CN101302556B

CN101302556B - 编码结核分枝杆菌组蛋白样蛋白质的hupB基因的鉴定

Info

Publication number: CN101302556B
Application number: CN2008100861931A
Authority: CN
Inventors: K·P·哈努曼莎帕; S·普拉哈卡尔; A·米施拉; T·J·西瓦斯瓦米
Original assignee: All India Institute of Medical Sciences AIIMS; Department of Biotechnology
Current assignee: All India Institute of Medical Sciences AIIMS; Department of Biotechnology
Priority date: 2002-12-18
Filing date: 2003-09-09
Publication date: 2011-05-25
Anticipated expiration: 2023-09-09
Also published as: CN1742099B; WO2004055214A1; EP1581659A1; US20060147931A1; AU2003263587A1; CN101302556A; CN1742099A; ZA200505007B; AU2003263587A8

Abstract

用于特异性扩增分枝杆菌属种hupB基因的寡核苷酸引物，选自SeqID NO.1、Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5，以及一种方法，以编码组蛋白样蛋白质例如hupB的靶基因为基础，区分分枝杆菌种属，包括a)从培养物或临床样品中获得DNA；b)在聚合酶链反应中，使用所述DNA作为模板，以根据权利要求1的一对寡核苷酸引物，扩增编码组蛋白样蛋白质，例如分枝杆菌属种hupB靶基因的部分区域；c)检测所述hupB基因的扩增片段，以检测是否存在分枝杆菌属种，并以扩增片段的大小为基础，区分结核分枝杆菌与牛分枝杆菌。

Description

编码结核分枝杆菌组蛋白样蛋白质的hupB基因的鉴定

本申请是申请日为2003年9月9日、申请号为03825875.7、发明名称为“编码结核分枝杆菌组蛋白样蛋白质的hupB基因的鉴定”的发明专利申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及编码结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)组蛋白样蛋白质的hupB的基因的鉴定。涉及一种以hupB基因为基础，区分结核分枝杆菌和牛分枝杆菌(M.bovis)的方法。

发明背景

目前有许多方法用于区分MTB集合体的成员。几名研究人员已经证实结核病诊断时，使用IS6110作为靶进行PCR扩增，可获得最佳的灵敏度和特异性。然而，使用从ATCC获得的标准分枝杆菌属种和菌株，以及从临床样品分离的分枝杆菌培养物时，该靶区分结核分枝杆菌与其它分枝杆菌的能力有限。

基于检测位于MTB集合体菌株DR基因座上小重复单元间的非重复间隔序列的spoligotyping，其它遗传标志和生化测定已被用于区分结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和canetti分枝杆菌(Niemann等人，2000)。除spoligotyping外，已报导有mtp40基因序列(Liebana等人，1996)、pncA基因169位的点突变(Scropio &Zhang，1996)、oxyR基因座多态性(Sreevatsan等人，1996)，可作为区分TB集合体成员的有效靶。

理想情况下，基于PCR靶点的检测，应不仅能区分分枝杆菌属种，还能区分MTB集合体中彼此非常相关的成员。

虽然PCR方法已普遍用于结核病诊断的评价，但已有报导主要集中于结核分枝杆菌的检测。而在区分结核性集合体和非结核性分枝杆菌方面，其成绩是有限的。

在此我们报导一种PCR测定方法，能够准确区分MTB集合体中非常相关的分枝杆菌。编码结核分枝杆菌组蛋白样蛋白质的hupB基因作为靶点，被用于检测和区分结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。hupB基因靶点不仅能从牛分枝杆菌中，还能从测试的其它MTB集合体成员、非结核性分枝杆菌和非分枝杆菌种属中，将结核分枝杆菌区分出来。对于畜牧业感染发生率较高的发展中国家，该测定方法尤为实用(Grange，2001)。已知通过空气途径或感染/污染的乳制品消费，牛分枝杆菌已从感染的牛蔓延到人(动物传染结核病)(Moda等人，1996；Cosivi等人，1998)。虽然在发达国家已基本根除，但最近已有牛结核复发的报导(www.defra.gov.uk/animalh)，牛结核在发展中国家仍有发生。在发展中国家，关于牛结核对人体健康的流行病学影响，目前尚无评价，基本为空白(lacuna)。然而随着AIDS患者由于牛分枝杆菌感染导致结核病的报导(Bouvet等人，1993；O’Reilly等人，1995)，以及全球性结核病发病率的升高，检测以及鉴别临床样品中的致病性分枝杆菌，皆需快速而可靠的诊断测定方法。其对结核病的快速诊断、治疗和控制是必须的。鉴定人致病性分枝杆菌，更加关系到新一代人用候选疫苗的开发需要。

HupB蛋白质的免疫原性：

有两种方法用于区分与人体应答有关的分枝杆菌组分，即T细胞印迹和免疫消减(immuno-subtraction)测定法(Prabhakar等人，1998)。发现在结核菌素反应中，分枝杆菌裂解物中的30kDa级分，诱导的淋巴增殖指数最高。同样，在免疫消减测定法中，在大约30kDa可见明显的反应性条带。从SDS-PAGE凝胶上电洗脱该30kDa蛋白质，并纯化至均一。

使用内部肽序列，得到与粘粒CY349的16个氨基酸100％相同的序列，Seq ID.No.8(VKPTSVPAFRPGAQFK)。其后相应的基因得到阐释，并被命名为HupB基因(Rv2986c，Cole等人，1998)。利用免疫金电子显微技术，发现蛋白质位于分枝杆菌细胞膜的胞质内及胞浆表面。HupB基因被归入结核分枝杆菌的结合蛋白类(组蛋白样)DNA(Cole等人，1998)。设计引物扩增hupB基因。在结核分枝杆菌中获得645bp的扩增子。使用α³²p标记的PCR扩增子进行Southern杂交，确定MTB集合体(结核分枝杆菌和牛分枝杆菌)成员及其它分枝杆菌种中，hupB基因的大小、流行程度和构成。

现有技术缺陷

虽然PCR方法已经普遍用于结核诊断的评价，但报导通常集中于结核分枝杆菌的检测。然而在区分结核性集合体和非结核性分枝杆菌方面，其成功是有限的。单独使用IS6110，或与mtp40因联合使用的一步PCR方法，来区分牛分枝杆菌与结核分枝杆菌，产生的结果很不一致。而且，已证明mpt40非存在于所有的结核分枝杆菌菌株中，因此不能用于区分结核分枝杆菌与牛分枝杆菌菌株。有人提出将sen X3-regX3基因间区域(IR)作为区分MTB集合体成员与其它分枝杆菌的靶序列。然而使用该靶区域，即使可以将BCG与相关菌株区分开来，也由于不能区分MTB集合体成员而受到限制。目前研究已表明，hupB基因靶点容许从测试的牛分枝杆菌以及其它TB集合体成员、非结核性分枝杆菌和非分枝杆菌种属中，将结核分枝杆菌区分出来。对于畜牧业感染发病率的较高发展中国家，该测定方法尤为有用(Grange，2001)。

在发展中国家，关于牛结核病对人体健康的流行病学影响，目前尚无评价，基本为空白。然而随着AIDS患者由于牛分枝杆菌感染导致结核病的报导(Bouvet等人，1993；O’Reilly等人，1995)，以及全球性结核病发病率的升高，检测以及区分临床样品中的致病性分枝杆菌，皆需快速而可靠的诊断测定方法。其对结核病的快速诊断、治疗和控制是必须的。在此，我们报导的PCR、RFLP和巢式PCR测定方法，能够准确区分MTB集合体中紧密相关的分枝杆菌。

发明目的

本发明目的在于：

(1)表征编码结核分枝杆菌组蛋白样蛋白质的hupB基因。

(2)表征分枝杆菌基因作为新的靶点，用于新型抗分枝杆菌化学治疗试剂。

(3)以PCR产生的hupB基因扩增子的RFLP为基础，区分结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。

(4)以hupB基因PCR扩增子的序列为基础，区分结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。

(5)以hupB基因的巢式PCR为基础，区分结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。

发明概述

PCR，PCR-RFLP：本发明涉及方法，使用编码组蛋白样蛋白质的hupB基因靶点的特异性引物，来区分分枝杆菌属种。单一引物对可以同时扩增来自结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的靶序列。扩增产物的大小，可将结核分枝杆菌与牛分枝杆菌以及有关和无关种属区分开来。与扩增区域杂交的DNA探针，可将结核分枝杆菌与牛分枝杆菌及有关和无关种属区分开来。进一步提供方法(RFLP)，通过PCR扩增片段的限制性消化，区分结核分枝杆菌和牛分枝杆菌hupB基因。

巢式PCR测定：利用hupB基因作为靶点的应用，就开发区分结核分枝杆菌集合体成员的分子生物技术而言，是非常重要的。由于当前技术在区分结核分枝杆菌和牛分枝杆菌方面的困难，有关由牛分枝杆菌致人或动物疾病发病率的具体资料是缺乏/有限的。这种技术有助于确定和证明牲畜中由牛分枝杆菌所引起疾病的真实程度。所述的巢式PCR测定法对目前用于区分结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的繁琐方法而言，将会是一个巨大的贡献。在印度，由于宗教和社会经济原因，不可能普遍实现结核菌素反应性动物的强制性清除。本测定方法对于流行病学规划以及感染动物的鉴别将十分有益。可将感染动物隔离，从而限制疾病的传播。而且，随着乳制品(肉和奶)广泛应用，此处所述巢式PCR测定方法，将有助于解决当前人分枝杆菌病原体的鉴别难题。这些病原体都是MTB集合体成员，并且遗传相似。

附图说明：

图1：hupB基因的位置和用于产生PCR片段的引物。

图A：hupB序列中引物的位置，使用该引物获得PCR片段已在文中描述。hupB基因特异性的引物对N(Seq ID No.1)和S(Seq ID No.2)；hupB基因C末端部分特异性的内部引物M(Seq ID No.3)和S(Seq IDNo.2)。

图B，C和D：使用引物对N(Seq ID No.1)和S(Seq ID No.2)(图B)、M(Seq ID No.3)和S(Seq ID No.2)(图C)，以及F(SeqID No.4)和R(Seq ID No.1)(图D)，产生的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的溴化乙啶染色的扩增片段经聚丙烯酰胺凝胶电泳。645和618bp(图B)、318和291bp(图C)、116和89bp(图D)片段已标出。泳道1&4，645bp，6&10，318bp，和13，116bp的hupB基因/C末端部分基因扩增片段，从结核分枝杆菌H37Rv获得；泳道2&5，618bp的hupB基因，7&9，291bp和11，12，15-17，89bp的hupB基因/C末端部分的基因扩增片段，从牛分枝杆菌AN5获得；3，8&14，100bp的分子量标准。

图2：基于PCR测定法的hupB_Mt特异性分析

扩增片段在琼脂糖凝胶上电泳。其溴化乙啶染色(图A&图B)和杂交图，分别如图A′和图B′所示。使用645bp探针(使用N(Seq ID No.1)和引物S(Seq ID No.2)和结核分枝杆菌DNA，通过PCR制备)。该645bp片段已标出。图A&A′：泳道1，结核分枝杆菌H37Rv；2，结核分枝杆菌H37Ra；3，牛分枝杆菌BCG；4，田鼠分枝杆菌；5，蟾分枝杆菌；6，偶发分枝杆菌；7，草分枝杆菌；8，戈特氏分枝杆菌；9，牝牛分枝杆菌；10，堪萨斯氏分枝杆菌；11，100bp标准；12，胞内分枝杆菌；13，鸟分枝杆菌；14，瘰疬分枝杆菌；15，耻垢分枝杆菌；16，结核分枝杆菌P8497；17，结核分枝杆菌C1084；18，结核分枝杆菌779634；19，龟分枝杆菌；20，结核分枝杆菌P8473；21，胃分枝杆菌。

图B&B′：泳道1，结核分枝杆菌1207；2，大肠杆菌；3，星状诺卡氏菌；4，金黄色葡萄球菌；5，铜绿假单胞菌；6，S.faecalis；7，金黄色葡萄球菌；8，黑色曲霉；9，烟曲霉；10，白色假丝酵母；11，100bp标准；12，结核分枝杆菌Erdman；13，肺炎杆菌；14，M.leprae；15，非洲分枝杆菌；16，阴性对照。图B&B′中，使用645bp片段(质粒pHLPMT经PstI和Ncol消化)进行杂交。

图3：基于hupB的PCR测定法检测结核分枝杆菌DNA的敏感性。

用连续稀释的结核分枝杆菌DNA(1ng-1fg)进行扩增反应。溴化乙啶染色和杂交图分别如图A和B所示。645bp片段已标出。泳道1，1ng；2，500pg；3，50pg；4，5pg；5，1pg；6，500fg；7，100fg；8，50fg；9，10fg；10，5fg；11，2fg；12，1fg；13，阴性对照；14，阳性对照(结核分枝杆菌)；M，HindIII消化的λDNA。检测极限对溴化乙啶染色是50pg，对杂交是500fg。

图4：645和318bp PCR片段的RFLP分析。

图A描绘了hupB序列中引物位置的示意图，使用该引物以获得645bp和318bp的PCR片段。溴化乙啶染色显示645bp(图B)和318bp(图C)的扩增片段。泳道1，结核分枝杆菌H37Rv；2，结核分枝杆菌H37Ra；3，结核分枝杆菌Erdman；4，牛分枝杆菌AN5；5，牛分枝杆菌BCG；(日本)6.牛分枝杆菌BCG(哥本哈根)；7，牛分枝杆菌IC 378；8，牛分枝杆菌IC 379；9，牛分枝杆菌IC 380；10，牛分枝杆菌IC 381；11，牛分枝杆菌IC 382；12，PCR分子量标准。图D：用HpaII(泳道1-3)和HaeIII(泳道6-9)消化645bp扩增子的RFLP聚丙烯酰胺凝胶分析：泳道1，结核分枝杆菌H37Rv；2，结核分枝杆菌H37Ra；3，牛分枝杆菌BCG；4，阴性对照；M，100bp分子量标准；5，结核分枝杆菌H37Rv；6，结核分枝杆菌H37Ra；7，牛分枝杆菌BCG；8，牛分枝杆菌AN5。

图5：结核分枝杆菌和牛分枝杆菌hupB基因核苷酸序列的比对：

使用GCG软件，对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌标准菌株、牛分枝杆菌临床分离物的hupB基因C末端区域核苷酸序列(326-676bp)进行了比对。在所有牛分枝杆菌菌株hupB序列中，均可见27bp的缺失。相对于结核分枝杆菌，在385-411bp之间缺失的9个氨基酸(KAATKAPAR)，以单字母代码显示于第一行。序列编号参见hupB(Rv2986c)中的核苷酸位置。牛分枝杆菌菌株的编号在左侧给出。

图6：结核分枝杆菌和牛分枝杆菌标准菌株和牛源分离物的巢式PCR图：

分枝杆菌菌株的巢式PCR扩增片段在8％天然聚丙烯酰胺凝胶上电泳。显示于泳道1阴性对照；2分子量标准；3结核分枝杆菌(H37Rv)；3确定为结核分枝杆菌的牛分离物；4确定为牛分枝杆菌的牛分离物；牛分枝杆菌(ICC380)；以及5结核分枝杆菌(JALMA，Agra，分离物)。

发明详述

一种区分结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的hupB基因的方法。使用3套引物测定hupB基因的大小差异性(图1，表II)：

本发明的一个实施方案提供，特异性扩增分枝杆菌种属hupB基因的寡核苷酸引物，其选自Seq ID No.1、Seq ID No.2、Seq ID No.3、SeqID No.4，Seq ID No.5。

另一个实施方案是，以编码组蛋白样蛋白质例如hupB的靶基因为基础，区分分枝杆菌属种的方法。

另一个实施方案是，其中结核分枝杆菌和/或牛分枝杆菌种，选自遗传相关的分枝杆菌属和遗传无关的微生物。

在另一个实施方案的方法中，寡核苷酸引物对包括，Seq ID No.1和Seq ID No.2；Seq ID No.3和Seq ID No.2；Seq ID No.4和Seq IDNo.5，其中扩增片段通过溴化乙啶染色或DNA探针杂交检测。

另一个实施方案为一种区分方法，包括设计引物：Seq ID No.1、Seq ID No.2、Seq ID No.3、Seq ID No.4、Seq ID No.5，从结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中扩增所述hupB基因的一部分。在聚合酶酶链反应中，使用所述DNA作为模板，以一对寡核苷酸引物，扩增编码组蛋白样蛋白质例如分枝杆菌属hupB的靶基因的一部分。分析并确认扩增片段的大小。测定所述扩增片段的完整序列。从序列推定其是结核分枝杆菌还是牛分枝杆菌。

另一个实施方案为方法，其中DNA探针由Seq ID No.6或Seq ID No.7，或其互补序列，经可检测的标记物标记组成。

另一个实施方案为方法，其中区分步骤包括测定由牛分枝杆菌获得的较小扩增片段。

另一个实施方案为方法，其中牛分枝杆菌中PCR扩增片段为618bp。

另一个实施方案为方法，其中结核分枝杆菌中PCR扩增片段为645bp。

另一个实施方案为方法，其中牛分枝杆菌中PCR扩增片段为291bp。

另一个实施方案为方法，其中结核分枝杆菌中PCR扩增片段为318bp。

另一个实施方案为方法，其中牛分枝杆菌中PCR扩增片段为89bp。

另一个实施方案为方法，其中结核分枝杆菌中PCR扩增片段为116bp。

另一个实施方案为方法，其中牛分枝杆菌中PCR扩增片段比结核分枝杆菌扩增片段小27bp。

另一个实施方案为方法，其中结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的区分包括步骤：在聚合酶链反应中，使用引物Seq ID No.1和Seq ID No.2，扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌hupB靶基因的部分序列。用HpaII限制性内切酶限制性消化扩增片段，生成限制性酶切片段。通过在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，分离限制性酶切片段，并经溴化乙啶染色检测该限制性酶切片段。

另一个实施方案为方法，其中结核杆菌中限制性酶切片段为280bp和150bp。

另一个实施方案为方法，其中牛分枝杆菌中限制性酶切片段为253bp和150bp。

另一个实施方案为基本如此处所述的HupB基因(Seq ID No.8)，前述实施方案中的方法已经基本描述。

另一个实施方案为基本如此处所述的HupB基因(Seq ID No.7)，前述实施方案中的方法已经基本描述。

本方法用于区分分枝杆菌属种，在聚合酶酶链反应中，使用所述DNA作为模板，以一对寡核苷酸引物，扩增编码分枝杆菌属种组蛋白样蛋白质hupB靶基因的一部分。检测所述hupB基因扩增片段，以检测是否存在分枝杆菌属种，并以扩增片段的大小为基础区分结核分枝杆菌与牛分枝杆菌。

特异性扩增分枝杆菌属种hupB基因的寡核苷酸引物，选自Seq IDNo.1、Seq ID No.2、Seq ID No.3、Seq ID No.4，Seq ID No.5。一种以靶hupB基因为基础，区分分枝杆菌属种的方法。在聚合酶链反应中使用来自培养物或临床样品的DNA作为模板。检测所述hupB基因扩增片段，以确定是否存在分枝杆菌属种，并以扩增片段的大小为基础，区分结核分枝杆菌与牛分枝杆菌。

1)hupB基因靶DNA引物N，Seq ID No.1(5′ggagggttgggatgaacaaagcag 3′)和S，Seq ID No.2(5′gtatccgtgtgtcttgacctatttg 3′)，用于扩增hupB基因序列。在结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中，预期扩增子的大小分别为645bp和618bp。

PCR-RFLP：用于区分结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法。

包括步骤：在聚合酶链反应中，使用引物对Seq ID No.1和Seq IDNo.2/Seq ID No.3和Seq ID No.2，扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌hupB靶基因。用HpaII限制性内切酶限制性消化扩增的片段，生成限制性酶切片段。通过在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离限制性酶切片段。

2)基因C末端部份的扩增使用：

I)内部引物M，Seq ID No.3(5′gcagccaagaaggtagcgaa 3′)，和S，Seq ID No.2(5′gtatccgtgtgtcttgacctatttg3′)，预期的扩增子为～318bp(图1)。

在结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中，预期扩增子的大小分别为318bp和291bp。

巢式PCR：用于区分结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法。

包括步骤：在聚合酶链反应中，从结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中扩增hupB靶基因的一部分。使用Seq ID No.1-N和Seq ID No.2-S引物获得的PCR片段，被用作巢式PCR的靶DNA。同时使用Seq ID No.4-F和Seq IDNo.5-R，扩增基因的C末端部分，预期的扩增子在结核分枝杆菌中为～116bp，在牛分枝杆菌中为89bp，

(II)使用引物F，Seq ID No.4(5′ccaagaaggcgacaaagg3′)，和R，Seq ID No.5(5′gacagctttcttggcggg3′)。在结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中，预期扩增子的大小分别为～116bp和89bp。

PCR扩增片段的测序：

通过确定扩增片段的完整序列，分析并确认hupB基因扩增片段的大小。从序列推定其是结核分枝杆菌还是牛分枝杆菌。区分步骤包括由牛分枝杆菌获得的较小扩增片段的确定。使用引物Seq ID No.1和2获得的牛分枝杆菌PCR扩增片段为618bp。结核分枝杆菌PCR扩增片段为645bp。而使用引物Seq ID No.3和2获得的PCR扩增片段，在牛分枝杆菌中为291bp，在结核分枝杆菌中为318bp。使用引物Seq ID No.4和5获得的PCR扩增片段，在牛分枝杆菌和结核分枝杆菌中分别为89bp和116bp。牛分枝杆菌中的PCR扩增片段，比结核分枝杆菌扩增片段小27bp。

使用从结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中提取的分枝杆菌DNA。从结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中均获得PCR扩增片段。不过由牛分枝杆菌获得的扩增子略小于结核分枝杆菌扩增子。这一差异通过对从不同来源收集的50种结核分枝杆菌和牛分枝杆菌菌株进行分析得到确认(表1)。从结核分枝杆菌和牛分枝杆菌(BCG)的3个标准菌株和4个临床分离物中提取DNA，使用hupB引物(N，Seq ID No.1和S，Seq ID No.2/M Seq IDNo.3和S，Seq ID No.2，表II)进行扩增。通过RFLP确认由结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中获得的扩增子的大小差异(图4D)，并通过PCR片段的序列测定进行确证(图5)。用HaeIII和HpaII消化两种分枝杆菌的PCR片段，并在12％非变性凝胶上分析。用HpaII消化645bp片段显示，与结核分枝杆菌中获得的大小～280bp的条带相比，在牛分枝杆菌中可见～250bp的片段(图4D)。PCR片段序列分析显示，在牛分枝杆菌中有相应于9个氨基酸的27bp的缺失(图5)。由于这一缺失，由牛分枝杆菌获得的PCR扩增子为618bp，比由结核分枝杆菌获得的PCR片段(645bp)小27bp(图4B，C)。

用HpaII消化由M和S引物产生的基因C末端部分的扩增子的结果显示与使用hupB引物(Seq ID No.1-N和Seq ID No.2-S)获得的PCR片段差异相符，表明利用hupB引物(N，Seq ID No.1-N和S，Seq ID No.2-S)或者C末端引物(Seq ID No.3-M和S，Seq ID No.2-S)，获得的PCR片段的PCR-RFLP测定，确实可区分杆菌结核和牛分枝杆菌。

以hupB基因作为靶点，诊断和区分牛结核中致病性分枝杆菌的应用已得到证实(表IV-VII)。靶向hupB基因C末端部分，对临床样品采用巢式PCR方法，使测定方法的灵敏度和特异性显著改善，(图6)和(表VI-VIII)。

实施例

菌株：用于研究的分枝杆菌菌株和非分枝杆菌菌株列于表1中。除了10株非分枝杆菌属种，总计80株分枝杆菌菌株被归入研究中。80株分枝杆菌分离物中的55株为MTB集合体成员，(结核分枝杆菌-25，牛分枝杆菌-25，田鼠分枝杆菌-3，非洲分枝杆菌和canetti分枝杆菌各1)。包含的牛分枝杆菌的详细资料如下：7株来自Central MilitaryVeterinary Laboratory，Meerut，印度)感染的牛，9株来自NationalMycobacterial Repository，JALMA，Agra，印度，2株分别来自荷兰和阿根廷，3株人分离株来自荷兰(Drs.J.D.A.van Embden和D.vanSoolingen)。

用于特异性分析的杆菌的处理

所有结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌菌株，均培养于固体培养基上(所有分枝杆菌属均LJ斜面培养)，用无菌牙签从LB琼脂(大肠杆菌)、营养肉汁琼脂(黑色曲霉，星状诺卡氏菌，铜绿假单胞菌，肺炎杆菌)或血琼脂培养基(白喉棒杆菌，溶血性链球菌)上刮落，重悬于含0.1％Triton x-100的无菌蒸馏水中。将重悬的杆菌于100℃煮沸20分钟，取一小份(2μl)用于PCR。

PCR分析：

1)23S rDNA靶物：引物：C，Seq ID No.9(5′gtgagcgacgggatttgcctat3′)和L，Seq ID No.10(5′accacccaaaaccggatcgat3′)，用于检测属分枝杆菌属的生物体DNA的存在。预期的扩增子大小为174bp(Verma等人，1994；Dasgupta等人，1998)。

2)hupB DNA靶物：引物N，Seq ID No.1(5′ggagggttgggatgaacaaagcag 3′)和S，Seq ID No.2(5′gtatccgtgtgtcttgacctatttg3′)，用于扩增hupB基因序列。在结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中，预期扩增子的大小分别为～645bp和618bp(表II，图1)。

每一反应(20μl)包含1.5mM MgCl₂，0.5μM引物，200μM dNTPs，10mM Tris-HCl(25℃时pH8.8)，50mM KCl，0.08％Nonidet P40，和0.5单位的Taq DNA聚合酶。PCR反应在94℃起始变性10分钟，进行35个循环，每个循环为94℃，1分钟，63℃ 1分钟和72℃ 1分钟，随后于72℃最终延伸30分钟。片段在1.2％琼脂糖凝胶上分析，并用溴化乙啶染色。

使用M，Seq ID No.3(5′gcagccaagaaggtagcgaa 3′)和S，Seq IDNo.2(5′gtatccgtgtgtcttgacctatttg3′)，扩增基因C末端部分，预期的扩增子为～318bp。

巢式PCR(Nested PCR)：从临床样品/培养的分枝杆菌中提取DNA，进行PCR，使用引物Seq ID No.1-N和Seq ID No.2-S。通过Seq ID No.1-N和Seq ID No.2-S引物得到的PCR产物，被用作巢式PCR的靶DNA。

每一反应(40μl)包含2.5mM MgCl₂，0.5μM引物，200μM dNTPs，10mM Tris-HCl(25℃时pH8.8)，50mM KCl，0.08％Nonidet P40，和0.5单位的Taq DNA聚合酶。PCR反应在95℃起始变性10分钟，进行35个循环，每个循环为94℃ 1分钟，59℃ 30秒，最终于72℃延伸7分钟。片段在3.5％琼脂糖凝胶/8％非还原聚丙烯酰胺凝胶上分析，并用溴化乙啶染色。同时使用Seq ID No.4-F(5′ccaagaaggcgacaaagg3′)与Seq IDNo.5-R(5′gacagctttcttggcggg3′)扩增基因C末端部分，预期的扩增子在结核分枝杆菌中为～116bp，在牛分枝杆菌中为～89bp(表II，图1)。

Southern杂交：将琼脂糖凝胶分离的PCR扩增子转移到硝基纤维素膜上(Southern，1975)。然后印迹与α-³²P标记的645bp hupB基因(SeqID No.6)探针杂交，探针来自结核分枝杆菌(Pstl和Ncol消化的质粒pHLPMT/或使用N Seq ID No.1-N和S(Seq ID No.2-S)引物和结核分枝杆菌DNA进行PCR产生的探针)。

限制性片段长度多态性：

用HpaII限制性内切酶消化hupB扩增序列，片段在12％非变性聚丙烯酰胺凝胶上分析。凝胶用溴化乙啶染色，在紫外光下观测DNA片段。

DNA序列分析：PCR片段用Sanger的双脱氧链终止法(Sanger等，1977)测序，根据操作指南使用Sequenase Ver 2.0测序试剂盒，α³⁵SdATP和正/反向通用M13引物或hupB内部引物进行。DNA模板经碱变性，于-70℃与引物退火1小时。标记前，将富含GC的分枝杆菌DNA与0.5μg单链结合蛋白混合。蛋白质以0.1μg蛋白酶K，于68℃消化20分钟，随后终止标记反应。反应物在6％尿素-聚丙烯酰胺凝胶上，1xTBE缓冲液中，以70W电泳适当时间。凝胶用乙酸(10％)和甲醇(30％)固定，干燥，并进行放射自显影。同时由瑞士Microsynth公司对从标准菌株和分离物获得的PCR片段进行测序。

PCR测定特异性：来自16株分枝杆菌DNA和10株非分枝杆菌属的DNA，被用作靶物质以建立PCR测定特异性(表1)。从结核分枝杆菌和牛分枝杆菌(BCG)的3株标准菌株和4株临床分离物中提取DNA，使用hupB引物(Seq ID No.1-N和Seq ID No.2-S，表11，图1)用于扩增。只在结核杆菌H37Rv、H37Ra、牛分枝杆菌BCG和5株结核分枝杆菌临床分离物中(如图2A中1，2，3，16，17，18和20泳道，以及图2B中的泳道1和12)，从结核分枝杆菌中获得的预期片段为645bp，在牛分枝杆菌中获得的预期片段为618bp。在MTB集合体的田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、M.leprae，MAIS集合体及其它分枝杆菌属种(快速和慢速生长物)，包括白喉棒杆菌和星状诺卡氏菌(其共同构成棒状杆菌)诺卡氏菌属和分枝杆菌(CNM)组中，均未见扩增。在其它非分枝杆菌种中也未见扩增(图2B)。扩增片段的真实性，通过与α-³²P标记的645bp片段(Seq IDNo.6)杂交确认(图2A′和B′)。这证实使用任何其它模板DNA，没有得到可能由于单独使用溴化乙啶染色而遗漏的其它扩增。因此，hupB的5′和3′引物是结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特异性引物。

基于hupB基因的PCR测定的敏感性：DNA PCR扩增的敏感性(检测水平)，通过向PCR反应中加入连续稀释的分枝杆菌DNA(1ng至1fg)来确定，使用引物Seq ID No.1-N和Seq ID No.2-S。可见单独溴化乙啶染色的检测极限为50pg，杂交检测极限增至500fg(图3A和B)。这分别相当于5000和50个基因组等价物(equivalents)。

来源于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的hupB基因PCR扩增子的RFLP：来自结核分枝杆菌和牛分枝杆菌不同分离物中的DNA(列于表1)，使用Seq ID No.1-N和Seq ID No.2-S引物(645bp片段，表II)和(ii)SeqID No.3-M(内部引物)和Seq ID No.2-S(318bp片段，图4C，表II，图1)进行扩增。由牛分枝杆菌DNA获得的PCR扩增子(泳道4-11，图4B和4C)的大小，比由结核分枝杆菌菌株获得的PCR扩增子(泳道1-3，图4B和4C)小。使用2套引物得到的PCR测定结果概括于表III。

为确认645和618bp PCR片段的大小差异，用HpaII和HaeIII消化扩增子(图4D)。在12％非变性聚丙烯酰胺凝胶上分析消化片段。用HpaII消化645bp片段清楚地显示，由牛分枝杆菌获得的～250bp片段(图4D，泳道3)，比由结核分枝杆菌H37Ra和H37Rv获得的～280bp条带小(图4D，泳道1和2)。用HaeIII消化则看不出差异(图4D，泳道5-8)。使用Seq ID No.3-M和Seq ID No.2-S引物产生的基因C末端部分的扩增子(318bp)，经HpaII消化得到的结果，呈现相似的差异性(结果未显示)，表明PCR-RFLP测定方法，确实能区分结核分枝杆菌与牛分枝杆菌菌株。

PCR扩增片段的序列测定：对由牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的标准菌株，包括牛源的牛分枝杆菌的本地分离物的DNA获得的PCR扩增子进行了序列测定。对618和645bp PCR扩增子(使用Seq ID No.1-N和2-S获得)，318和291bp(使用Seq ID No.3-M和2-S获得)，116和89bp(使用Seq ID No.4-F和5-R获得)进行序列测定，以确认大小差异。序列分析表明，牛分枝杆菌在基因C末端部分，第128位密码子之后框架中有27bp的缺失(9氨基酸)(图5)。该牛分枝杆菌(登录号Y18421)和结核分枝杆菌(登录号P95109)的组蛋白样基因序列，已提交NCBI数据库。

PCR，RFLP和巢式PCR测定的优点：

1)不同于现有测定方法，本测定方法提供直接用于临床样品、乳制品和肉制品中人致病性分枝杆菌的检测和区分方法。本测定方法能够鉴别属于结核分枝杆菌复合体的人致病性分枝杆菌。

2)与现有方法相比，此处所述方法具有独特的优点--作为一种方法，既能同时检测，又能准确区分两个密切相关的分枝杆菌，即结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。

3)此处描述的PCR，RFLP和巢式PCR方法，利用以HupB基因作为靶物的独特的新颖性。设计的新型引物对(Seq ID No.1&2；3&2；4&5)，便于在两种已知的致病性分枝杆菌，即结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中，特异性扩增hupB基因。

4)扩增片段的大小和序列差异性，赋予它们可靠的辨别性，这在迄今报导的所有其它方法中还是不可能的。

5)更重要的是，所述方法能够检测和诊断出临床样品中，除结核分枝杆菌外的其它致病性分枝杆菌，如牛分枝杆菌引起的双重感染。

表I

结核分枝杆菌(人分离物)	H37Rv，H37Ra，Erdman，P8473，P8497，C1207，C1084，779634，ICC107，ICC120，ICC22，ICC238，ICC136，ICC37，ICC247，ICC16，ICC235，ICC145，ICC06，ICC11，ICC85，ICC95，CSU-17，CSU-27，CSU-20	a，b，c，d，g，n
			牛分枝杆菌(牛分离物)	T11，AN5，IC378，IC379，IC380，IC381，IC382，ICC388，ICC391，117，126，73，130，CL1，CL3，CL4，CL8，CL10，CL33，CL42，Japanese&Copenhagen	d，o，p，q

人分离物M.canetti非洲分枝杆菌(M.africanum)田鼠分枝杆菌(M.microti)胃分枝杆菌(M.gastri)龟分枝杆菌(M.chelonae)牝牛分枝杆菌(M.vaccae)鸟分枝杆菌(M.avium)胞内分枝杆菌(M.intracellulare瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)戈特氏分枝杆菌(M.gordonae)偶发分枝杆菌(M.fortuitum)耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)草分枝杆菌(M.phlei)堪萨斯氏分枝杆菌(M.Kansasii)M.leprae猿分枝杆菌(M.simae)

6，47，85，11681543OV254，T14，N5TMC1456TMC191，J31IND123NCTC8562，ICC192TMC1302，N25，N8TMC1302，MAC29TMC13245J32，ICC420，ICC419，ICC417，ICC416ATCC27204，LR222，N18ND124，N141201组织活检IN7

ooe，gd，fbbbddddg，d，lb，dbcdd

白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)β溶血性链球菌(Streptococcusβ-haemolyticus)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)

临床分离物临床分离物临床分离物

hhh

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)肺炎杆菌(Klebsiellapneumonlae)星状诺卡氏菌(Nocardiaasteriodes)烟曲霉(Aspergillus fumigatus)黑色曲霉(Aspergillus niger)白色假丝酵母(Candidaalbicans)大肠杆菌(Escherichia coli)

临床分离物临床分离物MTCC274土壤分离物土壤分离物临床分离物DH5α，BL21(DE3)

hhijjkm

a-P.S.Murthy，UCMS，University of Delhi，India；b-N.K.Jain，NDTC，New Delhi，India；c-CN.Paramasivan，TRC，Chennai，India；d-V.M.Katooh，JALMA，Agra，India；e-Y.M.Yates，Public Health Laboratory，DulwichHospital，London，UK；f-P.Draper，NMR，Mill Hill，London，UK；g-Kathleen Eisenach，University of Arkanasa，USA；h-Dept.of Mlcroblology.AIIMS，New Delhi，India；i-Microblologloat Type Culture Collectlon，IMTECH，Chandlgarh，India；j-Shivkumar，Anna University，Chennal，India；k-ZU.Khan，V.P.Chest Institute，Delhi，India；l-Jack Crawfort，CDC，Atlanta，GA，USA；m-GIBCO BRL，USA；n-Suman Laal，VA Medical Center，NY U，School ofMedicine，New York，USA；o-J.D.A.van Embden，Netherlands；p-Central Milltary Veterinary Laboratory，Meerut，India.q-Dept.of Paedlatrics，AIIMS，New Delhi，India；(″)Human vaccine straln；Numbers In bold-human Isolates.

表II：用于扩增hupB分枝杆菌DNA靶的引物

序列

<213>生物体名称：分枝杆菌

<400>PreSequenceString：

VKPTSVPAFR PGAQFK

<212>类型：PRT

<211>长度：16

序列名称：Seq ID No.6(改为8)

序列描述：

序列

<213>生物名称：hupB-结核分枝杆菌，Rv2986c，登录号P95109

<400>PreSequenceString

atgaacaaag cagagctcat tgacgtgctc acacagaaat tgggctcgga ccgtcggcag 60

gcgaccgccg ccgtcgagaa tgtcgttgac acgattgtgc gtgcggtaca caaaggcgac 120

agcgtcacca ttaccgggtt cggtgtgttc gaacagcgtc gccgcgcggc tcgagtggcc 180

cgcaatccgc gtaccggcga gacagtaaag gtgaagccga cgtcggtgcc ggcgttccgc 240

ccgggcgcgc aattcaaagc ggttgtgtct ggcgcgcagc gtctcccggc agaaggaccc 300

gctgttaagc gtggtgtggg ggccagtgca gccaagaagg tagcgaagaa ggcacctgcc 360

aagaaggcga caaaggccgc caagaaggcg gcgaccaagg cgcccgccag gaaggcggcg 420

accaaggcgc ccgccaagaa agcggcgacc aaggcgcccg ccaagaaagc tgtcaaggcc 480

acgaagtcac ccgccaagaa ggtgaccaag gcggtgaaga agaccgcggt caaggcatcg 540

gtgcgtaagg cggcgaccaa ggcgccggca aagaaggcag cggccaagcg gccggctacc 600

aaggctcccg ccaagaaggc aaccgctcgg cggggtcgca aatag 645

<212>类型：DNA

<211>长度：645

序列名称：Seq ID No.7(改为6)

序列描述：

序列

<213>生物名称：HIP牛分枝杆菌，登录号Y18421

<400>PreSequenceString

atgaacaaag cagagctcat tgacgtgctc acacagaaat tgggctcgga ccgtcggcag 60

gcgaccgccg ccgtcgagaa tgtcgttgac acgattgtgc gtgcggtaca caaaggcgac 120

agcgtcacca ttaccgggtt cggtgtgttc gaacagcgtc gccgcgcggc tcgagtggcc 180

cgcaatccgc gtaccggcga gacagtaaag gtgaagccga cgtcggtgcc ggcgttccgc 240

ccgggcgcgc aattcaaagc ggttgtgtct ggcgcgcagc gtctcccggc agaaggaccc 300

gctgttaagc gtggtgtggg ggccagtgca gccaagaagg tagcgaagaa ggcacctgcc 360

aagaaggcga caaaggccgc caagaaggcg gcgaccaagg cgcccgccaa gaaagcggcg 420

accaaggcgc ccgccaagaa agctgtcaag gccacgaagt cacccgccaa gaaggtgacc 480

aaggcggtga agaagaccgc ggtcaaggca tcggtgcgta aggcggcgac caaggcgccg 540

gcaaagaagg cagcggccaa gcggccggct accaaggctc ccgccaagaa ggcaaccgct 600

cggcggggtc gcaaatag 618

<212>类型：DNA

<211>长度：618

序列名称：Seq ID No.8(改为7)

序列描述：

序列

<213>生物名称：23S-分枝杆菌属-C

<400>PreSequenceString

gtgagcgacg ggatttgcct at

<212>类型：DNA

<211>长度：22

序列名称：seq id no.9

序列描述：

序列

<213>生物名称：23S-分枝杆菌属-L

<400>PreSequenceString

accacccaaaa accggatcga t

<212>类型：DNA

<211>长度：21

序列名称：seq id no.10

序列描述：

表III A：结核分枝杆菌hupB PCR测定的典型结果

a-Dr.Kathleen Eisenach.Universitv of Arkansas.USA

b-Dr.C.N.Paramasivan，Tuberculosis Research Centre， Chennai，India

表III B：牛分枝杆菌hupB PCR测定的典型结果

c-Dr.V.M.Katoch.JALMA.Agra.India；d-Dr.J.D.A.van Embden，Netherlands

e-Pediatrics Dept. of AIIMS，New Delhi.

表IV：采用牛样品进行直接PCR测定的结果

发现如下牛的样品适于PCR测定检测牛分枝杆菌：淋巴腺活检组织标本并发现牛奶最佳(Chi方检验，p值＜0.05，处于显著水平，(SAS8.0统计软件).

表V：临床& AFB情况下牛直接PCR结果的比较分析

A-结核菌素阳性，有结核病临床表现

B-结核菌素阳性，外观健康动物

C-结核菌素阴性，有结核病临床表现

D-结核菌素阴性，外观健康动物

E-感染非-分枝杆菌的动物

在研究的动物临床类别中，与其它类别相比，从感染非-分枝杆菌微生物的动物检测到的牛结核最少(类别E)(p＜0.05，(Chi方检验，p值＜0.05，处于显著水平，(SAS 8.0统计软件)。

表VI：基于巢式PCR鉴别牛来源样品中的病原性分枝杆菌

a-每一类别测试64个样品

b.hupB基因C末端区域巢式PCR

c-含柠檬酸盐的血液

表VII：临床& AFB情况下牛巢式PCR结果的比较分析

A-结核菌素阳性，有结核病临床表现

B-结核菌素阳性，外观健康动物

C-结核菌素阴性，有结核病临床表现

D-结核菌素阴性，外观健康动物

E-感染非-分枝杆菌的动物

表VIII：牛来源分枝杆菌分离物细菌学比较和基于PCR-RFLP/巢式PCR的鉴别

Claims

1.一对用于特异性扩增分枝杆菌属种hupB基因的寡核苷酸引物，即Seq ID No.4和5。

2.基于编码组蛋白样蛋白质的hupB靶基因区分结核分枝杆菌与牛分枝杆菌的方法，包括：

a)从培养物获得DNA，

b)在聚合酶链反应中，使用所述DNA作为模板，使用根据权利要求1所述的一对寡核苷酸引物，扩增编码组蛋白样蛋白质的hupB靶基因的一部分，

c)检测所述hupB基因的扩增片段，以检测是否存在结核分枝杆菌和牛分枝杆菌，并基于扩增的片段的大小，区分结核分枝杆菌与牛分枝杆菌；

其中，所述方法不是疾病的诊断方法。

3.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(c)中扩增的片段通过溴化乙啶染色或DNA探针杂交检测。

4.根据权利要求3所述的方法，其中DNA探针由经可检测的标记物标记的SeqID No.6或Seq ID No.7，或其互补序列组成。

5.根据权利要求2所述的方法，其中在牛分枝杆菌中PCR扩增片段为89bp。

6.根据权利要求2所述的方法，其中在结核分枝杆菌中PCR扩增片段为116bp。

7.根据权利要求2所述的方法，其中牛分枝杆菌中PCR扩增片段比结核分枝杆菌扩增片段小27bp。

8.根据权利要求1所述的寡核苷酸引物对在制备用于基于编码组蛋白样蛋白质的hupB靶基因区分结核分枝杆菌与牛分枝杆菌的试剂中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述试剂进一步包含溴化乙啶或DNA探针。

10.根据权利要求9所述的用途，其中DNA探针由经可检测的标记物标记的Seq ID No.6或Seq ID No.7，或其互补序列组成。

11.根据权利要求8所述的用途，其中在牛分枝杆菌中PCR扩增片段为89bp。

12.根据权利要求8所述的用途，其中在结核分枝杆菌中PCR扩增片段为116bp。

13.根据权利要求8所述的用途，其中牛分枝杆菌中PCR扩增片段比结核分枝杆菌扩增片段小27bp。