CN113621721A - 用于结核杆菌复合群内菌株快速鉴别的引物组合及试剂盒 - Google Patents

用于结核杆菌复合群内菌株快速鉴别的引物组合及试剂盒 Download PDF

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CN113621721A CN202110938421.9A CN202110938421A CN113621721A CN 113621721 A CN113621721 A CN 113621721A CN 202110938421 A CN202110938421 A CN 202110938421A CN 113621721 A CN113621721 A CN 113621721A
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Hexi University
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Abstract

本发明公开了用于结核杆菌复合群内菌株快速鉴别的引物组合及试剂盒，属于生物检测试剂领域。该引物组合包括：第一组引物为基因1Forward序列/Reverse序列、基因2Forward序列/Reverse序列；第二组引物为基因3Forward序列/Reverse序列、基因4Forward序列/Reverse序列；第三组引物为基因5Forward序列/Reverse序列；第四组引物为基因6Forward序列/Reverse序列、基因7Forward序列/Reverse序列。本发明的引物组合每鉴定1株细菌，只需4个PCR反应，可简化检测流程，提高工作效率并降低检测成本，为菌株的批量鉴定提供了方便。

Description

用于结核杆菌复合群内菌株快速鉴别的引物组合及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测试剂领域，特别是涉及一种用于结核杆菌复合群内菌株快速鉴别的引物组合及试剂盒。
背景技术
结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tubercμlosis complex，MtbC)内成员细菌是导致哺乳动物肺结核病的主要病原菌。结核分枝杆菌复合群(MtbC)包括：结核分枝杆菌(Mycobacterium tubercμlosis)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)、牛分枝杆菌山羊亚种(Mycobacterium caprae)和结核分枝杆菌卡内蒂亚种(Mycobacterium.canettii)。源自于牛分支杆菌的卡介苗疫苗株(Mycobacterium bovis derived bacillus Calmette-Gue′rin[BCG]vaccine strains)被广泛用于结核病的预防；然而，对于免疫力低下或免疫缺陷者，BCG也可以造成播散性结核病。
对病原体种型及亚型的鉴别是传染病溯源及防控工作的重要环节。以往使用分别含有对硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2-羧酸酰肼(TCH)的选择性罗氏培养基培养方法进行鉴别，培养结果可以对结核分支杆菌、牛分支杆菌及非结核分枝杆菌进行区分，是结核病病原菌菌种鉴定的重要方法之一。由于分枝杆菌生长缓慢，在获得病原菌菌株的基础上，这种以培养方法对病原菌菌种鉴定的过程也需要近30天时间才能获得鉴定结果。总体上看，这种鉴别方法费时、费力、对实验室生物安全条件要求高。
随着，分子生物学的兴起与发展，涌现出许多从DNA分子水平进行菌种鉴别的方法。Richard C.Huard等人，通过分别对分枝杆菌的16SrDNA、Rv0577、IS1561、Rv1510、Rv1970、Rv3877(或Rv3878)和Rv3120等7个基因片段的PCR扩增方法，达到鉴别结核分枝杆菌复合群成员及其他分枝杆菌的目的。由于该方法是分别对这7个基因进行单一PCR扩增，每鉴定1株细菌，需要进行7个PCR反应，后续进行DNA电泳检测时，在琼脂糖凝胶上至少需要占用7个泳道，加样繁琐、综合费用较高，较难适用于菌株的批量鉴定。因此，需要一种可以提高检测效率、降低检测成本的快速检测结核杆菌复合群内菌株的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于结核杆菌复合群内菌株快速鉴别的引物组合及试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，该引物组合每鉴定1株细菌，只需4个PCR反应，这大大简化检测流程，提高了工作效率并降低检测成本，为菌株的批量鉴定提供了方便。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种用于结核杆菌复合群内菌株快速鉴别的引物组合，包括：
第一组引物：
基因1Forward序列：5’-GGATAAGCCTGGGAAACTGG-3’；
基因1Reverse序列：5’-CCTTCGTCGATGGTGAAAGA-3’；
基因2Forward序列：5’-CGGCCACGTCACGAAAATC-3’；
基因2Reverse序列：5’-GGTGGTCTTGTTGACCGAGT-3’；
第二组引物：
基因3Forward序列：5’-TCATCTATCTGGCGGCCC-3’；
基因3Reverse序列：5’-CACTTTGAGCAACACTGGGA-3’；
基因4Forward序列：5’-CCTTCAGACCACCGATCAGT-3’；
基因4Reverse序列：5’-GTCGGATCGGTGATGAACG-3’；
第三组引物：
基因5Forward序列：5’-GCATTCGTTGGAACGCGAAA-3’；
基因5Reverse序列：5’-GTCGGCAAAGTACCAGAGCA-3’；
第四组引物：
基因6Forward序列：5’-CGGCTGATTGGCGGTTCCT-3’；
基因6Reverse序列：5’-GCCTGTTGGGCGGTTTGACT-3’；
基因7Forward序列：5’-GTCGATGTCACCGAGCATCT-3’；
基因7Reverse序列：5’-TTCGCCAAAATGCGGAATCG-3’；
上述第一组引物～第四组引物所示序列在一次检测中共同使用。
优选的是，所述基因1～基因7分别为16SrDNA、Rv1970、Rv1510、Rv0577、Rv3210、Rv3878、IS1561。
本发明还提供一种试剂盒，包括权利要求1所述的引物组合。
本发明还提供一种用于结核杆菌复合群内菌株快速鉴别的方法，包括利用所述的引物组合扩增目的基因，以鉴别结核杆菌复合群内菌株的步骤。
优选的是，第一组引物扩增条件为：2×PCR Mix 12.5μl、基因1Forward序列/基因1Reverse序列/基因2Forward序列/基因2Reverse序列各0.75μl、DNA模板1μl、H2O 8.5μl；
第二组引物扩增条件为：2×PCR Mix 12.5μl、基因3Forward序列/基因3Reverse序列/基因4Forward序列/基因4Reverse序列各0.75μl、DNA模板1μl、H2O 8.5μl；
第三组引物扩增条件为：2×PCR Mix 12.5μl、基因5Forward序列/基因5Reverse序列各0.75μl、DNA模板1μl、H2O 10μl；
第四组引物扩增条件为：2×PCR Mix 12.5μl、基因6Forward序列/基因6Reverse序列/基因7Forward序列/基因7Reverse序列各0.75μl、DNA模板1μl、H2O 8.5μl。
优选的是，扩增程序为：预变性95℃5min；变性95℃40s，退火58℃30s，延伸72℃45s，共30个循环；延伸72℃5min，4℃∞。
本发明还提供所述的引物组合或者所述的试剂盒或所述的方法在结核杆菌复合群内菌株鉴别中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明在现有技术上，根据分支杆菌的16SrDNA、Rv0577、IS1561、Rv1510、Rv1970、Rv3877(或Rv3878)和Rv3120等7个基因片段的DNA序列特点设计，并经实验筛选获得了双重PCR反应的引物组合，利用该套引物组合每鉴定1株细菌，只需4个PCR反应，DNA电泳检测时，在琼脂糖凝胶上对应需要4个泳道即可，检测耗时短，一般不超过1天。本发明通过所设计的引物组合进行结核杆菌复合群内菌株准确率高，费用低，易推广，并且可大大提高工作效率，为菌株的批量鉴定提供了方便和可行方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Rv基因组DNA多位点双重PCR扩增产物电泳带型模式；M：marker II；1：第一组引物反应空白对照；2：第一组引物反应结果；3：第二组引物反应空白对照；4：第二组引物反应结果；5：第三组引物反应空白对照；6：第三组引物反应结果；7：第四组引物反应空白对照；8：第四组引物反应结果；
图2为非洲分枝杆菌I型(M.africanum subtype I)基因组DNA多位点双重PCR扩增产物电泳带型模式；M：marker II；1：第一组引物反应空白对照；2：第一组引物反应结果；3：第二组引物反应空白对照；4：第二组引物反应结果；5：第三组引物反应空白对照；6：第三组引物反应结果；7：第四组引物反应空白对照；8：第四组引物反应结果；
图3为牛分枝杆菌(M.bovis)基因组DNA多位点双重PCR扩增产物电泳带型模式；M：marker II；1：第一组引物反应空白对照；2：第一组引物反应结果；3：第二组引物反应空白对照；4：第二组引物反应结果；5：第三组引物反应空白对照；6：第三组引物反应结果；7：第四组引物反应空白对照；8：第四组引物反应结果；
图4为卡介苗(M.bovis BCG)基因组DNA多位点双重PCR扩增产物电泳带型模式；M：marker II；1：第一组引物反应空白对照；2：第一组引物反应结果；3：第二组引物反应空白对照；4：第二组引物反应结果；5：第三组引物反应空白对照；6：第三组引物反应结果；7：第四组引物反应空白对照；8：第四组引物反应结果；
图5为田鼠分枝杆菌(M.microti)基因组DNA多位点双重PCR扩增产物电泳带型模式；M：marker II；1：第一组引物反应空白对照；2：第一组引物反应结果；3：第二组引物反应空白对照；4：第二组引物反应结果；5：第三组引物反应空白对照；6：第三组引物反应结果；7：第四组引物反应空白对照；8：第四组引物反应结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中所涉及的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、非洲分枝杆菌(II型)(M.africanum subtypes II)、结核分枝杆菌卡内蒂亚种(M.canettii)、非洲分枝杆菌(I型)(M.africanum subtype I)、牛分枝杆菌山羊亚种(M.bovis subsp.caprae)、牛分枝杆菌(M.bovis)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、其他分支杆菌(Mycobacterium other thanMtbC，MOTT)均为首都医科大学李卫民教授惠赠；卡介苗(M.bovis BCG)为河西学院实验室保存。
实施例1
1、试验方法
(1)用接种环刮取在改良罗氏培养基上生长良好的菌，放入装有400μl纯水的EP管中，盖上盖子后，振荡混匀，在85℃金属浴中加热15min，灭活。
(2)按照柱式分枝杆菌DNAout试剂盒的说明书提取各种菌株的DNA。
(3)测DNA浓度，根据不同的浓度，稀释到20μg/ml。
(4)PCR反应体系的配制：
第一组反应体系：总体积25μl，包括以下组分：2×PCR Mix 12.5μl；H2O 8.5μl；第一组引物(基因1Forward序列(SEQ ID NO：1)：5’-GGATAAGCCTGGGAAACTGG-3’和基因1Reverse序列(SEQ ID NO：2)：5’-CCTTCGTCGATGGTGAAAGA-3’和基因2Forward序列(SEQ IDNO：3)：5’-CGGCCACGTCACGAAAATC-3’和基因2Reverse序列(SEQ ID NO：4)：5’-GGTGGTCTTGTTGACCGAGT-3’)各0.75μl；DNA模板1μl。两个基因扩增均阳性，电泳可见大小约为311bp和592bp的扩增条带，带型模式记为：“1+2”。
第二组反应体系：总体积25μl，包括以下组分：2×PCR Mix 12.5μl；H2O 8.5μl；第二组引物(基因3Forward序列(SEQ ID NO：5)：5’-TCATCTATCTGGCGGCCC-3’和基因3Reverse序列(SEQ ID NO：6)：5’-CACTTTGAGCAACACTGGGA-3’和基因4Forward序列(SEQ ID NO：7)：5’-CCTTCAGACCACCGATCAGT-3’和基因4Reverse序列(SEQ ID NO：8)：5’-GTCGGATCGGTGATGAACG-3’)各0.75μl；DNA模板1μl。两个基因扩增均阳性，电泳可见大小约为638bp和312bp的扩增条带，带型模式记为：“3+4”。
第三组反应体系：总体积25μl，包括以下组分：2×PCR Mix 12.5μl；H2O 10μl；第三组引物(基因5Forward序列(SEQ ID NO：9)：5’-GCATTCGTTGGAACGCGAAA-3’和基因5Reverse序列(SEQ ID NO：10)：5’-GTCGGCAAAGTACCAGAGCA-3’)各0.75μl；DNA模板1μl。基因扩增阳性，电泳可见大小约为321bp的扩增条带，带型模式记为：“5”
第四组反应体系：总体积25μl，包括以下组分：2×PCR Mix 12.5μl；H2O 8.5μl；第四组引物(基因6Forward序列(SEQ ID NO：11)：5’-CGGCTGATTGGCGGTTCCT-3’和基因6Reverse序列(SEQ ID NO：12)：5’-GCCTGTTGGGCGGTTTGACT-3’和基因7Forward序列(SEQID NO：13)：5’-GTCGATGTCACCGAGCATCT-3’和基因7Reverse序列(SEQ ID NO：14)：5’-TTCGCCAAAATGCGGAATCG-3’)各0.75μl；DNA模板1μl。两个基因扩增均阳性，电泳可见大小约为670bp和303bp的扩增条带，带型模式记为：“6+7”。
(5)空白对照、阳性对照PCR反应体系的配制：
在临床分离株检测鉴定实验过程中，以上各组空白对照的反应体系中以等体积的H2O替代DNA模板，其他成分及用量不变。以上各组阳性对照的反应体系中DNA模板建议用等体积的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)H37Rv基因组DNA，其他成分及用量不变。
(6)PCR反应热循环参数：
预变性95℃5min；变性95℃40s，退火58℃30s，延伸72℃45s，共30个循环；延伸72℃5min，4℃∞。
(7)将扩增所得的产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检测，根据电泳检测结果对结核杆菌复合群内菌种进行鉴别。
2、实验结果判断
(1)每个样品的每个反应体系设置2个重复，两个重复孔的结果一致则为可信。
(2)PCR扩增产物电泳检测结果出现：
带型模式：1+2、3+4、5、6+7，对应的样品菌则为结核分枝杆菌(M.tuberculosis)或非洲分枝杆菌(II型)(M.africanum subtypes II)；见图1。
带型模式：1+2、3+4、6+7，对应的样品菌则为结核分枝杆菌卡内蒂亚种(M.canettii)；
带型模式：1、3+4、5、6+7，对应的样品菌则为非洲分枝杆菌(I型)(M.africanumsubtype I)；见图2。
带型模式：1、3+4、6+7，对应的样品菌则为牛分枝杆菌山羊亚种(M.bovissubsp.caprae)；
带型模式：1、4、6+7，对应的样品菌则为牛分枝杆菌(M.bovis)；见图3。
带型模式：1、4、7，对应的样品菌则为卡介苗(M.bovis BCG)；见图4。
带型模式：1、3+4、5、6，对应的样品菌则为田鼠分枝杆菌(M.microti)；见图5。
带型模式：1，对应的样品菌则为结核杆菌复合群以外其他分支杆菌(Mycobacterium other than MtbC，MOTT)。
从上述试验结果可以看出，本发明设计的引物组合同时使用在一次检测中，根据检测结果所出现的带型就能准确分辨结核杆菌复合群内不同菌株，特异性强。对于临床分离株检测而言，可以大大缩短检测时间，提高工作效率，提供了极大的便利性，适于广泛推广和应用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 河西学院
<120> 用于结核杆菌复合群内菌株快速鉴别的引物组合及试剂盒
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggataagcct gggaaactgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccttcgtcga tggtgaaaga 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggccacgtc acgaaaatc 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtggtcttg ttgaccgagt 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcatctatct ggcggccc 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cactttgagc aacactggga 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccttcagacc accgatcagt 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcggatcgg tgatgaacg 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcattcgttg gaacgcgaaa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtcggcaaag taccagagca 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cggctgattg gcggttcct 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcctgttggg cggtttgact 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtcgatgtca ccgagcatct 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttcgccaaaa tgcggaatcg 20

Claims (7)

1.一种用于结核杆菌复合群内菌株快速鉴别的引物组合，其特征在于，包括：
第一组引物：
基因1Forward序列：5’-GGATAAGCCTGGGAAACTGG-3’；
基因1Reverse序列：5’-CCTTCGTCGATGGTGAAAGA-3’；
基因2Forward序列：5’-CGGCCACGTCACGAAAATC-3’；
基因2Reverse序列：5’-GGTGGTCTTGTTGACCGAGT-3’；
第二组引物：
基因3Forward序列：5’-TCATCTATCTGGCGGCCC-3’；
基因3Reverse序列：5’-CACTTTGAGCAACACTGGGA-3’；
基因4Forward序列：5’-CCTTCAGACCACCGATCAGT-3’；
基因4Reverse序列：5’-GTCGGATCGGTGATGAACG-3’；
第三组引物：
基因5Forward序列：5’-GCATTCGTTGGAACGCGAAA-3’；
基因5Reverse序列：5’-GTCGGCAAAGTACCAGAGCA-3’；
第四组引物：
基因6Forward序列：5’-CGGCTGATTGGCGGTTCCT-3’；
基因6Reverse序列：5’-GCCTGTTGGGCGGTTTGACT-3’；
基因7Forward序列：5’-GTCGATGTCACCGAGCATCT-3’；
基因7Reverse序列：5’-TTCGCCAAAATGCGGAATCG-3’；
上述第一组引物～第四组引物所示序列在一次检测中共同使用。
2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述基因1～基因7分别为16SrDNA、Rv1970、Rv1510、Rv0577、Rv3210、Rv3878、IS1561。
3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合。
4.一种用于结核杆菌复合群内菌株快速鉴别的方法，其特征在于，包括利用权利要求1中所述的引物组合扩增目的基因，以鉴别结核杆菌复合群内菌株的步骤。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，第一组引物扩增条件为：2×PCR Mix12.5μl、基因1Forward序列/基因1Reverse序列/基因2Forward序列/基因2Reverse序列各0.75μl、DNA模板1μl、H2O 8.5μl；
第二组引物扩增条件为：2×PCR Mix 12.5μl、基因3Forward序列/基因3Reverse序列/基因4Forward序列/基因4Reverse序列各0.75μl、DNA模板1μl、H2O 8.5μl；
第三组引物扩增条件为：2×PCR Mix 12.5μl、基因5Forward序列/基因5Reverse序列各0.75μl、DNA模板1μl、H2O 10μl；
第四组引物扩增条件为：2×PCR Mix 12.5μl、基因6Forward序列/基因6Reverse序列/基因7Forward序列/基因7Reverse序列各0.75μl、DNA模板1μl、H2O 8.5μl。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，扩增程序为：预变性95℃5min；变性95℃40s，退火58℃30s，延伸72℃45s，共30个循环；延伸72℃5min，4℃∞。
7.如权利要求1所述的引物组合或者权利要求3所述的试剂盒或权利要求4所述的方法在结核杆菌复合群内菌株鉴别中的应用。
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