JP2024026210A - 結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のためのポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよびプローブ - Google Patents

Abstract

【課題】結核菌のＤＮＡの存在を同定するおよび／または抗結核薬への耐性を同定するために、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）における異なる遺伝子のセグメントを増幅するための新規プライマーならびにスロッピー分子ビーコンおよび分子ビーコンプローブ関する。【解決手段】ｒｐｏＢ遺伝子、ｇｙｒＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｉｎｈＡプロモーター、ｒｒｓ遺伝子、ｅｉｓプロモーター、ｅｍｂＢ遺伝子、ｋａｔＧ遺伝子、ｄｏｓＲ遺伝子、ＩＳ６１１０遺伝子およびＩＳ１０８１遺伝子からなる群から選択される結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）領域の一部分を増幅するためのオリゴヌクレオチドセットを提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／０６２，３５
１号の優先権を主張し、その開示は、参照により本明細書中に援用される。

連邦政府の利益
本明細書に開示される発明は、少なくとも一部が国立衛生研究所の認可番号Ｕ０１ＡＩ
０８２１７４およびＲ０１ＡＩ０８０６５３に基づく政府の支援によりなされた。したが
って、米国政府が、本発明について特定の権利を有しうる。

発明の分野
本発明は、結核菌のＤＮＡの存在を同定するおよび抗結核薬への耐性を同定するために
、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）における異なる遺
伝子のセグメントを増幅および検出するための新規プライマーならびにスロッピー（ｓｌ
ｏｐｐｙ）分子ビーコン（ＳＭＢ）および分子ビーコン（ＭＢ）プローブに関する。

結核（ＴＢ）は、およそ２０年前、世界規模の緊急事態と宣言された（ＷＨＯ Ｇｌｏ
ｂａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｒｅｐｏｒｔ ２０１３）。ＴＢの新たな症例の割
合は、世界的に減少しているが、２０１５年までに疾患の５０％削減というミレニアム開
発目標の狙いを達成することは困難である（ＷＨＯ Ｇｌｏｂａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ
ｓｉｓ Ｒｅｐｏｒｔ ２０１３）。多剤耐性（ＭＤＲ）および広範な薬剤耐性（ＸＤＲ
）であるＴＢの発生率の増加は、これらの減少目標に対する深刻な脅威である（ＷＨＯ
Ｇｌｏｂａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｒｅｐｏｒｔ ２０１３）。ＭＤＲ ＴＢは
、少なくともリファンピシンおよびイソニアジドによる治療に対するＴＢ耐性と定義され
、ＸＤＲ ＴＢは、抗生物質のフルオロキノロン類ならびに注射剤のアミカシン、カナマ
イシンおよびカプレオマイシンによる治療に対してさらに耐性があるＭＤＲ ＴＢとして
定義される。薬剤耐性ＴＢを患う患者は、適切な感染管理および治療を迅速に開始できる
ように、できるだけ迅速に同定されるのが最善である（Ｂｏｅｈｍｅ， Ｃ． Ｃ．，
ｅｔ．ａｌ， ２０１１， Ｌａｎｃｅｔ ３７７：１４９５－１５０５）。

従来の表現型の方法は、細菌の非常に遅い増殖のために、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍｔｂ）の薬剤耐性パターンを完全に明らかに
するために数週間から数ヶ月かかることがある（Ｈｅｉｆｅｔｓ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ
．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３８：１２２７－１２３０； Ｋｉｍ， Ｓ
． Ｊ．， ２００５， Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ２５：５６４－５６９； ａｎｄ
ＰＴ， Ｋ．， ａｎｄ Ｋ． ＧＰ．， １９８５， Ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ： Ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｌｅｖｅｌ ＩＩＩ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ． Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ，
Ｕ．Ｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖ
ｉｃｅｓ， Ａｔｌｔａｎｔａ， Ｇｅｏｒｇｉａ．）。分子検査は、より迅速な薬剤耐
性の検出を約束する。Ｍｔｂは、薬剤耐性プラスミドを自然には含まない；したがって、
分子検査は、染色体ＤＮＡに対して行われる。遺伝子型のアッセイは、Ｍｔｂゲノムがか
なり高い配列保存を有するので、設計が比較的容易である。実質的には、すべての薬剤感
受性の臨床Ｍｔｂ単離株は、いくつかの容易に同定される「自然多型（ｎａｔｕｒａｌ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）」を除いて、薬剤耐性ターゲットにおいて同一のＤＮＡ配
列を有する。薬剤耐性ターゲット遺伝子における野生型配列からのいかなる逸脱も、対応
する薬剤に対する薬剤耐性の存在を示すことになる。遺伝子型のアッセイは、ＤＮＡター
ゲットがＰＣＲにより増幅されうるため、表現型のアッセイよりも迅速かつ敏感である。
バイオハザードは、感染性の生物の早期死滅により最小限にすることができる。

ＴＢにおける薬剤耐性のほとんどのケースの主要因である遺伝子のターゲットは、現在
既知である。リアルタイムＰＣＲは、細菌の突然変異を検出する最も繊細、迅速および安
定した方法である。実質的には、ＰＣＲ－ＭＳ、マイクロアレイ、ミニアレイおよび次世
代シークエンシングを含む他のすべての突然変異検出方法は、検出プロセスの第１段階と
して核酸の増幅を必要とする。一方、リアルタイムＰＣＲでは、サンプル増幅、検出およ
び分析をシングルウェルにおいて全て実施することができる。チューブを開く必要はなく
、複雑な流体工学が不要である。しかし、参照試験所の外で実施するための十分に単純で
安定である薬剤耐性検査の一般的な方法論を誰も開発できていない。したがって、Ｍ．ｔ
ｂおよび最も一般的に使用される第一選択薬および第二選択薬に対するＭ．ｔｂ薬剤耐性
を検出するための新規プライマーおよびプローブが必要である。

本発明は、Ｍ．ｔｂおよびＭ．ｔｂ薬剤耐性におけるプライマー、プローブおよび関連
する使用に関する。

一態様において、本発明は、ｒｐｏＢ遺伝子、ｇｙｒＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｉｎ
ｈＡプロモーター、ｒｒｓ遺伝子、ｅｉｓプロモーター、ｅｍｂＢ遺伝子、ｋａｔＧ遺伝
子、ｄｏｓＲ遺伝子、ＩＳ６１１０遺伝子およびＩＳ１０８１遺伝子からなる群から選択
される結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）領域の一部分を増幅するための単離され
たオリゴヌクレオチドセットまたはプライマーセットを提供する。前記セットは、前記一
部分に特異的な一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、各プライ
マーは、下記表１Ａおよび表１Ｂに記載のものから選択されるオリゴヌクレオチド配列と
実質的に同一である配列を有する。したがって、各プライマーは、表に記載のものから選
択されるオリゴヌクレオチド配列の相補体に実質的に相補的な配列を有する。いくつかの
実施形態において、プライマーの配列は、表１Ａおよび表１Ｂに記載のものから選択され
るオリゴヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチド配列と同一である。

第２の態様において、本発明は、表２に記載のものから選択される配列と実質的に同一
である配列を有する単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態において、前記核酸
は、表２に記載のものから選択される一つの配列を含む。前記核酸は、例えば、２つの末
端それぞれでフルオロフォアおよびクエンチャーで、またはプローブの内部ヌクレオチド
（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）に結合したフルオロフォアでラベル化する
ことができる。フルオロフォアの例は、フルオレセイン、シアニン５、またはＴｅｘａｓ
Ｒｅｄ（登録商標）およびＴＡＭＲＡを含む。クエンチャーの例は、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２
およびＤＡＢＣＹＬを含む
本発明は、１以上の上記オリゴヌクレオチドセットおよび核酸を含むキットを提供する
。前記キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、伸長ヌクレオチド、およびバッファーをさらに含
むことができる。

第３の態様において、本発明は、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）における薬
剤耐性を検出する方法を特徴とする。前記方法は、第１のプライマー対で第１の核酸ター
ゲット配列を増幅して、第１の単位複製配列を生成する、この際（ｉ）前記第１のプライ
マー対がｒｐｏＢ遺伝子、ｇｙｒＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｉｎｈＡプロモーター、ｒ
ｒｓ遺伝子、ｅｉｓプロモーター、ｅｍｂＢ遺伝子およびｋａｔＧ遺伝子からなる群から
選択される領域の一部分に特異的であり、（ｉｉ）各プライマーは、表１Ａおよび表１Ｂ
に記載のものから選択されるオリゴヌクレオチド配列と実質的に同一である配列を有し、
ならびに前記第１の単位複製配列における突然変異を検出する工程を含む。前記突然変異
の存在は、薬剤耐性を示す。前記方法において、前記検出する工程は、例えば、シークエ
ンシングに基づく技術および核酸またはペプチド核酸プローブハイブリダイゼーションに
基づく技術を含む様々な公知の核酸検出技術により行うことができる。

一実施形態において、前記検出工程は、（ｉ）ハイブリダイゼーションを促す条件下で
、前記第１の単位複製配列と前記突然変異に特異的な第１のプローブとを接触させて、プ
ローブ－ターゲットハイブリットを形成すること；（ｉｉ）融解温度（Ｔｍ）分析を行い
、前記プローブ－ターゲットハイブリットのためのテストＴｍ値（ｔｅｓｔ Ｔｍ ｖａ
ｌｕｅ）を決定すること；および（ｉｉｉ）前記テストＴｍ値と所定の基準Ｔｍ値とを比
較することを含むプロセスにより行われる。前記テストＴｍ値は、前記所定の基準Ｔｍ値
と異なる場合、突然変異の存在を示す。例えば、前記所定の基準Ｔｍ値から少なくとも３
（例えば、３、４、または５）標準偏差である前記テストＴｍ値におけるシフトは、突然
変異の存在を示す。逆に言うと、前記所定の基準Ｔｍ値から３未満の標準偏差である前記
テストＴｍ値におけるシフトは、突然変異がないことを示す。本明細書において、所定の
基準Ｔｍ値は、野生型Ｔｍ値の平均でありうる。一例において、所定の基準Ｔｍ値は、例
えば少なくとも３標準偏差の差で所定の基準Ｔｍ値より低い場合、突然変異の存在を示す
。そうでなければ、テストＴｍ値は、例えば３標準偏差の差で所定の基準Ｔｍ値以上であ
る場合、突然変異がないことを示す。

前記方法は、第２のプライマー対で第２の核酸ターゲット配列を増幅して、第２の単位
複製配列を生成することをさらに含むことができ、前記第２のプライマー対は、ｒｐｏＢ
遺伝子、ｇｙｒＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｉｎｈＡプロモーター、ｒｒｓ遺伝子、ｅｉ
ｓプロモーター、ｅｍｂＢ遺伝子、およびｋａｔＧ遺伝子からなる群から選択される第２
の領域の一部分に特異的である。いくつかの実施形態において、前記第１の領域は、ｒｓ
ｓ遺伝子またはｅｉｓプロモーターである。例えば、第１の領域は、ｒｓｓ遺伝子であり
得、第２の領域は、ｅｉｓプロモーターであり得る。２つの領域は、独立して増幅する、
またはネステッドＰＣＲなどの技術を用いる同じ反応系において増幅することができる。
その場合、前記突然変異は、ｒｒｓ遺伝子におけるＡ１４０１ＧまたはＣ１４０２Ｔであ
り得る。前記突然変異は、ｅｉｓプライマー配列によりクエリされるｅｉｓプロモーター
領域内にあり得る。

上記の方法は、イソニアジド、リファンピシン、アミカシン、カナマイシン、カプレオ
マイシン、エタンブトールおよびフルオロキノロン類の薬剤からなる群から選択される薬
剤に対する耐性を検出することを可能にする。プライマー対は、表１Ａおよび表１Ｂに記
載のものから選択された一つであり得る。プローブは、表２に記載のものから選択された
一つと実質的に同一であるまたは完全に同一である配列を有することができる。

第４の態様において、本発明は、例えば、被験体からのテストサンプルにおける結核菌
（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の存在を検出する方法を提供する。前記方法は、増幅
反応を促す条件下、テストサンプルと第１のプライマー対とを接触させて、第１の単位複
製配列を得ること、および前記単位複製配列の存在を検出して、それによって前記テスト
サンプルにおける結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の
存在を検出することを含む。前記第１のプライマー対は、ｇｙｒＢ遺伝子、ｉｎｈＡプロ
モーター、ｅｉｓプロモーター、ｅｍｂＢ遺伝子、ｋａｔＧ遺伝子、ｄｏｓＲ遺伝子、Ｉ
Ｓ６１１０遺伝子、およびＩＳ１０８１遺伝子からなる群から選択される結核菌（Ｍ．ｔ
ｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）領域の一部分を増幅するためのオリゴヌクレオチドセットであ
り得る。前記第１のプライマー対の各プライマーが表１Ｂに記載のものから選択されるオ
リゴヌクレオチド配列と実質的に同一であり得る配列を有する。前記方法は、増幅反応を
促す条件下、前記テストサンプルまたは前記第１のプライマー対により生成された単位複
製配列と第２のプライマー対とを接触させて、第２の単位複製配列を得ること、および前
記第２の単位複製配列の存在を検出することをさらに含むことができる。その場合、第１
の単位複製配列および第２の単位複製配列の両方の存在は、テストサンプルにおける結核
菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の存在を示す。

第５の態様において、本発明は、テストサンプルにおける結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ）の存在を検出するもう一つの方法を提供する。前記方法は、ハイブリッド形
成反応を促す条件下、テストサンプルと第１の分子ビーコンプローブとを接触させて、プ
ローブ－ターゲットハイブリッドを得ること、および前記プローブ－ターゲットハイブリ
ッドの存在を検出して、それによってテストサンプルにおける結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の存在を検出することを含む。前記方法におい
て、前記第１の分子ビーコンプローブは、表２に記載のものから選択される一つと実質的
に同一である配列を含む。一例では、第１の分子指標プローブは、ＩＳ１０８１、ｄｏｓ
Ｒ２、およびＩＳ６１１０（配列番号６７～６９）からなる群から選択される。

本発明の１以上の実施形態の詳細は、以下の明細書に記載されている。本発明のその他
の特徴、目的および利点は、明細書および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

図１は、３点Ｔｍプロファイルを生成したＳＭＢプローブを用いた６０３の臨床ＤＮＡサンプルにおけるＡＭＫおよび／またはＫＡＮ耐性の検出を示す図である。３つのアッセイＳＭＢのそれぞれは、マルチプレックスＰＣＲ反応でのすべてのＭ．ｔｂ ＤＮＡサンプルに対して検査された。各サンプルの結果は、Ｘ軸での３点ＴＭプロットおよびＹ軸に示される各ＳＭＢのＴｍ値として示される。単離株は、表現型に感受性ありとして、次に耐性ありとして左から右へソートされる。３つのプローブの少なくとも１つからはっきりと異なるＴｍシフトは、各耐性単離株において見ることができる。 図２Ａ、ＢおよびＣは、３つのＳＭＢプローブの一次導関数融解ピークプロファイルを示す図である。野生型、突然変異および混合ＤＮＡサンプルの融解ピークプロファイルは、ｒｒｓ－１４００ ＳＭＢプローブ（２Ａ）、ｅｉｓ１ ＳＭＢプローブ（２Ｂ）、およびｅｉｓ２ ＳＭＢプローブ（２Ｃ）を示す。各融解曲線は、個別株を表す。 図３は、ｒｒｓおよびｅｉｓ突然変異ならびに野生型菌株のＭＩＣ値を示す図である。ｒｒｓおよびｅｉｓ突然変異ならびに野生型菌株のＡＭＫおよびＫＡＮに対する平均ＭＩＣ値を示す。エラーバーは、ＭＩＣ値の±１標準偏差を表す。ｅｉｓ－Ｐは、ｅｉｓ遺伝子プロモーターを示す。

本発明は、少なくとも一部では、Ｍ．ｔｂ ＤＮＡおよびイソニアジド、リファンピシ
ン、アミカシン、カナマイシン、カプレオマイシン、エタンブトール、およびフルオロキ
ノロン類の薬剤などの抗結核薬への耐性の存在を同定するためのＭ．ｔｂにおける１１の
異なる遺伝子の断片増幅のための新規プライマー、ＳＭＢプローブ、およびＭＢプローブ
の予期せぬ発見に基づく。

プライマーおよびプローブ
本明細書では、ｒｐｏＢ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｉｎｈＡプロモーター領域、ｒｒｓ、
ｅｉｓプロモーター領域、ｅｍｂＢおよびｋａｔＧ遺伝子を増幅することを特徴とするプ
ライマーは、Ｍ．ｔｂにおける突然変異ホットスポットを誘発する薬剤耐性の感受性増幅
を可能にする。対応するＳＭＢプローブは、最も一般的に使用される第一および第二選択
薬への薬剤耐性をもたらすこれらの突然変異を標的および同定する。これらのプライマー
は、対称および非対称の両方のＰＣＲアッセイにおいて非常に高い効率で使用することが
できる。本明細書に記載のプライマーおよびプローブ配列は、Ｍ．ｔｂに対する迅速で正
確な分子薬剤感受性試験アッセイを開発するために本発明者らにより使用されている。Ｍ
．ｔｂに対する分子診断アッセイにおける明らかな有用性とは別に、これらのプライマー
はまた、ターゲット遺伝子をシークエンシングするために使用され、サーベイランスアッ
セイおよびその他のプローブに基づくアッセイにおける突然変異を誘発する耐性を同定し
、Ｍ．ｔｂにおける突然変異を誘発する共通の薬剤耐性の特異的で高感度な同定を目的と
する。ｄｏｓＲ、ＩＳ６１１０およびＩＳ１０８１遺伝子を増幅するプライマー配列は、
Ｍ．ｔｂの非常に高感度で特異的な同定を可能にし、結核の非常に特異的で高感度な分子
診断を目的とするいかなるＰＣＲアッセイフォーマットにおいても使用できる。下記表に
おいて記載されたものは、本発明の例示的なプライマーおよびプローブである。

表２において、１以上のプローブ配列は、ライナー（ｌｉｎｅｒ）プローブを含む二重
ラベルプローブ、Ｔａｑｍａｎプローブ、分子ビーコンプローブ、およびスロッピー分子
ビーコンプローブなど、様々な検出フォーマットで作製することができる。「スロッピー
（ｓｌｏｐｐｙ）」プローブは、ミスマッチ耐性（ｍｉｓｍａｔｃｈ－ｔｏｌｅｒａｎｔ
）があるプローブを意味する。ミスマッチ耐性プローブは、アッセイにおいて検出可能な
温度で２つ以上のターゲット配列の検出可能なシグナルとハイブリダイズし、検出可能な
シグナルを生成し、それにより形成された様々なハイブリッドは、異なる融点を有するで
あろう。ライナー、またはランダムコイルの、一本鎖プローブは、一般的にミスマッチ耐
性である。かかるプローブの例は、１つまたは別のターゲット鎖へのハイブリダイゼーシ
ョン時に蛍光のレベルが増加する内部蛍光部分を有するヘアピンまたはリニアプローブで
ある。例えば、米国特許第７６６２５５０号明細書および第５９２５５１７号明細書、米
国特許出願公開第２０１３００９５４７９号明細書参照。

好ましくは、スロッピープローブは、米国特許第７６６２５５０号明細書および第５９
２５５１７号明細書に記載の二重ラベルヘアピンプローブまたは分子ビーコンプローブで
ある。これらのヘアピンプローブは、互いに補完する一対のアームによって挟まれている
ターゲット結合配列を含む。これらは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはＰＮＡ、または３つの
核酸全ての組み合わせであり得る。さらに、これらは、修飾ヌクレオチドおよび修飾イン
ターヌクレオチド結合を含んでもよい。これらは、第１のフルオロフォアを一方のアーム
、第２のフルオロフォアをもう一方のアームに有し、第２のフルオロフォアの吸収スペク
トルは、第１のフルオロフォアの発光スペクトルと実質的に重なる。最も好ましくは、か
かるヘアピンプローブは、溶液中に遊離するとプローブがダークであるように、一方のア
ームにフルオロフォア、もう一方のアームにクエンチャーを有する「分子ビーコンプロー
ブ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ ｐｒｏｂｅｓ）」である。これらはまた、たと
えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって相互作用する一方のアームの複数の
フルオロフォアと、もう一方のアームのクエンチャーとを有する波長シフト分子ビーコン
プローブであり得る。ターゲット結合配列は、例えば、長さ１２～５０、または２５～５
０のヌクレオチドであり得、ハイブリダイズするアームは、長さ４～１０または４～６（
例えば、５もしくは６）のヌクレオチドであり得る。分子ビーコンプローブは、米国特許
第７６６２５５０号明細書および第５９２５５１７号明細書ならびに国際公開第０１／３
１０６２号に記載のとおり、プライマーにつなぐことができる。

したがって、スロッピー分子ビーコンプローブは、そのようなクラスの蛍光ラベルされ
たヘアピンオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを意味する。かかるプロ
ーブは、ホモジニアスアッセイにおいて、検出可能なシグナルを生成する、すなわちター
ゲットにハイブリダイズしたプローブを結合していないプローブから分離する必要がない
。所与のターゲット配列の２つ以上の変異に結合するそれらの能力のおかげで、プローブ
は、多くの可能な変異の中から関心のある核酸配列セグメントの１つの変異の存在を検出
するために、または２つ以上の変異の存在を検出するためにアッセイにおいて使用するこ
とができる。したがって、プローブは、同じアッセイにおいて２以上の組み合わせで使用
することができる。それらは、ターゲット結合配列が異なるので、異なる変異に対するそ
れらの相対的な親和性は、異なる。例えば、第１のプローブは、野生型配列に強く、第１
の対立遺伝子にほどほどに、第２の対立遺伝子に弱く結合でき、第３の対立遺伝子には全
く結合しない；一方、第２のプローブは、野生型配列および第１の変異に弱く、第２およ
び第３の変異にほどほどに結合できる。さらなるスロッピープローブは、それらの異なる
ターゲット結合配列により、さらに異なる結合パターンを示すだろう。したがって、スロ
ッピープローブの組み合わせからの蛍光発光スペクトルは、異なる微生物株または種、お
よび遺伝子の対立遺伝子変異（ｖａｒｉａｎｔｓ）または突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）
を明確にする。

スロッピープローブは、異なるＤＮＡ配列に結合した後、様々な強度で再現性よく蛍光
を発するので、例えば、単一の反応容器で複数の病原体または変異を同定する、単純、迅
速および精度の高い核酸増幅反応アッセイ（例えば、ＰＣＲに基づくアッセイ）において
、組み合わせを使用することができる。しかし、アッセイを直接検出可能な量の非増幅タ
ーゲット核酸を含むと疑われるサンプルにおいても実施できることが理解されよう。この
同定アッセイは、種特異的または変異特異的なＤＮＡ配列の「シグネチャスペクトル（ｓ
ｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｐｅｃｔｒａ）」を生成するのに最適な異なる波長の光を発するフ
ルオロフォアでそれぞれ標識された、スロッピー分子ビーコンプローブなどの、一連の部
分的にハイブリダイズするスロッピーシグナル伝達プローブのスペクトルを分析すること
に基づく。

前記プローブを用いて、例えば、各ターゲットに対して異なる対立遺伝子識別（ａｌｌ
ｅｌｅ－ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ）分子ビーコンプローブをデザインすることおよ
び各プローブを区別してラベル化することにより、多重化を達成できる。（例えば、米国
特許第７６６２５５０号明細書および第５９２５５１７号明細書、国際公開第０１／３１
０６２号、ならびにＴｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ １８：１１９１－１１９６参照）。対立遺伝子識別プローブの混合物は
、それぞれが複数の色のありコートを含み、プローブシグネチャの数を拡張する。そのた
めに、固有の融解温度を有する分子ビーコン－ターゲットハイブリッドのすべては、明ら
かな温度ならびにプローブおよび単位複製配列の濃度で、対応する固有のシグナル強度を
有するであろう。したがって、リアルタイムＰＣＲ反応において多くの異なる可能性のあ
るターゲット配列を同定するために、限られた数のスロッピープローブをプローブとして
使用することができる。前記プローブは、増幅前、増幅中、または増幅後に増幅反応混合
物に加えることができる。米国特許第７６６２５５０号明細書参照。

本発明はさらに、ＰＣＲおよび／またはプローブ－ターゲットハイブリダイゼーション
反応を含む、上記方法を実施するための試薬を含むキットを提供する。そのために、本明
細書に記載の方法のために、１以上の反応成分、例えば、ＰＣＲプライマー、ポリメラー
ゼ、およびプローブは、使用のためのキットの形態で提供することができる。かかるキッ
トにおいて、適切な量の１以上の反応成分が１以上の容器で提供される、または基材上に
保持される。

前記キットはまた、上記方法を実施するための追加の材料を含む。いくつかの実施形態
において、キットは、試薬、本発明に係るプライマーおよび／またはプローブを用いる方
法を実施するための材料の一部またはすべてを含む。キットの成分の一部またはすべては
、本発明のプライマーおよび／またはプローブを含む容器とは別の容器で提供することが
できる。キットの追加の成分の例は、特に制限されないが、１以上の異なるポリメラーゼ
、１以上のコントロール試薬（例えば、プローブもしくはＰＣＲプライマーまたはコント
ロールテンプレート）、および反応のためのバッファー（１Ｘまたは濃縮形態）を含む。
キットはまた、１以上の下記成分：支持体、終結、修飾または消化試薬、オスモライトお
よび検出のための装置を含む。

使用される反応成分は、様々な形態で提供され得る。例えば、前記成分（例えば、酵素
、プローブおよび／またはプライマー）は、水溶液中に、または乾燥凍結もしくは凍結乾
燥粉末、ペレット、もしくはビーズとして、懸濁することができる。後者の場合、成分は
、再構成された場合、アッセイに使用する成分の完全な混合物を形成する。本発明のキッ
トは、任意の適切な温度で提供することができる。例えば、液体にタンパク質成分（例え
ば、酵素）を含むキットの保管のために、それらを０℃以下、好ましくは－２０℃以下、
またはその他の凍結状態で提供し、維持することが好ましい。

この発明のキットまたはシステムは、少なくとも１つのアッセイに十分な量で、任意の
組み合わせの本明細書に記載の成分を含んでもよい。いくつかの用途において、１以上の
反応成分は、個々の、一般的には使い捨ての、チューブまたは同等の容器中のあらかじめ
測定した１回使用量で提供されてもよい。このような準備で、ＰＣＲ反応は、ターゲット
核酸または個々のチューブに対して直接ターゲット核酸を含むサンプル／細胞を加えるこ
とにより実施することができる。キットに含まれる成分の量は、任意の適切な量にするこ
とができ、製品が対象にするターゲット市場に依存するであろう。成分が提供される容器
は、提供形態を保持できる任意の一般的な容器、例えば、微量遠心管チューブ、アンプル
、ボトル、または流体装置、カートリッジ、側方流動、もしくは他の同様な装置などの不
可欠の試験装置であり得る。

キットはまた、容器または容器の組み合わせを保持するための包装材料も含むことがで
きる。かかるキットおよびシステムのための典型的な包装材料は、任意の様々な構成（例
えば、バイアル、マイクロタイタープレートウェル、マイクロアレイなど）において反応
成分または検出プローブを保持する固体マトリクス（例えば、ガラス、プラスチック、紙
、箔、微小粒子など）を含む。キットは、成分の使用のための具体的な形態で記録された
指示書をさらに含むことができる。

定義
核酸は、ＤＮＡ分子（例えば、制限されないが、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮ
Ａ分子（例えば、制限されないが、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡアナログを
意味する。ＤＮＡまたはＲＮＡアナログは、ヌクレオチドアナログから合成することがで
きる。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）
」核酸は、その構造がいかなる天然起源の核酸構造、または天然起源のゲノム核酸のいか
なる断片の構造とも同一ではない核酸である。したがって、この用語は、例えば、（ａ）
天然起源のゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、天然起源の生物のゲノムにおける
分子のその部分に隣接するコード配列の両方に隣接していないＤＮＡ；（ｂ）結果として
生じる分子がいかなる天然起源のベクターまたはゲノムＤＮＡと同一ではないように、ベ
クターまたは原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた核酸；（ｃ）ｃＤＮ
Ａ、ゲノム断片、ＰＣＲにより生成された断片、または制限断片などの別の分子；ならび
に（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である
組み換え核酸配列をカバーする。

本明細書において、用語「ターゲット核酸（ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
）」または「ターゲット（ｔａｒｇｅｔ）」は、関心のあるターゲット核酸配列を含む核
酸を意味する。ターゲット核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、多くの場合、二本鎖Ｄ
ＮＡである。「ターゲット核酸配列（ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ）」、「ターゲット配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「ター
ゲット領域（ｔａｒｇｅｔ ｒｅｇｉｏｎ）は、一本鎖核酸の配列の全てまたは一部を含
む特定の配列を意味する。ターゲット配列は、核酸テンプレート内、または細胞のゲノム
内にあってもよく、一本鎖または二本鎖核酸の任意の形態でもあり得る。テンプレートは
、精製されたまたは単離された核酸でもよく、または精製されていないまたは単離されて
いないものでもよい。

「相補的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」配列は、本明細書において、ハイブリダ
イズするそれらの能力に関する上記要件が満たされる限り、ワトソン－クリック塩基対（
例えば、Ａ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）、非ワトソン－クリック塩基対および／または非天然
および修飾ヌクレオチドからから形成される塩基対を含んでも、またはすべてがこれらか
ら形成されてもよい。完全な相補体（ｆｕｌｌ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）または完全に相
補的な（ｆｕｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）は、核酸分子のヌクレオチドまたは
ヌクレオチドアナログ間で１００％（完全に）相補的なまたは実質的に相補的な塩基対合
を意味するであろう。

「実質的に相補的な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」
は、核酸またはオリゴヌクレオチドが例えばＰＣＲ反応のアニーリング条件またはプロー
ブ－ターゲットハイブリダイゼーション条件下、ターゲット核酸配列にハイブリダイズま
たはアニールできるように、核酸またはオリゴヌクレオチドがターゲット核酸配列の少な
くとも１０の隣接する塩基に対して少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％
、９６％、９７％、９８％、９９％、および１００％）である少なくとも１０の隣接する
塩基を含む配列を有することを意味する。配列間の相補性は、比較される少なくとも１０
の隣接する塩基の各セットにおいて塩基ミスマッチの数を表すことができる。用語「実質
的に同一（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」は、第１の核酸がＰＣ
Ｒアニーリングまたはプローブ－ターゲットハイブリダイゼーション条件下、第２の核酸
の相補体と実質的に相補的であるまたはハイブリダイズできるように、第１の核酸が第２
の核酸に対して少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、
９８％、９９％、および１００％）相補的であることを意味する。

「ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」もしくは「ハイブリダイ
ズすること（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」もしくは「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄ
ｉｚｅ）」または「アニールする（ａｎｎｅａｌ）は、２つの構成鎖が水素結合で結合さ
れている安定な二本鎖構造または領域（時には、「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」また
は「二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）」または「ステム（ｓｔｅｍ）」と呼ばれる）を形成するた
めに平行配向または好ましくは非平行配向で完全にまたは部分的に相補的な核酸鎖を特定
のハイブリダイゼーション条件下で一つにする能力を意味する。水素結合は、典型的には
アデニンおよびチミンもしくはウラシル（ＡおよびＴもしくはＵ）またはシステインおよ
びグアニン（ＣおよびＤ）の間で形成されるが、他の塩基対が形成されてもよい（例えば
、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，１１ｔｈ ｅｄ．，１９９２）。

「核酸二本鎖（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｕｐｌｅｘ）」、「二本鎖（ｄｕｐｌｅ
ｘ）」、「ステム（ｓｔｅｍ）」、「核酸ハイブリッド（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈ
ｙｂｒｉｄ）」または「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」は、二本鎖、水素結合領域、例
えばＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡおよびＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖分子およびそのアナロ
グを含む安定した核酸構造を意味する。かかる構造は、例えば、ラベル化されたプローブ
、その表面の質量の変化に敏感な光学活性プローブでコーティングされた基材（米国特許
第６，０６０，２３７号明細書）、または結合剤（米国特許第５，９９４，０５６号明細
書）を用いることで公知の手段により検出することができる。

本明細書において、用語「増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」およびそのバリアン
トは、ポリヌクレオチドの少なくともある部分の複数のコピーまたは相補体を生成するた
めの任意のプロセスを含み、前記ポリヌクレオチドは、通常「テンプレート（ｔｅｍｐｌ
ａｔｅ）」と呼ばれる。テンプレートポリヌクレオチドは、一本鎖でも二本鎖でもよい。
テンプレートはまた、精製されたまたは単離された核酸でもよく、精製されていないまた
は単離されていない核酸でもよい。所与のテンプレートの増幅は、ポリヌクレオチド増幅
産物の集団の生成をもたらすことができ、集団で「単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）」
と呼ばれる。単位複製配列のポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖または両方の混
合物であり得る。通常、テンプレートは、ターゲット配列を含むであろうし、結果として
生じる単位複製配列は、ターゲット配列と実質的に同一または実質的に相補的のいずれか
である配列を有するポリヌクレオチドを含むであろう。いくつかの実施形態において、特
定の単位複製配列のポリヌクレオチドは、互いに、実質的に同一であるか、実質的に相補
的であり；または、いくつかの実施形態において、所与の単位複製配列内のポリヌクレオ
チドは、互いに異なるヌクレオチド配列を有することができる。増幅は、直線的にまたは
指数関数的に進行することができ、２以上の増幅産物を形成するために所与のテンプレー
トの反復および連続した複製を含むことができる。いくつかの典型的な増幅反応は、テン
プレートに基づく核酸合成の連続および反復サイクルを含み、テンプレートのクレオチド
配列の少なくともある部分を含み、テンプレートと少なくともある程度の核酸配列同一性
（または相補性）を共有する複数の娘ヌクレオチド（ｄａｕｇｈｔｅｒ ｐｏｌｙｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ）の形成をもたらす。いくつかの実施形態において、増幅の「サイクル（
ｃｙｃｌｅ）」と呼ばれることがある、核酸合成の各過程は、遊離３’末端（例えば、ｄ
ｓＤＮＡの一方の鎖を切断することによる）を生成し、それによりプライマーおよびプラ
イマー伸長工程を生成することを含み；任意に、追加の変性工程を含むことも可能であり
、この際テンプレートは、部分的または完全に変性される。いくつかの実施形態において
、増幅の１ラウンドは、増幅のシングルサイクルの所与の数の反復を含む。例えば、増幅
のラウンドは、特定サイクルの５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、
またはそれ以上の反復を含むことができる。１つの例示的な実施形態において、増幅は、
任意の反応を含み、この際特定のポリヌクレオチドテンプレートは、核酸合成の２つの連
続するサイクルに供される。合成は、テンプレート依存性核酸合成を含むことができる。

本発明の増幅はまた、等温増幅を含んでもよい。用語「等温（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ）
」は、実質的に一定の温度で、すなわち核酸重合反応が起こる反応温度を変化させること
なく、反応を行うことを意味する。等温増幅反応の等温温度は、反応で使用される鎖置換
核酸ポリメラーゼによる。一般的に、等温温度は、以下の一般的な反応産物の融解温度（
Ｔｍ；混合物中の二本鎖の半分が一本鎖で、変性状態である可能性の温度）、すなわち一
般的には、９０℃以下、通常約２０℃から７５℃の間、好ましくは３０℃から６０℃の間
、またはより好ましくは約３７℃である。

用語「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」または「プライマーオリゴヌクレオチド（ｐｒｉ
ｍｅｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、核酸合成用テンプレート核酸の組成物
に従い、テンプレート核酸にハイブリダイズでき、伸長ヌクレオチドを組み込むための開
始点の機能を果たすことができる核酸またはオリゴヌクレオチドの鎖を意味する。「伸長
ヌクレオチド（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、増幅の間の伸長産物
、すなわちラベルを含んでもよい、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡもしくはＲＮＡの誘導体
に組み込まれることができる任意のヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰ）およびそのアナロ
グを意味する
本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」
は、短いポリヌクレオチド、通常３００以下の長さ（例えば、５から１５０の範囲、好ま
しくは１０から１００の範囲、より好ましくは１５から５０の範囲の長さ）を意味する。
しかし、本明細書において、この用語はまた、より長いまたはより短いポリヌクレオチド
鎖を包含することも意味する。「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
）」は、他のポリヌクレオチドとハイブリダイズでき、よってポリヌクレオチド検出のた
めのプローブ、またはポリヌクレオチド鎖伸長のためのプライマーとしての機能を果たす
。

本明細書において、用語「プローブ（ｐｒｏｂｅ）」は、１以上のタイプの化学結合に
より、通常相補的な塩基対合により、通常水素結合形成により、相補的な配列のターゲッ
ト核酸に結合できるオリゴヌクレオチドを意味する。プローブは、ハイブリダイゼーショ
ン条件のストリンジェンシーに依存して、完全な相補性を欠くターゲット配列とプローブ
配列とを結合させることができる。ターゲット配列と本明細書に記載の一本鎖核酸とのハ
イブリダイゼーションを妨げるであろう任意の数の塩基対ミスマッチがあってもよい。し
かし、突然変異の数が多すぎるため、最小のストリンジェントのハイブリダイゼーション
条件下でさえ、ハイブリダイゼーションが起こらない場合、配列は、相補的なターゲット
配列ではない。プローブは、一本鎖であってもよく、または部分的に一本鎖でありおよび
部分的に二本鎖であってもよい。プローブの鎖は、構造、構成、およびターゲット配列の
特性により決定される。プローブは、ストレプトアビジン複合体が後に結合するビオチン
などのラベルで直接ラベル化または間接的にラベル化されてもよい。

用語「検出プローブ（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ）」は、ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件下、検出のために安定なプローブ：ターゲットハイブリットを
形成するために、ターゲット配列と十分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを意
味する。プローブは通常、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、ターゲッ
ト核酸とのハイブリダイゼーションを妨げないターゲットとされた領域の外側の配列に相
補的な塩基を含んでもよい合成オリゴマーである。ターゲットに相補的ではない配列は、
ホモポリマートラクト（例えば、ｐｏｌｙ－Ａまたはｐｏｌｙ－Ｔ）、プロモーター配列
、制限エンドヌクレアーゼ認識配列、もしくは所望の二次または三次構造をもたらす配列
（例えば、触媒サイトまたはヘアピン構造）、または検出および／または増幅を促進する
ことができるタグ領域でもよい。「安定（ｓｔａｂｌｅ）」または「検出のために安定（
ｓｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」は、反応混合物の温度が前記混合物に含
まれる核酸二本鎖の融解温度（Ｔｍ）より少なくとも２℃低い、好ましくはＴｍより少な
くとも５℃低い、よりさらに好ましくはＴｍより少なくとも１０℃低いことを意味する。

「ラベル（ｌａｂｅｌ）」または「レポーター分子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｍｏｌｅｃｕ
ｌｅ）」は、核酸（単一ヌクレオチドを含む）、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド
、またはタンパク質リガンド、例えばアミノ酸もしくは抗体をラベル化するために有用な
化学的または生化学的部分である。例としては、蛍光剤、化学発光剤、消光剤、放射性ヌ
クレオチド、酵素、基質、補助因子、阻害剤、磁気粒子、および公知のその他の部分を含
む。ラベルまたはレポーター分子は、測定可能なシグナルを生成することができ、オリゴ
ヌクレオチドもしくはヌクレオチド（例えば、非天然ヌクレオチド）またはリガンドに共
有結合または非共有結合することができる。

本明細書において、用語「接触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」およびそのバリアン
トは、任意のセットの成分に関して使用される場合、任意のプロセスを含み、それにより
接触される成分は、同じ混合物に混合され（例えば、同じ区画または溶液に添加される）
、列挙した成分間の実際の物理的接触を必ずしも必要としない。列挙した成分は、任意の
順番および任意の組み合わせ（またはサブコンビネーション）で接触することができ、１
つまたはいくつかの列挙した成分がその後混合物から除かれる（その他の列挙した成分の
添加より前でもよい）状況を含むことができる。例えば、「ＡとＢおよびＣとを接触させ
る（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ Ａ ｗｉｔｈ Ｂ ａｎｄ Ｃ）」は、以下の状況のいずれ
かまたはすべてを含む：（ｉ）ＡがＣと混合され、その後Ｂが混合物に加えられる；（ｉ
ｉ）ＡおよびＢが混合物中に混合する；Ｂを混合物から除き、その後Ｃを混合物に添加す
る；ならびに（ｉｉｉ）ＡをＢおよびＣの混合物に添加する。ターゲット核酸または細胞
と１以上の反応成分、例えばポリメラーゼ、プライマーセットもしくはプローブとを「接
触させる（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」は、以下の状況のいずれかまたはすべてを含む：（
ｉ）ターゲットまたは細胞を反応混合物の第１の成分と接触させて混合物を生成する；そ
の後、反応混合物のその他の成分を任意の順番または組み合わせで混合物に加える；（ｉ
ｉ）反応混合物をターゲットまたは細胞との混合より前に完全に形成する。

本明細書において、用語「混合物（ｍｉｘｔｕｒｅ）」は、散在しており、特定の順序
ではない、要素の組み合わせを意味する。混合物は、不均一であり、空間的のその異なる
物質に分離できない。混合物の要素の例は、同じ水溶液中に溶解された多くの異なる要素
、または異なる要素が空間的に区別されず、個体支持体にランダムにもしくは特定の順番
ではなく付着した多くの異なる要素を含む。換言すると、混合物は、アドレス可能ではな
い。

本明細書において、用語「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、ゲノムを有する任意の生命
体、好ましくは生きている動物、例えば、哺乳類を意味し、診断、治療、観察または実験
の対象である。被検体の例は、ヒト、家畜動物（肉牛および乳牛、ヒツジ、家禽、ブタな
ど）、またはコンパニオン動物（イヌ、ネコ、ウマなど）であり得る。

本明細書において、「サンプル（ｓａｍｐｌｅ）」は、生命体（例えば、患者）から、
または生命体の構成要素（例えば、血液）から得られた任意の生物学的液体または組織を
意味する。サンプルは、任意の生物学的組織、細胞または液体であり得る。サンプルは、
ヒト患者または獣医学的被検体などの被検体に由来するサンプルである「臨床サンプル（
ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）」であり得る。有用な生物学的サンプルは、制限され
ないが、全血、唾液、尿、滑液、骨髄、脳脊髄液、膣粘液、子宮頸管粘液、鼻分泌物、唾
液、精液、羊水、気管支肺胞洗浄液、および患者または被験体からのその他の細胞滲出液
を含む。かかるサンプルは、生理食塩水、バッファーまたは生理学的に許容される希釈剤
でさらに希釈されてもよい。または、かかるサンプルは、従来の方法により濃縮される。
生物学的サンプルはまた、組織学的目的のために採取された凍結切片などの組織の切片を
含むことができる。生物学的サンプルはまた、「患者サンプル（ｐａｔｉｅｎｔ ｓａｍ
ｐｌｅ）」と呼ぶこともできる。生物学的サンプルはまた、実質的に精製されたまたは単
離されたタンパク質、膜調製物、または細胞培養物を含むことができる。

用語「決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」、「測定する（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）」
、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」および「アッセイする（ａｓｓａｙｉｎｇ）」は
、交換可能に使用され、定量的および定性的測定の両方を含み、特性、形質、または特徴
が存在するかどうかを決定することを含む。アッセイすることは、相対的または絶対的な
ものであり得る。ターゲットの存在を評価することは、存在するターゲットの量を決定す
ること、およびそれが存在するか否かを決定することを含む。

本明細書において、用語「基準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」値は、アッセイ結果と比較し
た場合、統計的に特定のアウトカムと相関する値を意味する。好ましい実施形態において
、基準値は、野生型値の平均を分析する統計的分析から決定することができる。基準値は
、閾値スコア値またはカットオフスコア値であってもよい。一般的には、基準値は、１つ
のアウトカムがより可能性がある閾値を超える（またはそれより低い）もの、および代替
のアウトカムがより可能性がある閾値より下のものでもよい。

本明細書に開示されているように、値の差は、病原体（例えば、結核菌（Ｍｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））または突然変異の有無を示す。レベルま
たは値の「差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）」というフレーズは、コントロールまたは基準レ
ベルもしくは基準値と比較して、サンプルにおける検査対象（例えば、プローブ－ターゲ
ットハイブリット）の変数（例えば、Ｔｍ）での差を意味する。一実施形態において、値
またはレベルの差は、コントロールと比較して、サンプルにおける存在する検査対象の量
の間の統計学的に有意な差であり得る。例えば、差は、分析対象の測定レベルが任意のコ
ントロールまたは基準群の平均値の約１．０、２．０、３．０、４．０、または５．０標
準偏差の範囲外である場合、統計学的に有意であり得る。

本明細書に開示されているように、多くの範囲の値が提供される。その範囲の上限およ
び下限の間に、明確に記載されない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値もまた
、具体的に開示されることが理解される。言及した範囲におけるいかなる言及した値また
は介在値と、その言及した範囲におけるその他の言及または介在値との間の、より小さい
範囲のそれぞれは、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、
独立して、範囲に含まれても、含まれなくてもよく、いずれか一方、どちらでもない、ま
たは両方の限界値がより小さい範囲に含まれる範囲のそれぞれはまた、本発明に包含され
、言及した範囲における任意の特定の除外された範囲に依存する。言及した範囲が一つま
たは両方の限界値を含む場合、それらの含まれる限界値のいずれかまたは両方を除外する
範囲もまた、本発明に含まれる。用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、一般的に示された数値の
プラスまたはマイナス１０％を意味する。例えば、「約１０％（ａｂｏｕｔ １０％）」
は、９％～１１％範囲を示すであろうし、「約２０％（ａｂｏｕｔ ２０％）」は、１８
～２２を意味するであろう。「約（ａｂｏｕｔ）」のその他の意味は、四捨五入などの文
脈から明らかであり、よって、例えば「約１（ａｂｏｕｔ １）」はまた、０．５から１
．４を意味するであろう。

用途
リファンピンおよびフルオロキノロン（ＦＱ）耐性に大きく関与しているＭ．ｔｂ突然
変異体を迅速かつ確実に同定する２つの別々なＳＭＢアッセイは、最近説明された（Ｃｈ
ａｋｒａｖｏｒｔｙ，Ｓ．，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ ４９：９３２－９４０；Ｃｈａｋｒａｖｏｒｔｙ，Ｓ．，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，
２０１２，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５０：２１９４－２２０２）。本明細書
に開示されるアッセイは、リアルタイムＰＣＲフォーマットであるという利点を有するの
で、それらは使用が容易であり、単位複製配列二次汚染を受けない。また、突然変異の検
出では、ハイスループット試験に対して頑強で適していることが示されている。以下の実
施例は、ＳＭＢ ＴＢ薬剤耐性検出アッセイシステムを示し、ＡＭＫおよびＫＡＮに対す
る耐性の検出を可能にするアッセイを追加する。本明細書で開示されるアッセイと表現型
感受性試験方法との間の不一致の原因もまた、調査された。結果は、最も一般的に使用さ
れる表現型方法のいくつかが、突然変異がＫＡＮへの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を適度
に増加させるだけの場合、耐性－付与突然変異を有するＭ．ｔｂ単離株を見逃し得ること
を示す。低レベルＫＡＮ耐性に関連するｗｈｉＢ７での新規の突然変異もまた、発見され
た。

本明細書に開示されているように、多重化ＳＭＢ ＰＣＲおよび溶解アッセイ（ｍｅｌ
ｔ ａｓｓａｙ）は、ＡＭＫおよび／またはＫＡＮに対する耐性に関連するｒｒｓ遺伝子
およびｅｉｓプロモーターにおける突然変異を正確に同定した。アッセイは、ＮＴＭ、グ
ラム陽性細菌、およびグラム陰性細菌に対して試験した場合、偽の耐性信号（ｒｅｓｉｓ
ｔａｎｃｅ ｃａｌｌ）を生成しなかった。ヘテロ－抵抗性のほとんどのケースは、存在
する場合、アッセイによっても検出された。ＭＴＢＤＲｓｌプラットフォームとは異なり
、アッセイは、クローズドのリアルタイムＰＣＲシステムで実施することができ、全ての
アッセイの工程が３８４ウェルプレートで行われるように、ハイスループット試験に容易
に適合することができる。ＳＭＢアッセイはまた、突然変異の検出の代替方法に関連する
潜在的な問題を回避する。高分解能融解曲線分析は、融解曲線の微妙な変化を検出する能
力を必要とする（Ｙａｄａｖ，Ｒ．，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ａｐｐｌ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ １１３：８５６－８６２）。その他のポストＰＣＲ融解に基づく分子
アッセイは、複雑な蛍光の輪郭を解読することにより突然変異を検出しなければならない
（Ｒｉｃｅ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
４０：ｅ１６４．）。一方、ＳＭＢアッセイは、明確かつ容易に識別可能なＴｍピーク
および明確なＴｍシフトを生成し、関心ある突然変異を同定する。個々のＴｍ値はまた、
同じ遺伝子型を有するサンプルをクラスター化するために使用することができる。

本明細書に開示されているように、アッセイは、ＴＢの新たなケースと未解決の再処置
のケースの両方を表す６０３の臨床サンプルのパネルで試行され、臨床単離株の感受性パ
ターンを有するターゲットの突然変異の関係を評価した。ｒｒｓ Ａ１４０１Ｇ突然変異
を有する単離株の１００％は、ＡＭＫおよびＫＡＮの両方に対する高いレベルの耐性と強
い相関を有することが観察された。しかし、ｅｉｓプロモーター突然変異は、中（ｍｏｄ
ｅｒａｔｅ）から低レベルＫＡＮ耐性およびＡＭＫに対する耐性がないことだけをもたら
し、これは、以前の研究と一致している（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ，２
０１１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５５：２０３２－
２０４１；Ｚａｕｎｂｒｅｃｈｅｒ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ Ｎ
ａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０６：２０００４－２０００９）。本研究は
また、感受性試験のためのＬＪ絶対濃度法が中から低レベルのＫＡＮ耐性を適切に検出し
ないことを示した。実際には、ｅｉｓプロモーター変異を有するサンプルのほぼ３分の２
は、ＬＪ培地におけるＫＡＮ感受性として検出された。しかし、ｅｉｓプロモーター変異
を有する１つのサンプルを除くすべてがＭＧＩＴ法によりＫＡＮ耐性として検出された。
２つのかかる単離株は、ｅｉｓ Ｃ（－１２）Ｔ突然変異を含んだ。これらの突然変異体
はまた、ＭＹＣＯＴＢにより試験した場合、ＫＡＮにも耐性であり、５μｇ／ｍｌのＫＡ
Ｎ ＭＩＣを示した。これまでの研究は、Ｃ（－１２）Ｔ突然変異を有する臨床単離株が
ＫＡＮ耐性と相関がないこと（Ｚａｕｎｂｒｅｃｈｅｒ（２００９））または相関が低い
こと（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，２０１１；Ｈｏｓｈｉｄｅ，Ｍ．，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２０１
４，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５２：１３２２－１３２９．）を示唆している
。これらの研究はおそらく、表現型感受性を確立するために使用された試験方法によりこ
の突然変異と低レベルＫＡＮ耐性との関係を見落としていた。これらの結果は、ＭＧＩＴ
またはＭＹＣＯＴＢ法がＫＡＮに対する表現型耐性を試験するのに好ましいはずであるこ
とを示唆している。それらはまた、本明細書に開示されるように、低レベル耐性を引きお
こし、表現型試験単独では見落とされるであろう突然変異を検出するための遺伝子型耐性
試験の力を強調している（Ｒｉｇｏｕｔｓ，Ｌ．，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｃ
ｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５１：２６４１－２６４５；Ｓｉｒｇｅｌ，Ｆ．Ａ．，ｅ
ｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｉｃｒｏｂ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ １８：１９３－１９７
；およびＶａｎ Ｄｅｕｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ ５１：２６３３－２６４０）。

ここでの一揃いの研究は、ｒｒｓ野生型およびｒｒｓ Ｃ１４０２Ｔ突然変異体の混合
物である１つのサンプルが含まれていた。このサンプルは、ＬＪ培地においてＡＭＫおよ
びＫＡＮの両方に対して感受性であった。Ｃ１４０２Ｔ突然変異を有する単離株は、ＡＭ
Ｋに対して感受性であるがＫＡＮに対して耐性であることが報告されている（Ｍａｕｓ，
Ｃ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏ
ｔｈｅｒ ４９：３１９２－３１９７）。この特定のケースにおいて、ＬＪ培地を用いた
度重なる感受性試験は、おそらくサンプルのヘテロ－耐性のために、ＫＡＮに対する感受
性を示した。ここで、ＳＭＢアッセイが野生型および突然変異のＤＮＡ型の両方の存在を
明確に検出したので、表現型アッセイよりも潜在的に生じる耐性のよりよい予測因子とし
て役立った。

ＡＭＫまたはＫＡＮ耐性を有する臨床株におけるｒｒｓ１４８４突然変異の発生率は、
とても低いものであり（Ｇｅｏｒｇｈｉｏｕ，Ｓ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＰＬ
ｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ３３２７５）、その臨床的意義は議論の余地がある。ｒｒｓ１４８
４コドンをターゲットにした別のバージョンのアッセイは、６０３の単離株のいずれにお
いて、および３３のＡＭＫおよびＫＡＮ耐性単離株を含んでいた、ニュージャージー－ニ
ューヨークエリアからの追加の２５９の単離株においていかなる突然変異を検出しなかっ
た。この拡大された一揃いの研究において、いかなるｒｒｓ １４８４突然変異の欠如は
、サンガーシークエンシングにより確認された（データ示さず）。ｒｒｓ １４８４突然
変異の非常に低い罹患率に照らすと、このコドンは、アミノグリコシド耐性を予測する上
で、大きな価値を提供するとは考えにくい。したがって、アミノグリコシド耐性の分子ア
ッセイは、ｒｒｓ遺伝子の１４０１～１４０２コドンのみをターゲットにすることが推奨
される。

２２のＡＭＫまたはＫＡＮ耐性サンプルは、ｒｒｓ遺伝子およびｅｉｓプロモーター領
域において野生型配列を有することが見出された。最近の研究は、説明できないＫＡＮ耐
性を有する単一の臨床株での５’ＵＴＲ ｗｈｉＢ７突然変異を同定することにより、ｗ
ｈｉＢ７突然変異の５’ＵＴＲでの突然変異とＫＡＮ耐性との間の関連の可能性を示して
いる（Ｒｅｅｖｅｓ，Ａ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇ
ｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５７：１８５７－１８６５）。ＫＡＮ耐性に関連すると
思われる、いくつかの新規５’ＵＴＲ ｗｈｉＢ７突然変異、および欠失もまた示された
。野生型ｒｒｓ、ｅｉｓプロモーター領域を有する臨床株の残り１５～２０％におけるＫ
ＡＮおよびＡＭＫ耐性を説明できる、適切で普遍的なバイオマーカーは同定されていない
。ＫＡＮまたはＡＭＫ耐性亜集団からの微量の変異体ターゲットと混合された野生型ｒｒ
ｓ遺伝子およびｅｉｓプロモーター領域ＤＮＡを含むサンプルはまた、表現型耐性試験と
本明細書に開示されるＳＭＢアッセイとの間の残りの不一致を説明できる。しかし、ヘテ
ロ耐性の高額な調査は、この研究の範囲を超えている。いくつかの最近の研究は、臨床の
場面において確認されることが残っているが、ＰＰＥ６０およびＲｖ３１６８遺伝子が説
明できないＫＡＮ耐性に関連する可能性を示唆している（Ｆａｒｈａｔ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ
ａｌ．，２０１３．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４５：１１８３－１１８９；Ｚｈａｎｇ，Ｈ
．，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４５：１２５５－１２６０）。

要約すると、高感度で特異的なアッセイは、Ｍ．ｔｂにおけるＡＭＫおよびＫＡＮ耐性
の検出のために開発され、ＭＤＲおよびＸＤＲ ＴＢの罹患率が高い臨床単離株でそれを
実証した。結果は、ｒｒｓ Ａ１４０１Ｇ突然変異がＡＭＫおよびＫＡＮの両方に対する
高レベルの交差耐性をコードし、ｅｉｓプロモーター突然変異が以前の機能的ゲノム研究
と一致する、中から低レベルのＫＡＮ耐性をコードすることを示す（Ｚａｕｎｂｒｅｃｈ
ｅｒ ２００９）。本明細書に開示されたアッセイの性能と固体および液体培地における
３つの異なる表現型感受性試験方法とを比較すると、ｅｉｓプロモーター突然変異により
引き起こされる低から中レベルのＫＡＮ耐性がＬＪに基づく感受性試験により大きく見落
とされていることが明らかになった。これらの結果は、アミノグリコシド耐性を検出する
ための遺伝子型試験の価値を強く示し、結果は、本明細書に開示されるＳＭＢに基づくア
ッセイの特異的有用性を明らかにする。

実施例１
この実施例は、下記実施例２～７で使用した材料および方法を記載する。

ＤＮＡサンプル
Ｍ．ｔｂテストサンプルは、大韓民国カンウォンのナショナルマサン病院のＭＤＲ結核
（ＮＣＴ００３４１６０１ ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）の自然史研究に登
録された５０３人の患者から培養された６０３の一連の単離株から単離されたＤＮＡから
構成された。２つのコホートを試験した。コホートＡは、未治療の新たに疑われるＴＢの
ケース（１５８サンプル）から構成され、コホートＢは、再治療のＴＢケース（４４５サ
ンプル）から構成された。新鮮な唾液サンプルを処置の開始時に各患者から採取し、Ｍ．
ｔｂを培養した。患者のサブセットにおいて、反復して唾液サンプルを処置の１、４およ
び６月目に採取し、まｔＭ．ｔｂのために培養された。非結核性抗酸菌（Ｎｏｎ－Ｔｕｂ
ｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）（ＮＴＭ）ならびにグラム陽性および
グラム陰性菌テストサンプルを以前に記載のＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓ
ｃｈｏｏｌ（ＮＪＭＳ） ＤＮＡリポジトリから採取した（Ｃｈａｋｒａｖｏｒｔｙ，Ｓ
．，２０１２．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５０：２１９４－２２０２）。

表現型薬剤感受性試験
表現型薬剤感受性試験（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｄｒｕｇ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉ
ｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ）は、韓国のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ
ｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ （ＩＴＲＣ）で、ＬＪ培地上で絶対濃度法によ
り６０３の単離株の全てで行われ、両方の抗生物質（Ｊｎａｗａｌｉ，Ｈ．Ｎ．，２０１
３，Ｄｉａｇｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ７６：１８７－１９６）
に対して４０μｇ／ｍｌの臨界濃度（２０１２年の間に、単離株を試験したときに使用し
た標準濃度）を用いてＡＭＫおよびＫＡＮに対する感受性を決定した。１７３／６０３サ
ンプルのＡＭＫおよびＫＡＮに対するＭＩＣもまた、以前に記載されているように（Ｌｅ
ｅ，Ｊ．，２０１４，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５８
：１１－１８）、ＴＲＥＫ Ｓｅｎｓｉｔｉｔｒｅ（登録商標） ＭＹＣＯＴＢ ＭＩＣ
プレート（“ＭＹＣＯＴＢ”；ＴＲＥＫ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｌ
ｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）を用いて評価された。５６０／６０３サンプルにつ
いて、ＫＡＮに対する耐性はまた、２．５μｇ／ｍｌの臨界濃度でＭｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ Ｔｕｂｅ （ＭＧＩＴ）システム（Ｂｅｃ
ｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて
評価された。ターゲット遺伝子のサンガーシークエンシング結果と一致しなかった表現型
感受性試験結果を有するサンプルについて、表現型感受性試験を繰り返して、初期の所見
を確認した。ＭＧＩＴおよびＬＪ感受性試験結果が不一致を示した場合、両方のアッセイ
を繰り返して、初期の所見を確認または修正した。

ＤＮＡ調製およびシークエンシング
ＳＭＢアッセイ試験およびサンガーシークエンシングのためのＤＮＡは、１０～１５分
間、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００の存在下で２００μｌのＩｎｓｔａｇｅｎｅ Ｍ
ａｔｒｉｘ樹脂（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ Ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）中の一白金耳量の培養物をボイルすることにより培養した単
離株から調製された。上清を遠心分離後に回収し、Ｎａｎｏｄｒｏｐマイクロボリューム
分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍ
ａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を用いて定量した。サンガーシークエンシングのた
めに、ｒｒｓ遺伝子の２つの異なる断片（ヌクレオチド４２０～９８０および１２９３～
１５３７）ならびに上流のｅｉｓコード領域およびｅｉｓプロモーター全体を０．５μＭ
のフォワードおよびリバースプライマー１Ｘ ＰＣＲバッファー、２５０ｍＭ ｄＮＴＰ
ｓ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および０．０３Ｕ／μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ酵素 （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉ
ｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて、以下のパラメータに従って増幅した：
最初の変性を９５℃で１０分間、続いて９５℃で１０秒、５８～６０℃で３０秒、および
単位複製配列のサイズに依存して７０℃で１０～３０秒の４０サイクル。ｅｉｓプロモー
ター領域およびｒｒｓ遺伝子断片を以前に記載されているように（１０，３３）増幅した
。サンプルのサブセットについて、４１２ｂｐの５’非翻訳領域およびＯＲＦからの１２
６ｂｐを含むｗｈｉＢ７遺伝子からの５３８ｂｐの断片を増幅し、ｗｈｉＢ７Ｆ ５’ａ
ａａｃｇｃｇｃａｇｇｔｃａｇａａａａｔ ３’およびｗｈｉＢ７Ｒ ５’ｃａｇｔｇｔ
ｃｔｔｇｇｃｔａｃｃｔｃｇａ ３’（配列番号７０および７１）のプライマーを用いて
配列決定した。さらに、ほぼ全体のｗｈｉＢ７ ＯＲＦを含む、ｗｈｉＢ７遺伝子からの
２７５ｂｐの断片もまた、ｗｈｉＢ７－ｉｎｇｅｎｅ－Ｆ ５’ ＧＴＣＧＧＴＡＣＴＧ
ＡＣＡＧＴＣＣＣＣ ３’およびｗｈｉＢ７－ｉｎｇｅｎｅ－Ｒ ５’ＡＴＧＣＡＡＣＡ
ＧＣＡＴＣＣＴＴＧＣＧ ３’（配列番号７２および７３）のプライマーを用いて増幅し
た。ＰＣＲ産物は、製造業者の説明書に従い、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ，ｖ
ｅｒｓｉｏｎ ３．１，ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる３１３０ＸＬ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ－ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉａ，ＵＳＡ）で遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマーを用いて、双方向性
のシークエンシングを受けた。

アッセイ分子ビーコンおよびプライマー
ＳＭＢアッセイは、ｒｒｓ遺伝子のコドン１４０１および１４０２のＭ．ｔｂ突然変異
およびｅｉｓ遺伝子のプロモーター領域に沿った突然変異をターゲットにした。１１３ｂ
ｐの断片（ヌクレオチド１３３５～１４５１）をＡＭＧ－Ｆ（５’－ＧＣＴＡＧＴＡＡＴ
ＣＧＣＡＧＡＴＣＡＧＣＡＡＣＧＣＴＧＣ－３’，配列番号５１）およびＡＭＧ－Ｒ（５
’－ＣＣＴＣＣＣＧＡＧＧＧＴＴＡＧＧＣＣＡＣＴ－３’，配列番号５２）のプライマー
を用いてｒｒｓ遺伝子から増幅し、プロモーター領域およびｅｉｓ遺伝子の最初の５つの
コドン（ヌクレオチド－８１から１７）を包含する９８ｂｐの断片をｅｉｓ－Ｆ（５’－
ＣＡＣＡＧＧＧＴＣＡＣＡＧＴＣＡＣＡＧＡＡＴＣ－３’，配列番号１８）およびｅｉｓ
－Ｒ（５’－ＧＣＡＴＣＧＣＧＴＧＡＴＣＣＴＴＴＧＣＣＡＧＡＣ－３’，配列番号５３
）のプライマーを用いて増幅した。ｒｒｓプライマーは、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｅｎｕｓ）に特異的に設計され、ｅｉｓプライマーは、Ｍ．ｔ
ｂ複合体に特異的に設計された。１つのＳＭＢプローブｒｒｓ－１４００（５’－６ｃａ
ｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｃａｃｇａｃｃｇｃｃｃｇｔｃａｃｇｔｃａｔｇａ
ａａｇｔｃｇｇｔｃｇｔｇ－ＢＨＱ１－３’，配列番号５９）と２つのＳＭＢプローブｅ
ｉｓ－１（５’－Ｃｙａｎｉｎｅ５－ｃａｇｇｃｇｇｔｃｇｔａａｔａｔｔｃａｃｇｔｇ
ｃａｃｃｔｇｇｃｃｇｃｃｇｃｃｔｇ－ＢＨＱ２－３’，配列番号１６）およびｅｉｓ－
２（５’－ＴｅｘａｓＲｅｄ－ｃｔｃｇｃｇｇｃａｔａｔｇｃｃａｃａｇｔｃｇｇａｔｔ
ｃｔｃｔｇａｃｇｃｇａｇ－ＢＨＱ２－３’，配列番号６１）（配列がＳＭＢのステム部
分を示すものおよびＢＨＱがブラックホールクエンチャーを示すものに下線を引いた）と
は、それそれｒｒｓ遺伝子およびｅｉｓプロモーター領域に対するターゲットとされた。
ｒｒｓプローブは、アンチセンス鎖に相補的であるように設計され、ｅｉｓプローブは、
センス鎖に相補的であるように設計された。ＳＭＢは、ｈｔｔｐ：／／ｍｆｏｌｄ．ｒｎ
ａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＿ｍｆｏｌｄ／ｄｎａ－ｆｏｌｄｉｎｇ－ｆｏｒｍのｉ
ｎ ｓｉｌｉｃｏ ＤＮＡフォールディングプログラムを用いて設計され、ｈｔｔｐ：／
／ｍｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＿ＤＩＮＡＭｅｌｔ／Ｔｗｏ－ｓｔ
ａｔｅ－ｍｅｌｔｉｎｇのプローブ－ターゲットハイブリッドフォールディングプログラ
ムは、可能なプローブ－ターゲットハイブリッド構造および溶解温度（Ｔｍ）を予測する
ために使用された。プローブは、明確な突然変異の同定を可能にするために、それぞれの
標的領域における野生型配列および突然変異体配列の間の最大のＴｍ差を生成するように
設計された。プライマーは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓ
ｏｕｒｉ，ＵＳＡ）から、ＳＭＢプローブは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ（Ｎｏｖａｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から手に入れた。

アッセイ手順
全てのサンプルは、アッセイの検証が盲検法で行われることを確保するために、独立し
てコード化して、ランダムに分配された。アッセイは、韓国マサンのＩＴＲＣおよびニュ
ージャージーメディカルスクール（ＮＪＭＳ），Ｒｕｔｇｅｒｓ，Ｎｅｗａｒｋ，Ｎｅｗ
Ｊｅｒｓｅｙの両方で試験された。６０３サンプル全体の試験が完了すると、サンプル
はデコードされ、ＰＣＲ結果は、対応するシークエンシング、および表現型薬剤感受性試
験結果と比較された。各サイトで得られた結果も比較された。アッセイ結果は、治療する
医師に報告されず、いかなる治療決定を導くために使用されなかった。ＰＣＲは、Ｒｏｃ
ｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＩＩ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓ
ｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏ．Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎ
ｄｉａｎａ，ＵＳＡ）を用いて３８４ウェルプレートで実施され、２０μｌの反応ボリュ
ームは、ｒｒｓ遺伝子のための１００ｎＭのフォワードプライマーおよび１μＭのリバー
スプライマーならびにｅｉｓプロモーター領域のための１μＭフォワードプライマーおよ
び５０ｎＭリバースプライマー、１ｎｇ／μｌのｒｒｓ－１４００およびｅｉｓ－１プロ
ーブならびに０．８ｎｇ／μｌのｅｉｓ－２プローブ、４ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２５０ｍＭ
デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、１Ｘ ＰＣＲバッファー、８％グリセロ
ール、０．０６Ｕ／μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標） ＴｆｉＥｘｏ（－） ＤＮＡ
ポリメラーゼ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ），ならびに２から５ｎｇのサンプルＤＮＡまたは等ボリューム
の水を含む。ＰＣＲは、以下の工程で実施された：９５℃で２分間の酵素の活性化、続い
て９５℃で１０秒間の変性および６７℃で３０秒間のアニーリングと伸長との組み合わせ
の５０サイクル。ＰＣＲサイクル後、１℃あたり１データの取得速度でプロセス中の蛍光
の連続モニタリングと共に、９５℃で２分間の変性後、４５℃に冷却して、８５℃に徐々
に加熱することにより、ポストＰＣＲ－Ｔｍ分析を行った。Ｔｍ値は、Ｔｍコーリングソ
フトウェア（Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて反応終了
時に同定された。しかし、各Ｔｍはまた、Ｔｍ値の最終的な同定が行われる前に、訓練を
受けた観察者により検証された。野生型および突然変異体のＴｍに対応する任意のプロー
ブの明確なダブルピークを示すサンプルは、ヘテロ耐性を示すと考えられた。テンプレー
トとしてＤＮＡの代わりに滅菌水を用いたテンプレートなしのコントロールは、ＤＮＡ－
ネガティブコントロールとして使用され、テンプレートとしてＭ．ｔｂ Ｈ３７Ｒｖから
の１ｎｇのゲノムＤＮＡを用いたＤＮＡ－ポジティブコントロールはまた、各アッセイプ
レートに含まれた。

ヒト被検体の承認
この研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｓａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ＮＩＡＩＤおよびＲ
ｕｔｇｅｒｓ（旧ＵＭＤＮＪ）ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄ
ｓにより承認され、すべての被検体は、同意書を渡した（Ｒｕｔｇｅｒｓ ＩＲＢ ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌ ｎｕｍｂｅｒ ０１２００９０１０４）。

実施例２．野生型および突然変異体の配列に関連するＴｍ値の同定
本明細書に開示されるＳＭＢに基づくアッセイは、耐性との関連性が知られているＭ．
ｔｂのｒｒｓ遺伝子およびｅｉｓプロモーターにおける突然変異を探すことによりＡＭＫ
およびＫＡＮに対する耐性を検出した。本アッセイは、ｒｒｓおよびｅｉｓターゲット単
位複製配列の一部分に相補的なＳＭＢプローブの存在下でのＴｍ分析に続くＰＣＲ工程か
らなる。本発明者らは、最初に、人工オリゴヌクレオチドでのターゲットの突然変異を同
定するためにアッセイの能力を評価し、選択された野生型および突然変異体のＭ．ｔｂ株
からのＤＮＡテンプレートを配列決定した（データ示さず）。野生型の配列は、野生型タ
ーゲットの既知の平均値の１℃以内のＴｍ値の存在によって同定された。突然変異体の配
列は、平均野生型Ｔｍ値から少なくとも５標準偏差のＴｍ値のシフトによって同定された
。ＡＭＫおよびＫＡＮ耐性に関連する最も一般的な突然変異を検出する本アッセイの能力
は、その後の臨床ＤＮＡサンプルで評価された。試験は、野生型配列を有する４８７のサ
ンプルおよびアッセイターゲットに突然変異を有する１１６のサンプルからなる、６０３
の臨床サンプルのパネルで行われた。これらのサンプルの５つは、野生型およびサンダー
シークエンシングで検出された突然変異株のＤＮＡの混合物を有していた。ＳＭＢアッセ
イは、突然変異体または混合として１１５／１１６（９９％）の突然変異体または混合（
突然変異体および野生型のＤＮＡの両方を含む不均一サンプル）サンプルおよび野生型と
して４８７／４８７（１００％）の純野生型サンプルを正確に同定した。ただ一つの混合
サンプル（サンガーシークエンシングにより示される）は、本明細書で開示するアッセイ
により野生型サンプルとして同定された。野生型および突然変異体のターゲットの設定に
おいて各ＳＭＢプローブにより生成されたＴｍ値は、高い再現性があった。野生型ターゲ
ットについて、ｒｒｓ－１４００、ｅｉｓ－１およびｅｉｓ－２のプローブは、それぞれ
７０．１℃±０．１５、６３．９℃±０．１９および６９℃±０．２３の平均Ｔｍ値を示
した（表３）。Ａ１４０１ＧおよびＣ１４０２Ｔの突然変異体のＴｍターゲットについて
、突然変異は、それぞれプローブｒｒｓ－１４００におけるＴｍ値の３．９℃（±０．１
７）および５．６℃（±０．２１）の減少もたらした（表３）。同様に、ｅｉｓ－１およ
びｅｉｓ－２プローブは、期待された野生型Ｔｍ値と比較して、Ｔｍ値の４．３℃から６
．５℃の減少を発生させることによって突然変異としてｅｉｓプロモーター領域における
突然変異の範囲を確実に検出した（表３）。ＲｕｔｇｅｒｓおよびＩＴＲＣでの２つの異
なる実験室で実施されたＰＣＲアッセイは、野生型および突然変異体ならびに混合物とし
て検出されたすべてのサンプルについて完全に一致した。

アッセイの結果は、我々が個々の３点Ｔｍパターンに基づき、６０３のサンプルを野生
型および突然変異体のＴｍクラスター型に明確に分離することを可能にした（図１）。本
アッセイは、Ａ１４０１Ｇ突然変異のみを含む７５サンプルの全てにおいて突然変異を正
しく同定した（表３、図２パネルＡ）。Ａ１４０１Ｇおよび野生型配列の混合物を含む４
つのサンプルのうち３つはまた、二重のＴｍピークの存在に基づき、混合野生型／突然変
異体として検出された。Ｃ１４０２Ｔ突然変異および野生型ＤＮＡの混合物を含むただ一
つのサンプルはまた、Ｃ１４０２Ｔ突然変異に特異的な突然変異体のＴｍを有するサンプ
ルからの二重のＴｍピークの存在によって同定された（表３、図２パネルＡ）。ｅｉｓプ
ロモーター領域の突然変異を有する３２のサンプルは、５つの異なる多型（－８、－１０
、－１２、－１４および－３７の位置）を含んだ。これらの突然変異のすべては、ｅｉｓ
ＳＭＢのいずれか一つによって成功裏に検出された（表３、図２パネルＢおよびＣ）。
ｒｒｓ遺伝子およびｅｉｓプロモーター領域の両方に突然変異を有する４つのサンプルは
また、二重突然変異体として正しく検出された（表３）。ｒｒｓ遺伝子のシークエンシン
グは、その薬剤感受性パターンにもかかわらず、コドン１４８４突然変異を有するサンプ
ルのいずれも同定しなかった。

アミカシン耐性の同定
この実施例では、アッセイを行い、表現型薬剤感受性試験結果と比較して、分子アッセ
イの性能を評価した。遺伝型薬剤感受性試験の見かけの性能は、試験に含まれるために選
択された突然変異およびゴールドスタンダードとして使用される表現型アッセイに依存し
て変化しうる（Ｋｉｍ，Ｓ．Ｊ．２００５ Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ２５：５６４－
５６９；Ｒｉｇｏｕｔｓ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ ５１：２６４１－２６４５；およびＶａｎ Ｄｅｕｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２
０１３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５１：２６３３－２６４０）。ＬＪに基づ
く薬剤感受性試験方法をゴールドスタンダードとして考慮すると（６０３の試験サンプル
すべてに対して実施された）、Ａ１４０１Ｇ突然変異のｒｒｓ ＳＭＢ Ｔｍ特性は、Ａ
ＭＫ耐性サンプルの８２／９０を耐性として分類した（９１．１％の感度；９５％ＣＩ、
８２．８％から９６．８％）。野生型Ｔｍは、ＡＭＫ感受性サンプルの５１２／５１３を
感受性として分類した。５１３のＡＭＫ感受性単離株中のただ一つの単離株は、野生型Ｔ
ｍおよび特異的なＣ１４０２Ｔ突然変異体Ｔｍに対応する、ｒｒｓ ＳＭＢプローブによ
って生成された明らかな二重ピークの存在により、本明細書に開示されるＳＭＢアッセイ
によって野生型およびＣ１４０２Ｔ突然変異体のＤＮＡの混合物として同定された（図２
パネルＡ）。これは、サンガーシークエンシングによっても確認された。これまでの研究
では、Ｃ１４０２Ｔ突然変異がＡＭＫ耐性をコードしていないことが示されているため（
２４）、Ｃ１４０２Ｔ突然変異に対応する特異的なＴｍは、ＡＭＫ感受性の指標として考
えることができる。この考察は、１００％の特異性（９５％ＣＩ、９９から１００％）を
もたらすすべての５１３／５１３ＡＭＫ感受性サンプルを正しく検出する本明細書に開示
されるアッセイをもたらした。分析においてｅｉｓプロモーター領域での突然変異に特徴
があるＴｍ値を含むことは、ＡＭＫ耐性を検出する感受性を増加させないが、特異性は１
００％から９３．８％に減少した（９５％ＣＩ、９１．２から９５．６％）。これらの結
果は、ｅｉｓプロモーター突然変異がＬＪ薬剤感受性試験によって明らかにされたように
ＡＭＫ耐性に関連しないことを示唆する以前の報告と一致する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ２０
１１およびＺａｕｎｂｒｅｃｈｅｒ ２００９）。

実施例４．カナマイシン耐性の同定
ＫＡＮ耐性を検出するアッセイの性能はまた、６０３のサンプルのすべてについてゴー
ルデンスタンダードとしてＬＪに基づく薬剤感受性試験を用いて評価された。耐性を明ら
かにするためにＡ１４０１ＧまたはＣ１４０２Ｔ突然変異のいずれかに典型的な本明細書
に開示されたｒｒｓ ＳＭＢにより生成されたＴｍ値を用いて、本アッセイは、８２／１
０６サンプルをＫＡＮ耐性として検出した（感受性７７．４％；９５％ＣＩ ６８．０か
ら８４．７％）。逆に、感受性を明らかにするために野生型ターゲットに特徴的なｒｒｓ
ＳＭＢ Ｔｍを用いると、４９６／４９７のＫＡＮ感受性サンプルが感受性として同定
された（表４）（特異性９９．８％；９５％ＣＩ、９８．７から１００％）。ｅｉｓプロ
モーター領域において突然変異に特徴的な２つのｅｉｓＳＭＢのＴＭ値を耐性の定義に加
えると、１１の追加のＫＡＮ耐性サンプルが耐性として分類されたので、ＫＡＮ耐性を検
出する感受性が７７．４％から８７．７％（９５％ＣＩ、７９．５から９３％）に増加し
た。しかし、ｅｉｓプロモーター突然変異を有する２１のＫＡＮ感受性サンプルが現状Ｋ
ＡＮ耐性として「誤って（ｆａｌｓｅｌｙ）」検出されたので、特異性は、９９．８％か
ら９５．６％（９５％ＣＩ、９３．３から９７．１％）に減少した（表４）。

次に、ＭＧＩＴ結果が利用可能であった５０６のサンプルのゴールドスタンダードとし
て、ＭＧＩＴに基づく薬剤感受性試験結果を用いて同様の分析を行った。このサブセット
は、ｅｉｓプロモーター突然変異のみを有する全てのサンプルを含んでいた。アッセイ結
果とＭＧＩＴに基づくゴールドスタンダードとの比較は、ＬＪ培地における不一致なＫＡ
Ｎ耐性を有するｅｉｓ突然変異体を明らかにするのに役立った。ＫＡＮ耐性を明らかにす
るためにゴールドスタンダードとしてＭＧＩＴおよびＡ１４０１ＧまたはＣ１４０２Ｔ突
然変異に特徴的なｒｒｓ ＳＭＢ Ｔｍ値のみを用いると、６３／１１３のＫＡＮ耐性サ
ンプルだけがＳＭＢアッセイによって耐性のあるものとして同定された（感受性５５．８
％；９５％ＣＩ、４６．１から６５％）。逆に、感受性を明らかにするために野生型ター
ゲットに特徴的なｒｒｓ ＳＭＢ Ｔｍを用いると、４４５／４４７サンプルをＫＡＮ感
受性として同定した（感受性９９．８％；９５％ＣＩ、９＋８．５から１００％；表４）
。ＬＪに基づく感受性試験の場合とは異なり、この場合におけるｅｉｓプロモーター突然
変異に特徴的なＴｍ値を含むことで、９９．５％（９５％ＣＩ、９８．２から１００％）
と非常に高いままであるＫＡＮ耐性のアッセイの特異性を用いて、耐性試験の感受性が５
５．８％から８２．３％へと増加した。したがって、ＭＧＩＴに基づく感受性試験に基づ
いて、ｅｉｓアッセイは、特異性に影響を及ぼすことなく２９の追加のＫＡＮ耐性サンプ
ルの検出を可能にした（表４）。

実施例５．本アッセイおよびＭｉｃによって検出された突然変異間の関係
本明細書で開示されるアッセイにより明らかにされた耐性と本明細書で開示される２つ
の表現型感受性試験方法によって明らかにされた耐性との間の不一致は、主にｅｉｓプロ
モーター突然変異を有する単離株に関係していた。以前の研究は、ｅｉｓプロモーター突
然変異が比較的低レベルのＫＡＮ耐性を引き起こし、一方ｒｓｓ遺伝子突然変異がＡＭＫ
、ＫＡＮおよびＣＡＰに対する高レベルの耐性をもたらすことを示している（Ｃａｍｐｂ
ｅｌｌ ２０１１；Ｄｕ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｄｉａｇｎ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ７７：１３８－１４２；Ｇｅｏｒｇｈｉｏｕ ２０１２；
およびＺａｕｎｂｒｅｃｈｅｒ ２００９）。結果についてのさらなる知見は、ＬＪ対Ｍ
ＧＩＴに基づく感受性試験結果の間の不一致であった。ＭＩＣ試験は、ｒｒｓおよびｅｉ
ｓプロモーター突然変異、ならびにＬＪおよびＭＧＩＴシステムにおけるそれらの感受性
パターンの間の関係をより慎重に探索するために行われた。ＡＭＫおよびＫＡＮ（および
ターゲット領域の両方で野生型）の両方に対して感受性であるもの、または２つのターゲ
ット遺伝子（ｒｒｓ Ａ１４０１Ｇならびにｅｉｓ Ｇ（－１０）Ａ、Ｃ（－１４）Ｔお
よびＧ（－３７）Ｔ）における最も一般的な突然変異型を代表するように選択されるもの
いずれかであるサンプルは、ＭＹＣＯＴＢ法によって試験され、それらのＭＩＣを決定し
た。アッセイターゲットの両方における野生型として知られる追加の単離株もまた、コン
トロールとして試験された。ｅｉｓプロモーター突然変異のみ（ｒｒｓ突然変異なし）を
有する単離株のＡＭＫ ＭＩＣは、０．５μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌのＭＩＣを示すサ
ンプルの大部分で、０．２５μｇ／ｍｌおよび２μｇ／ｍｌの間の範囲であることが観察
された（図３）。一つのｅｉｓプロモーター突然変異体だけが４μｇ／ｍｌのＡＭＫ Ｍ
ＩＣを有した。ｅｉｓプロモーターまたはｒｒｓ突然変異を有さないコントロールの単離
株は、０．２５μｇ／ｍｌおよび０．５μｇ／ｍｌの範囲の間にＭＩＣを有した。したが
って、野生型または突然変異体のｅｉｓプロモーター配列のいずれかを有する単離株のＡ
ＭＫ ＭＩＣは、実質的に重複していた。一方、同じｅｉｓプロモーター突然変異のほと
んどのＫＡＮ ＭＩＣは、５μｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌの範囲であり、一つの単離株
が４０μｇ／ｍｌのＭＩＣを示した（図３）。２つのｅｉｓプロモーター突然変異体だけ
が２．５μｇ／ｍｌの低いＭＩＣを有した。野生型ｅｉｓプロモーター配列を有する単離
株は、ｅｉｓプロモーター突然変異体の平均ＭＩＣの２から３０分の１である、０．６μ
ｇ／ｍｌおよび２．５μｇ／ｍｌの間のＭＩＣを示した（図３）。したがって、ＡＭＫの
状況とは対照的に、野生型単離体のＫＡＮ ＭＩＣは、ｅｉｓプロモーター突然変異体の
ＫＡＮ ＭＩＣとほとんど重複しなかった。これらの結果は、耐性がＬＪに基づくまたは
ＭＧＩＴに基づく感受性試験で検出されなくても、ｅｉｓプロモーター突然変異体が小か
ら中レベルＫＡＮ耐性を有すると考えられるべきであることを強く示唆する。

実施例６．Ｍ．ｔｂ以外の菌に対するアッセイ特異性
本アッセイの分析特異性は、ＡＴＣＣリポジトリ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉ
ａ、ＵＳＡ）から得られた非結核性マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）（Ｎ
ＴＭ）の１８種、２６種を代表する１２１の臨床ＮＴＭ株、ならびにグラム陽性およびグ
ラム陰性菌の１８種のパネルに対して試験された。本アッセイでターゲットとするｒｒｓ
領域は、異なるＮＴＭ種の間で高度に保存されている。したがって、ｒｒｓアッセイは、
いかなるＴｍも生成しない、Ｍ・ゼノピ（Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ）を除き、配列ホモロジーに
基づいて予想されたとおり、試験したすべてのＮＴＭについて７０℃のＴｍを生成した（
野生型Ｍ．ｔｂ ＤＮＡの存在下で生成されたＴｍと同一である）。アミノグリコシド感
受性Ｍ．ｔｂと同一のＴｍ値を生成するＮＴＭ種は、偽の耐性試験結果の原因になるとは
予想されない。ｒｒｓ突然変異体ＡＭＫおよびＫＡＮ耐性株からのＭ．ｔｂ ＤＮＡが１
０から２０倍過剰なＮＴＭ ＤＮＡと混合された場合、明確な二重Ｔｍピークがアッセイ
によって生成され、Ｍ．ｔｂターゲットからの突然変異体Ｔｍ値およびＮＴＭ配列からの
野生型Ｔｍ値（データ示さず）に相当することは、耐性－関連ｒｒｓ突然変異がＮＴＭ
ＤＮＡの大きなバックグラウンドの存在下でさえ本アッセイによってＭ．ｔｂで検出され
得ることを示している。１０^７ゲノム当量のＤＮＡをＰＣＲアッセイに添加した場合でさ
え、試験した任意のＮＴＭ種の存在下で、ｅｉｓプローブによって明らかな融解曲線は生
成されなかった。グラム陽性またはグラム陰性菌のいずれも、ｒｒｓまたはｅｉｓ ＳＭ
ＢのいずれにもＴｍ値を生成しなかった；したがって、それらは、アッセイによって生成
されるべきいかなる偽の耐性コールを引き起こさなかった。

実施例７．ＡＭＫおよびＫＡＮ耐性のさらなる遺伝的原因
この実施例における研究は、ＡＭＫおよび／またはＫＡＮに対して耐性であるが、野生
型ｒｒｓ遺伝子およびｅｉｓプロモーター配列を有する２２のサンプルを含んでいた。最
近の研究により、ｗｈｉＢ７遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）での突然変異がＭ．ｔｂ
におけるアミノグリコシド耐性を引き起こすことが示唆されている。ｗｈｉＢ７突然変異
が表現型の上では耐性であるがアッセイ－感受性である単離株のいくつかの原因でありう
るかどうかを決定するために、２２サンプル全ては、ｗｈｉＢ７遺伝子開始部位の上流４
１２ｂｐ領域、加えてｗｈｉＢ７オープンリーディングフレームの一部分において、配列
決定された。コントロールセットとして、３０のランダムに選別された総感受性単離株も
また、配列決定された。２２の不一致な単離株のうち、３人の患者からの６の単離株がｗ
ｈｉＢ７ ５’ＵＴＲ領域において突然変異を示した。転写開始部位を＋１と考えると、
１つのサンプルは、５’ＵＴＲの＋１３８位にシトシン欠失を有し、一人の患者からの２
つのサンプルは、＋２３７位にＡからＧの突然変異を含み、ただ一人の患者からの残りの
３つのサンプルは、＋２３７位にＡからＧの突然変異を示した（表５）（Ｒｅｅｖｅｓ，
Ａ．Ｚ．，２０１３，５７：１８５７－１８６５）。ただ一人の患者からの３つのサンプ
ルは、機能するポジティブＰＣＲコントロールにもかかわらず、繰り返しＰＣＲを試した
後、５’ＵＴＲからのいかなる増幅も生成しなかった。これは、２７５ｂｐの断片が３つ
のサンプル全てについてｗｈｉＢ７ ＯＲＦ内から容易に増幅されうるため、５’ＵＴＲ
領域での大きな欠失の存在を示唆した。ｗｈｉＢ７突然変異を有するすべてのサンプルは
、ｅｉｓ遺伝子の上方制御によって推定されるｗｈｉＢ７作用機序と一致するＫＡＮに対
してのみ耐性であった（Ｒｅｅｖｅｓ ２０１３）。これらの単離株についてのＫＡＮ
ＭＩＣはまた、５μｇ／ｍｌと低く、これはｅｉｓプロモーター突然変異株で観察された
ものと同じであった。アミノグリコシドに感受性である３０のコントロールサンプルのい
ずれも、ｗｈｉＢ７遺伝子の５’ＵＴＲにいかなる突然変異も有していなかった。これら
の突然変異とアミノグリコシド耐性を有するｗｈｉＢ７遺伝子の５’ＵＴＲにおける欠失
との関係を確認するために、さらなる研究が必要である。しかし、感受性株にかかる突然
変異が存在しないことは、それらがアミノグリコシド耐性において何らかの役割を有する
であろうことを暗示し、さらなるアッセイが低レベルＫＡＮ耐性を検出するための感受性
を改善するためにこれらの突然変異をターゲットにすることができる。

ＳＤは、異なる臨床サンプルのプローブそれぞれのＴｍ値の＋／－標準偏差を表し、ｄ
Ｔｍは、各プローブの野生型配列と突然変異体配列とのＴｍ差を表す。

ＳＤ；標準偏差、ｄＴｍ：デルタＴｍ
プローブ番号１、２および３は、それぞれｒｒｓ－１４００、ｅｉｓ－１およびｅｉｓ
－２プローブに対応する。

ＬＪおよびＭＧＩＴは、それぞれＬＪ比率およびＭＧＩＴ法による感受性試験を意味す
る。

ＬＪおよびＭＧＩＴは、それぞれＬＪ比率およびＭＧＩＴ法による感受性試験を意味す
る。

ＮＤ：未決定、ＮＭ：変異なし、Ｒ：耐性、Ｓ：感受性。

好ましい実施形態である前述の実施例は、特許請求の範囲により規定される本発明を限
定するものではなく、例示とされるべきである。容易に理解されるように、上記特徴の多
くの変形および組み合わせは、特許請求の範囲に記載された本発明から逸脱することなく
利用することができる。かかる変形は、本発明の範囲からの逸脱とは見なされず、かかる
変形のすべては、下記の特許請求の範囲内に含まれるものとする。本明細書に引用される
すべての参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。

Claims (28)

1. ｒｐｏＢ遺伝子、ｇｙｒＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｉｎｈＡプロモーター、ｒｒｓ遺
   伝子、ｅｉｓプロモーター、ｅｍｂＢ遺伝子、ｋａｔＧ遺伝子、ｄｏｓＲ遺伝子、ＩＳ６
   １１０遺伝子およびＩＳ１０８１遺伝子からなる群から選択される結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅ
   ｒｃｕｌｏｓｉｓ）領域の一部分を増幅するためのオリゴヌクレオチドセットであって、
   前記一部分に特異的な一対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、
   各プライマーは、表１Ａおよび表１Ｂに記載のものから選択されるオリゴヌクレオチド配
   列と実質的に同一である配列を有する、オリゴヌクレオチドセット。
2. 前記配列が表１Ａおよび表１Ｂに記載のものから選択される前記オリゴヌクレオチド配
   列と同一である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドセット。
3. 表２に記載のものから選択される配列と実質的に同一である配列を含む、単離された核
   酸。
4. 表２に記載のものから選択される一つの配列を含む、請求項３に記載の核酸。
5. 前記核酸がラベル化されている、請求項３または４に記載の核酸。
6. 前記核酸が２つの末端それぞれでフルオロフォアおよびクエンチャーでラベル化されて
   いる、請求項５に記載の核酸。
7. 前記フルオロフォアがフルオレセイン、シアニン５、またはＴｅｘａｓＲｅｄ（登録商
   標）もしくはＴＡＭＲＡである、請求項６に記載の核酸。
8. 前記クエンチャーがＢＨＱ１、ＢＨＱ２またはＤＡＢＣＹＬである、請求項６に記載の
   核酸。
9. 請求項１もしくは２に記載のオリゴヌクレオチドセットまたは請求項３～８のいずれか
   １項に記載の核酸を含む、キット。
10. ＤＮＡポリメラーゼ、伸長ヌクレオチド、およびバッファーをさらに含む、請求項９に
    記載のキット。
11. 第１のプライマー対で第１の核酸ターゲット配列を増幅して、第１の単位複製配列を生
    成すること、および
    前記第１の単位複製配列における突然変異を検出することを含み、
    前記第１のプライマー対がｒｐｏＢ遺伝子、ｇｙｒＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｉｎｈ
    Ａプロモーター、ｒｒｓ遺伝子、ｅｉｓプロモーター、ｅｍｂＢ遺伝子およびｋａｔＧ遺
    伝子からなる群から選択される領域の一部分に特異的であり、各プライマーは、表１Ａお
    よび表１Ｂに記載のものから選択されるオリゴヌクレオチド配列と実質的に同一である配
    列を有し、
    前記突然変異の存在が薬剤耐性を示す、
    結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）における薬剤耐性を検出する方法。
12. 前記検出する工程をシークエンシングにより行う、請求項１１に記載の方法。
13. 前記検出する工程を以下：
    ハイブリダイゼーションを促す条件下で、前記第１の単位複製配列と前記突然変異に特
    異的な第１のプローブとを接触させて、プローブ－ターゲットハイブリットを形成するこ
    と；
    融解温度（Ｔｍ）分析を行い、前記プローブ－ターゲットハイブリットのためのテスト
    Ｔｍ値（ｔｅｓｔ Ｔｍ ｖａｌｕｅ）を決定すること；および
    前記テストＴｍ値と所定の基準Ｔｍ値とを比較すること、を含み、
    前記テストＴｍ値は、前記所定の基準Ｔｍ値と異なる場合、突然変異の存在を示す、
    のプロセスにより行う、請求項１１に記載の方法。
14. 前記テストＴｍ値が、前記所定の基準Ｔｍ値より小さい場合、突然変異の存在を示す、
    請求項１３に記載の方法。
15. 第２のプライマー対で第２の核酸ターゲット配列を増幅して、第２の単位複製配列を生
    成することをさらに含み、
    前記第２のプライマー対がｒｐｏＢ遺伝子、ｇｙｒＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｉｎｈ
    Ａプロモーター、ｒｒｓ遺伝子、ｅｉｓプロモーター、ｅｍｂＢ遺伝子、およびｋａｔＧ
    遺伝子からなる群から選択される第２の領域の一部分に特異的である、
    請求項１１～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記第１の領域が前記ｒｓｓ遺伝子または前記ｅｉｓプロモーターである、請求項１５
    に記載の方法。
17. 前記第１の領域が前記ｒｓｓ遺伝子である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記第２の領域が前記ｅｉｓプロモーターである、請求項１７に記載の方法。
19. 前記突然変異が前記ｒｒｓ遺伝子におけるＡ１４０１ＧまたはＣ１４０２Ｔである、請
    求項１６に記載の方法。
20. 前記突然変異がｅｉｓプライマー配列によりクエリされるｅｉｓプロモーター領域内に
    ある、請求項１７に記載の方法。
21. 前記耐性がイソニアジド、リファンピシン、フルオロキノロン類の薬剤、アミカシン、
    カナマイシン、カプレオマイシン、およびエタンブトールからなる群から選択される薬剤
    に対するものである、請求項１１～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記プライマー対が表１Ａおよび表１Ｂに記載のものから選択される一つである、請求
    項１１～２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記プローブが表２に記載のものから選択される一つと実質的に同一であるまたは完全
    に同一である配列を含む、請求項１３～２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 増幅反応を促す条件下、テストサンプルと第１のプライマー対とを接触させて、第１の
    単位複製配列を得ること、および
    前記単位複製配列の存在を検出して、それによって前記テストサンプルにおける結核菌
    （Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の存在を検出すること、を
    含み、
    前記第１のプライマー対がｇｙｒＢ遺伝子、ｉｎｈＡプロモーター、ｅｉｓプロモータ
    ー、ｅｍｂＢ遺伝子、ｋａｔＧ遺伝子、ｄｏｓＲ遺伝子、ＩＳ６１１０遺伝子、およびＩ
    Ｓ１０８１遺伝子からなる群から選択される結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）領
    域の一部分を増幅するためのオリゴヌクレオチドセットであり、
    前記第１のプライマー対の各プライマーが表１Ｂに記載のものから選択されるオリゴヌ
    クレオチド配列と実質的に同一である配列を有する、
    テストサンプルにおける結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の存在を検出する方
    法。
25. 前記プライマー対が表１Ｂに記載のものから選択される一つである、請求項２４に記載
    の方法。
26. 増幅反応を促す条件下、前記テストサンプルと第２のプライマー対とを接触させて、第
    ２の単位複製配列を得ること、および
    前記第２の単位複製配列の存在を検出すること、をさらに含み、
    前記第１の単位複製配列および第２の単位複製配列の両方の存在がテストサンプルにお
    ける結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の存在を示す、
    請求項２４または２５に記載の方法。
27. ハイブリッド形成反応を促す条件下、テストサンプルと第１の分子ビーコンプローブと
    を接触させて、プローブ－ターゲットハイブリッドを得ること、および
    前記プローブ－ターゲットハイブリッドの存在を検出して、それによってテストサンプ
    ルにおける結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の存在を
    検出すること、を含み、
    前記第１の分子ビーコンプローブが表２に記載のものから選択される一つと実質的に同
    一である配列を含む、
    テストサンプルにおける結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の存在を検出する方
    法。
28. 前記第１の分子ビーコンプローブが配列番号６７～６９からなる群から選択される、請
    求項２６に記載の方法。