CN104651520A - 一种鉴别结核分枝杆菌复合群菌种的引物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速鉴别结核分枝杆菌复合群菌种的引物及应用。本发明的快速鉴别结核分枝杆菌复合群菌种的引物由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6和引物对7组成。通过实验证明：本发明的引物能准确的鉴别结核分枝杆菌复合群菌种，并且本发明的7对引物采用同一个扩增反应条件，一次完成7个不同引物对的扩增，无需进行多次扩增，简化了操作，快速省时。
Description
技术领域
本发明属于医学检验领域，具体涉及一种鉴别结核分枝杆菌复合群菌种的引物及应用。
背景技术
结核病是最严重的流行性传染疾病之一，使人类的公共健康面临着巨大的挑战，它在全世界范围内有着相当高的致病率和致死率。结核分枝杆菌复合群(MTBC)中的一些菌种是引发人类和动物结核病的病原菌。引起人类结核病的主要病原菌即结核分枝杆菌(M.tuberculosis)起源于大约3百万年前，并因耐药株的出现持续影响着人类健康。除了结核分枝杆菌，在病人体内还发现了MTBC中的其它菌种，包括牛型分枝杆菌(M.bovis)、肯尼迪分枝杆菌(M.canetii)、非洲分枝杆菌(M.africanum subtype I)、山羊分枝杆菌(M.caprae)、田鼠分枝杆菌(M.microti)。其中牛型分枝杆菌是牛结核病的主要病原菌，由于直接与牛接触或食用未消毒的奶制品致使人类的感染。肯尼迪分枝杆菌、非洲分枝杆菌、山羊分枝杆菌、田鼠分枝杆菌均常见于非洲病人体内。
传统的鉴定MTBC菌种的方法是根据菌落形态、氧偏好性、烟酸累积、硝酸盐还原酶的活性以及生长动力学等的表型特征来判断，这些方法都制约于缓慢的细菌培养，而且涉及主观解读易于判错。传统的鉴定方法由于时间长等原因已不能满足当前的临床需要，因此快速鉴定MTBC中的成员，对于控制传染源和早期治疗起着至关重要的作用，也可为临床治疗提供用药指导。
现今的分子鉴别方法主要有IS6110-RFLP，MIRU-VNTR、Spoligotyping和SNP。IS6110-RFLP应用广泛，分辨率较高，但该方法基于大量菌株的培养，价格高，时间长且IS6110拷贝数较少的菌株不易分型；MIRU-VNTR不需要大量培养菌株，结果容易读识，但由于位点组合不同，其分辨率和成簇率亦不尽相同；Spoligotyping分型方法用时较短，成本较低，但分辨率较低，图片结果易产生假阳性；SNP需要测序，价格昂贵，不能在实验室间推广。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种鉴别结核分枝杆菌复合群菌种的成套引物。
本发明提供的鉴别结核分枝杆菌复合群菌种的成套引物，由引物对(1)-(7)组成：
(1)为由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成的引物对1；
(2)为由SEQ ID No.3所示的单链DNA和SEQ ID No.4所示的单链DNA组成的引物对2；
(3)为由SEQ ID No.5所示的单链DNA和SEQ ID No.6所示的单链DNA组成的引物对3；
(4)为由SEQ ID No.7所示的单链DNA和SEQ ID No.8所示的单链DNA组成的引物对4；
(5)为由SEQ ID No.9所示所示的单链DNA和SEQ ID No.10所示的单链DNA组成的引物对5；
(6)为由SEQ ID No.11所示的单链DNA和SEQ ID No.12所示的单链DNA组成的引物对6；
(7)为由SEQ ID No.13所示的单链DNA和SEQ ID No.14所示的单链DNA组成的引物对7。
本发明的另一个目的是提供一种鉴别结核分枝杆菌复合群菌种的PCR试剂组。
本发明提供的鉴别结核分枝杆菌复合群菌种的PCR试剂组由PCR试剂1、PCR试剂2、PCR试剂3、PCR试剂4、PCR试剂5、PCR试剂6和PCR试剂7组成。
上述PCR试剂组中，所述PCR试剂1包括上述成套引物中的引物对1；所述PCR试剂2包括上述成套引物中的引物对2；所述PCR试剂3包括上述成套引物中的引物对3；所述PCR试剂4包括上述成套引物中的引物对4；所述PCR试剂5包括上述成套引物中的引物对5；所述PCR试剂6包括上述成套引物中的引物对6；所述PCR试剂7包括上述成套引物中的引物对7。
上述PCR试剂组中，所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6或引物对7中的各条引物的物质的量相同。
上述成套引物中各个引物对独立包装，各条引物独立包装。
本发明还有一个目的是提供一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群菌种的试剂盒。
本发明提供的用于鉴别结核分枝杆菌复合群菌种的试剂盒，其含有上述的成套引物或含有上述的PCR试剂组。
上述的成套引物或上述的PCR试剂组或上述的试剂盒在制备鉴别或辅助鉴别待测菌株是否为结核分枝杆菌复合群菌种的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述的成套引物或上述的PCR试剂组或上述的试剂盒在鉴别或辅助鉴别待测菌株是否为结核分枝杆菌复合群菌种中的应用也属于本发明的保护范围。
上述的成套引物或上述的PCR试剂组或上述的试剂盒在制备鉴别或辅助鉴别待测菌株为结核分枝菌复合群菌种7种中哪一种的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述的成套引物或上述的PCR试剂组或上述的试剂盒在鉴别或辅助鉴别待测菌株为结核分枝菌复合群菌种7种中哪一种中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还有一个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别待测菌株为结核分枝杆菌复合群菌种7种中哪一种的方法。
本发明提供的鉴别或辅助鉴别待测菌株为结核分枝杆菌复合群菌种中哪一种的方法包括如下步骤：以上述的成套引物中的7种引物对分别对待测菌株进行PCR扩增，各自引物对对应的所述PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物；
若所述PCR扩增产物满足如下1)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段(或所述引物对1的PCR扩增产物为大小是975bp的片段)、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段(或所述引物对2的PCR扩增产物为大小是588bp的片段)、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段(或所述引物对3的PCR扩增产物为大小是466bp的片段)、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段(或所述引物对4的PCR扩增产物为大小是802bp的片段)、所述引物对5的PCR扩增产物含有大小为711bp的片段(或所述引物对5的PCR扩增产物为大小是711bp的片段)、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段(或所述引物对6的PCR扩增产物为大小是1055bp的片段)且所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为321bp的片段(或所述引物对7的PCR扩增产物为大小是321bp的片段)，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的结核分枝杆菌M.tuberculosis；
若所述PCR扩增产物满足如下2)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段(或所述引物对1的PCR扩增产物为大小是975bp的片段)、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段(或所述引物对2的PCR扩增产物为大小是588bp的片段)、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段(或所述引物对3的PCR扩增产物为大小是466bp的片段)、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段(或所述引物对4的PCR扩增产物为大小是802bp的片段)、所述引物对5的PCR扩增产物含有大小为711bp的片段(或所述引物对5的PCR扩增产物为大小是711bp的片段)、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段(或所述引物对6的PCR扩增产物为大小是1055bp的片段)且所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段(或所述引物对7的PCR扩增产物不为大小是321bp的片段)，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的肯尼迪分枝杆菌M.canetii；
若所述PCR扩增产物满足如下3)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段(或所述引物对1的PCR扩增产物为大小是975bp的片段)、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段(或所述引物对2的PCR扩增产物为大小是588bp的片段)、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段(或所述引物对3的PCR扩增产物为大小是466bp的片段)、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段(或所述引物对4的PCR扩增产物为大小是802bp的片段)、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段(或所述引物对6的PCR扩增产物为大小是1055bp的片段)、所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为321bp的片段(或所述引物对7的PCR扩增产物为大小是321bp的片段)且所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段(或所述引物对5的PCR扩增产物不为大小是711bp的片段)，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的非洲分枝杆菌M.africanum；
若所述PCR扩增产物满足如下4)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段(或所述引物对1的PCR扩增产物为大小是975bp的片段)、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段(或所述引物对2的PCR扩增产物为大小是588bp的片段)、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段(或所述引物对3的PCR扩增产物为大小是466bp的片段)、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段(或所述引物对4的PCR扩增产物为大小是802bp的片段)、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段(或所述引物对6的PCR扩增产物为大小是1055bp的片段)且所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段(或所述引物对5的PCR扩增产物不为大小是711bp的片段)、所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段(或所述引物对7的PCR扩增产物不为大小是321bp的片段)，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的山羊分枝杆菌M.caprae；
若所述PCR扩增产物满足如下5)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段(或所述引物对1的PCR扩增产物为大小是975bp的片段)、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段(或所述引物对2的PCR扩增产物为大小是588bp的片段)、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段(或所述引物对4的PCR扩增产物为大小是802bp的片段)、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段(或所述引物对6的PCR扩增产物为大小是1055bp的片段)、所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为321bp的片段(或所述引物对7的PCR扩增产物为大小是321bp的片段)且所述引物对3的PCR扩增产物不含有大小为466bp的片段(或所述引物对3的PCR扩增产物不为大小是466bp的片段)、所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段(或所述引物对5的PCR扩增产物不为大小是711bp的片段)，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的田鼠分枝杆菌M.microti；
若所述PCR扩增产物满足如下6)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段(或所述引物对1的PCR扩增产物为大小是975bp的片段)、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段(或所述引物对2的PCR扩增产物为大小是588bp的片段)、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段(或所述引物对3的PCR扩增产物为大小是466bp的片段)、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段(或所述引物对6的PCR扩增产物为大小是1055bp的片段)且所述引物对4的PCR扩增产物不含有大小为802bp的片段(或所述引物对4的PCR扩增产物不为大小是802bp的片段)、所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段(或所述引物对5的PCR扩增产物不为大小是711bp的片段)、所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段(或所述引物对7的PCR扩增产物不为大小是321bp的片段)，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的牛型分枝杆菌M.bovis；
若所述PCR扩增产物满足如下7)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段(或所述引物对1的PCR扩增产物为大小是975bp的片段)、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段(或所述引物对2的PCR扩增产物为大小是588bp的片段)、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段(或所述引物对3的PCR扩增产物为大小是466bp的片段)且所述引物对4的PCR扩增产物不含有大小为802bp的片段(或所述引物对4的PCR扩增产物不为大小是802bp的片段)、所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段(或所述引物对5的PCR扩增产物不为大小是711bp的片段)、所述引物对6的PCR扩增产物不含有大小为1055bp的片段(或所述引物对6的PCR扩增产物不为大小是1055bp的片段)、所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段(或所述引物对7的PCR扩增产物不为大小是321bp的片段)，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的卡介苗M.bovis BCG；
若所述PCR扩增产物不满足上述1)-7)中任一种，则待测菌株不为或候选不为结核分枝杆菌复合群菌种中的任一种。
上文中，所述结核分枝杆菌复合群菌种由结核分枝杆菌M.tuberculosis、牛型分枝杆菌M.bovis、卡介苗M.bovis BCG、田鼠分枝杆菌M.microti、肯尼迪分枝杆菌M.canetii、山羊分枝杆菌M.caprae和非洲分枝杆菌M.africanum 7种菌组成。
上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测菌株的基因组DNA；所述PCR扩增的退火温度为54℃。
本发明最后一个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别待测菌株是否为结核分枝杆菌复合群菌种的方法。
本发明提供的鉴别或辅助鉴别待测菌株是否为结核分枝杆菌复合群菌种的方法包括如下步骤：以上述的成套引物中的7种引物对分别对待测菌株进行PCR扩增，得到各自引物对对应的所述PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物；
若所述PCR扩增产物满足如下1)-7)中的至少一种，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群菌种：
1)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物含有大小为711bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段且所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为321bp的片段；
2)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物含有大小为711bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段且所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段；
3)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为321bp的片段且所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段；
4)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段且所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段；
5)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为321bp的片段且所述引物对3的PCR扩增产物不含有大小为466bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段；
6)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段且所述引物对4的PCR扩增产物不含有大小为802bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段；
7)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段且所述引物对4的PCR扩增产物不含有大小为802bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物不含有大小为1055bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段；
若所述PCR扩增产物不满足如上1)-7)中的任一种，则待测菌株不为或候选不为结核分枝杆菌复合群菌种。
上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测菌株的基因组DNA；所述PCR扩增的退火温度为54℃。
上述方法中，所述结核分枝杆菌复合群菌种为结核分枝杆菌M.tuberculosis、牛型分枝杆菌M.bovis、卡介苗M.bovis BCG、田鼠分枝杆菌M.microti、肯尼迪分枝杆菌M.canetii、山羊分枝杆菌M.caprae和非洲分枝杆菌M.africanum。
本发明方法与现有技术比较，具有如下优点：
(1)无需培养及生化检验等繁琐的步骤，简便；
(2)无需等待4-8周得到检测结果，快速；
(3)综合结核分枝杆菌复合群的7个菌种的鉴别，不仅包括主要侵染人体并引起严重耐药的M.tuberculosis，还包括同时能够引起人结核病的M.bovis、M.canetii、M.africanum、M.caprae和M.microti，鉴别较全面；
(4)无需大型昂贵的检测仪器，只需普通的PCR仪及其试剂即可进行实验，并且检测结果条带区分明显，直观明了，易于辨别。
(5)与目前常见的多重PCR鉴别诊断不同，本技术中7对引物采用同一个扩增反应条件，一次完成7个不同引物对的扩增，无需进行多次扩增，简化了操作，快速省时。
附图说明
图1为引物对1-引物对7对供试菌株结核分枝杆菌Mycobacteriumtuberculosis(ATCC 27294)的扩增结果。
图2为引物对1-引物对7对供试菌株肯尼迪分枝杆菌Mycobacterium.canetii的扩增结果。
图3为引物对1-引物对7对供试菌株非洲分枝杆菌Mycobacteriumafricanum Castets et al.(ATCC 35711)的扩增结果。
图4为引物对1-引物对7对供试菌株山羊分枝杆菌Mycobacterium.caprae的扩增结果。
图5为引物对1-引物对7对供试菌株田鼠分枝杆菌Mycobacteriummicroti Reed(ATCC 19422)的扩增结果。
图6为引物对1-引物对7对供试菌株牛型分枝杆菌Mycobacterium bovisKarlson and Lessel(ATCC 19210)的扩增结果。
图7为引物对1-引物对7对供试菌株卡介苗Mycobacterium bovis BCG(ATCC 35737)的扩增结果。
图8为引物对1-引物对7对MOTT供试菌株鸟分支杆菌Mycobacteriumavium subsp.avium Chester(ATCC 25291)的扩增结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
供试菌株：
(1)结核分枝杆菌复合群：
结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis(ATCC 27294)；
牛型分枝杆菌Mycobacterium bovis Karlson and Lessel(ATCC 19210)；
卡介苗Mycobacterium bovis BCG(ATCC 35737)；
田鼠分枝杆菌Mycobacterium microti Reed(ATCC 19422)；
肯尼迪分枝杆菌Mycobacterium canettii由重庆儿童医院提供的临床分离株，在文献“Gaby E.Pfyffer,Raymond Auckenthaler,et al.Mycobacteriumcanettii,the Smooth Variant of M.tuberculosis,Isolated from a Swiss PatientExposed in Africa.Emerging Infectious Diseases,4(4),1998:631-634.”中公开过，公众可从首都医科大学附属北京胸科医院获得；
山羊分枝杆菌Mycobacterium caprae由重庆儿童医院提供的临床分离株，在文献“Wolfgang M.Prodinger,Anita Brandstatter,et al.Characterization ofMycobacterium caprae Isolates from Europe by Mycobacterial InterspersedRepetitive Unit Genotyping.Journal of Clinical Microbiology,43(10),2005:4984-4992.”中公开过，公众可从首都医科大学附属北京胸科医院获得；
非洲分枝杆菌Mycobacterium africanum Castets et al.(ATCC 35711)；
(2)结核分枝杆菌复合群之外的非结核分枝杆菌：
鸟分支杆菌Mycobacterium avium subsp.avium Chester(ATCC 25291)。
实施例1、用于鉴别结核分枝杆菌复合群菌种的引物对及鉴别方法
一、用于鉴别结核分枝杆菌复合群的引物对
本发明针对16S rRNA、Rv0577、IS1561、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8和Rv3120分别设计PCR引物对1-引物对7。7对引物的PCR产物大小分别为975bp、588bp、466bp、802bp、711bp、1055bp和321bp。引物序列如表1所示。
表1、7对引物信息
二、快速鉴别结核分枝杆菌复合群菌种的方法
1、PCR扩增
提取待测菌株的基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，分别采用步骤一设计的7对引物对进行PCR扩增。
反应体系(20μl)：2×Premix Taq 10μl，10μM的上下游引物各1μl(终浓度均为0.5μM)，DNA模板1μl，补双蒸水7μl至20μl体系。其中，2×PremixTaq为Takara公司产品，目录号为R004A
反应条件：94℃5min，30个循环：94℃45s、54℃45s、72℃50s，最终延伸72℃7min。实验重复三次。
反应结束后，采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
2、鉴别方法
若所述PCR扩增产物满足如下1)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物含有大小为711bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段且所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为321bp的片段，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的结核分枝杆菌M.tuberculosis；
若所述PCR扩增产物满足如下2)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物含有大小为711bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段且所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的肯尼迪分枝杆菌M.canetii；
若所述PCR扩增产物满足如下3)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为321bp的片段且所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的非洲分枝杆菌M.africanum；
若所述PCR扩增产物满足如下4)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段且所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的山羊分枝杆菌M.caprae；
若所述PCR扩增产物满足如下5)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为321bp的片段且所述引物对3的PCR扩增产物不含有大小为466bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的田鼠分枝杆菌M.microti；
若所述PCR扩增产物满足如下6)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段且所述引物对4的PCR扩增产物不含有大小为802bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的牛型分枝杆菌M.bovis；
若所述PCR扩增产物满足如下7)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段且所述引物对4的PCR扩增产物不含有大小为802bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物不含有大小为1055bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的卡介苗M.bovisBCG；
若所述PCR扩增产物不满足上述1)-7)中任一种，则待测菌株不为或候选不为结核分枝杆菌复合群菌种中的任一种。
所述结核分枝杆菌复合群菌种由结核分枝杆菌M.tuberculosis、牛型分枝杆菌M.bovis、卡介苗M.bovis BCG、田鼠分枝杆菌M.microti、肯尼迪分枝杆菌M.canetii、山羊分枝杆菌M.caprae和非洲分枝杆菌M.africanum 7种菌组成。
上述7对引物或含有各自引物的PCR试剂均可作为鉴别结核分枝杆菌复合群菌种试剂盒的组分。鉴别方法具体如表2所示。
表2、7对引物的PCR产物在不同结核分枝杆菌复合群菌种中的表现形式
实施例2、结核分枝杆菌复合群菌种引物的应用
1、供试菌株：结核分枝杆菌M.tuberculosis(ATCC 27294)；牛型分枝杆菌M.bovis Karlson and Lessel(ATCC 19210)；卡介苗M.bovis BCG(ATCC35737)；田鼠分枝杆菌M.microti Reed(ATCC 19422)；肯尼迪分枝杆菌M.canetii、山羊分枝杆菌M.caprae、非洲分枝杆菌M.africanum Castets et al.(ATCC 35711)；鸟分支杆菌M.avium subsp.avium Chester(ATCC 25291)。
2、采用实施例1中的快速鉴别结核分枝杆菌复合群菌种的方法对上述待测菌株进行验证。
3、验证结果
结果如图1-图8所示。
从图1可以看出，7对引物分别对结核分枝杆菌M.tuberculosis(ATCC27294)的PCR产物共检测到7条带：引物对1扩增得到975bp、引物对2扩增得到588bp、引物对3扩增得到466bp、引物对4扩增得到802bp、引物对5扩增得到711bp、引物对6扩增得到1055bp、引物对7扩增得到321bp；
从图2可以看出，7对引物分别对肯尼迪分枝杆菌M.canetii的PCR产物检测到6条带：引物对1扩增得到975bp、引物对2扩增得到588bp、引物对3扩增得到466bp、引物对4扩增得到802bp、引物对5扩增得到711bp、引物对6扩增得到1055bp；引物对7没有扩增得到321bp；
从图3可以看出，7对引物分别对非洲分枝杆菌M.africanum Castets et al.(ATCC 35711)的PCR产物检测到6条带：引物对1扩增得到975bp、引物对2扩增得到588bp、引物对3扩增得到466bp、引物对4扩增得到802bp、引物对6扩增得到1055bp、引物对7扩增得到321bp；引物对5没有扩增得到711bp；
从图4可以看出，7对引物分别对山羊分枝杆菌M.caprae的PCR产物检测到5条带：引物对1扩增得到975bp、引物对2扩增得到588bp、引物对3扩增得到466bp、引物对4扩增得到802bp、引物对6扩增得到1055bp；引物对5没有扩增得到711bp、引物对7没有扩增得到321bp；
从图5可以看出，7对引物分别对田鼠分枝杆菌M.microti Reed(ATCC19422)的PCR产物检测到5条目的条带：引物对1扩增得到975bp、引物对2扩增得到588bp、引物对4扩增得到802bp、引物对6扩增得到1055bp、引物对7扩增得到321bp；引物对3没有扩增得到466bp、引物对5没有扩增得到711bp；
从图6可以看出，7对引物分别对牛型分枝杆菌M.bovis Karlson andLessel(ATCC 19210)的PCR产物检测到4条带：引物对1扩增得到975bp、引物对2扩增得到588bp、引物对3扩增得到466bp、引物对6扩增得到1055bp；引物对4没有扩增得到802bp、引物对5没有扩增得到711bp、引物对7没有扩增得到321bp；
从图7可以看出，7对引物分别对卡介苗M.bovis BCG ATCC 35737的PCR产物检测到3条带：引物对1扩增得到975bp、引物对2扩增得到588bp、引物对3扩增得到466bp；引物对4没有扩增得到802bp、引物对5没有扩增得到711bp、引物对6没有扩增得到1055bp、引物对7没有扩增得到321bp；
从图8可以看出，7对引物分别对结核分枝杆菌复合群之外的M.aviumsubsp.avium Chester(ATCC 25291)的PCR产物检测到1条带：引物对1扩增得到975bp；引物对2没有扩增得到588bp、引物对3没有扩增得到466bp、引物对4没有扩增得到802bp、引物对5没有扩增得到711bp、引物对6没有扩增得到1055bp、引物对7没有扩增得到321bp。
以上结果证明本发明用于鉴定结核分枝杆菌复合群菌种的引物对特异性较强，可以用于快速并准确的鉴定结核分枝杆菌复合群的菌种。
Claims (10)
1.一种鉴别结核分枝杆菌复合群菌种的成套引物，由引物对(1)-(7)组成：
(1)为由SEQ ID No.1所示的单链DNA和SEQ ID No.2所示的单链DNA组成的引物对1；
(2)为由SEQ ID No.3所示的单链DNA和SEQ ID No.4所示的单链DNA组成的引物对2；
(3)为由SEQ ID No.5所示的单链DNA和SEQ ID No.6所示的单链DNA组成的引物对3；
(4)为由SEQ ID No.7所示的单链DNA和SEQ ID No.8所示的单链DNA组成的引物对4；
(5)为由SEQ ID No.9所示所示的单链DNA和SEQ ID No.10所示的单链DNA组成的引物对5；
(6)为由SEQ ID No.11所示的单链DNA和SEQ ID No.12所示的单链DNA组成的引物对6；
(7)为由SEQ ID No.13所示的单链DNA和SEQ ID No.14所示的单链DNA组成的引物对7。
2.一种鉴别结核分枝杆菌复合群菌种的PCR试剂组，由PCR试剂1、PCR试剂2、PCR试剂3、PCR试剂4、PCR试剂5、PCR试剂6和PCR试剂7组成；
所述PCR试剂1包括权利要求1所述成套引物中的引物对1；
所述PCR试剂2包括权利要求1所述成套引物中的引物对2；
所述PCR试剂3包括权利要求1所述成套引物中的引物对3；
所述PCR试剂4包括权利要求1所述成套引物中的引物对4；
所述PCR试剂5包括权利要求1所述成套引物中的引物对5；
所述PCR试剂6包括权利要求1所述成套引物中的引物对6；
所述PCR试剂7包括权利要求1所述成套引物中的引物对7。
3.根据权利要求2所述的PCR试剂组，其特征在于：所述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6和引物对7中的各条引物的物质的量相同。
4.一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群菌种的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1所述的成套引物或含有权利要求2或3所述的PCR试剂组。
5.权利要求1所述的成套引物或权利要求2或3所述的PCR试剂组或权利要求4所述的试剂盒在制备鉴别或辅助鉴别待测菌株是否为结核分枝杆菌复合群菌种的产品中的应用；
或权利要求1所述的成套引物或权利要求2或3所述的PCR试剂组或权利要求4所述的试剂盒在鉴别或辅助鉴别待测菌株是否为结核分枝杆菌复合群菌种中的应用；
或权利要求1所述的成套引物或权利要求2或3所述的PCR试剂组或权利要求4所述的试剂盒在制备鉴别或辅助鉴别待测菌株为结核分枝菌复合群菌种7种中哪一种的产品中的应用；
或权利要求1所述的成套引物或权利要求2或3所述的PCR试剂组或权利要求4所述的试剂盒在鉴别或辅助鉴别待测菌株为结核分枝菌复合群菌种7种中哪一种中的应用。
6.一种鉴别或辅助鉴别待测菌株为结核分枝杆菌复合群菌种7种中哪一种的方法，包括如下步骤：以权利要求1所述的成套引物中的7种引物对分别对待测菌株进行PCR扩增，得到各自引物对对应的PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物；
若所述PCR扩增产物满足如下1)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物含有大小为711bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段且所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为321bp的片段，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的结核分枝杆菌M.tuberculosis；
若所述PCR扩增产物满足如下2)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物含有大小为711bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段且所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的肯尼迪分枝杆菌M.canetii；
若所述PCR扩增产物满足如下3)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为321bp的片段且所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的非洲分枝杆菌M.africanum；
若所述PCR扩增产物满足如下4)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段且所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的山羊分枝杆菌M.caprae；
若所述PCR扩增产物满足如下5)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为321bp的片段且所述引物对3的PCR扩增产物不含有大小为466bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的田鼠分枝杆菌M.microti；
若所述PCR扩增产物满足如下6)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段且所述引物对4的PCR扩增产物不含有大小为802bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的牛型分枝杆菌M.bovis；
若所述PCR扩增产物满足如下7)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段且所述引物对4的PCR扩增产物不含有大小为802bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物不含有大小为1055bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群的卡介苗M.bovis BCG；
若所述PCR扩增产物不满足上述1)-7)中任一种，则待测菌株不为或候选不为结核分枝杆菌复合群菌种中的任一种。
所述结核分枝杆菌复合群菌种由结核分枝杆菌M.tuberculosis、牛型分枝杆菌M.bovis、卡介苗M.bovis BCG、田鼠分枝杆菌M.microti、肯尼迪分枝杆菌M.canetii、山羊分枝杆菌M.caprae和非洲分枝杆菌M.africanum 7种菌组成。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的模板为待测菌株的基因组DNA；所述PCR扩增的退火温度为54℃。
8.一种鉴别或辅助鉴别待测菌株是否为结核分枝杆菌复合群菌种的方法，包括如下步骤：以权利要求1所述的成套引物中的7种引物对分别对待测菌株进行PCR扩增，得到各自引物对对应的PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物；
若所述PCR扩增产物满足如下1)-7)中的至少一种，则待测菌株为或候选为结核分枝杆菌复合群菌种：
1)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物含有大小为711bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段且所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为321bp的片段；
2)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物含有大小为711bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段且所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段；
3)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为321bp的片段且所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段；
4)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段且所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段；
5)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对4的PCR扩增产物含有大小为802bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物含有大小为321bp的片段且所述引物对3的PCR扩增产物不含有大小为466bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段；
6)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物含有大小为1055bp的片段且所述引物对4的PCR扩增产物不含有大小为802bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段；
7)：所述引物对1的PCR扩增产物含有大小为975bp的片段、所述引物对2的PCR扩增产物含有大小为588bp的片段、所述引物对3的PCR扩增产物含有大小为466bp的片段且所述引物对4的PCR扩增产物不含有大小为802bp的片段、所述引物对5的PCR扩增产物不含有大小为711bp的片段、所述引物对6的PCR扩增产物不含有大小为1055bp的片段、所述引物对7的PCR扩增产物不含有大小为321bp的片段；
若所述PCR扩增产物不满足如上1)-7)中的任一种，则待测菌株不为或候选不为结核分枝杆菌复合群菌种。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的模板为待测菌株的基因组DNA；所述PCR扩增的退火温度为54℃。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述结核分枝杆菌复合群菌种为结核分枝杆菌M.tuberculosis、牛型分枝杆菌M.bovis、卡介苗M.bovis BCG、田鼠分枝杆菌M.microti、肯尼迪分枝杆菌M.canetii、山羊分枝杆菌M.caprae和非洲分枝杆菌M.africanum。
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Non-Patent Citations (3)
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Also Published As
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