞内分枝杆菌(MIN)、鸟分枝杆菌(MAV)、堪萨斯分枝杆菌(MKA)，戈登分枝杆菌(MGO)和偶发分枝杆菌(MFO)无交叉反应。采用盲法，73株临床分离的分枝杆菌中有72株被正确鉴定，与以往rpoB测序结果一致。这些结果表明，基于Cas12a/gNRA的平台是快速、准确和经济有效地鉴定MTB和NTM物种的一个有希望的工具。

附图说明

图1为基于rpoB序列的物种特异性gRNA探针设计；

图2为扩增靶序列序列表；

图3为基于FnCas12a/gRNA的分枝杆菌鉴定平台示意图；

图4为FnCas12a/gRNA平台检测下限；

图5为临床试验检测结果。

具体实施方式

为了更清楚地表述本发明，下面结合附图对本发明作进一步地描述，但是实施例并不对本发明做任何形式的限定。对于本领域的技术人员来说，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代的技术手段，在没有付出任何创造性的劳动下，均包含在本发明的保护范围之内。

首先从医院分离得到结核分枝杆菌10株、脓肿分枝杆菌15株、胞内分枝杆菌15株、鸟分枝杆菌10株、偶发分枝杆菌10株、堪萨斯分枝杆菌7株和戈登分枝杆菌6株，且经rpoB测序验证。，这些分枝杆菌分别与中国疾病预防控制中心提供结核分枝杆菌H37Rv、脓肿分枝杆菌ATCC 19977、胞内分枝杆菌ATCC 13950、鸟分枝杆菌ATCC 25291、堪萨斯分枝杆菌ATCC12478、戈登分枝杆菌ATCC 14470、偶发分枝杆菌ATCC 6841等7株参考菌株由中国疾病预防控制中心赠送。所有菌株培养在7H9液体培养基中，37℃孵育。大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肠炎沙门氏菌和肺炎克雷伯菌从深圳市第三人民医院获得，并在血琼脂平板上培养。

请参阅图1和图2，由于rpoB基因已被报道为区分分枝杆菌菌种的合适位点，所以选择它作为设计gRNA探针的靶序列。结核分枝杆菌H37Rv和最常见的NTM(脓肿分枝杆菌ATCC 19977，胞内分枝杆菌ATCC 13950，鸟分枝杆菌ATCC 25291，堪萨斯分枝杆菌ATCC12478，戈登分枝杆菌ATCC 14470和偶发分枝杆菌ATCC 6841)的rpoB基因序列可从NCBI(https://www.NCBI.nlm.nih.gov/)下载。利用DNAMAN 8软件对rpoB基因序列进行多重比对(保守序列标记为黑色；红色框表示gRNA探针的目标区域；绿色方框代表FnCas12a蛋白识别基序用箭头指示扩增rpoB片段的通用引物)基于rpoB基因的差异区域设计了物种特异性gRNA探针。我们为每种分枝杆菌设计了两种特异性的gRNA探针，除了偶发分枝杆菌。基于gRNA探针靶向区域两侧的保守序列，设计了一个通用的扩增靶序列的引物对(RpoB-F和RpoB-R)。使用T7高产RNA转录试剂盒(诺唯赞，南京，中国)通过体外转录制备gRNA探针。由生工生物科技有限公司合成gRNA转录的DNA模板，用VAHTS RNA清洁珠(诺唯赞，南京，中国)纯化转录RNA，并用NanoDrop 2000进行定量。

针对DNA制备与PCR扩增，首先DNA的提取根据天根细菌DNA提取试剂盒说明书或者简单的热消煮法提取DNA。DNA浓度测量使用Qubit dsDNAHS Assay Kit(赛默飞，马萨诸塞州，美国)。使用上述通用引物对rpoB靶基因进行PCR扩增。PCR方法为：94℃3min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，72℃5min，4℃冷却，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR产物浓度使用Qubit dsDNA HS Assay Kit(赛默飞，马萨诸塞州，美国)测量。

采用安徽吐露港生物科技有限公司生产的重组的FnCas12a蛋白成品，FnCas12a的识别切割特征基序是“TTN”。FnCas12/gRNA切割实验体系如下：

在37℃的条件下反应1小时，然后添加2ul的0.25M EDTA终止反应，在激发光波长为535nm，发射光波长为560nm的条件下检测荧光，以无靶基因的反应作为荧光背景值进行试验，根据荧光强度将多种分枝杆菌进行区分；其原理是用PCR扩增靶DNA，然后与FnCas12a、gRNA探针和猝灭荧光报告ssDNA孵育；如果反应混合物中的物种特异性gRNA探针检测到目标DNA，则FnCas12a/gRNA/靶DNA三元复合物的形成会反式切割报告者ssDNA，显示荧光，从而将分枝杆菌进行区分。

此外，针对所述使用的gRNA探针的特异性和检测下限也进行了测定，利用7株分枝杆菌参考菌株和大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼氏菌、肠炎链球菌和肺炎克雷伯菌细菌对gRNA探针的特异性进行评估。PCR扩增rpoB片段后，用1ul未纯化的PCR产物，进行FnCas12a/gRNA切割实验，检测gRNA探针的特异性和检测下限。请参阅图3，其中1-7分别代表结核分枝杆菌H37Rv、脓肿分枝杆菌(ATCC 19977)、胞内分枝杆菌(ATCC 13950)、鸟分枝杆菌(ATCC25291)、堪萨斯分枝杆菌(ATCC 12478)、戈登分枝杆菌(ATCC 14470)和偶发分枝杆菌(ATCC6841)；8-12分别代表大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼菌、肠炎链球菌和肺炎克雷伯菌；误差线表示平均值±标准差，其中n＝3个技术重复。从图3所示的荧光检测结果来看，每一个设计的gRNA探针只能识别特定的分枝杆菌物种，没有出现交叉反应。从图4所示的荧光检测

请参阅图4；为了确定以上检测方法能实际应用于临床上对分枝杆菌进行分离，采用盲法检测73株临床分离菌，包括10株结核分枝杆菌、15株脓肿分枝杆菌、15株胞内分枝杆菌、10株禽流感分枝杆菌、7株堪萨斯分枝杆菌、10株戈尔多纳分枝杆菌和6株偶然分枝杆菌，以确定基于FnCas12a/gRNA平台鉴定主要分枝杆菌的可行性。每次试验均以大肠杆菌作为阴性对照。检测结果显示：73个临床菌株中的72个得到了正确的鉴定，显示与之前的rpoB测序结果几乎一致。

本发明的优势在于：

1)采用基于FnCas12a/gRNA的检测平台对分枝杆菌鉴定,方法操作简单，无需昂贵的设备，有助于在贫困国家和地区推广应用；整个过程在3h内完成，根据荧光强度可方便直观地读出实验结果。

以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 深圳市第三人民医院

<120> 基于Cas12a/gRNA的快速鉴定分枝杆菌的方法

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

<210> 2

<211> 3

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

<210> 3

<211> 3

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

<210> 4

<211> 3

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

<210> 5

<211> 3

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

<210> 6

<211> 3

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

<210> 7

<211> 3

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 7

<210> 8

<211> 3

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 8

<210> 9

<211> 3

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 9

<210> 10

<211> 3

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 10

<210> 11

<211> 3

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 11

<210> 12

<211> 3

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 12

<210> 13

<211> 3

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 13

<210> 14

<211> 3

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 14

<210> 15

<211> 3

<212> RNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 15

Claims (6)

1.一种基于Cas12a/gRNA的快速鉴定分枝杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1:进行菌种的培养；

S2: gRNA探针的设计与制备；

S3: DNA制备与PCR扩增；

S4：采用FnCas12a/gRNA进行切割，进行荧光检测，从而区分出分枝杆菌。

2.根据权利要求1所述的基于Cas12a/gRNA的快速鉴定分枝杆菌的方法，其特征在于，在步骤S1中，讲多种不同类型的分歧杆菌均培养在7H9液体培养基中，温度设定在35-40℃进行孵育。

3.根据权利要求1所述的基于Cas12a/gRNA的快速鉴定分枝杆菌的方法，其特征在于，在步骤S2中，采用分枝杆菌中的rpoB基因作为gRNA探针的靶序列，基于分枝杆菌中的rpoB基因的差异性设计物种特异性gRNA探针，且每一种分枝杆菌均设计两种特异性gRNA探针。

4.根据权利要求3所述的基于Cas12a/gRNA的快速鉴定分枝杆菌的方法，其特征在于，针对gRNA探针的靶序列两侧的保守序列，设计一个通用的扩增靶序列的引物对，然后使用RNA转录试剂盒通过体外转录制备gRNA探针。

5.根据权利要求1所述的基于Cas12a/gRNA的快速鉴定分枝杆菌的方法，其特征在于，在步骤S3中，进行DNA的提取制备根据天根细菌DNA提取试剂盒说明书或者热培养的菌株中提取DNA；然后使用该DNA对ropB靶基因进行PCR扩增，PCR扩增方法为：94°C3min，94°C30s，60°C30s，72°C30s，72°C5min，在4°C下冷却，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

6.根据权利要求1所述的基于Cas12a/gRNA的快速鉴定分枝杆菌的方法，其特征在于，利用FnCas12a/gRNA进行识别切割，在37℃反应1小时，然后添加2ul的0.25M EDTA终止反应，在激发光波长为535nm，发射光波长为560nm的条件下检测荧光，从而鉴别出不同的分枝杆菌。

Images