KR20010084904A

KR20010084904A - 마이코박테리아 균종 동정용 올리고뉴클레오티드

Info

Publication number: KR20010084904A
Application number: KR1020017003220A
Authority: KR
Inventors: 김철민; 박희경; 장현정
Original assignee: 김철민; 김정준; 박희경; 주식회사 에스제이하이테크
Priority date: 1999-05-29
Filing date: 2000-05-16
Publication date: 2001-09-07
Also published as: KR20010112899A; KR20010112901A; KR100343607B1; KR100343615B1; KR100343616B1; KR20010084910A; KR100316093B1; KR100343622B1; CN1542142A; AU4620100A; KR100343617B1; KR100316095B1; KR20010084909A; KR20010112902A; KR20010084907A; KR100343611B1; KR20010084906A; KR20010112905A; KR20010112903A; KR100343618B1

Abstract

본 발명은 마이코박테리아 균종의 동정 및 감별 진단에 사용할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브(probe)에 관한 것으로, 비결핵 마이코박테리아의 일종인 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum), 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae), 마이코박테리움 엡서수스(M. abscessus), 마이코박테리움 베체(M. vaccae), 마이코박테리움 플라베센스(M. flavescens), 마이코박테리움 아시아티쿰 (M. asiaticum), 마이코박테리움 포르시눔(M. porcinum), 마이코박테리움 아카풀센시스(M. acapulcensis), 및 마이코박테리움 디에른호퍼리(M. diernhoferi)의 내부전사지역(ITS, Internal Transcribed Spacer region)의 염기서열을 밝히고, 이들 염기서열을 이용하여 마이코박테리아 속의 동정 및 각각의 마이코박테리움 균종의 동정이 가능한 PCR용 프라이머 또는 혼성화 반응용 프로브로서 서열 번호 10 내지 241의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

Description

마이코박테리아 균종 동정용 올리고뉴클레오티드{OLIGONUCLEOTIDE FOR DETECTION AND IDENTIFICATION OF MYCOBACTERIA}

결핵은 과거에 비해서는 꾸준히 감소되고 있는 중이지만 아직도 전세계적으로 매년 약 800 만명 정도의 새로운 환자가 발생하고 300 만명 정도의 환자가 사망하는 것으로 보고되고 있다. 더우기, 개발도상국에서는 항결핵제의 부족으로 인한 부적절한 치료로 약제 내성균을 갖는 만성 보균자가 증가되고 있고, 선진국에서도 1980년대에 들어서면서 후천성면역결핍증(AIDS) 환자의 증가로 인하여 결핵 감소가 정체되고 다시 증가하는 양상을 보이고 있다. 따라서, 이러한 추세라면 2000 년 경에는 1200 만명의 새로운 환자가 발생할 것으로 예측되고 있다(J. P. Natain, M. C. Raviglione, 및 A. Kochi,Tubercle and Lung Disease, 73: 311-321, 1992; Murray CJL. 및 Lopez AD. The global burden of disease.Global burden of disease and injury series. Vol. 1.Cambridge, Mass: Harvard University Press, 1996, p349-350; Global Tuberculosis Programme: Anti-tuberculosis drug resistance, WHO Report 1997: World Health Organization. 1997).

1950년대에 비결핵 마이코박테리아(non-tuberculous mycobacteria, NTM)도 인간에게 질병을 일으킬 수 있다는 사실이 보고되었고, 1980년 이후 마이코박테리움 아비움 콤플렉스(M. aviumcomplex, MAC)가 AIDS 환자에게 전신 질환을 유발한다고 알려진 다음부터, 비결핵 마이코박테리아에 대한 관심이 높아지고 있다. 비결핵 마이코박테리아에 의한 질환은 임상적인 소견이나 일반적인 병리 소견이 결핵과 유사하다. 하지만 비결핵 마이코박테리아는 주변의 생활 환경에 널리 분포하고 있고, 임상 가검물로부터 분리되어도 병원성 여부를 판단하기 어려워 진단이 쉽지 않을 뿐만 아니라, 대부분의 각종 항결핵제에 약제 내성을 보이고 있어 치료가 어렵고 재발율도 높은 것으로 알려져 있다. 이처럼 여러 약제에 내성을 가진 비결핵 마이코박테리아 균주가 점차 증가하고 있는데, 이들에 의한 질병에 대해서는 결핵균에 의한 질환에서와 다른 방법을 사용하여야 하기 때문에 이들에 대한 신속하고도 정확한 동정 방법이 요구되고 있다. 또한, 결핵 발병율과 다제내성 결핵균주의 증가로 결핵의 효과적인 치료 및 관리를 위해서도 TB 복합체 뿐 아니라 NTM 균주의 보다 신속하고 정확한 동정이 요구되고 있다.

마이코박테리아 감염 여부의 조기 진단과 마이코박테리아 균종의 확인은 치료에 있어서 상당히 중요한 위치를 차지하기 때문에 여러 가지 진단 방법들이 연구 및 개발되어 왔다. 이들 중에서 현재 이용되고 있는 동정 및 감염 여부 진단 방법은 다음과 같다.

첫째로, 미생물학적 방법인 도말 및 배양 검사가 있다. 그러나, 이 방법은 마이코박테리아처럼 세대 기간이 길어 배양 시간이 오래 걸리고 실험자에게 감염 위험이 수반되는 병원성 미생물에 적용하기에는 적합하지 않다.

둘째로, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)법이 있는데, 이 방법은 민감도와 특이성이 높아 마이코박테리아처럼 분리 배양에 오랜 시간이 걸리는 병원균의 검출에 매우 유용하다. 특히 소량의 DNA를 증폭시켜 검출하므로 균주의 배양 과정을 거치지 않고 검체에 존재하는 소량의 병원균만으로도 동정이 가능하다는 장점이 있다. 이러한 PCR에 의한 검출은 증폭시키는 표적 DNA에 따라 여러 가지 방법이 소개되고 있는데 그 중에서도 여러 카피(copy)로 존재하는 IS6110과 16S rRNA가 주로 이용되고 있다(Bauer J, Andersen AB, Kremer K, 및 Miorner H, Usefulness of spoligotyping to discriminate IS6110 low-copy-number Mycobacterium tuberculosis complex strains cultured in Denmark, 1999,J.Clin. Microbiol. 37: 2602-2606; Troesch, A., H. Nguyen, C. G. Miyada, S. Desvarenne, T. R. Gingeras, P. M. Kaplan, P. Cros 및 C. Mabilat. 1999, Microbacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays,J. Clin. Microbiol. 37: 49-55).

셋째는 마이코박테리아 균체 성분의 물리화학적 분석방법으로, 마이코박테리아의 균체 성분 중 지방 화합물을 HPLC 또는 GC 및 질량 분석기를 이용하여 검출하는 방법이다. 이 방법은 특이도가 높기는 하나 고가의 장비가 필요하다는 단점이 있다.

넷째는 혈청학적 방법에 의한 균체 성분의 검출 방법으로, 균항원에 대한 항체를 흡착시킨 혈구나 라텍스(latex) 입자를 이용한 응집 반응과 효소를 항체에 결합시킨 효소 결합 면역 분석법 등이 이용되고 있다. 그러나 이 기법은 매우 정교하여 세심한 주의를 요하므로 한정된 검사실에서만 가능하고, 현재의 감염과 그 이전의 감염 간의 차이를 구별하는 것이 어렵다는 단점이 있다.

다섯째로는, 마이코박테리오파아지 L5에 루시페라제(luciferase) 유전자를 삽입하고 마이코박테리아에 감염시킨 후, 배지 내에 첨가된 루시페린(luciferin)으로 발광 여부를 조사하여 마이코박테리아를 검색할 수 있는 방법이 있다(W. R. Jacobs, R. G. Barletta, R. Udani, J. Chan, G. Kalkut, G. Sosne, T. Kieser, G. J. Sarkis, G. F. Hatful, 및 B. R. Bloom. 1993,Science 260:819-822).

여섯째로는, 올리고뉴클레오티드 프로브의 혼성화(hybridization)에 의한 동정 방법이 있다(A. Troesch, H. Nguyen, C. G. Miyada, S. Desvarenne, T. R.Gingeras, P. M. Kaplan, P. Cros 및 C. Mabilat. 1999.J. Clin. Microbiol. 37: 49-55).

한편, 인체에 질병을 유발하는 비결핵 마이코박테리아로는 상기 언급된 마이코박테리움 아비움 콤플렉스(MAC) 이외에도 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum), 마이코박테리움 첼로네 컴플렉스(M. chelonaecomplex), 마이코박테리움 테레(M. terrae) 및 마이코박테리움 베체(M. vaccae) 등이 알려져 있다. 이중에서 마이코박테리움 첼로네 컴플렉스는 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae)와 마이코박테리움 엡서수스(M. abscessus)로 분류되며, 임상에서 아직 이 두 균주를 구별할 수 있는 방법은 알려져 있지 않다.

본 발명은 마이코박테리아 균종의 동정에 사용할 수 있는 올리고뉴클레오티드에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 비결핵 마이코박테리아의 일종인 마이코박테리움 포튜이튬(Mycobacterium fortuitum), 마이코박테리움 첼로네(Mycobacterium chelonae), 마이코박테리움 엡서수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 베체(Mycobacterium vaccae), 마이코박테리움 플라베센스(Mycobacterium flavescens), 마이코박테리움 아시아티쿰(Mycobacterium asiaticum), 마이코박테리움 포르시눔(Mycobacterium porcinum), 마이코박테리움 아카풀센시스 (Mycobacterium acapulcensis), 및 마이코박테리움 디에른호퍼리(Mycobacterium diernhoferi)의 내부전사지역(ITS, Internal Transcribed Spacer region)의 염기서열을 밝히고, 이들 ITS 염기서열을 이용하여 마이코박테리아 속의 동정 및 각각의 마이코박테리움 균종의 동정이 가능한 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브를 제공하고자 한 것이다.

도 1은 마이코박테리아 내부전사지역(ITS) 및 ITS의 중합효소연쇄반응(PCR) 증폭에 이용되는 프라이머의 위치에 관한 개요도,

도 2는 마이코박테리아의 16S rRNA 및 23S rRNA 일부를 포함하는 ITS 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 여러 가지 마이코박테리아 균주에 대하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진,

도 3은 마이코박테리아인지를 확인하는 프라이머쌍(ITSF와 MYC2)을 이용하여 여러 가지 마이코박테리아 균주에 대하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진,

도 4는 마이코박테리아인지를 확인하고, 동시에 마이코박테리아 중에서 TB 복합체(complex)인지 비결핵 마이코박테리아(NTM)인지를 동정하는 멀티플렉스 PCR (multiplex PCR)을 설명하는 개요도,

도 5는 마이코박테리아 확인용 프라이머쌍(ITSF와 MYC2)과 마이코박테리아 중 TB 복합체(complex) 동정용 프라이머쌍(MTB2와 MYC2)으로 멀티플렉스 PCR (multiplex PCR)을 실시한 후 전기영동한 사진,

도 6은 비결핵 마이코박테리아(NTM) 각 균주의 다형성 지역의 염기서열로부터 제작된 종 특이적인 프라이머쌍을 이용하여 각각의 마이코박테리아 균주에 대하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진,

도 7은 비결핵 마이코박테리아(NTM) 각 균주의 다형성 지역의 염기서열로부터 제작된 종 특이적인 프라이머쌍을 이용하여 여러 가지 마이코박테리아 균주에 대하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진.

본 발명에서는 상기와 같은 종래의 마이코박테리아 동정 및 감염 여부 진단 방법의 문제점을 고려하여 기존의 균 배양 및 생화학적 방법에 의한 동정법을 대신할 수 있는 간단하면서도 정확도와 효율성 높은 방법을 제공하고자 한다.

즉, 본 발명의 목적은 마이코박테리아 속에 공통적인 염기서열 부위와 각각의 균종에 특이적인 염기서열 부위를 PCR 용 프라이머 또는 동정용 프로브로 제공함으로써, 마이코박테리아 균주인지 여부의 판별 및 마이코박테리아 균주 중에서도 TB 복합체인지 NTM인지를 동정하는 방법, 즉 마이코박테리아 속(genus)과 종 (species)을 정확하게 동정하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에서는 서열 번호 1 내지 서열 번호 9에 기재된 마이코박테리움 포튜이튬(Mycobacterium fortuitum), 마이코박테리움 첼로네(Mycobacterium chelonae), 마이코박테리움 엡서수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 베체(Mycobacterium vaccae), 마이코박테리움 플라베센스 (Mycobacterium flavescens), 마이코박테리움 아시아티쿰(Mycobacterium asiaticum), 마이코박테리움 포르시눔(Mycobacterium porcinum), 마이코박테리움 아카풀센시스(Mycobacterium acapulcensis) 및 마이코박테리움 디에른호퍼리 (Mycobacterium diernhoferi) 유전자의 내부 전사 지역(ITS, Internal Transcribed Spacer region)의 DNA를 제공한다.

또한 본 발명에서는 PCR용 프라이머 또는 혼성화용 프로브로서,

서열 번호 10∼14 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리아 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 15∼23 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리아중 TB 복합체 (TB complex)와 비결핵 마이코박테리아 구분에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 24∼27 중 하나의 염기서열을 갖는, MAC (Mycobacterium avium및Mycobacterium intracellulare) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 28∼38 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 포튜이튬 (Mycobacterium fortuitum) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 39∼46 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 첼로네 (Mycobacterium chelonae) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 47∼52 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 엡서수스 (Mycobacterium abscessus) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 53∼64 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 베체 (Mycobacterium vaccae) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 65∼72 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 플라베센스 (Mycobacterium flavescens) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 73∼77 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 고도네 (Mycobacterium gordonae) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 78∼100 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 테레 (Mycobacterium terrae) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 101∼108 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 스크로플래시움(Mycobacterium scroflaceum) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 109∼112 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 칸사시 (Mycobacterium kansasii) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 113∼116 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 스줄가이 (Mycobacterium szulgai) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 117∼119 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 마리눔 (Mycobacterium marinum) 및 마이코박테리움 울세란스(Mycobacterium ulcerans) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 120∼123 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 가스트리 (Mycobacterium gastri) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 124∼133 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 제노피(Mycobacterium xenopi) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 134∼141 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 제나벤스 (Mycobacterium genavense) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 142∼146 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 말모엔스 (Mycobacterium malmoense) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 147∼153 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 시미에 (Mycobacterium simiae) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 154∼165 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 166∼172 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 쉬모이데이 (Mycobacterium shimoidei) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 173∼180 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 하바나 (Mycobacterium habana) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 181∼189 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 파시노겐 (Mycobacterium farcinogen) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 190∼193 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 아시아티쿰 (Mycobacterium asiaticum) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 194∼205 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 포르시눔 (Mycobacterium porcinum) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 206∼215 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 아카풀센시스(Mycobacterium acapulcensis) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 216∼227 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 디에른호퍼리(Mycobacterium diernhoferi) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드;

서열 번호 228∼240 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 파라투베르쿨로시스(Mycobacterium paratuberculosis) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드; 및

서열 번호 241의 염기서열을 갖는, 마이코박테리아 속(Mycobacteria sp) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

종래의 PCR 방법에 의한 동정법에서는 목적으로 하는 한 종류 또는 두 종류의 균주 만을 동정할 수 있었으나, 본 발명에서는 거의 모든 인체 감염성 마이코박테리아 균주의 동정이 동시에 가능하도록 하기 위해 마이코박테리아의 ITS 염기서열로부터 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. ITS는 흔히 표적 DNA로 사용되는 16S rRNA 보다 다형성 지역이 많은 동시에 보존적인 지역이 존재하여 유전형 감별을 위한 표적 DNA로서 높은 유용성을 갖고 있는 영역이다(Gurtler, V., 및 V. A. Stanisich, 1996, New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S-23S rDNA spacer region.Microbiol. 142:3-16).

이에 따라, 본 발명에서는 비결핵 마이코박테리아 중에서 아직 염기서열이 밝혀지지 않은 마이코박테리움 포튜이튬(Mycobacterium fortuitum), 마이코박테리움 첼로네(Mycobacterium chelonae), 마이코박테리움 엡서수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 베체(Mycobacterium vaccae), 마이코박테리움 플라베센스(Mycobacterium flavescens), 마이코박테리움 아시아티쿰(Mycobacterium asiaticum), 마이코박테리움 포르시눔(Mycobacterium porcinum), 마이코박테리움 아카풀센시스(Mycobacterium acapulcensis) 및 마이코박테리움 디에른호퍼리 (Mycobacterium diernhoferi) 유전자의 ITS 염기서열을 밝히고, 이들을 이용하여 균종의 구별이 가능한 프로브 및 프라이머를 디자인하였다. 그 밖의 균주는 현재까지 공중(GenBank)에 공개되어 있는 염기서열 정보를 멀티얼라인먼트(multi-alignment)와 블라스트(blast)로 분석하여 이론적으로 동일한 부위의 다형성 (polymorphism)으로 감별이 가능한 부위를 선택하여 프로브 또는 프라이머를 디자인하여 균주 특이적인 혼성화 반응(hybridization)으로 동정을 하였다. 그 확인 실험으로서 PCR 반응의 속특이적 및 종특이적 프라이머로 증폭시켜본 결과 효과적으로 동정이 가능함을 확인할 수 있었다.

즉, 마이코박테리아의 ITS에 존재하는 특이 핵산 서열에만 혼성화하는 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브(oligonucleotide probe)를 고형 지지체에 부착시켜 마이코박테리아의 균종을 특이적이고 민감하게 탐지 또는 동정할 수 있다. 또한, 각 균종을 특이적으로 탐지하는 이들 올리고뉴클레오티드 프로브와 같은 서열로 프라이머를 제작하여 PCR을 실시한 후 일정한 크기로 증폭되는지 여부에 의해서도 동정이 가능하다. 이들 마이코박테리아 ITS 염기서열로부터 제작된 본 발명의 프로브 또는 프라이머를 이용하면, 먼저 마이코박테리아인지 여부를 구별하고, 계속해서 마이코박테리아 중에서도 TB 복합체인지 NTM인지를 구별하고, 나아가 NTM 중에서도 균종을 정확히 구별할 수 있다.

본 발명을 다음 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 마이코박테리아의 배양 및 게놈 DNA(genomic DNA) 분리

마이코박테리아 표준균주는 KCTC(Korean Collection for Type Culture, 유전자은행)와 ATCC(American Type Culture Collection)로부터, 임상균주는 대한결핵협회, 결핵병원 및 부산대학병원을 통해서 입수하였으며, 균주의 보관과 배양은 부산대학병원 임상병리과 임상미생물 전공교수의 관리하에 수행하였다. 본 발명에서 사용된 마이코박테리아와 일반 병원성 세균의 종류는 아래 표 8과 같다.

마이코박테리아에서 DNA의 추출은 다음과 같은 방법으로 실시하였다: 마이코박테리아를 오가와(Ogawa) 배지에서 배양한 후 1 백금이를 따서 원심분리관에 넣고 인스타진 매트릭스(InstaGene matrix, Bio-Rad Co.) 200 ㎕를 가하여 부유시킨 후, 56 ℃에서 30 분 동안 유지하고 10 초 동안 교반(vortex)한 다음 100 ℃에서 8 분 동안 열처리하였다. 다시 10 초 동안 교반(vortex)한 후 12,000 rpm에서 3 분 동안 원심분리하여 상층액을 새 튜브로 옮겨 -20 ℃에 보관하였다. 분리된 각 균종의 DNA 2 ㎕를 아래의 PCR 반응에 사용하였다.

실시예 2. 마이코박테리아의 ITS 증폭용 프라이머의 제작

마이코박테리아의 ITS 및 ITS의 PCR 증폭에 이용되는 프라이머의 위치는 도 1에 나타낸 바와 같다. 마이코박테리아의 ITS를 증폭시키기 위한 프라이머는 마이코박테리아의 16S rRNA와 23S rRNA의 보존적인 지역 중 일부 염기서열을 선정하여 제작하였다. 즉, 이미 공개되어 있는 마이코박테리아의 16S와 23S rRNA의 염기서열을 멀티얼라인먼트 (multialignment)와 블라스트 검색(blast search)으로 컴퓨터 분석하여 프라이머를 디자인하였는데, 선정된 프라이머는 16S rRNA 및 23S rRNA 일부와 함께 ITS 부위가 약 500 bp 크기로 선택적으로 증폭되도록 고안된 것으로, 서열 번호 242(ITSF) 및 243(ITSR)의 염기서열을 갖는다. ITS 증폭 프라이머를 포함하여 실험에 사용한 모든 프라이머는 바이오베이직(BioBasic, 캐나다)에 의뢰하여 퍼킨-엘머 DNA 합성기 (Perkin-Elmer DNA synthesizer)에서 50 nmol 농도로 제작하여 사용하였다.

실시예 3. PCR 반응 및 산물의 확인

실시예 1에서 얻은 각 균종의 DNA 2 ㎕씩을 PCR 반응에 사용하였다. 반응물의 조성은 다음과 같다: 500 mM KCl, 100 mM Tris HCl(pH 9.0), 1% Triton X-100, 0.2 mM dNTP(dATP, dGTP, dTTP 및 dCTP), 1.5 mM MgCl₂, 1 pmol 프라이머, 1U Taq DNA 폴리머라제(Bio Basic Inc.). 이 혼합액을 94 ℃에서 5 분 동안 반응시켜 충분히 변성시킨 후 94 ℃에서 1 분, 60 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 1 분씩 30 회 반응시켰으며, 마지막으로 72 ℃에서 10 분간 연장하였다. 반응이 끝난 후 1.5 % 아가로즈 겔(agarose gel)에 전기영동하여 PCR 산물을 확인하였다. GenBank의 자료를 통해서 미리 예견하였던 바와 같이 16S rRNA와 23S rRNA의 보존적인 프라이머로 증폭시킨 ITS의 크기는 약 500 bp로 나타났다.

도 2는 마이코박테리아의 16S rRNA 및 23S rRNA 일부를 포함하는 ITS 증폭용 프라이머 쌍을 이용하여 여러 가지 마이코박테리아 균주에 대하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다. 여기에서 M은 분자량 표지로 100 bp 간격을 갖고 있으며, C는 대조군, 레인(lane) 1은 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum), 레인 2는 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae), 레인 3은 마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellularae), 레인 4는 마이코박테리움 아비움(M. avium), 레인 5는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. Tb), 레인 6은 마이코박테리움 아그리(M. agri), 레인 7은 마이코박테리움 칸사시(M. kansasii), 레인 8은 마이코박테리움 고도네(M. gordonae), 그리고 레인 9는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. TbH37Rv)를 나타내는 것으로, 대조군인 C를 제외하고 레인 1∼9의 마이코박테리아에서는 ITS 증폭이 일어난 것을 볼 수 있다.

실시예 4. 마이코박테리아 ITS의 DNA 서열 분석

PCR 반응의 확인이 끝난 후, ITS 염기서열이 공개되어 있지 않은 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum), 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae), 마이코박테리움 엡서수스(M. abscessus), 마이코박테리움 베체(M. vaccae), 마이코박테리움 플라베센스(M. flavescens), 마이코박테리움 아시아티쿰(M. asiaticum), 마이코박테리움 포르시눔(M. porcinum), 마이코박테리움 아카풀센시스(M. acapulcensis) 및 마이코박테리움 디에른호퍼리(M. diernhoferi)의 ITS 반응물을 PCR로 증폭시킨 후 PCR 반응물 그대로 DNA 서열 분석에 사용하였다.

DNA는 200 μmol 농도로 정량하여 반응에 사용하였다. DNA 자동서열분석기(auto sequencer, Perkin-Elmer, ABI prim 377 sequencer)로 만능 프라이머 (universal primer) M13을 사용하여 다이 터미네이터(dye terminator) 법으로 염기서열을 결정하였다.

서열 번호 1 내지 9는 각각 마이코박테리움 포튜이튬 (Mycobacterium fortuitum), 마이코박테리움 첼로네(Mycobacterium chelonae), 마이코박테리움 엡서수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 베체(Mycobacterium vaccae), 마이코박테리움 플라베센스(Mycobacterium flavescens), 마이코박테리움 아시아티쿰(Mycobacterium asiaticum), 마이코박테리움 포르시눔(Mycobacterium porcinum), 마이코박테리움 아카풀센시스(Mycobacterium acapulcensis) 및 마이코박테리움 디에른호퍼리(Mycobacterium diernhoferi)의 ITS 염기서열을 나타낸다.

실시예 5. 올리고뉴클레오티드 프라이머의 선정과 합성

실시예 4에서 얻어진 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum), 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae), 마이코박테리움 엡서수스(M. abscessus), 마이코박테리움 베체(M. vaccae), 마이코박테리움 플라베센스(M. flavescens), 마이코박테리움 아시아티쿰(M. asiaticum), 마이코박테리움 포르시눔(M. porcinum), 마이코박테리움 아카풀센시스(M. acapulcensis) 및 마이코박테리움 디에른호퍼리(M. diernhoferi)의 ITS 염기서열 중에서 각각 20 bp 크기의 프라이머를 디자인한 후, GenBank로부터 확보된 다른 마이코박테리아의 ITS 염기서열을 멀티얼라인먼트 (multi-alignment)와 블라스트(blast)로 분석하여 비교하였다.

상기 결과에 기초하여, 마이코박테리아 ITS의 보존적인 염기서열에 해당하는것은 마이코박테리아 동정용 프라이머 또는 프로브로, 다형성이 높은 염기서열 부분에 해당하는 것은 균주 특이적 프라이머 또는 프로브로 선정하였다. 디자인한 프라이머 또는 프로브의 ITS 내에서의 위치 및 그 서열 번호는 표 1 내지 7와 같다.

동정 균주	프로브 명칭	ITS 내 위치	서열 번호
마이코박테리아	MYC1MYC2MYC3MYC4MYC5	균종에 따라 다름	1011121314
TB 복합체	MTB1MTB2MTB3MTB4MTB5MTB6MTB7MTB8MTB9	166-18565-8420-3941-6060-7981-100125-144139-158203-222	151617181920212223
M. avium - M. intracellularae(MAC)	MAC1MAC2MAC3MAC4	241-260142-16192-111117-136	24252627
M. fortuitum	FOR1FOR2FOR3FOR4FOR5FOR6FOR7FOR8FOR9FOR10FOR11	40-5944-6364-8378-9789-108109-128114-133134-153157-176246-265289-308	2829303132333435363738
M. chelonae	CHE1CHE2CHE3CHE4CHE5CHE6CHE7CHE8	11-3029-4858-7778-97109-128132-151171-190246-265	3940414243444546

동정 균주	프로브 명칭	ITS 내 위치	서열 번호
M. abscessus	ABC1ABC2ABC3ABC4ABC5ABC6	37-5655-74247-266263-282270-289261-280	474849505152
M. vaccae	VAC1VAC2VAC3VAC4VAC5VAC6VAC7VAC8VAC9VAC10VAC11VAC12	18-3738-5758-77118-137138-157158-177178-197199-218219-238265-284298-317321-340	535455565758596061626364
M. flavescens	FLA1FLA2FLA3FLA4FLA5FLA6FLA7FLA8	12-3132-5152-7172-91105-124125-144173-192278-297	6566676869707172
M. gordonae	GOR1GOR2GOR3GOR4GOR5	84-103249-268216-235201-220223-242	7374757677

동정 균주	프로브 명칭	ITS 내 위치	서열 번호
M. terrae	TER1TER2TER3TER4TER5TER6TER7TER8TER9TER10TER11TER12TER13TER14TER15TER16TER17TER18TER19TER20TER21TER22TER23	178-197237-25624-4370-8989-108102-121122-141142-161162-181182-201202-221222-241238-257307-326322-341342-361362-381382-40112-2131-5052-7172-9182-101	78798081828384858687888990919293949596979899100
M. scroflaceum	SCO1SCO2SCO3SCO4SCO5SCO6SCO7SCO8	118-137131-150210-22984-103152-171200-219221-240241-260	101102103104105106107108
M. kansasii	KAN1KAN2KAN3KAN4	35-54238-25783-102214-233	109110111112

동정 균주	프로브 명칭	ITS 내 위치	서열 번호
M. szulgai	SZU1SZU2SZU3SZU4	124-143209-228227-246247-166	113114115116
M.marinum및M. ulcerans	MAR-ULC1MAR-ULC2MAR-ULC3	85-104128-147224-243	117118119
M. gastri	GAS1GAS2GAS3GAS4	85-104145-164133-152239-258	120121122123
M. xenopi	XEN1XEN2XEN3XEN4XEN5XEN6XEN7XEN8XEN9XEN10	190-2091-2021-4041-6061-8081-100121-140141-160201-220221-240	124125126127128129130131132133
M. genavense	GEN1GEN2GEN3GEN4GEN5GEN6GEN7GEN8	190-20985-104131-150147-166186-205206-225226-245240-265	134135136137138139140141
M. malmoense	MAL1MAL2MAL3MAL4MAL5	203-22229-48136-155222-241242-261	142143144145146
M. simiae	SIM1SIM2SIM3SIM4SIM5SIM6SIM7	83-102129-148208-22722-4180-99136-155241-260	147148149150151152153

동정 균주	프로브 명칭	ITS 내 위치	서열 번호
M. smegmatis	SMEG1SMEG2SMEG3SMEG4SMEG5SMEG6SMEG7SMEG8SMEG9SMEG10SMEG11SMEG12	17-3637-5657-7677-9697-116117-136137-156157-176177-196193-21261-80112-131	154155156157158159160161162163164165
M. shimoidei	SHI1SHI2SHI3SHI4SHI5SHI6SHI7	89-10820-3970-8997-116135-154224-243244-263	166167168169170171172
M. habana	HAB1HAB2HAB3HAB4HAB5HAB6HAB7HAB8	86-10517-3651-7081-100134-153175-194200-219242-261	173174175176177178179180
M. farcinogen	FAR1FAR2FAR3FAR4FAR5FAR6FAR7FAR8FAR9	122-141111-13022-4148-6776-95108-127114-133275-294295-314	181182183184185186187188189

동정 균주	프로브 명칭	ITS 내 위치	서열 번호
M. asiaticum	ASI1ASI2ASI3ASI4	82-101145-164189-208274-293	190191192193
M. porcinum	POR1POR2POR3POR4POR5POR6POR7POR8POR9POR10POR11POR12	45-6413-3267-8691-110115-134137-156164-183194-213221-240273-292298-317325-344	194195196197198199200201202203204205
M. acapulcensis	ACA1ACA2ACA3ACA4ACA5ACA6ACA7ACA8ACA9ACA10	66-85112-131132-151178-197198-217219-238242-261262-281318-337350-369	206207208209210211212213214215
M. diernhoferi	DIE1DIE2DIE3DIE4DIE5DIE6DIE7DIE8DIE9DIE10DIE11DIE12	16-3536-5562-81103-122154-173175-194195-214232-251261-280282-301304-323344-363	216217218219220221222223224225226227

동정 균주	프로브 명칭	ITS 내 위치	서열 번호
M. para- tuberculosis	PARA1PARA2PARA3PARA4PARA5PARA6PARA7PARA8PARA9PARA10PARA11PARA12PARA13	7-2630-4940-5950-6971-9083-102103-122135-154157-176178-197198-217219-238241-260	228229230231232233234235236237238239240
M. sp	SP1	225-244	241

실시예 6. 마이코박테리아 동정용 프라이머에 의한 RCR 결과

마이코박테리아에 존재하는 보존적인 염기서열을 선택하여, 마이크로박테리아 만을 증폭시키는 속 특이적인 프라이머(genus-specific primer)로 제작하였다. 즉, 약 270-350 bp 크기의 ITS 염기서열 중에서 보존적인 염기서열을 선택하여 프라이머로 제작하였으며, 이중에서 ITSF(서열 번호 242)와 MYC2(서열 번호 11)의 프라이머쌍으로 PCR 반응을 실시하였다. 그 결과, 마이코박테리아 균주에 대해서는 약 350 bp의 크기로 증폭되었으나, 다른 병원성 세균인 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 엔테로코쿠스 패키움(Enterococcus faecium), 그리고 세라티아 마르케센스(Serratia marcescens) 등에서는 증폭되지 않았다. 따라서, 이들 프라이머가 마이코박테리아 동정용으로 사용 가능함을 알 수 있다.

도 3은 마이코박테리아인지를 확인하는 프라이머쌍(ITSF와 MYC2)을 이용하여 여러 가지 마이코박테리아 균주에 대하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다. 여기에서, M은 분자량 표지로 100 bp 간격을 갖고 있으며, C는 대조군, 레인 1은 마이코박테리움 엡서수스(M. abscessusATCC 19977), 레인 2는 마이코박테리움 아그리(M. agriATCC 27406), 레인 3은 마이코박테리움 아시아티쿰(M. asiaticumATCC 25276), 레인 4는 마이코박테리움 아우스트로아프리카눔(M. austroafricanumATCC 33464), 레인 5는 마이코박테리움 아비움(M. aviumATCC 25291), 레인 6은 마이코박테리움 보비스(M. bovisATCC 19210), 레인 7은 마이코박테리움 첼로네(M. chelonaeATCC 35752), 레인 8은 마이코박테리움 플라베센스(M. flavescensATCC 14474), 레인 9는 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitumATCC 6841), 레인 10는 마이코박테리움 고도네(M. gordonae ATCC 14470), 레인 11은 마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellularaeATCC 13950), 레인 12는 마이코박테리움 칸사시(M. kansasiiATCC 12478), 레인 13은 마이코박테리움 플레이(M. phleiATCC 354), 레인 14는 마이코박테리움 스크로플래시움(M. scroflaceumATCC 19981), 레인 15는 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatisATCC 21701), 레인 16은 마이코박테리움 스줄가이(M. szulgaiATCC 35799), 레인 17은 마이코박테리움 테레(M. terraeATCC 15755), 레인 18은 마이코박테리움 트리비알레(M. trivialeATCC 23292), 레인 19는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosisH37Rv), 그리고 레인 20은 마이코박테리움 베체(M. vaccaeATCC 15483)를 나타내는 것으로, 대조군인 C를 제외하고 레인 1∼20의 마이코박테리아 전부에서 ITS 증폭을 확인할 수 있다.

표 8은 마이코박테리아인지를 확인하는 프라이머쌍(ITSF와 MYC2)으로 PCR을 실시한 후 증폭 여부를 나타낸 것으로, 마이코박테리아 이외의 균주에서는 증폭이 일어나지 않은 것을 볼 수 있다.

균주 이름	결과	균주 이름	결과
M. tuberculosisH37Rv	+	M. phleiATCC 354	+
M. bovisATCC 19210	+	Aeromonas hydrophila	-
M. aviumATCC 25291	+	Burkholderia cepacia	-
M. intracellulareATCC 13950	+	Candida albicans	-
M. abscessusATCC 19977	+	Citrobacter freundii	-
M. chelonaeATCC 35752	+	Enterobacter aerogenes	-
M. flavescensATCC 14474	+	Enterobacter cloacae	-
M. fortuitumATCC 6841	+	Enterococcus faecalis	-
M. gastriATCC 15754	+	Enterococcus faecium	-
M. genavenseATCC 51233	+	Enterococcus raffinosis	-
M. gordonaeATCC 14470	+	Escherichia coli	-
M. kansasiiATCC 12478	+	Klebsiella pneumoniae	-
M. malmoenseATCC 29571	+	Plesiomonas shigelloides	-
M. scroflaceumATCC 19981	+	Proteus mirabilis	-
M. simiaeATCC 25275	+	Proteus vulgaris	-
M. smegmatisATCC 21701	+	Providencia rettgeri	-
M. szulgaiATCC 35799	+	Pseudomonas aeruginosa	-
M. terraeATCC 15755	+	Rahnella aquatilis	-
M. vaccaeATCC 15483	+	Salmonella spp.	-
M. xenopiATCC 19250	+	Serratia marcescens	-
M. marinumATCC 927	+	Shewanella putrefaciens	-
M. ulceranceATCC 19423	+	Shigella flexneri	-
M. porcinumATCC 33776	+	Shigella sonnei	-
M. asiaticumATCC 25276	+	Staphylococcus epidermidis	-
M. acapulcensisATCC 14473	+	Staphylococcus aureus	-
M. diernhoferiATCC 19340	+	Streptococcus agalactiae	-
M. agriATCC 27406	+	Streptococcus intermidius	-
M. austroafricanumATCC 33464	+	Streptococcus pneumoniae	-
M. trivialeATCC 23292	+	Vibrio parahemolyticus	-

실시예 7. TB 복합체 동정 프라이머에 의한 PCR 결과

본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드를 PCR 용 프라이머로 제작하여 각 균주 특이적인 동정이 가능한지에 대한 실험을 PCR에서의 증폭 여부로 확인하였다. 먼저 TB 복합체(TB complex) 동정을 위하여, 마이코박테리아인지를 확인하는 프라이머쌍(ITSF와 MYC2)과 TB 복합체를 동정하는 프라이머쌍(MTB2와 MYC2; 서열 번호 16과 11)으로 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)을 실시하였다. 도 4는 이와 같이 마이코박테리아인지를 확인하고, 동시에 마이코박테리아 중에서 TB 복합체(complex)인지 비결핵 마이코박테리아(NTM)인지를 동정하는 멀티플렉스 PCR을 설명하는 개요도이다.

도 5는 마이코박테리아인지를 확인하는 프라이머 쌍(ITSF와 MYC2)과 마이코박테리아 중 TB 복합체(complex) 동정용 프라이머 쌍(MTB2와 MYC2)으로 멀티플렉스 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다. 여기에서, M은 분자량 표지로 100 bp 간격을 갖고 있으며, C는 대조군, 레인 1과 2는 TB 복합체인 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. TbH37Rv)와 마이코박테리움 보비스(M. bovis)를 나타내고, 레인 3∼10은 각각 마이코박테리움 아비움(M. avium), 마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellularae), 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum), 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae), 마이코박테리움 고도네(M. gordonae), 마이코박테리움 스줄가이 (M. szulgai), 마이코박테리움 테레(M. terrae) 및 마이코박테리움 스크로플래시움 (M. scroflaceumATCC 19981)을 나타내는 것으로, TB 복합체인 레인 1과 2에서는 마이코박테리아 확인용 프라이머와 TB 복합체용 프라이머에 의해 두 개의 밴드가 형성되어 이중 증폭이 일어난 것을 알 수 있고, 나머지 NTM 균종들에서는 하나의 밴드만 형성되어 단일 증폭이 일어난 것을 확인할 수 있다.

실시예 8. NTM 균종 동정용 프라이머에 의한 PCR 결과

비결핵 마이코박테리아(NTM)의 각 균종(species)을 동정하기 위해 각 균주의 다형성지역(polymorphic site)의 염기서열로부터 제작된 종 특이적인 프라이머 (species-specific primer)를 가지고 PCR 반응을 실시하였다.

즉, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosisH37Rv)와 마이코박테리움 보비스(M. bovis)에 특이적인 서열 번호 16과 21, 마이코박테리움 아비움(M. avium) 및 마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellularae)에 특이적인 서열24와 27, 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum)에 특이적인 서열 29와 37, 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae)에 특이적인 서열 41과 44, 마이코박테리움 엡서수스(M. abscessus)에 특이적인 서열 48과 49, 마이코박테리움 베체(M. vaccae)에 특이적인 서열 55와 63, 마이코박테리움 플라베센스(M. flavescens)에 특이적인 서열 66과 72, 마이코박테리움 고도네(M. gordonae)에 특이적인 서열 73과 75, 마이코박테리움 테레(M. terrae)에 특이적인 서열 88과 96, 마이코박테리움 스크로플래시움 (M. scroflaceum)에 특이적인 서열 102와 103, 마이코박테리움 칸사시(M. kansasii)에 특이적인 서열 109와 110, 마이코박테리움 스줄가이(M. szulgai)에 특이적인 서열 113와 114, 마이코박테리움 마리눔(M. marinum)에 특이적인 서열 117과 119, 마이코박테리움 울세란스(M. ulcerans)에 특이적인 서열 117과 119, 마이코박테리움 가스트리(M. gastri)에 특이적인 서열 120과 123, 마이코박테리움 제노피(M. xenopi)에 특이적인 서열 128과 132, 마이코박테리움 제나벤스(M. genavense)에 특이적인 서열 135와 141, 마이코박테리움 말모엔스(M. malmoense)에 특이적인 서열 143과 145, 마이코박테리움 시미에(M. simiae)에 특이적인 서열 147과 149, 그리고 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis)에 특이적인 서열 154와 159의 염기서열을 각각 선택하여, 첫번째 염기서열의 센스 스트랜드(sense strand)를 가진 프라이머와 두번째 염기서열의 안티센스 스트랜드 (antisense strand)를 가진 프라이머의 쌍으로 각 마이코박테리아의 균종들과 PCR 반응시킨 후 전기영동하여 결과를 확인하였다.

도 6은 비결핵 마이코박테리아(NTM) 각 균주의 다형성 지역의 염기서열로부터 제작된 종 특이적인 프라이머쌍을 이용하여 각각의 마이코박테리아 균주에 대하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다. 여기에서, M은 분자량 표지로 100 bp 간격을 갖고 있으며, C는 대조군, 레인 1과 2는 TB 복합체인 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosisH37Rv)와 마이코박테리움 보비스(M. bovisATCC 19210), 레인 3과 4는 마이코박테리움 아비움(M. aviumATCC 25291)과 마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellularaeATCC 13950), 레인 5는 마이코박테리움 포튜이튬 (M. fortuitumATCC 6841), 레인 6은 마이코박테리움 첼로네(M. chelonaeATCC 35752), 레인 7은 마이코박테리움 엡서수스(M. abscessusATCC 19977), 레인 8은 마이코박테리움 베체(M. vaccaeATCC 15483), 레인 9는 마이코박테리움 플라베센스 (M. flavescensATCC 14474), 레인 10은 마이코박테리움 고도네(M. gordonaeATCC 14470), 레인 11은 마이코박테리움 테레(M. terraeATCC 15755), 레인 12는 마이코박테리움 스크로플래시움(M. scroflaceumATCC 19981), 레인 13은 마이코박테리움 칸사시(M. kansasiiATCC 12478), 레인 14는 마이코박테리움 스줄가이(M. szulgaiATCC 35799), 레인 15는 마이코박테리움 마리눔(M. marinumATCC 927), 레인 16은 마이코박테리움 울세란스(M. ulceransATCC 19423), 레인 17은 마이코박테리움 가스트리(M. gastriATCC 15754), 레인 18은 마이코박테리움 제노피(M. xenopiATCC 19250), 레인 19는 마이코박테리움 제나벤스(M. genavenseATCC 1233), 레인 20은 마이코박테리움 말모엔스(M. malmoenseATCC 29571), 레인 21은 마이코박테리움 시미에(M. simiaeATCC 25275), 그리고 레인 22는 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatisATCC 21701)로, 레인 1∼22의 각 마이코박테리아 균주가 종 특이적으로증폭된 것을 볼 수 있다.

또한, 도 7은 비결핵 마이코박테리아(NTM) 각 균주의 다형성 지역의 염기서열로부터 제작된 종 특이적인 프라이머쌍을 이용하여 여러 가지 마이코박테리아 균주에 대하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다. 여기에서 보면, TB 복합체(complex)에 특이적인 제 1 단의 프라이머쌍(ITSF와 MYC2)에서는 레인 1과 2의 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosisH37Rv)와 마이코박테리움 보비스(M. bovis)가 증폭되고, 마이코박테리움 아비움(M. avium)과 마이코박테리움 인트라셀룰라레 (M. intracellularae)에 특이적인 제 2 단의 프라이머쌍(MAC1와 MAC4)에서는 레인 3과 4의 마이코박테리움 아비움(M. avium)과 마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellularae)가 증폭되고, 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum)에 특이적인 제 3 단의 프라이머쌍(FOR2와 FOR10)에서는 레인 5의 마이코박테리움 포튜이튬(M. fortuitum)이 증폭되고, 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae)에 특이적인 제 4 단의 프라이머쌍(CHE3와 CHE6)에서는 레인 6의 마이코박테리움 첼로네(M. chelonae)가 증폭되고, 마이코박테리움 고도네(M. gordonae)에 특이적인 제 5 단의 프라이머쌍(GOR1과 GOR3)에서는 레인 7의 마이코박테리움 고도네(M. gordonae)가 증폭되고, 마이코박테리움 스줄가이(M. szulgai)에 특이적인 제 6 단의 프라이머쌍(SZU1과 SZU2)에서는 레인 8의 마이코박테리움 스줄가이(M. szulgai)가 증폭되고, 그리고 마이코박테리움 스크로플래시움(M. scroflaceum)에 특이적인 제 7 단의 프라이머쌍 (SCO2와 SCO3)에서는 레인 10의 마이코박테리움 스크로플래시움(M. scroflaceum) 만이 증폭되고 다른 균종에서는 증폭이 일어나지 않은 것을 볼 수 있다. 레인 9는 마이코박테리움 테레(M. terrae)로, 이들 종 특이적인 프라이머쌍 어디에서도 증폭이 일어나지 않았다.

따라서, 각각의 종 특이적인 프라이머쌍에 의한 PCR 반응으로 마이코박테리아의 각 균종을 특이적으로 동정할 수 있음을 알 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 비결핵 마이코박테리아의 일종인 마이코박테리움 포튜이튬(Mycobacterium fortuitum), 마이코박테리움 첼로네(Mycobacterium chelonae), 마이코박테리움 엡서수스(Mycobacterium abscessus), 마이코박테리움 베체(Mycobacterium vaccae), 마이코박테리움 플라베센스(Mycobacterium flavescens), 마이코박테리움 아시아티쿰(Mycobacterium asiaticum), 마이코박테리움 포르시눔(Mycobacterium porcinum), 마이코박테리움 아카풀센시스 (Mycobacterium acapulcensis), 및 마이코박테리움 디에른호퍼리(Mycobacterium diernhoferi)의 내부전사지역(ITS, Internal Transcribed Spacer region)의 염기서열을 분석하고, 이를 이용하여 마이코박테리아 속의 동정 및 각각의 마이코박테리움 균종의 동정이 가능한 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머를 디자인할 수 있다. 이와 같이 얻어진 PCR용 프라이머 또는 혼성화 반응용 프로브에 의하면 이들 균종의 동정 결과를 신속하고도 효과적으로 얻을 수 있으며, TB 복합체와 NTM 균종의 구별이 가능하여 그 결과에 따라 올바른 치료 방법을 선택할 수 있고 동시 감염도 효과적으로 진단할 수 있다.

Claims

서열 1에 기재된 마이코박테리움 포튜이튬(Mycobacterium fortuitum) 유전자의 내부 전사 지역(ITS, Internal Transcribed Spacer region)의 DNA.
서열 2에 기재된 마이코박테리움 첼로네(Mycobacterium chelonae) 유전자의 내부 전사 지역(ITS, Internal Transcribed Spacer region)의 DNA.
서열 3에 기재된 마이코박테리움 엡서수스(Mycobacterium abscessus) 유전자의 내부 전사 지역(ITS, Internal Transcribed Spacer region)의 DNA.
서열 4에 기재된 마이코박테리움 베체(Mycobacterium vaccae) 유전자의 내부 전사 지역(ITS, Internal Transcribed Spacer region)의 DNA.
서열 5에 기재된 마이코박테리움 플라베센스(Mycobacterium flavescens) 유전자의 내부 전사 지역(ITS, Internal Transcribed Spacer region)의 DNA.
서열 6에 기재된 마이코박테리움 아시아티쿰(Mycobacterium asiaticum) 유전자의 내부 전사 지역(ITS, Internal Transcribed Spacer region)의 DNA.
서열 7에 기재된 마이코박테리움 포르시눔(Mycobacterium porcinum) 유전자의 내부 전사 지역(ITS, Internal Transcribed Spacer region)의 DNA.
서열 8에 기재된 마이코박테리움 아카풀센시스(Mycobacterium acapulcensis) 유전자의 내부 전사 지역(ITS, Internal Transcribed Spacer region)의 DNA.
서열 9에 기재된 마이코박테리움 디에른호퍼리(Mycobacterium diernhoferi) 유전자의 내부 전사 지역(ITS, Internal Transcribed Spacer region)의 DNA.
서열 10∼14 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리아 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 15∼23 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리아중 TB 복합체(TB complex)와 비결핵 마이코박테리아 구분에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 24∼27 중 하나의 염기서열을 갖는, MAC (Mycobacterium avium및Mycobacterium intracellulare) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 28∼38 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 포튜이튬 (Mycobacterium fortuitum) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 39∼46 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 첼로네 (Mycobacterium chelonae) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 47∼52 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 엡서수스 (Mycobacterium abscessus) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 53∼64 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 베체 (Mycobacterium vaccae) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 65∼72 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 플라베센스 (Mycobacterium flavescens) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 73∼77 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 고도네 (Mycobacterium gordonae) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 78∼100 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 테레 (Mycobacterium terrae) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 101∼108 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 스크로플래시움(Mycobacterium scroflaceum) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 109∼112 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 칸사시 (Mycobacterium kansasii) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 113∼116 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 스줄가이 (Mycobacterium szulgai) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 117∼119 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 마리눔 (Mycobacterium marinum) 및 마이코박테리움 울세란스(Mycobacterium ulcerans) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 120∼123 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 가스트리 (Mycobacterium gastri) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 124∼133 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 제노피 (Mycobacterium xenopi) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 134∼141 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 제나벤스 (Mycobacterium genavense) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 142∼146 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 말모엔스 (Mycobacterium malmoense) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 147∼153 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 시미에 (Mycobacterium simiae) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 154∼165 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 스메그마티스 (Mycobacterium smegmatis) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 166∼172 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 쉬모이데이 (Mycobacterium shimoidei) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 173∼180 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 하바나 (Mycobacterium habana) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 181∼189 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 파시노겐 (Mycobacterium farcinogen) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 190∼193 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 아시아티쿰(Mycobacterium asiaticum) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 194∼205 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 포르시눔 (Mycobacterium porcinum) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 206∼215 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 아카풀센시스 (Mycobacterium acapulcensis) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 216∼227 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 디에른호퍼리 (Mycobacterium diernhoferi) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 228∼240 중 하나의 염기서열을 갖는, 마이코박테리움 파라투베르쿨로시스(Mycobacterium paratuberculosis) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.
서열 241의 염기서열을 갖는, 마이코박테리아 속(Mycobacteria sp) 동정에 사용되는 올리고뉴클레오티드.