CN1351176A - 诊断结核杆菌及其耐药性的dna芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诊断结核杆菌及其耐药性的DNA芯片。它是在玻片、硅片、膜、高分子材料载体上固定W1:AGG AGT TCT TCG GCA、W2:AGC CAG CTG AGCCAA……M2:AGC CAG CCG AGC CAA、M3:AGC CAG CGGAGC CAA等12～100个DNA探针。本发明可提高诊断效率和诊断准确性、降低检测成本、缩短诊断时间,能与结核杆菌的RNA聚合酶β次单元的野生型及耐药性突变型的序列进行特异性杂交,本发明可以同时检测结核杆菌的存在及约90%与耐药性相关的基因突变。
Description
本发明涉及一种诊断结核杆菌及其耐药性的DNA芯片。
结核杆菌引致的结核病已重新出现为一重要传染病。每年世界各地共有大约3000万人受感染发病，因此病死亡人数高达200万。第一线抗结核药，包括利福平、异烟肼、吡秦酰胺、乙烯二氨基二丁醇、链霉素，一般能有效治疗结核病，但病人需连续服药六至八个月达多种药，不良的副作用可使病人不能完成指定的疗程，引致耐药结核杆菌的出现，最後治疗失败。这种情况可部分导致多耐药株的出现。自90年代初，结核菌多耐药株的报告渐有增加，尤其是从对爱滋病毒抗体呈阳性的欧美病人群中。
结核菌多耐药株爆发经常导致高死亡率，因此快速诊断结核菌的耐药性是必须的。当病人被诊断已被结核菌感染，应及早开始葯物治疗可防止并发症或减低传染其他人的机会。药物敏性测试可帮助医生选择最有效抗结核药及评估病人对治疗的反应，但目前结核菌药敏实验涉及培养生长很慢的结核菌，需时一至两个星期。
有些结核菌的基因DNA突变产生抗结核药耐药性已被证明。例如，超过30种突变在rpoB基因中段已被查出(见表1、图1)，约97％的耐利福平结核菌与这些突变有关连，这些突变减少利福平和细菌RNA聚合酶的粘合，产生对利福平耐药。利福平耐药性表面上与多耐药性结核菌有关连，故利福平耐药性可能可以用作多耐药性结核菌的标志。
DNA芯片技术适用突变的检验，一个芯片能用时容纳许多个探针，当和PCR扩增技术结合，根据芯片检查结核菌的药敏实验不同于传统的结核菌药敏实验，可不需要培养生长慢的结核菌。最近有报告高密度DNA芯片用作测试结核菌利福片耐药性，这芯片用光刻导向合成技术制作，但该技术制作成本高，不利於一般临床使用，本发明则利用机器人点样系统来制造芯片。
DNA芯片技术是一种高度集成的DNA检测技术。首先采用专用自动化设备将已知DNA寡核苷酸探针排列在玻片或硅片上，然後将待检测样本中的所有DNA成分与芯片探针杂交，有相对应的靶DNA就会出现相应的杂交信号。理论上可以做到一次实验检测多个基因。
DNA芯片技术的设想可追溯到90年代初，美国Affymetrix公司首先开始这方面的研究(http：//www.affymetrix.com)。由於这项技术的广泛的应用前景以及巨大的经济效益，目前美国的斯坦福大学、美国橡树岭国家实验室、Incyte商业公司和Hyseq公司、德国的自动化公司(http：//www.mpimg-berlin-dahlem.mpg.de/~autom)、都在进行全力研究，竞争市场份额。国内也有单位开始跟进了DNA芯片的研究。
本发明的目的是提供一种可提高诊断效率和诊断准确性、降低检测成本、缩短诊断时间的诊断结核杆菌及其耐药性的DNA芯片。
为了达到上述目的，本发明采取下列措施：
诊断结核杆菌及其耐药性的DNA芯片是在玻片、硅片、膜、高分子材料载体上固定DNA探针，所说的探针为：
W1 AGG AGT TCT TCG GCA
W2 AGC CAG CTG AGC CAA
W3 CAG CTG AGC CAA TTC
W4 GCT GAG CCA ATT CAT
W5A GCC AAT TCA TGG ACCA
W6 TTC ATG GAC CAG AAC
W7 CCC GCT GTC GGG GTT
W8 GGG TTG ACC CAC AAG
W9 TTG ACC CAC AAG CGC
W10 AAG CGC CGA CTG TCG
W11 CGA CTG TCG GCG CTG
W12 TCG GCG CTG GGG CCC
M2 AGC CAG CCG AGC CAA
M3 AGC CAG CGG AGC CAA
M4 CAG CTG ACC CAA TTC
M5 GCT GAG CGA ATT CAT
M7 CTG AGC CCA TTC ATG
M8 CTG AGC CTA TTC ATG
M9 AGC CAA TTC TTC ATG
M10 GCC AAT TCA TGT TCA
M11 CTG AGC CTG GAC CAG
M12 CTG AGC CAC CAG AAC
M13 ATT CAT GAA CAA CCC
M14 GGA CCA GAA CCC GCT
M15 CCA ATT CGT GGA CCA
M16 ATT CAT GTA CCA GAA
M17 TTC ATG GTC CAG AAC
M18 TTC ATG GCC CAG AAC
M20 ATT CAT GAA CCA GAA
M22 CCC GCT GCA GGG GTT
M26 GTT GAC CAC CAA GCG
M27 TTG ACC CCC AAG CGC
M28 TTG ACC CGC AAG CGC
M29 TTG ACC CTC AAG CGC
M30 TTG ACC TGC AAG CGC
M31B GTT GAC CTA CAA GC
M32D TTG ACC GAC AAG CG
M34 AAG CGC CAA CTG TCG
M35E GAC TGT TGG CGC T
M37 CGA CTG TGT GCG CTG
M38 TCG GCG CCG GGG CCC
本发明可提高诊断效率和诊断准确性、降低检测成本、缩短诊断时间，能与结核杆菌的RNA聚合酶β次单元的野生型及耐药性突变型的序列进行特异性杂交，本发明可以同时检测结核杆菌的存在及约90％与耐药性相关的基因突变(见图2)。
下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。
图1是RNA聚合酶β次单位基因示意图；
图2是结核杆菌rpoB基因非突变探针和突变探针DNA序列示意图；
图3是显示菌种有S531L突变的杂交结果示意图。
本发明总结分析了至目前为止已知RNA聚合酶β次单位突变基因的序列，根据DNA序列特异性识别的原理设计这些突变的DNA探针。每个探针依据杂交动力学数据，其长度设定在15碱基左右。这些寡核苷酸探针在合成时进行5’端活性基团标记以及活性基团与探针之间的连拉臂。在DNA芯片制备时，利用我们已组装的三维DNA点样装置将探针按一定规律排列在载体玻片或硅片上，经过固定和相关处理後可以进行下列杂交检测。杂交之前必须进行被检测DNA的标记。标记可采取直接标记法如将萤光物质标记的核苷酸类似物合成进DNA分子，或采取萤光标记的PCR引物扩增样品中的相关DNA序列。杂交时，将被标记的DNA分子与DNA芯片共同孵育杂交。应用芯片专用扫描仪进行杂交信号的检测。根据各人探针位点的萤光信号的强弱，可确定突变有没有发生。
为了DNA探针能有效地固定在玻片上，通常在DNA探针合成後进行DNA探针5’末端活性基团的标记，这些活性基团有胺基(NH2)、巯基(SH)和羧基(COOH)等，固定DNA的玻片也需进行活化处理。通常进行活化处理使之表面带有醛基或氨基，可以与DNA探针形成共价键。在直接寡核苷酸DNA探针的固定中，先将DNA探针用消毒双蒸水稀释至200pmol/μl和等量1.0M 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC)and 1.0MN-Hydroxysuccinimide(NHS)混合，进行点样。在进行杂交时，先将合成的已知序列DNA探针固定在芯片的相应位置，然後将待检DNA样本进行萤光标记，再与DNA芯片杂交，因此可以同时检测多个基因序列。这种方法是一种反向杂交技术。杂交信号检测可以通过专用激光扫描仪进行检测。扫描获得的图像，用芯片图像专用分析软件分析每个基因的杂交信号的强弱，从而查明结核杆菌是否存在及突变有没有发生。实施例1)探针的遴选
试验之探针估计可覆盖超过90％与结核杆菌耐药性相关的DNA突变之总数目。探针的长度一般是在15个碱基左右。这些基因探针序列如下(不含各种阳性、阴性和空白对照基因探针)。
编号名称标记连接臂
W1 AGG AGT TCT TCG GCA
W2 AGC CAG CTG AGC CAA
W3 CAG CTG AGC CAA TTC
W4 GCT GAG CCA ATT CAT
W5A GCC AAT TCA TGG ACCA
W6 TTC ATG GAC CAG AAC
W7 CCC GCT GTC GGG GTT
W8 GGG TTG ACC CAC AAG
W9 TTG ACC CAC AAG CGC
W10 AAG CGC CGA CTG TCG
W11 CGA CTG TCG GCG CTG
W12 TCG GCG CTG GGG CCC
M2 AGC CAG CCG AGC CAA
M3 AGC CAG CGG AGC CAA
M4 CAG CTG ACC CAA TTC
M5 GCT GAG CGA ATT CAT
M7 CTG AGC CCA TTC ATG
M8 CTG AGC CTA TTC ATG
M9 AGC CAA TTC TTC ATG
M10 GCC AAT TCA TGT TCA
M11 CTG AGC CTG GAC CAG
M12 CTG AGC CAC CAG AAC
M13 ATT CAT GAA CAA CCC
M14 GGA CCA GAA CCC GCT
M15 CCA ATT CGT GGA CCA
M16 ATT CAT GTA CCA GAA
M17 TTC ATG GTC CAG AAC
M18 TTC ATG GCC CAG AAC
M20 ATT CAT GAA CCA GAA
M22 CCC GCT GCA GGG GTT
M26 GTT GAC CAC CAA GCG
M27 TTG ACC CCC AAG CGC
M28 TTG ACC CGC AAG CGC
M29 TTG ACC CTC AAG CGC
M30 TTG ACC TGC AAG CGC
M31B GTT GAC CTA CAA GC
M32D TTG ACC GAC AAG CG
M34 AAG CGC CAA CTG TCG
M35E GAC TGT TGG CGC T
M37 CGA CTG TGT GCG CTG
M38 TCG GCG CCG GGG CCC2)寡核苷酸探针5’活性基团标记：
包括胺基(NH2)、巯基(SH)和羧基(COOH)等的标记，以及活性基团与DNA分子之间的适宜的碳链长度等，这些间隔的连接臂将增加探针与玻片表面的距离，有利於探针与被检测DNA的杂交链的形成。固定DNA的玻片也需进行活化处理。通常进行活化处理之表面带有醛基(CHO)或胺基(NH2)，可以与DNA探针形成共价键。3)DNA探针排列和芯片制作：
在直接寡核苷酸DNA探针的固定中，先将DNA探针用1M NHS，1M EDC混合，进行点样。完成DNA探针的合成之後，启动DNA点样装置，在芯片制作控制程序的控制下进行DNA探针的打印。通过DNA打印针每次取一个DNA探针，通过三维定点传递装置将DNA探针传送到指定的点样位置。完成一次打印後，将打印针清洗、乾燥，进行下一轮探针的点样，依次类推，直至所有DNA探针传递点样完毕。4)检测：
在检测时，首先将待检样品中DNA抽提出来，用PCR方法及特异性引物进行扩增，扩增过程中或之后将待检DNA样本进行萤光标记，再与DNA芯片杂交，因此可以同时检测多个基因。这种方法是一种反向杂交技术。杂交信号检测可以通过专用激光芯片扫描仪进行检测。扫描获得的图像，用芯片图像专用分析软件分析每个基因探针位点的杂交信号的强弱，从而确定结核杆菌目标DNA是否存在以及DNA突变有没有发生。图3显示一个菌种有S531L突变的杂交结果例子。
| 表1 | ||||||
| 受影响胺酸 | 胺酸改变 | DNA改变 | 出现数目 | 突变数目 | 突变探针 | 非突变探针 |
| 505 | Phe->Leu | TTC->TTG | 2 | 0.38％ | M1 | W1 |
| 509 | Ser->Thr | AGC->ACC | 1 | 0.19％ | W2 | |
| 511 | Leu->Pro | CTG->CCG | 16 | 3.08％ | M2 | W2，W3，W4 |
| 511 | Leu->Arg | CTG->CGG | 3 | 0.58％ | M3 | W2，W3，W4 |
| 512 | Ser->Thr | AGC->ACC | 2 | 0.38％ | M4 | W2，W3，W4 |
| 513 | Gln->Glu | CAA->GAA | 3 | 0.58％ | M5 | W2，W3，W4，W5 |
| 513 | Gln->Lys | CAA->AAA | 1 | 0.19％ | M6 | W2，W3，W4，W5 |
| 513 | Gln->Pro | CAA->CCA | 7 | 1.35％ | M7 | W2，W3，W4，W5 |
| 513 | Gln->Leu | CAA->CTA | 15 | 2.88％ | M8 | W2，W3，W4，W5 |
| 513 514 515 | Gln Phe Met deletion，Leu insertion | AAT TCA deletion | 1 | 0.19％ | M11 | W2，W3，W4，W5，W6 |
| 514 514 515 516 | Gln Phe Met Asp deletion，His insertion | AAT TCA TGG deletion | 2 | 0.38％ | M12 | W2，W3，W4，W5，W6 |
| 514 | Phe insertion | TTC insertion | 7 | 1.35％ | M9 | W3，W4，W5，W6 |
| 514 515 | Phe Met insertion | TTC ATG insertion | 1 | 0.19％ | M10 | W5，W6 |
| 515 | Met->Val | ATG->GTG | 3 | 0.58％ | M15 | W4，W5，W6 |
| 516 | Asp->Tyr | GAC->TAC | 8 | 1.54％ | M16 | W5，W6 |
| 516 | Asp->Val | GAC->GTC | 30 | 5.77％ | M17 | W5，W6 |
| 516 | Asp->Ala | GAC->GCC | 2 | 0.38％ | M18 | W5，W6 |
| 516 | Asp->Gly | GAC->GGC | 1 | 0.19％ | M19 | W5，W6 |
| 516 | Asp->Glu | GAC->GAA | 1 | 0.19％ | M20 | W5，W6 |
| 516 | Asp->Glu | GAC->GAG | 2 | 0.38％ | M21 | W5，W6 |
| 516 | Asp->Gly | GAC->GGG | 1 | 0.19％ | W5，W6 | |
| 516 517 | Asp Gln deletion | GAC CAG deletion | 10 | 1.92％ | M13 | W5，W6 |
| 517 518 | Gln Asn deletion | CAG AAC deletion | 1 | 0.19％ | W5，W6 | |
| 518 | Asn deletion | AAC deletion | 4 | 0.77％ | M14 | W6 |
| 521 | Leu->Met | CTG->ATG | 1 | 0.19％ | W7 | |
| 522 | Ser->Gln | TCG->TTG | 5 | 0.96％ | M22 | W7 |
| 522 | Ser->Leu | TCG->CAG | 7 | 1.35％ | M23 | W7 |
| 523 | Gly->Trp | GGG->TGG | 1 | 0.19％ | W7，W8 | |
| 525 | Thr->Asn | ACC->AAC | 1 | 0.19％ | M24 | W8，W9 |
| 525 | Asp->Tyr | ACC->ATC | 1 | 0.19％ | W8，W9 | |
| 526 | His->Asn | CAC->AAC | 3 | 0.58％ | M25 | W8，W9 |
| 526 | His->Thr | CAC->ACC | 1 | 0.19％ | M26 | W8，W9 |
| 526 | His->Pro | CAC->CCC | 7 | 1.35％ | M27 | W8，W9 |
| 526 | His->Arg | CAC->CGC | 22 | 4.23％ | M28 | W8，W9 |
| 526 | His->Leu | CAC->CTC | 11 | 2.12％ | M29 | W8，W9 |
| 526 | His->Cys | CAC->TGC | 3 | 0.58％ | M30 | W8，W9 |
| 526 | His->Tyr | CAC->TAC | 86 | 16.54％ | M31 | W8，W9 |
| 526 | His->Asp | CAC->GAC | 37 | 7.12％ | M32 | W8，W9 |
| 526 | His->Gln | CAC->CAG | 1 | 0.19％ | M33 | W8，W9 |
| 526 | His->Gln | CAC->CAA | 1 | 0.19％ | W8，W9 | |
| 527 | Lys->Gln | AAG->CAG | 1 | 0.19％ | W8，W9，W10 | |
| 529 | Arg->Gln | CGA->CAA | 1 | 0.19％ | M34 | W10，W11 |
| 531 | Ser->Leu | TCG->TTG | 173 | 33.27％ | M35 | W10，W11，W12 |
| 531 | Ser->Trp | TCG->TGG | 14 | 2.69％ | M36 | W10，W11，W12 |
| 531 | Ser->Cys | TCG->TGT | 2 | 0.38％ | M37 | W10，W11，W12 |
| 533 | Leu->Pro | CTG->CCG | 15 | 2.88％ | M38 | W11，W12 |
| 541 | Glu->Gly | GAC->GAT | 1 | 0.19％ | ||
| 553 | Ser->Ala | TCG->GCG | 1 | 0.19％ | ||
| 520 | 100.00％ |
Claims (2)
1.一种诊断结核杆菌及其耐药性的DNA芯片，其特征在于：在玻片、硅片、膜、高分子材料载体上固定DNA探针，所说的探针为：
W1 AGG AGT TCT TCG GCA
W2 AGC CAG CTG AGC CAA
W3 CAG CTG AGC CAA TTC
W4 GCT GAG CCA ATT CAT
W5A GCC AAT TCA TGG ACCA
W6 TTC ATG GAC CAG AAC
W7 CCC GCT GTC GGG GTT
W8 GGG TTG ACC CAC AAG
W9 TTG ACC CAC AAG CGC
W10 AAG CGC CGA CTG TCG
W11 CGA CTG TCG GCG CTG
W12 TCG GCG CTG GGG CCC
M2 AGC CAG CCG AGC CAA
M3 AGC CAG CGG AGC CAA
M4 CAG CTG ACC CAA TTC
M5 GCT GAG CGA ATT CAT
M7 CTG AGC CCA TTC ATG
M8 CTG AGC CTA TTC ATG
M9 AGC CAA TTC TTC ATG
M10 GCC AAT TCA TGT TCA
M11 CTG AGC CTG GAC CAG
M12 CTG AGC CAC CAG AAC
M13 ATT CAT GAA CAA CCC
M14 GGA CCA GAA CCC GCT
M15 CCA ATT CGT GGA CCA
M16 ATT CAT GTA CCA GAA
M17 TTC ATG GTC CAG AAC
M18 TTC ATG GCC CAG AAC
M20 ATT CAT GAA CCA GAA
M22 CCC GCT GCA GGG GTT
M26 GTT GAC CAC CAA GCG
M27 TTG ACC CCC AAG CGC
M28 TTG ACC CGC AAG CGC
M29 TTG ACC CTC AAG CGC
M30 TTG ACC TGC AAG CGC
M31B GTT GAC CTA CAA GC
M32D TTG ACC GAC AAG CG
M34 AAG CGC CAA CTG TCG
M35E GAC TGT TGG CGC T
M37 CGA CTG TGT GCG CTG
M38 TCG GCG CCG GGG CCC
2.根据权利要求1所述的诊断结核杆菌及其耐药性的DNA芯片，其特征在于：在所说的玻片、硅片、膜、高分子材料载体上固定有12～100个能与结核杆菌的RNA聚合酶β次单元的野生型及耐药性突变型的序列进行特异性杂交的DNA探针。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: YANG MENG Effective date: 20020513 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20020513 Address after: 518000, EF building, 10 floor, Mao Mao Building, 59 news Road, Guangdong, Shenzhen Applicant after: Yaneng Biotechnology (Shenzhen) Co., Ltd. Address before: Department of biology and chemistry, City University Hong Kong, 83 Tat Tat Road, Hongkong Applicant before: Yang Mengsu |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: GANGLONG BIOLOGY TECHNOLOGY ( SHENZHEN ) CO., LTD Free format text: FORMER OWNER: YANENG BIOTECHNOLOGY (SHENZHEN) CO., LTD. Effective date: 20070727 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20070727 Address after: 518057 high tech Zone of Shenzhen city in a biological incubator building 2310 Patentee after: Genetal Pharmaceuticals (Shenzhen) Co.,Ltd. Address before: 518000, EF building, 10 floor, Mao Mao Building, 59 news Road, Guangdong, Shenzhen Patentee before: Decipher Bioscience (Shenzhen) Co., Ltd. |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20040526 Termination date: 20191031 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |