KR101612678B1 - Tag-aspe 프라이머와 마그네틱 비드를 이용한 일·이차 항결핵제 내성 동시 진단 방법 - Google Patents

Tag-aspe 프라이머와 마그네틱 비드를 이용한 일·이차 항결핵제 내성 동시 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 타겟 유전자 프라이머 세트, TAG-ASPE 프라이머 및 마그네틱 비드를 이용하여 일차 및 이차 항결핵제 내성 관련 유전자들에 대한 다양한 돌연변이를 동시에 검출하는 비드 어레이 방법, 이에 이용되는 결핵균의 일·이차 항결핵제 내성 동시 검출 키트를 제공하며, 다수의 검체를 대상으로 다제/광역내성 약제감수성검사를 동시 실시할 수 있는 시스템으로서, 적은 비용으로 조기에 다수의 약제내성 진단이 가능하다.

Description

TAG-ASPE 프라이머와 마그네틱 비드를 이용한 일·이차 항결핵제 내성 동시 진단 방법{A SIMULTANEOUS DETECTION METHOD OF FIRST·SECOND LINE ANTI TUBERCULOSIS DRUG RESISTANCE USING TAG-ASPE PRIMER AND MAGNETIC BEADS}
본 발명은 TAG-ASPE(allelic specific primer extension) 프라이머와 마그네틱 비드를 이용하여 일·이차 항결핵제 내성을 동시에 검출하는 일차 및 이차 항결핵제 내성 동시 검출 방법에 관한 것이다.
결핵은, 결핵환자가 기침이나 재채기할 때 나오는 비말핵(droplet)에서 검출되는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 의해 감염되는 만성 소모성 질환으로, 전세계적으로 AIDS에 이어 성인 사망원인의 두 번째를 차지하는 감염성 질환이며, 전세계적인 결핵관리 사업에도 불구하고 약제내성결핵이 공공보건에서 지속적으로 문제가 되고 있는 실정이다.
세계보건기구(World Health Organization; WHO)의 2010년 보고에 따르면 2008년 세계 27개 국가(이 중 15개 국가는 유럽지역)로부터 신고된 다제내성결핵 (multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)의 발병자 수는 약 440,000만명(range, 390,000~510,000)이며, 다재내성결핵 추정 환자 수가 가장 많은 나라는 중국 (100,000; range, 79 000~120 000), 인도 (99,000; range, 79 000~120 000), 러시아 연방 (38,000; range, 30,000~45,000), 남아프리카 공화국 (13,000; range 10,000~16,000) 순이었으며, 국내 항결핵제 내성 실태조사에 의하면 치료력이 없는 신환에서 다제내성률이 1994년 1.6%에서 2004년 2.7%로(보건소에 신고된 환자 중심의 보고) 국내 약제내성결핵이 증가하는 것으로 추정되며, 2001 ~ 2006년까지 보고된 자료에 의하면 다제내성결핵균의 발병 빈도는 13.2%를 차지하고 있어 점차 증가되는 것을 확인할 수 있다(김 등 2010, The Korean Academy of Tuberculosis and Respiratory Diseases).
이와 같은 다제내성결핵의 치료는 심한 부작용, 높은 비용부담, 오랜 치료기간과 낮은 완치율을 보인다. 따라서, 공공보건학적으로는 다제내성결핵의 조기 치료 및 전파를 막는 것이 매우 중요하며, 이를 위해 다제내성결핵균의 조기 검사가 무엇보다 중요하다.
광역내성결핵(extensively drug-resistant tuberculosis, XDR-TB)이 2006년 정의된 이래 전세계적으로 계속 증가되는 추세로 2009년 57개국에서 발생이 보고되어 있으며, 국내 광역내성결핵의 발병은 매년 100~250명 정도로 추정되며, 다제내성결핵에 대한 비율은 약 7.8~10.7%로 나타나는 것으로 보고되고 있고, 특히 HIV 양성환자에서 치명률이 높은 것으로 알려져 있다.
이러한 다제내성 및 광역내성 결핵환자들의 적절한 치료를 위해서는 신속하고 신뢰할 수 있는 약제감수성 시험법(Drug susceptibility testing, DST)이 정립되어야 한다. 그러나, 종래에 사용되어 온 고체배지를 통한 배양 및 약제감수성 검사는 비교적 저렴한 검사비용과 정확한 검사결과를 알 수 있다는 장점이 있는 반면, 검사결과를 얻기까지 8주 이상 소요되어 진단이 늦어질 수 있다는 큰 단점을 안고 있다. L-J(Lowenstein-Jensen) 배지를 주로 사용하고 있는 우리나라의 경우 결핵치료를 시작한 후부터 약제감수성 검사결과의 확인까지 평균 80일 이상이 소요된다.
액체배지를 이용한 약제감수성 검사법으로 BD(Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD., USA) 사에서 개발한 MGIT(Mycobacterium Growth Indicator Tube) 960 시스템은 검사 시 오염발생의 위험성이 높고 무엇보다 고가의 수입 재료를 사용해야 한다는 단점이 있다. 그 외에 분자생물학적인 기법을 바탕으로 한 다양한 시도들과 제품들이 소개되고 있지만, 이 또한 비용이나 검사자의 숙련도 등에서 문제점이 지적되고 있으며, 무엇보다 미생물학적 방법을 통한 결핵균의 확인이 불가능하다는 점이 큰 차이점이라고 할 수 있다.
따라서, 상술한 종래 기술의 단점을 극복하고 짧은 시간에 일·이차 항결핵제 약제감수성 검사결과를 얻을 수 있는 경제성 있는 약제감수성 검사 방법의 개발이 요구된다.
최근 개발된 다양한 분자생물학적 또는 비분자생물학적 검사들을 통해 결핵을 좀 더 신속하고 간단하게 진단하는 것이 가능해졌다. 기존의 배양 검사에 걸리던 시간을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 최근 결핵관리에서 가장 중요한 문제인 내성결핵의 진단 역시 기존의 약제감수성 결과에 비해 빠르게 진단할 수 있어 결핵 관리에 긍정적인 기여를 할 것으로 기대된다. 그러나 이러한 새로운 검사법은 여전히 결핵균 배양검사를 대체할 수는 없으며, 기존의 약제 감수성검사 역시 대체할 수 없다. 이는 새로운 검사법들이 도말 음성 결핵 또는 폐외 결핵 등 특수한 상황에서의 결핵에서 진단적 유용성에 차이를 나타내고, 여건과 인력이 갖추어진 실험실에서만 가능하기 때문에 광범위내성결핵의 진단을 위해서는 여전히 현재의 약제 감수성결과를 필요하기 때문이다.
그러므로 약제감수성검사를 위하여 다제내성 결핵균과 광역내성결핵균에서의 유전자 변이에 관련된 변이 유전자를 동시에 검사할 수 있는 시스템, 그리고 여러 명을 동시에 검사할 수 있어 단시간에 많은 수의 검사를 실시할 수 있는 검사법을 개발할 필요가 있다.
1. Lee SH, Choi HB, Yu SY, Chang UJ, Kim CK, Kim HJ. Detection of First-Line Anti-Tuberculosis Drug Resistance Mutations by Allele-Specific Primer Extension on a Microsphere-Based Platform. Ann Lab Med. 2015 Sep;35(5):487-93.
본 발명에서는 상기와 같은 종래 기술의 단점을 극복하고 짧은 시간에 약제감수성 검사결과를 얻을 수 있는, 경제성 있는 약제감수성 검사 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 타겟 유전자 프라미어 세트, TAG-ASPE 프라이머 및 마그네틱 비드를 이용하여 일차 및 이차 항결핵제 내성을 동시에 검출하는 방법을 제공한다.
일·이차 항결핵제 내성 동시 검출 방법은,
검체로부터 DNA를 추출하는 단계;
추출된 DNA를 주형으로 타겟 유전자 프라이머 세트를 사용하여 다중 PCR(multiplex PCR)하여 타겟 유전자를 증폭시키는 단계;
증폭된 타겟 유전자를 TAG-ASPE 프라이머를 사용하여 다중 ASPE(multiplex Allele-specific primer extension) 반응 시키는 단계;
다중 ASPE 반응산물을 마그네틱 비드와 교잡 반응 시키는 단계; 및
상기 다중 ASPE- 마그네틱 비드 교잡 반응산물에서 발생되는 형광 강도를 분석하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 일차 및 이차 항결핵제는 아이소니아지드(Isoniazid), 리팜핀(Rifampin), 에탐부톨(Ethambutol), 아미노글리코시드계(Aminoglycoside), 퀴놀론계(Quinolone) 및 스트렙토마이신(streptomycin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 타겟 유전자는 아이소니아지드(Isoniazid) 내성 유전자 inhA 와 katG, 리팜핀(Rifampin) 내성 유전자 rpoB, 에탐부톨(Ethambutol) 내성 유전자 embB, 아미노글리코시드계(Aminoglycoside) 내성 유전자 rrs, 퀴놀론계(Quinolone) 내성 유전자 gyrA 및 스트렙토마이신(streptomycin) 내성 유전자 rpsL로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 돌연변이 부위를 포함하여 증폭시키는, 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 inhA 유전자 증폭 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 katG 유전자 증폭 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6로 이루어진 rpoB 유전자 증폭 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 embB 유전자 증폭 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10로 이루어진 rrs(S) 유전자 증폭 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 rrs(K) 유전자 증폭 프라이머 세트; 서열번호 13와 서열번호 14로 이루어진 gyrA 유전자 증폭 프라이머 세트; 및 서열번호 15와 서열번호 16으로 이루어진 rpsL 유전자 증폭 프라이머 세트;으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 TAG-ASPE 프라이머는, 야생형 inhA 유전자의 15/16UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 17, 돌연변이형 inhA 유전자의 15UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 18, 돌연변이형 inhA 유전자의 16UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 19, 야생형 inhA 유전자의 8UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 20, 돌연변이형 inhA 유전자의 8UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 21, 야생형 katG 유전자의 코돈 315와 특이적으로 결합하는 서열번호 22, 돌연변이형 katG 유전자의 코돈 315와 특이적으로 결합하는 서열번호 23, 야생형 rpoB 유전자의 코돈 516과 특이적으로 결합하는 서열번호 24, 돌연변이형 rpoB 유전자의 코돈 516과 특이적으로 결합하는 서열번호 25 및 서열번호 26, 야생형 rpoB 유전자의 코돈 526과 특이적으로 결합하는 서열번호 27, 돌연변이형 rpoB 유전자의 코돈 526과 특이적으로 결합하는 서열번호 28 및 서열번호 29, 야생형 rpoB 유전자의 코돈 531과 특이적으로 결합하는 서열번호 30, 돌연변이형 rpoB 유전자의 코돈 531과 특이적으로 결합하는 서열번호 31, 야생형 embB 유전자의 코돈 306과 특이적으로 결합하는 서열번호 32, 돌연변이형 embB 유전자의 코돈 306과 특이적으로 결합하는 서열번호 33 내지 서열번호 37, 야생형 rrs 유전자의 염기 1401/1402와 특이적으로 결합하는 서열번호 38, 돌연변이형 rrs 유전자의 염기 1401과 특이적으로 결합하는 서열번호 39, 돌연변이형 rrs 유전자의 염기 1402와 특이적으로 결합하는 서열번호 40 및 서열번호 41, 야생형 rrs 유전자의 염기 1484와 특이적으로 결합하는 서열번호 42, 돌연변이형 rrs 유전자의 염기 1484와 특이적으로 결합하는 서열번호 43, 야생형 rrs 유전자의 염기 514/517과 특이적으로 결합하는 서열번호 44, 돌연변이형 rrs 유전자의 염기 514와 특이적으로 결합하는 서열번호 45, 돌연변이형 rrs 유전자의 염기 517과 특이적으로 결합하는 서열번호 46, 야생형 gyrA 유전자의 코돈 88과 특이적으로 결합하는 서열번호 47, 돌연변이형 gyrA 유전자의 코돈 88과 특이적으로 결합하는 서열번호 48 및 서열번호 49, 야생형 gyrA 유전자의 코돈 90/91과 특이적으로 결합하는 서열번호 50, 돌연변이형 gyrA 유전자의 코돈 90과 특이적으로 결합하는 서열번호 51, 돌연변이형 gyrA 유전자의 코돈 91과 특이적으로 결합하는 서열번호 52, 야생형 gyrA 유전자의 코돈 94와 특이적으로 결합하는 서열번호 53, 돌연변이형 gyrA 유전자의 코돈 94와 특이적으로 결합하는 서열번호 54 내지 서열번호 58, 야생형 rpsL 유전자의 코돈 43과 특이적으로 결합하는 서열번호 59, 돌연변이형 rpsL 유전자의 코돈 43과 특이적으로 결합하는 서열번호 60, 야생형 rpsL 유전자의 코돈 88과 특이적으로 결합하는 서열번호 61, 및 돌연변이형 rpsL 유전자의 코돈 88과 특이적으로 결합하는 서열번호 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 기재된 프라이머 세트, 상기 기재된 TAG-ASPE 프라이머 및 마그네틱 비드를 포함하는 것을 특징으로 하는 일차 및 이차 항결핵제 내성 동시검출 키트를 제공한다.
본 발명에 따르면 일·이차 항결핵제 내성 관련 유전자들에 대한 다양한 돌연변이를 동시에 검출할 수 있는 비드 어레이 방법을 확립하였다. 따라서 다수의 검체를 대상으로 다제/광역내성 약제감수성검사를 실시할 수 있어 적은 비용으로 조기에 약제내성 진단이 가능하여 종래의 결핵진단 방법에 비해 결핵환자의 조기 치료 및 감염 예방에 도움이 될 것으로 기대된다.
도 1은 일차 및 이차 항결핵제 내성 관련 유전자들의 multiplex PCR 증폭산물의 아가로즈겔 전기영동 사진이다.
도 2는 비드 어레이(bead array) 방법을 간략하게 나타낸 도면이다.
도 3은 루미넥스(Luminxex) 분석기 시스템을 간략하게 나타낸 도면이다.
도 4는 일·이차 항결핵제 내성 관련 유전자의 비드 어레이 방법을 통한 루미넥스 분석결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공기 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하에서 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일·이차 항결핵제 내성 동시 검출 방법은 타겟 유전자 프라이머 세트, TAG-ASPE 프라이머 및 마그네틱 비드를 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 일차 및 이차 항결핵제 내성 동시 검출 방법은 검체로 부터 DNA를 추출하는 단계;
추출된 DNA를 주형으로 타겟 유전자 프라이머 세트를 사용하여 다중 PCR(multiplex PCR)하여 타겟 유전자를 증폭시키는 단계;
증폭된 타겟 유전자를 TAG-ASPE 프라이머를 사용하여 다중 ASPE(multiplex Allele-specific primer extension) 반응 시키는 단계;
다중 ASPE 반응산물을 마그네틱 비드와 교잡 반응 시키는 단계; 및
상기 다중 ASPE- 마그네틱 비드 교잡 반응산물에서 발생되는 형광 강도를 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 일차 및 이차 항결핵제는 아이소니아지드(Isoniazid), 리팜핀(Rifampin), 에탐부톨(Ethambutol), 아미노글리코시드계(Aminoglycoside), 퀴놀론계(Quinolone) 및 스트렙토마이신 (streptomycin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
여기서 '일차 항결핵제'는 아이소니아지드(Isoniazid), 리팜핀(Rifampin), 피라진아마이드(Pyrazinamide) 및 에탐부톨(Ethambutol) 또는 마이암부톨 (Myambutol)을 포함하는 약제로서 효과가 좋고 부작용이 적어서 초기치료 시 선택되는 약제를 의미하며, '이차 항결핵제'는 스트렙토마이신(Streptomycin), 가나마이신(Kanamycin), 아미카신(Amikacin) 등 아미노글리코시드계(Aminoglycoside), 퀴놀론계(Quinolone), 프로치온아미드(Prothionamide) 및 시클로세린(Cycloserine)을 포함하는 약제로서 일차 항결핵제에 대한 약제 내성이나 부작용으로 일차 항결핵제를 사용할 수 없을 때 선택되는 약제를 의미한다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 타겟 유전자는 아이소니아지드(Isoniazid) 내성 유전자 inhA 및 katG, 리팜핀(Rifampin) 내성 유전자 rpoB, 에탐부톨(Ethambutol) 내성 유전자 embB, 아미노글리코시드계(Aminoglycoside) 내성 유전자 rrs, 퀴놀론계(Quinolone) 내성 유전자 gyrA 및 스트렙토마이신(streptomycin) 내성 유전자 rpsL로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 돌연변이 부분을 포함하여 증폭시키는,
서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 inhA 유전자 증폭 프라이머 세트;
서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 katG 유전자 증폭 프라이머 세트;
서열번호 5 및 서열번호 6로 이루어진 rpoB 유전자 증폭 프라이머 세트;
서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 embB 유전자 증폭 프라이머 세트;
서열번호 9 및 서열번호 10로 이루어진 rrs(S) 유전자 증폭 프라이머 세트;
서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 rrs(K) 유전자 증폭 프라이머 세트;
서열번호 13와 서열번호 14로 이루어진 gyrA 유전자 증폭 프라이머 세트; 및
서열번호 15와 서열번호 16으로 이루어진 rpsL 유전자 증폭 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 TAG-ASPE 프라이머는
야생형 inhA 유전자의 15/16UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 17,
돌연변이형 inhA 유전자의 15UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 18,
돌연변이형 inhA 유전자의 16UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 19,
야생형 inhA 유전자의 8UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 20,
돌연변이형 inhA 유전자의 8UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 21,
야생형 katG 유전자의 코돈 315와 특이적으로 결합하는 서열번호 22,
돌연변이형 katG 유전자의 코돈 315와 특이적으로 결합하는 서열번호 23,
야생형 rpoB 유전자의 코돈 516과 특이적으로 결합하는 서열번호 24,
돌연변이형 rpoB 유전자의 코돈 516과 특이적으로 결합하는 서열번호 25 및 서열번호 26,
야생형 rpoB 유전자의 코돈 526과 특이적으로 결합하는 서열번호 27,
돌연변이형 rpoB 유전자의 코돈 526과 특이적으로 결합하는 서열번호 28 및 서열번호 29,
야생형 rpoB 유전자의 코돈 531과 특이적으로 결합하는 서열번호 30,
돌연변이형 rpoB 유전자의 코돈 531과 특이적으로 결합하는 서열번호 31,
야생형 embB 유전자의 코돈 306과 특이적으로 결합하는 서열번호 32,
돌연변이형 embB 유전자의 코돈 306과 특이적으로 결합하는 서열번호 33 내지 서열번호 37,
야생형 rrs 유전자의 염기1401/1402와 특이적으로 결합하는 서열번호 38,
돌연변이형 rrs 유전자의 염기1401과 특이적으로 결합하는 서열번호 39,
돌연변이형 rrs 유전자의 염기 1402와 특이적으로 결합하는 서열번호 40 및 서열번호 41,
야생형 rrs 유전자의 염기1484와 특이적으로 결합하는 서열번호 42,
돌연변이형 rrs 유전자의 염기1484와 특이적으로 결합하는 서열번호 43,
야생형 rrs 유전자의 염기 514/517과 특이적으로 결합하는 서열번호 44,
돌연변이형 rrs 유전자의 염기 514와 특이적으로 결합하는 서열번호 45,
돌연변이형 rrs 유전자의 염기 517과 특이적으로 결합하는 서열번호 46,
야생형 gyrA 유전자의 코돈 88과 특이적으로 결합하는 서열번호 47,
돌연변이형 gyrA 유전자의 코돈 88과 특이적으로 결합하는 서열번호 48 및 서열번호 49,
야생형 gyrA 유전자의 코돈 90/91과 특이적으로 결합하는 서열번호 50,
돌연변이형 gyrA 유전자의 코돈 90과 특이적으로 결합하는 서열번호 51,
돌연변이형 gyrA 유전자의 코돈 91과 특이적으로 결합하는 서열번호 52,
야생형 gyrA 유전자의 코돈 94와 특이적으로 결합하는 서열번호 53,
돌연변이형 gyrA 유전자의 코돈 94와 특이적으로 결합하는 서열번호 54 내지 서열번호 58,
야생형 rpsL 유전자의 코돈 43과 특이적으로 결합하는 서열번호 59,
돌연변이형 rpsL 유전자의 코돈 43과 특이적으로 결합하는 서열번호 60,
야생형 rpsL 유전자의 코돈 88과 특이적으로 결합하는 서열번호 61, 및
돌연변이형 rpsL 유전자의 코돈 88과 특이적으로 결합하는 서열번호 62로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 비드는 TAG-ASPE 프라이머와 결합하는 마그네틱 비드일 수 있다. 예를 들면, MagPlex-TAG microsphere(Luminex Corp.)가 사용가능하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 일차 및 이차 항결핵제 내성 동시 검출 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 inhA 유전자 증폭 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 katG 유전자 증폭 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6로 이루어진 rpoB 유전자 증폭 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 embB 유전자 증폭 프라이머 세트; 서열번호 9 및 서열번호 10로 이루어진 rrs(S) 유전자 증폭 프라이머 세트; 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 rrs(K) 유전자 증폭 프라이머 세트; 서열번호 13와 서열번호 14로 이루어진 gyrA 유전자 증폭 프라이머 세트; 및 서열번호 15와 서열번호 16으로 이루어진 rpsL 유전자 증폭 프라이머 세트 을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일차 및 이차 항결핵제 내성 동시 검출 TAG-ASPE 프라이머는 야생형 inhA 유전자의 15/16UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 17,
돌연변이형 inhA 유전자의 15UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 18,
돌연변이형 inhA 유전자의 16UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 19,
야생형 inhA 유전자의 8UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 20,
돌연변이형 inhA 유전자의 8UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 21,
야생형 katG 유전자의 코돈 315와 특이적으로 결합하는 서열번호 22,
돌연변이형 katG 유전자의 코돈 315와 특이적으로 결합하는 서열번호 23,
야생형 rpoB 유전자의 코돈 516과 특이적으로 결합하는 서열번호 24,
돌연변이형 rpoB 유전자의 코돈 516과 특이적으로 결합하는 서열번호 25 및 서열번호 26,
야생형 rpoB 유전자의 코돈 526과 특이적으로 결합하는 서열번호 27,
돌연변이형 rpoB 유전자의 코돈 526과 특이적으로 결합하는 서열번호 28 및 서열번호 29,
야생형 rpoB 유전자의 코돈 531과 특이적으로 결합하는 서열번호 30,
돌연변이형 rpoB 유전자의 코돈 531과 특이적으로 결합하는 서열번호 31,
야생형 embB 유전자의 코돈 306과 특이적으로 결합하는 서열번호 32,
돌연변이형 embB 유전자의 코돈 306과 특이적으로 결합하는 서열번호 33 내지 서열번호 37,
야생형 rrs 유전자의 염기1401/1402와 특이적으로 결합하는 서열번호 38,
돌연변이형 rrs 유전자의 염기1401과 특이적으로 결합하는 서열번호 39,
돌연변이형 rrs 유전자의 염기1402와 특이적으로 결합하는 서열번호 40 및 서열번호 41,
야생형 rrs 유전자의 염기1484와 특이적으로 결합하는 서열번호 42,
돌연변이형 rrs 유전자의 염기1484와 특이적으로 결합하는 서열번호 43,
야생형 rrs 유전자의 염기514/517과 특이적으로 결합하는 서열번호 44,
돌연변이형 rrs 유전자의 염기514와 특이적으로 결합하는 서열번호 45,
돌연변이형 rrs 유전자의 염기517과 특이적으로 결합하는 서열번호 46,
야생형 gyrA 유전자의 코돈 88과 특이적으로 결합하는 서열번호 47,
돌연변이형 gyrA 유전자의 코돈 88과 특이적으로 결합하는 서열번호 48 및 서열번호 49,
야생형 gyrA 유전자의 코돈 90/91과 특이적으로 결합하는 서열번호 50,
돌연변이형 gyrA 유전자의 코돈 90과 특이적으로 결합하는 서열번호 51,
돌연변이형 gyrA 유전자의 코돈 91과 특이적으로 결합하는 서열번호 52,
야생형 gyrA 유전자의 코돈 94와 특이적으로 결합하는 서열번호 53,
돌연변이형 gyrA 유전자의 코돈 94와 특이적으로 결합하는 서열번호 54 내지 서열번호 58,
야생형 rpsL 유전자의 코돈 43과 특이적으로 결합하는 서열번호 59,
돌연변이형 rpsL 유전자의 코돈 43과 특이적으로 결합하는 서열번호 60,
야생형 rpsL 유전자의 코돈 88과 특이적으로 결합하는 서열번호 61, 및
돌연변이형 rpsL 유전자의 코돈 88과 특이적으로 결합하는 서열번호 62 로부터 선택될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 일·이차 항결핵제 내성 동시검출 키트는 상기 프라이머 세트, 상기 TAG-ASPE 프라이머 및 마그네틱 비드를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 자명한 것이다.
< 준비예 1> 결핵균의 일·이차 항결핵제 내성 관련 돌연변이 유전자
결핵균의 일·이차 항결핵제 내성 동시진단을 위하여, 일·이차 항결핵제 내성 관련 돌연변이 유전자에 대해서 하기 표 1과 같이 선정하였다.
항생제 유전자 위치 혹은
아미노산코돈		 야생형 돌연변이
아이소니아지드
(Isoniazid)		 inhA 15 UPS C T
16 UPS A G
8 UPS T C
katG 315 AGC ACC
리팜핀
(Rifampin)		 rpoB 516 GAC TAC
GTC
526 CAC TAC
GAC
531 TCG TTG
에탐부톨
(Ethambutol)		 embB 306 ATG GTG
CTG
ATA
ATT
ATC
아미노글리코시드계
(Aminoglycoside)		 rrs 1401 A G
1402 C A
T
1484 G T
514 A C
517 C T
퀴놀론계
(Quinolone)		 gyrA 88 GGC TGC
GCC
90 GCG GTG
91 TCG CCG
94 GAC GGC
GCC
TAC
CAC
AAC
스트렙토마이신
(Streptomycin)		 rpsL 43 AAG AGG
88 AAG AGG
< 실시예 1> 결핵 균주로부터 일·이차 항결핵제 관련 유전자들의 증폭
결핵 균주를 배양하고, 유전자를 분리한 후, PCR 방법을 이용하여 타겟 유전자를 증폭시키고, 증폭된 PCR 산물을 정제하는 단계를 거쳐 일·이차 항결핵제 관련 유전자 증폭 산물을 얻었다.
< 실시예1 - 1> 결핵균주로부터 게놈 DNA의 분리
수집된 165개의 결핵균 균주를 오가와 배지(Ogawa media)에서 호기성 상태로 3주간 배양한 후, 형성된 결핵균 집락(colony)을 루프(loop)로 수집하여 400 ㎕ TE(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)에 잘 풀어주고, 결핵균 사멸 및 DNA 수집을 위하여 100℃에서 15분 동안 열처리한 후, 12,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 분리된 상층액을 PCR 반응의 주형 DNA로 사용하였다.
< 실시예1 - 2> 일·이차 항결핵제 관련 유전자들의 증폭
상기 실시예1-1에서 분리한 결핵균의 gDNA(genomic DNA)로부터 일·이차 항결핵제 내성 관련 유전자들을 증폭하기 위하여 하기 표 2 의 프라이머 세트를 이용하여 multiplex PCR을 하였다.
Figure 112015099981220-pat00001
상기 실시예1-1에서 분리한 gDNA를 주형으로 일·이차 항결핵제 내성 관련 유전자인 inhA, katG, rpoB, embB, rrs(S), rrs(K), gyrA 및 rpsL 유전자 부위를 증폭하기 위한 상기 표 2의 8쌍의 프라이머, 버퍼(buffer), dNTPs, Taq DNA 중합 효소(Taq DNA polymerase)를 사용하여 95℃ 15분; 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초 40cycle; 72℃ 7분; 조건으로 PCR을 수행하여 타겟 유전자 부위를 증폭하고, PCR 증폭산물을 EtBr(ethidium bromide)이 포함된 아가로즈겔에 전기영동하고, UV 환경에서 관찰하여 타겟 유전자의 증폭을 확인하였다. 상기 실험결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에서 일·이차 항결핵제 내성 관련 유전자 inhA는 179bp, katG는 246bp, rpoB는 217bp, embB는 188bp, rrs(S)는 265bp, rrs(K)는 308bp, gyrA는 160bp 및 rpsL는 370bp 를 나타내는 것을 확인 할 수 있었다.
< 실시예 1-3> PCR 증폭 산물의 정제
상기 실시예1-2에서 수득한 PCR 증폭 산물의 반응액에 포함되어 있는 반응 후 남은 dNTPs, 프라이머 등을 불활성화하기 위하여, 상기 PCR 증폭 산물 반응액에 엑소뉴클레아제 I(Exonuclease I)과 SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase)를 처리하여 37℃ 30분, 80℃ 15분간 반응시켜 PCR 증폭 산물을 정제하였다.
< 실시예 2> Bead array 방법을 통한 일·이차 항결핵제 내성 관련 유전자의 분석
일차 및 이차 항결핵제 내성 관련 유전자를 동시에 검출하기 위한 비드 어레이(Bead array)는 도 2에 나타낸 것과 같이 분리한 DNA 시료에서 프라이머 세트를 이용하여 증폭시킨 타겟 유전자들에 TAG-ASPE 프라이머을 이용하여 ASPE 반응시킨 후, TAG와 특이적으로 반응하는 마그네틱 비드와 교잡반응을 시키고, ASPE 반응 산물에 결합된 biotin-dCTP(B)와 스트렙타아비딘-알-피코에리트린 (streptavidin-R-phycoerythrin(PE))이 결합하여 발생되는 형광 강도를 측정하는 분석 방법으로, 상기 실시예 1의 일차 및 이차 항결핵제 관련 유전자 증폭 산물과 TAG-ASPE 프라이머을 multiplex ASPE 반응을 시킨 후, 각각의 ASPE 반응 산물과 TAG 특이적으로 결합하는 마그네틱 비드를 교잡 반응(hybridization)시키고, 루미넥스 분석기(Luminex 200 system)를 이용하여 형광 강도를 측정하여 분석하였다.
< 실시예 2-1> 일·이차 항결핵제 내성 유전자 특이 TAG- ASPE (allele-specific primer extension)을 이용한 multiplex ASPE 반응
상기 실시예 1의 일·이차 항결핵제 관련 유전자 증폭 산물과 하기 표 3의 TAG-ASPE 프라이머을 이용하여 multiplex ASPE (multiplex allele-specific primer extension) 반응시켰다.
프라이머 서열번호 TAG- ASPE 프라이머 염기서열 Target
inhA 15/16UPS WT 서열번호 17 TTCTTCATTAACTTCTAATCTTACaccccgacaacctatcgt C/A
inhA 15UPS MT 서열번호 18 TACTTAAACATACAAACTTACTCAcaccccgacaactatca T
inhA 16UPS MT 서열번호 19 TACACAAACAATCTTTCACAATTTaccccgacaacctatcgc　 G
inhA 8UPS WT 서열번호 20 CACAACAAATTCTTATTCAATTCAtggcagtcaccccgacaa T
inhA 8UPS MT 서열번호 21 AATCAACACACAATAACATTCATAggcagtcaccccgacag　 C
katG 315 WT 서열번호 22 ATACTTTACAAACAAATAACACACtaaggacgcgatcaccag AGC
katG 315 MT 서열번호 23 TTAAACAATCTACTATTCAATCACtaaggacgcgatcaccac　 ACC
rpoB 516 WT 서열번호 24 CTAAATCACATACTTAACAACAAAagctgagccaattcatgga GAC
rpoB 516 MT1 서열번호 25 TACTCAATACTTACTATATTCATCcagctgagccaattcatgt TAC
rpoB 516 MT2 서열번호 26 TTTATACATATACACAAACTCTCTagctgagccaattcatggt GTC
rpoB 526 WT 서열번호 27 AATTTCTTCTCTTTCTTTCACAATcgctgtcggggttgacc CAC
rpoB 526 MT1 서열번호 28 AACTTTCTCTCTCTATTCTTATTTcgctgtcggggttgacct TAC
rpoB 526 MT2 서열번호 29 TTAATACAATTCTCTCTTTCTCTAcgctgtcggggttgaccg GAC
rpoB 531 WT 서열번호 30 TACTTCTTTACTACAATTTACAACccacaagcgccgactgtc TCG
rpoB 531 MT 서열번호 31 TCTCATCTATCATACTAATTCTTTccacaagcgccgactgtt TTG
embB 306 WT 서열번호 32 TCTTACTAATTTCAATACTCTTACggctacatcctgggcatg ATG
embB 306 MT1 서열번호 33 CTTAAACTCTACTTACTTCTAATTggctacatcctgggcata ATA
embB 306 MT2 서열번호 34 CTAACTATAATCTTCATACACATAggctacatcctgggcatt ATT
embB 306 MT3 서열번호 35 ACAATATACATCACTTAAACTTTCggctacatcctgggcatc ATC
embB 306 MT4 서열번호 36 TCATCACTTTCTTTACTTTACATTgacgacggctacctgggcg GTG
embB 306 MT5 서열번호 37 ACTTACAATAACTACTAATACTCTacggctacatcctgggcc CTG
rrs 1401/1402 WT 서열번호 38 TCACTTATTACTTCACATTATCTAcccgggccttgtacacacgcgccgtcac A/C
rrs 1401 MT1 서열번호 39 ATTTAACACATACTCTTTCATAACtcccgggccttgtacacaccgcccgtcg G
rrs 1402 MT2 서열번호 40 ACATCAAATTCTTTCAATATCTTCcccgggccttgtacacaccgcccgtcaa A
rrs 1402 MT3 서열번호 41 TTAACAACTTATACAAACACAAACcccgggccttgtacacaccgcccgtcat T
rrs 1484 WT 서열번호 42 ACAAATATCTAACTACTATCACAAgaacggcgattgggacg G
rrs 1484 MT 서열번호 43 TAACTTACACTTAACTATCATCTTccaacggcgattgggact T
rrs 514/517 WT 서열번호 44 TACAACATCTCATTAACATATACAaactacgtgccagcagcc A/C
rrs 514 MT 서열번호 45 CATAATCAATTTCAACTTTCTACTccaactacgtgccagcc C
rrs 517 MT 서열번호 46 CAAACAAACATTCAAATATCAATCaactacgtgccagcagct T
gyrA 88 WT 서열번호 47 CTTAACATTTAACTTCTATAACACgtagatcgacgcgcc GGC
gyrA 88 MT1 서열번호 48 TTCTTTATTCTCATTATCACATCAgtagatcgacgcgtcgca TGC
gyrA 88 MT2 서열번호 49 CAATAAACATTCTTTACATTCTCAgtagatcgacgcgtcgg GCC
gyrA 90/91 WT 서열번호 50 TCAAACTCTCAATTCTTACTTAATgcgcaccaggctgtcgtagatcgacg GCG
gyrA 90 MT 서열번호 51 CTAAACATACAAATACACATTTCAgcgcaccaggctgtcgtagatgcaca GTG
gyrA 91 MT 서열번호 52 ACACTCATTTAACACTATTTCATTatgcgcaccaggctgtcgtagatcgg CCG
gyrA 94 WT 서열번호 53 TACTATAATCTCACTTCTATTTCAagcgcagcgaccagggctgggccatgcgcaccaggctgtc GAC
gyrA 94 MT1 서열번호 54 ACTTATTTCTTCACTACTATATCAcagcgaccagggctgggccatgcgcaccaggctgta TAC
gyrA 94 MT2 서열번호 55 AAATAACTCACTATTTCACTTACAcaccgaccagggctgggccatgcggaccaggctgtg CAC
gyrA 94 MT3 서열번호 56 CTTTATCAAATTCTAATTCTCAACcagcgaccagggctgggccatgcgcaccaggctgtt AAC
gyrA 94 MT4 서열번호 57 AATCTCTACAATTTCTCTCTAATAcagggctgggccatgcgcaccaggctgc GGC
gyrA 94 MT5 서열번호 58 TCTCTTTAAACACATTCAACAATAcagggctgggccatgcgcaccaggctgg GCC
rpsL 43 WT 서열번호 59 AATAACAACTCACTATATCATAACgtatgcacccgcgtgtacaccaccactccgaa AAG
rpsL 43 MT 서열번호 60 CAATTTACATTTCACTTTCTTATCgtatgcacccgcgtgtacaccaccactccgag AGG
rpsL 88 WT 서열번호 61 ATCTCAATTACAATAACACACAAAcgcggcggccgggtgaa AAG
rpsL 88 MT 서열번호 62 TTCTCTTCTTCACTTTATACAAATcgcggcggccgggtgag AGG
상기 실시예 1의 일차 및 이차 항결핵제 관련 유전자 증폭 산물 5 ㎕에 1x buffer, 1.25 mM MgCl2, 25 nM 의 각 TAG-ASPE 프라이머, 0.75U Tsp DNA polymerase, 5 μM dATP, dTTP, dGTP, biotin-dCTP 및 멸균된 증류수를 첨가하여 96℃ 2분; 94℃ 30초, 55℃ 1분, 74℃ 2분 40cycle; 74℃ 2분 조건으로 multiplex ASPE (multiplex allele-specific primer extension) 반응시켰다.
< 실시예 2-2> ASPE 반응산물과 마그네틱 비드의 교잡반응(hybridization)
상기 실시예 2-1의 TAG-ASPE 반응 산물과 특이적으로 결합하는 마그네틱 비드(magnetic beads)를 이용하여 각 반응마다 2,500개의 마그네틱 비드를 준비하여 혼합하였다. 2X Tm 교잡 버퍼(Tm Hybridization buffer; 0.4 M NaCl, 0.2 M Tris, 0.16% Trition X-100, pH 8.0)를 이용하여 상기 혼합한 마그네틱 비드가 각 반응 별로 ㎕당 100개가 되도록 희석/농축하여 혼합하고 20초간 초음파 처리하한 후, 96-well 플레이트의 각 well에 마그네틱 비드 혼합액 25 ㎕를 분주하고, 1~5 ㎕ ASPE 반응 산물을 첨가한 후, D.W를 이용하여 최종 50 ㎕를 맞추고 96℃ 90초, 37℃ 30분 조건으로 반응하여 ASPE 반응 산물과 마그네틱 비드를 교잡하였다.
< 실시예 2-3> 마그네틱 비드 교잡반응물의 루미넥스 분석기를 이용한 분석
마그네틱 분리기를 이용하여 상기 실시예 2-2의 ASPE 반응 산물과 마그네틱 비드 교잡반응물에서 마그네틱 비드를 분리한 후, 1 X Tm 교잡 버퍼 (Tm Hybridization buffer)를 이용하여 2회 세척하고, 2~8 ㎍/ml 스트렙타아비딘-알-피코에리트린(streptavidin-R-phycoerythrin)이 포함된 1X Tm 교잡 버퍼(Tm Hybridization buffer) 75㎕를 현탁한 마그네틱 비드 혼합액이 들어있는 well에 분주하고 37℃ 15분 동안 반응시킨 후, 루미넥스 분석기(Luminex 200 system)를 이용하여 형광 강도를 측정하였으며, 그 결과를 표 4 및 도 4에 나타내었다.
Figure 112015099981220-pat00002
상기 형광 강도 측정 시 TAG-ASPE 프라이머에서 프라이머 부분의 길이에 따라 표준 형광강도(Mean Fluorescence Intensity; MFI)를 조정하여 판독하였으며, 그 중 분별력이 제일 좋은 길이 및 MFI를 하기 표 5에 나타내었다.
Figure 112015099981220-pat00003
< 실시예 3> 일·이차 항결핵제 내성 관련 돌연변이 유전자 분석
총 165 개의 균주 시료를 대상으로 상기 실시예 1 내지 2의 비드 어레이(bead array) 방법과 염기서열 분석(sequencing)을 하여 그 결과를 비교 분석하여 그 결과를 하기 표 6 내지 20에 나타내었으며, 비드 어레이(Bead array)에서 나타낸 MFI는 상기 표 4와 같다.
하기 표 6은 inhA 15/16 UPS 돌연변이 분석 결과이다.
Detection method No. of Wild type
(-15C/-16A)		 No. of Mutant
(-15T)		 No. of Mutant
(-16G)
Bead array 117 48 0
Sequencing 117 48 0
하기 표 7은 inhA 8 UPS 돌연변이 분석 결과이다.
Detection method No. of Wild type
(T)		 No. of Mutant
(C)
Bead array 157 8
Sequencing 157 8
하기 표 8은 katG 코돈 315 돌연변이 분석 결과이다.
Detection method No. of Wild type
(AGC)		 No. of Mutant
(ACC)
Bead array 67 98
Sequencing 67 98
하기 표 9는 rpoB 코돈 516 돌연변이 분석 결과이다.
Detection method No. of Wild type
(GAC)		 No. of Mutant
(GTC)		 No. of Mutant
(TAC)
Bead array 119 20 26
Sequencing 119 20 26
하기 표 10은 rpoB 코돈 526 돌연변이 분석 결과이다.
Detection method No. of Wild type
(CAC)		 No. of Mutant
(TAC)		 No. of Mutant
(GAC)
Bead array 145 15 5
Sequencing 145 15 5
하기 표 11은 rpoB 코돈 531 돌연변이 분석 결과이다.
Detection method No. of Wild type
(TCG)		 No. of Mutant
(TTG)
Bead array 78 87
Sequencing 78 87
하기 표 12는 embB 코돈 306 돌연변이 분석 결과이다.
Detection
method		 No. of
Wild type
(ATG)		 No. of
Mutant
(GTG)		 No. of Mutant
(CTG)		 No. of Mutant
(ATA)		 No. of Mutant
(ATT)		 No. of Mutant
(ATC)
Bead array 78 53 5 21 2 6
Sequencing 78 53 5 21 2 6
하기 표 13은 rrs 염기 1401/1402 돌연변이 분석 결과이다.
Detection method No. of
Wild type
(A/C)		 No. of
Mutant
(1401G)		 No. of
Mutant
(1402A)		 No. of
Mutant
(1402T)
Bead array 77 87 0 1
Sequencing 77 87 0 1
하기 표 14는 rrs 염기 1484 돌연변이 분석 결과이다.
Detection method No. of
Wild type
(G)		 No. of
Mutant
(T)
Bead array 162 3
Sequencing 162 3
하기 표 15는 rrs 염기 514/517 돌연변이 분석 결과이다.
Detection method No. of
Wild type
(A/C)		 No. of
Mutant
(514C)		 No. of
Mutant
(517T)
Bead array 151 13 1
Sequencing 151 13 1
하기 표 16은 gyrA 코돈 88 돌연변이 분석 결과이다.
Detection method No. of
Wild type
(GGC)		 No. of
Mutant
(TGC)		 No. of
Mutant
(GCC)
Bead array 164 1 0
Sequencing 164 1 0
하기 표 17은 gyrA 코돈 90/91 돌연변이 분석 결과이다.
Detection method No. of Wild type
(GCG/TCG)		 No. of Mutant
(90GTG)		 No. of Mutant
(91CCG)
Bead array 143 18 4
Sequencing 143 18 4
하기 표 18은 gyrA 코돈 94 돌연변이 분석 결과이다.
Detection method No. of
Wild type
(GAC)		 No. of Mutant
(TAC)		 No. of Mutant
(CAC)		 No. of Mutant
(AAC)		 No. of Mutant
(GGC)		 No. of Mutant
(GCC)
Bead array 87 0 1 1 62 14
Sequencing 87 0 1 1 62 14
하기 표 19는 rpsL 코돈 43 돌연변이 분석 결과이다.
Detection method No. of Wild type
(AAG)		 No. of Mutant
(AGG)
Bead array 106 59
Sequencing 106 59
하기 표 20은 rpsL 코돈 88 돌연변이 분석 결과이다.
Detection method No. of Wild type
(AAG)		 No. of Mutant
(AGG)
Bead array 154 11
Sequencing 154 11
상기 표 6 내지 20과 같이 165개 균주의 DNA 에서 일·이차 항결핵제 야생형 및 돌연변이형 유전자의 분석 결과 비드 어레이(bead array)방법과 염기서열 분석(sequencing) 방법에서 동일한 결과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
<110> KOREAN NATIONAL TUBERCULOSIS ASSOCIATION geneslabs Co., Ltd. <120> A SIMULTANEOUS DETECTION METHOD OF FIRST SECOND LINE ANTI TUBERCULOSIS DRUG RESISTANCE USING TAG-ASPE PRIMER AND MAGNETIC BEADS <130> DPA-0701 <160> 62 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> inhA_F <400> 1 gagcgtaacc ccagtgcgaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> inhA_R <400> 2 tccggtaacc aggactgaac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> katG_F <400> 3 gcggtcacac tttcggtaag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> katG_R <400> 4 caagcgccag cagggctctt 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpoB_F <400> 5 ttgatcaaca tccggccggt g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpoB_R <400> 6 ggggtttcga tcgggcacat 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> embB_F <400> 7 catgtcatcg gcgcgaattc g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> embB_R <400> 8 tggcaggcgc atccacagac t 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrs(S)_F <400> 9 aagcctgatg cagcgacgcc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrs(S)_R <400> 10 tctagtctgc ccgtatcgcc 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrs(K)_F <400> 11 gcgaatcctt aaaagccggt ct 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrs(K)_R <400> 12 gcctacgccc caccagttgg gg 22 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gyrA_F <400> 13 accgcagcca cgccaagtc 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gyrA_R <400> 14 cctggcgagc cgaagttgc 19 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpsL_F <400> 15 atgccaacca tccagcagct g 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpsL_R <400> 16 gcccttctct ttcttagcgc c 21 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> inhA 15/16UPS WT <400> 17 ttcttcatta acttctaatc ttacaccccg acaacctatc gt 42 <210> 18 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> inhA 15UPS MT <400> 18 tacttaaaca tacaaactta ctcacacccc gacaactatc a 41 <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> inhA 16UPS MT <400> 19 tacacaaaca atctttcaca atttaccccg acaacctatc gc 42 <210> 20 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> inhA 8UPS WT <400> 20 cacaacaaat tcttattcaa ttcatggcag tcaccccgac aa 42 <210> 21 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> inhA 8UPS MT <400> 21 aatcaacaca caataacatt cataggcagt caccccgaca g 41 <210> 22 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> katG 315 WT <400> 22 atactttaca aacaaataac acactaagga cgcgatcacc ag 42 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> katG 315 MT <400> 23 ttaaacaatc tactattcaa tcactaagga cgcgatcacc ac 42 <210> 24 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpoB 516 WT <400> 24 ctaaatcaca tacttaacaa caaaagctga gccaattcat gga 43 <210> 25 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpoB 516 MT1 <400> 25 tactcaatac ttactatatt catccagctg agccaattca tgt 43 <210> 26 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpoB 516 MT2 <400> 26 tttatacata tacacaaact ctctagctga gccaattcat ggt 43 <210> 27 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpoB 526 WT <400> 27 aatttcttct ctttctttca caatcgctgt cggggttgac c 41 <210> 28 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpoB 526 MT1 <400> 28 aactttctct ctctattctt atttcgctgt cggggttgac ct 42 <210> 29 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpoB 526 MT2 <400> 29 ttaatacaat tctctctttc tctacgctgt cggggttgac cg 42 <210> 30 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpoB 531 WT <400> 30 tacttcttta ctacaattta caacccacaa gcgccgactg tc 42 <210> 31 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpoB 531 MT <400> 31 tctcatctat catactaatt ctttccacaa gcgccgactg tt 42 <210> 32 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> embB 306 WT <400> 32 tcttactaat ttcaatactc ttacggctac atcctgggca tg 42 <210> 33 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> embB 306 MT1 <400> 33 cttaaactct acttacttct aattggctac atcctgggca ta 42 <210> 34 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> embB 306 MT2 <400> 34 ctaactataa tcttcataca cataggctac atcctgggca tt 42 <210> 35 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> embB 306 MT3 <400> 35 acaatataca tcacttaaac tttcggctac atcctgggca tc 42 <210> 36 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> embB 306 MT4 <400> 36 tcatcacttt ctttacttta cattgacgac ggctacctgg gcg 43 <210> 37 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> embB 306 MT5 <400> 37 acttacaata actactaata ctctacggct acatcctggg cc 42 <210> 38 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrs 1401/1402 WT <400> 38 tcacttatta cttcacatta tctacccggg ccttgtacac acgcgccgtc ac 52 <210> 39 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrs 1401 MT1 <400> 39 atttaacaca tactctttca taactcccgg gccttgtaca caccgcccgt cg 52 <210> 40 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrs 1402 MT2 <400> 40 acatcaaatt ctttcaatat cttccccggg ccttgtacac accgcccgtc aa 52 <210> 41 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrs 1402 MT3 <400> 41 ttaacaactt atacaaacac aaaccccggg ccttgtacac accgcccgtc at 52 <210> 42 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrs 1484 WT <400> 42 acaaatatct aactactatc acaagaacgg cgattgggac g 41 <210> 43 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrs 1484 MT <400> 43 taacttacac ttaactatca tcttccaacg gcgattggga ct 42 <210> 44 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrs 514/517 WT <400> 44 tacaacatct cattaacata tacaaactac gtgccagcag cc 42 <210> 45 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrs 514 MT <400> 45 cataatcaat ttcaactttc tactccaact acgtgccagc c 41 <210> 46 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rrs 517 MT <400> 46 caaacaaaca ttcaaatatc aatcaactac gtgccagcag ct 42 <210> 47 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gyrA 88 WT <400> 47 cttaacattt aacttctata acacgtagat cgacgcgcc 39 <210> 48 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gyrA 88 MT1 <400> 48 ttctttattc tcattatcac atcagtagat cgacgcgtcg ca 42 <210> 49 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gyrA 88 MT2 <400> 49 caataaacat tctttacatt ctcagtagat cgacgcgtcg g 41 <210> 50 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gyrA 90/91 WT <400> 50 tcaaactctc aattcttact taatgcgcac caggctgtcg tagatcgacg 50 <210> 51 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gyrA 90 MT <400> 51 ctaaacatac aaatacacat ttcagcgcac caggctgtcg tagatgcaca 50 <210> 52 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gyrA 91 MT <400> 52 acactcattt aacactattt cattatgcgc accaggctgt cgtagatcgg 50 <210> 53 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gyrA 94 WT <400> 53 tactataatc tcacttctat ttcaagcgca gcgaccaggg ctgggccatg cgcaccaggc 60 tgtc 64 <210> 54 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gyrA 94 MT1 <400> 54 acttatttct tcactactat atcacagcga ccagggctgg gccatgcgca ccaggctgta 60 60 <210> 55 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gyrA 94 MT2 <400> 55 aaataactca ctatttcact tacacaccga ccagggctgg gccatgcgga ccaggctgtg 60 60 <210> 56 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gyrA 94 MT3 <400> 56 ctttatcaaa ttctaattct caaccagcga ccagggctgg gccatgcgca ccaggctgtt 60 60 <210> 57 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gyrA 94 MT4 <400> 57 aatctctaca atttctctct aatacagggc tgggccatgc gcaccaggct gc 52 <210> 58 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gyrA 94 MT5 <400> 58 tctctttaaa cacattcaac aatacagggc tgggccatgc gcaccaggct gg 52 <210> 59 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpsL 43 WT <400> 59 aataacaact cactatatca taacgtatgc acccgcgtgt acaccaccac tccgaa 56 <210> 60 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpsL 43 MT <400> 60 caatttacat ttcactttct tatcgtatgc acccgcgtgt acaccaccac tccgag 56 <210> 61 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpsL 88 WT <400> 61 atctcaatta caataacaca caaacgcggc ggccgggtga a 41 <210> 62 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpsL 88 MT <400> 62 ttctcttctt cactttatac aaatcgcggc ggccgggtga g 41

Claims (7)

  1. 타겟 유전자 프라이머 세트, TAG-ASPE 프라이머 및 마그네틱 비드를 이용하는 일차 및 이차 항결핵제 내성 동시 검출 방법에 있어서,
    상기 TAG-ASPE 프라이머는
    야생형 inhA 유전자의 15/16UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 17,
    돌연변이형 inhA 유전자의 15UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 18,
    돌연변이형 inhA 유전자의 16UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 19,
    야생형 inhA 유전자의 8UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 20,
    돌연변이형 inhA 유전자의 8UPS 부분과 특이적으로 결합하는 서열번호 21,
    야생형 katG 유전자의 코돈 315와 특이적으로 결합하는 서열번호 22,
    돌연변이형 katG 유전자의 코돈 315 특이적으로 결합하는 서열번호 23,
    야생형 rpoB 유전자의 코돈 516과 특이적으로 결합하는 서열번호 24,
    돌연변이형 rpoB 유전자의 코돈 516과 특이적으로 결합하는 서열번호 25 및 서열번호 26,
    야생형 rpoB 유전자의 코돈 526과 특이적으로 결합하는 서열번호 27,
    돌연변이형 rpoB 유전자의 코돈 526과 특이적으로 결합하는 서열번호 28 및 서열번호 29,
    야생형 rpoB 유전자의 코돈 531과 특이적으로 결합하는 서열번호 30,
    돌연변이형 rpoB 유전자의 코돈 531과 특이적으로 결합하는 서열번호 31,
    야생형 embB 유전자의 코돈 306과 특이적으로 결합하는 서열번호 32,
    돌연변이형 embB 유전자의 코돈 306과 특이적으로 결합하는 서열번호 33 내지 서열번호 37,
    야생형 rrs 유전자의 염기 1401/1402와 특이적으로 결합하는 서열번호 38,
    돌연변이형 rrs 유전자의 염기 1401과 특이적으로 결합하는 서열번호 39,
    돌연변이형 rrs 유전자의 염기 1402와 특이적으로 결합하는 서열번호 40 및 서열번호 41,
    야생형 rrs 유전자의 염기 1484와 특이적으로 결합하는 서열번호 42,
    돌연변이형 rrs 유전자의 염기 1484와 특이적으로 결합하는 서열번호 43,
    야생형 rrs 유전자의 염기 514/517과 특이적으로 결합하는 서열번호 44,
    돌연변이형 rrs 유전자의 염기 514와 특이적으로 결합하는 서열번호 45,
    돌연변이형 rrs 유전자의 염기 517과 특이적으로 결합하는 서열번호 46,
    야생형 gyrA 유전자의 코돈 88과 특이적으로 결합하는 서열번호 47,
    돌연변이형 gyrA 유전자의 코돈 88과 특이적으로 결합하는 서열번호 48 및 서열번호 49,
    야생형 gyrA 유전자의 코돈 90/91과 특이적으로 결합하는 서열번호 50,
    돌연변이형 gyrA 유전자의 코돈 90과 특이적으로 결합하는 서열번호 51,
    돌연변이형 gyrA 유전자의 코돈 91과 특이적으로 결합하는 서열번호 52,
    야생형 gyrA 유전자의 코돈 94와 특이적으로 결합하는 서열번호 53,
    돌연변이형 gyrA 유전자의 코돈 94와 특이적으로 결합하는 서열번호 54 내지 서열번호 58,
    야생형 rpsL 유전자의 코돈 43과 특이적으로 결합하는 서열번호 59,
    돌연변이형 rpsL 유전자의 코돈 43과 특이적으로 결합하는 서열번호 60,
    야생형 rpsL 유전자의 코돈 88과 특이적으로 결합하는 서열번호 61, 및
    돌연변이형 rpsL 유전자의 코돈 88과 특이적으로 결합하는 서열번호 62를 모두 포함하는, 일차 및 이차 항결핵제 내성 동시 검출 비드 어레이 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 검출 방법은, 검체로부터 DNA를 추출하는 단계;
    추출된 DNA를 주형으로 타겟 유전자 프라이머 세트를 사용하여 다중 PCR(multiplex PCR)하여 타겟 유전자를 증폭시키는 단계;
    증폭된 타겟 유전자를 TAG-ASPE 프라이머를 사용하여 다중 ASPE(multiplex Allele-specific primer extension) 반응시키는 단계;
    다중 ASPE 반응산물을 마그네틱 비드와 교잡 반응시키는 단계; 및
    상기 다중 ASPE- 마그네틱 비드 교잡 반응산물에서 발생되는 형광 강도를 분석하는 단계를 포함하는, 일차 및 이차 항결핵제 내성 동시 검출 비드 어레이 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 일차 및 이차 항결핵제는 아이소니아지드(Isoniazid), 리팜핀(Rifampin), 에탐부톨(Ethambutol), 아미노글리코시드계(Aminoglycoside), 퀴놀론계(Quinolone) 및 스트렙토마이신(streptomycin)인, 일차 및 이차 항결핵제 내성 동시 검출 비드 어레이 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 타겟 유전자는 아이소니아지드(Isoniazid) 내성 유전자 inhA 및 katG, 리팜핀(Rifampin) 내성 유전자 rpoB, 에탐부톨(Ethambutol) 내성 유전자 embB, 아미노글리코시드계(Aminoglycoside) 내성 유전자 rrs, 퀴놀론계(Quinolone) 내성 유전자 gyrA 및 스트렙토마이신(streptomycin) 내성 유전자 rpsL인, 일차 및 이차 항결핵제 내성 동시 검출 비드 어레이 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 돌연변이 부위를 포함하여 증폭시키는
    서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 아이소니아지드(Isoniazid) 내성 inhA 유전자 증폭 프라이머 세트;
    서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 아이소니아지드(Isoniazid) 내성 katG 유전자 증폭 프라이머 세트;
    서열번호 5 및 서열번호 6로 이루어진 리팜핀(Rifampin) 내성 rpoB 유전자 증폭 프라이머 세트;
    서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 에탐부톨(Ethambutol) 내성 embB 유전자 증폭 프라이머 세트;
    서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 아미노글리코시드계(Aminoglycoside) 내성 rrs(S) 유전자 증폭 프라이머 세트;
    서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 아미노글리코시드계(Aminoglycoside) 내성 rrs(K) 유전자 증폭 프라이머 세트;
    서열번호 13와 서열번호 14로 이루어진 퀴놀론계(Quinolone) 내성 gyrA 유전자 증폭 프라이머 세트; 및
    서열번호 15와 서열번호 16으로 이루어진 스트렙토마이신(streptomycin) 내성 rpsL 유전자 증폭 프라이머 세트;를 모두 포함하는, 일차 및 이차 항결핵제 내성 동시 검출 비드 어레이 방법.
  6. 삭제
  7. 제1항의 방법에 사용되는, 타겟 유전자 프라이머 세트, TAG-ASPE 프라이머 및 마그네틱 비드를 포함하는, 일차 및 이차 항결핵제 내성 동시 검출 비드 어레이 키트.
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