CZ298020B6 - Zpusob pro detekci rezistence Mycobacterium sp., set prob divokého typu, kompozice obsahující tentoset a kit pro stanovení spektra antibiotické resistence - Google Patents
Zpusob pro detekci rezistence Mycobacterium sp., set prob divokého typu, kompozice obsahující tentoset a kit pro stanovení spektra antibiotické resistence Download PDFInfo
- Publication number
- CZ298020B6 CZ298020B6 CZ0361296A CZ361296A CZ298020B6 CZ 298020 B6 CZ298020 B6 CZ 298020B6 CZ 0361296 A CZ0361296 A CZ 0361296A CZ 361296 A CZ361296 A CZ 361296A CZ 298020 B6 CZ298020 B6 CZ 298020B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- probes
- wild
- prob
- resistance
- Prior art date
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 246
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 title claims abstract description 17
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 31
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 108
- 101150090202 rpoB gene Proteins 0.000 claims abstract description 95
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 claims abstract description 79
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 claims abstract description 79
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 103
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims description 80
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 34
- 101100038261 Methanococcus vannielii (strain ATCC 35089 / DSM 1224 / JCM 13029 / OCM 148 / SB) rpo2C gene Proteins 0.000 claims description 29
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 claims description 29
- 101150085857 rpo2 gene Proteins 0.000 claims description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 claims description 16
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 15
- 241000187482 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Species 0.000 claims description 12
- 241000677647 Proba Species 0.000 claims description 11
- ZWBTYMGEBZUQTK-PVLSIAFMSA-N [(7S,9E,11S,12R,13S,14R,15R,16R,17S,18S,19E,21Z)-2,15,17,32-tetrahydroxy-11-methoxy-3,7,12,14,16,18,22-heptamethyl-1'-(2-methylpropyl)-6,23-dioxospiro[8,33-dioxa-24,27,29-triazapentacyclo[23.6.1.14,7.05,31.026,30]tritriaconta-1(32),2,4,9,19,21,24,26,30-nonaene-28,4'-piperidine]-13-yl] acetate Chemical compound CO[C@H]1\C=C\O[C@@]2(C)Oc3c(C2=O)c2c4NC5(CCN(CC(C)C)CC5)N=c4c(=NC(=O)\C(C)=C/C=C/[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@@H]1C)c(O)c2c(O)c3C ZWBTYMGEBZUQTK-PVLSIAFMSA-N 0.000 claims description 11
- 229960000885 rifabutin Drugs 0.000 claims description 11
- 241000186363 Mycobacterium kansasii Species 0.000 claims description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 10
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 claims description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 7
- 102220259718 rs34120878 Human genes 0.000 claims description 6
- 102220486708 Cytochrome b-245 chaperone 1_R44G_mutation Human genes 0.000 claims description 4
- 241000186364 Mycobacterium intracellulare Species 0.000 claims description 3
- 238000004845 hydriding Methods 0.000 claims description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 abstract description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 24
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 22
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 12
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 9
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 9
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 101150005343 INHA gene Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 5
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 4
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 4
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 4
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000829171 Hypocrea virens (strain Gv29-8 / FGSC 10586) Effector TSP1 Proteins 0.000 description 3
- 241000588655 Moraxella catarrhalis Species 0.000 description 3
- 241001302239 Mycobacterium tuberculosis complex Species 0.000 description 3
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 3
- 239000006379 löwenstein-jensen medium Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 3
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- 108030002440 Catalase peroxidases Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 206010048723 Multiple-drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 241000187490 Mycobacterium scrofulaceum Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- KGTSLTYUUFWZNW-PPJQWWMSSA-N [(7S,9E,11S,12R,13S,14R,15R,16R,17S,18S,19E,21Z)-2,15,17,27,29-pentahydroxy-11-methoxy-3,7,12,14,16,18,22-heptamethyl-26-[(E)-(4-methylpiperazin-1-yl)iminomethyl]-6,23-dioxo-8,30-dioxa-24-azatetracyclo[23.3.1.14,7.05,28]triaconta-1(29),2,4,9,19,21,25,27-octaen-13-yl] acetate pyridine-4-carbohydrazide Chemical compound NNC(=O)c1ccncc1.CO[C@H]1\C=C\O[C@@]2(C)Oc3c(C2=O)c2c(O)c(\C=N\N4CCN(C)CC4)c(NC(=O)\C(C)=C/C=C/[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@@H]1C)c(O)c2c(O)c3C KGTSLTYUUFWZNW-PPJQWWMSSA-N 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 101150013110 katG gene Proteins 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 2
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 150000007660 quinolones Chemical class 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000013077 target material Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001549 tubercolostatic effect Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FRFSUUWVTVDAJG-UHFFFAOYSA-N 3-fluoro-1h-quinolin-2-one Chemical class C1=CC=C2NC(=O)C(F)=CC2=C1 FRFSUUWVTVDAJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588624 Acinetobacter calcoaceticus Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- KXFCBAHYSLJCCY-ZLUOBGJFSA-N Asn-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O KXFCBAHYSLJCCY-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- MUWDILPCTSMUHI-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asn-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)C(=O)O MUWDILPCTSMUHI-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- VPSHHQXIWLGVDD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VPSHHQXIWLGVDD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 description 1
- 241000588780 Bordetella parapertussis Species 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 241000589513 Burkholderia cepacia Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- STOOMQFEJUVAKR-KKUMJFAQSA-N His-His-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 STOOMQFEJUVAKR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N Leu-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRKCBIUDWAXNEG-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N Leu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N Lys-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010062207 Mycobacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241001467553 Mycobacterium africanum Species 0.000 description 1
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 1
- 241000187492 Mycobacterium marinum Species 0.000 description 1
- 241000187919 Mycobacterium microti Species 0.000 description 1
- 241000187488 Mycobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 101100509674 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) katG3 gene Proteins 0.000 description 1
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N Ser-Ser-Ser-Ser Chemical compound OCC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(O)=O JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101100388071 Thermococcus sp. (strain GE8) pol gene Proteins 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- 240000007313 Tilia cordata Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UPJONISHZRADBH-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- -1 alkyl phosphorothiates Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 102200126591 c.125A>G Human genes 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012786 cultivation procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940079920 digestives acid preparations Drugs 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000013100 final test Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 150000004678 hydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 201000009671 multidrug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 208000027531 mycobacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 229960005206 pyrazinamide Drugs 0.000 description 1
- IPEHBUMCGVEMRF-UHFFFAOYSA-N pyrazinecarboxamide Chemical compound NC(=O)C1=CN=CC=N1 IPEHBUMCGVEMRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N quinolin-2-ol Chemical compound C1=CC=C2NC(=O)C=CC2=C1 LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 102200050844 rs386833793 Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Liquid Crystal Substances (AREA)
Abstract
Zpusob pro detekci spektra antibiotické resistence Mycobacterium species vcetne M. Leprae, prítomných ve vzorcích, zahrnující kroky: (i) podle potreby uvolnení, izolování nebo koncentrování polynukleových kyselin prítomných ve vzorku; (ii) podle potreby amplifikaci relevantní cásti rpoB genu s alespon jedním vhodným párem primeru; (iii) hybridizaci polynukleových kyselin z kroku (i) nebo (ii) se setem prob divokého typu, pricemž každá proba z tohoto setu zabírá více než jedno polymorfní místo aset presahuje kompletní oblast mutace rpoB genu, za patricných hybridizacních a promývacích podmínek; (iv) detekci hybridu vytvorených v kroku (iii);(v) stanovení citlivosti na rifampicin (sensitivita versus resistence) Micobacterium species prítomného ve vzorku z hybridizacního signálu nebo rozdílných hybridizacních signálu získaných v kroku (iv). Kompozice obsahující jakýkoli set prob divokéhotypu. Kit pro stanovení spektra antibiotické resistence mykobakterií prítomných v biologickém vzorku.
Description
Způsob pro detekci resistence Mycobacterium sp., set prob divokého typu, kompozice obsahující tento set a kit pro stanovení spektra antibiotické resistence
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká oblasti na léky resistentních mykobakterií.
Předkládaný vynález se týká prob, primerů, metod a kitů obsahujících totéž pro detekci mykobakteriálních nukleových kyselin v biologických vzorcích.
Dosavadní stav techniky
Identifikace většiny klinicky relevantních Mycobacterium species, zejména mycobacterium tuberculosis, je únavná a zdlouhavá díky kultivačním procedurám, které mohou trvat déle než 6 týdnů. Rychlá diagnosa mycobacteriuové infekce je velmi důležitá, protože onemocnění může být život ohrožující a vysoce infekční. Nedávno byly vyvinuty některé metody - všechny na základě užití toho či onoho amplifikačního procesu - k identifikaci a detekci Mycobacterium species bez potřeby kultivace (Claridge et al. 1993). Většina těchto metod je stále ještě hodnocena a jejich přínos v rutinní aplikaci zůstává otázkou. Navíc, tyto metody neřeší problémy detekce Mycobacteriální lékové resistence, která stále zůstává na kultivaci.
Protože frekvence mnohotné lékové resistence u tuberkulózy pravidelně vzrůstá (Culliton, 1992), je nyní jasné, že časná diagnosa M. tuberculosis a rychlé rozpoznání resistence na hlavní tuberculostatika je základem pro terapii a optimální kontrolu znovu nastupující epidemie.
Antibiotika užívaná pro léčbu infekcí M. tuberculosis jsou zejména izoniazid a rifampicin buď jednotlivě, nebo v kombinaci. Příležitostně jsou užívány pyrazinamid, ethumbutol a streptomycin; další třídy antibiotik jako (fluro)chinolony se mohou stále preferovanými tuberckulostatiky v budoucnosti.
Protože většina mykobakterií s mnohotnou lékovou resistencí také ztrácí citlivost na rifampicin, je rafímpicinová resistence považována za potenciální markér pro mnohotnou lékovou resistencí u tuberkulózy. Z tohoto důvodu může mít detekce resistence na rifampicin značnou důležitost.
Pro většinu kmenů M. tuberculosis dosud zkoumaných byl vysvětlen mechanismus odpovědný za resistencí na rifampicin (a analogy jako rifabutin. Rifampicin (a analoga) blokují RNA polymerázu interakcí s β-podjednotkou tohoto enzymu. Telenti et al. (1993a) objevil, že mutace v limitované oblasti β-podjednotky RNA polymerázy M. tuberculosis zvyšují necitlivost RNA polymerázy pro účinek rifampicinu. Tento region je limitován v úseku 23 kodonů v rpoB genu. Autoři popisují 17 aminokyselinových změn provokujících resistencí na rifampicin (Telenti et al. 1993b). Tyto aminokyselinové změny jsou způsobeny bodovými mutacemi nebo delecemi v 15 nukleotidech nebo 8 aminokyselinových kodónech umístěných v rozsahu 67 nukleotidů nebo 23 aminokyselinových kodonů.
Telenti et al. (1993a a b) popsal PCR-SSCP metodu pro skríning pro relevantní mutace odpovědné za resistencí na rifampicin (SSCP označuje jednořetězcový konformační polymorfismus). SSCP analysa může být provedena buď použitím radioaktivního, nebo flurescentního markéru. V pozdějším případě je potřeba nákladné a složité vybavení (automatizovaný DNA sekvenční aparát). SSCP přístup má také jiná omezení s ohledem na jeho sensitivitu a specifícitu, která může ohrozit jeho rutinní užití. Vzorek může být přímo adekvátně analyzován pouze tehdy, jestliže je signifikantní množství bakterií (skóre: >90 mikroorganismů na pole) pozorováno mikroskopicky a mohou být pozorovány artefakty na vzorcích surové DNA separace řetězců, které mohou komplikovat interpretaci výsledků.
- 1 CZ 298020 B6
Kapur et al. (1994) popsal 24 odlišných rpoB alel asociovaných s resistencí na rifampicin. Navíc jsou popsány některé další nové mutace rpoB alel ktěm, které popsal Telenti et al. (1993a). Nicméně, nejčastěji se vyskytující mutace zůstávají stejné jak byly popsány dříve.
U M. leprae molekulární základ pro resistenci na rifampicin popsali Honoré a Cole (1993). Zde také resistence pramení z mutace rpoB genu, který kóduje beta podjednotkou RNA polymerázy M. leprae. Bylo analysováno pouze omezené množství kmenů M. leprae (9) a u většiny z nich (8/9) byla resistence způsobena mutací poškozující Ser-425 residuum.
Klinicky důležitá mykobakteria jiná než M. tuberculosis a M. leprae často vykazují vrozenou, může být proměnná, resistenci na rifampicin. To je příklad M. avium a M. intracelulare, lidských patogenů, pro které jsou dostupné pouze omezené možnosti léčby. Guerrero et al. (1994) srovnával rpoB - genové sekvence různých M. avium a M. intracelulare izolátů se sekvencemi M. 15 tuberculosis. Rozdíly jsou přítomné na nukleotidové úrovni, ale kompletní aminokyselinová identita byla nalezena s rifampicin sensitivním M. tuberculosis. Tyto objevy naznačují, že jiný mechanismus resistence, možná permeabilita bariery, je využívání pro M. avium a M. intracelulare.
Specifická detekce bodových mutací nebo malých delecí může být elementním přístupem za užití 20 hybridizačních procedur jako je reverzní hydridizační zkouška. Nicméně, složitost pozorovaná v relevantní části rpoB genu nedovoluje jednoduchý vývoj proby. Jak bude dále doloženo příkladem, je jedním z objektů předloženého vynálezu označení specifického přístupu dovolujícího detekci většiny, jestli ne všech nalezených mutací rychlým a vhodným způsobem bez potřeby složitého vybavení.
Mechanismus resistence na izoniazid je značně komplexnější než na rifampicin. Alespoň dva genové produkty jsou využívány v INH-resistenci. Za prvé, je zde catalase - paroxidasa, o které se soudí, že konvertuje INH na aktivní molekulu. Pro kmeny, které neprodukují catalaseperoxidázu díky defektnímu nebo deletovanému katG genu, nejsou nikdy citlivé na INH (Zhang 30 et al., 1992, Stoeckle et al., 1993). V tomto komplexu by mělo být zmíněno, že asociace mezi
INH resistencí a ztrátou catalasové aktivity byla již zmíněna v padesátých letech (Middlebrook, 1954 a a b, Youatt, 1969).
Druhou využívanou molekulou je inhA genový produkt, o kterém se soudí, že hraje roli 35 v biosyntéze kyseliny mycolinové. Je stanoveno, že aktivovaná INH molekula interaguje buď přímo, nebo nepřímo s tímto produktem a pravděpodobně zabraňuje vlastní biosyntéze kyseliny mycolinové. Tato hypotéza je založena na nedávných pozorováních, že ovarexprese divokého typu inhA genu nebo jednotlivá aminokyselinová změna (S94A) v inhA genovém produkci uděluje resistenci na INH (Banerjee et al. 1994).
Zkráceně a někdy zjednodušeně můžeme prohlásit, že resistence jistých kmenů M. tuberculosis na INH může být zprostředkována:
- ztrátou catalasa-peroxidázové aktivity
- přítomností jistých aminokyselinových změn v inhA proteinu
- úrovní exprese divokého typu inhA proteinu.
Také jiné mechanismy mohou být zahrnuty v udělení resistence na INH a podobné léky. Význam těchto faktorů v celkovém spektru mechanismů INH-resistence je ještě hodnocen. Tato otázka může být adresována prostředkům DNA probových technik, jestli spolehlivé DNA proby mohou 50 být vyvinuty z dostupných DNA-sekvencí katG genu (EMBL n° X 68081) a inhA genu (EMBL n° U02492) M. tuberculosis. Tyto prob-testy mohou pak také být aplikovány pro detekci lékové resistence v biologických vzorcích.
- 2 CZ 298020 B6
Pro detekci resistence na streptomycin a (fluro) chinolony byl sledován stejný přístup jako pro rifampicin. Resistence na tato antibiotika je také indukována bodovými mutacemi v limitované oblasti jednoho nebo více genů. Bodové mutace v genu pro gyrasu udělují resistenci na (fluro)chinolony (EMBL n L27512). Resistence na streptomycin koreluje s mutací v buď 16S rRNA genu nebo genu pro ribosomální protein S12 (rpsL) (Finken et al., 1993, Douglas and Steyn, 1993,Nairetal., 1993).
Resistence díky nukleotidovým změnám v katG, rpoB, a rpsL genech byly popsány v mezinárodní přihlášce WO 93/22454. Pro každý z různých genů M. tuberculosis pouze jedna z mnoha možných mutací byla specifikována detailně, nl. R461L pro katG, S425L (ekvivalentní k S531L popsané Telentim et al.,. a předkládaném vynálezu) pro rpoB a K42R pro rpsL.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je způsob pro detekci resistence Mycobacterium species přítomných ve vzorku vůěi repamcpicinu a/nebo rifabutinu, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje kroky:
(i) podle potřeby uvolnění, izolovány nebo koncentrování polynukleových kyselin přítomných ve vzorku;
(ii) podle potřeby amplifíkaci relevantní části rpoB genu s alespoň jedním vhodným párem primerů, (iii) hydridizaci polynukleových kyselin z kroku (i) nebo (ii) se setem prob divokého typu, přičemž každá proba z tohoto setu zabírá více než jedno polymorfní místo a set přesahuje kompletní oblast mutace rpoB genu, za patřičných hybridizačních a promývacích podmínek;
(iv) detekce hybridů vytvořených v kroku (iii);
(v) stanovení citlivosti na rifampicin (sensitivita versus resistence) Micobacterium species přítomného ve vzorku z hybridizačního signálu nebo různých hybridizačních signálů získaných v kroku (iv).
Předmětem tohoto vynálezu je dále set prob divokého typu pro detekci resistence Mycobacterium species vůči rafampicinu a/nebo rifabutinu, jehož podstata je založena na tom, že každá proba zabírá více než jedno polymorfní místo a set přesahuje kompletní oblast mutace rpoB genu.
Předmětem tohoto vynálezu je také kompozice obsahující jakýkoli set prob divokého typu, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje
- set jaký je definován výše,
- set, který sestává ze 2, 3,4, 5, 6, 7, 8 nebo 9 prob divokého typu,
- set prob divokého typu pro detekci resistence M. tuberculosis vůči rafampicinu a/nebo rifabutinu, který zahrnuje alespoň jednu probu divokého typu vybranou ze souboru sestávající z:
Sil
S33
S44
S444
S4444
S55
S555 (SEQ ID NO 1), (SEQ ID NO 2), (SEQ ID NO 3), (SEQ ID NO 4), (SEQ ID NO 5), (SEQ ID NO 6), (SEQ ID NO 7), (SEQ ID NO 43), (SEQ ID NO 8), (SEQ ID NO 9), (SEQ ID NO 10), (SEQ ID NO 39),
- 3 CZ 298020 B6 (SEQ ID NO 40), (SEQ ID NO 44), (SEQ ID NO 45), (SEQ ID NO 11) a
S5555
S55C
S55M
S6
S66 (SEQ ID NO 12), nebo
- set pob divokého typu pro detekci resistence M. leprae vůči rafampicinu a/nebo rifabutinu, který zahrnuje alespoň jednu probu divokého typu vybranou ze souboru sestávajícího z:
ML-S1
ML-S2
ML-S3
ML-S4
ML-S5
ML-S6 (SEQ ID NO 58), (SEQ ID NO 59), (SEQ ID NO 60), (SEQ ID NO 61), (SEQ ID NO 62) a (SEQ ID NO 63.
Předmětem tohoto vynálezu je rovněž kit pro stanovení spektra antibiotické resistence mykobakterií přítomných v biologickém vzorku, pokud možno ve spojení s identifikací přítomného druhu mykobakterií, který zahrnuje dále uvedené složky:
(i) je-li to vhodné, tak prostředky pro uvolnění, izolování nebo koncentrování polynukleových kyselin přítomných ve vzorku;
(ii) je-li to vhodné, tak set primerů pro amplifikaci rpoB genu, (iii) alespoň jeden sek prob divokého typu, pokud možno fixovaný na pevný nosič; přičemž v tomto setu každá proba zabírá více než jedno polymorfní místo a set předsahuje kompletní oblast mutace rpoB genu nebo set sestává ze 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 nebo 9 prob divokého typu, (iv) hydridizační pufr, nebo komponenty nezbytné pro produkci zmíněného pufru;
(v) promývací roztok, nebo komponenty nezbytné pro produkci zmíněného roztoku;
(vi) je-li to vhodné, tak prostředky pro detekci hybridů vzešlých z předchozí hybridizace.
Cílem předkládávaného vynálezu je poskytnout rychlý a spolehlivý přístup pro určení antibiotické resistence pro mykobakterium species přítomné v biologických vzorcích.
Přesněji je cílem předkládaného vynálezu poskytnout rychlý a spolehlivý přístup pro určení resistence na fifampicin (a/nebo rifambutin) u M. tuberculosis přítomného v biologickém vzorku.
Je také předmětem předkládaného vynálezu poskytnutí metody schopné detekce a identifikace Mycobacterium species v biologických vzorcích, přímo spojené s monitorováním spektra antibiotické resistence.
Podrobněji je cílem předkládaného vynálezu poskytnutí metody pro detekci přítomnosti Mycobacterium tuberculosis v biologickém vzorku přímo spojené s detekcí resistence na rifampicin (a/nebo rifambutin).
Podrobněji je cílem předkládaného vynálezu poskytnutí metody pro detekci přítomnosti Mycobacterium leprae v biologickém vzorku přímo spojené s detekcí resistence na rifampicin (a/nebo rifambutin).
Je také cílem předkládaného vynálezu vybrat jednotlivé proby schopné diskriminovat sekvence divokého typu od mutovaných sekvencí udělujících resistenci k jednomu nebo více lékům.
Podrobněji je také cílem předkládaného vynálezu vybrat jednotlivé proby schopné diskriminovat sekvence divokého typu od mutovaných sekvencí udělujících resistenci krifampicinu (a/nebo rifambutinu).
- 4 CZ 298020 B6
Podrobněji je také cílem předkládaného vynálezu vybrat jednotlivou sadu prob schopných diskriminovat sekvence divokého typu od mutovaných sekvencí udělujících resistenci k rifampicinu (a/nebo rifambutinu) s tím, že tato jednotlivá sada prob je užita za stejných hybridizačních a promývacích podmínek.
Navíc je cílem předkládaného vynálezu kombinovat sety selektovaných prob schopných rozlišení sekvencí divokého typu od sekvencí mutovaných, které udělují resistenci na rifampicin (a/nebo rifambutin) s jinými sety selektovaných prob schopných identifikovat Mycobacteria species přítomná v biologických vzorcích, kde všechny proby mohou být použity ze stejných hybridizačních a promývacích podmínek.
Je také cílem předkládaného vynálezu selektovat primery schopné amplifikace genových fragmentů určujících rysy antibiotické resistence.
Podrobnějším cílem předkládaného vynálezu je selekce primerů schopných amplifikace rpoB-genového fragmentu určujícího resistenci na rifampicin (a analoga).
Dalším cílem vynálezu je poskytnutí kitů pro detekci antibiotické resistence u mykobakterií, pokud možno ve spojení s identifikací určitého mykobakteriálního druhu.
Všechny cíle předkládaného vynálezu jsou uvedeny následujícími specifickými provedeními.
Selekce proferových prob předkládaného vynálezu je založena na principu Line Prob Assay (LiPA), která je reverzní hybridizační zkouškou užívající oligonukleotidových prob mobilizovaných jako paralelní linie na proužku pevného nosiče (Stuyver et al., 1993, mezinárodní přihláška WO 94/12670). Tento přístup je zejména výhodný proto, že je rychlý a snadný. Reverzní hybridizační formát a zejména LiPA přístup má mnoho praktických výhod ve srovnání s jinými DNA technikami nebo hybridizačními formáty, zejména je-li preferována užití kombinace prob neboje nevyhnutelné získat relevantní informační zdroj.
Mělo by být nicméně jasné, že jakýkoliv jiný typu hybridizačních zkoušek nebo formátů užívající jakékoliv ze selektovaných prob jak je popsáno dále ve vynálezu, je také zahrnut v předkládaném vynálezu.
Reverzní hybridizační přístup naznačuje, že proby jsou imobilizovány na pevném nosiči a že cílová DNA je značena tak, aby byla schopna detekce vytvářených hybridů.
Následující definice slouží k ilustraci termínů a výrazů užitých v předkládaném vynálezu.
Cílový materiál v těchto vzorcích může být buď DNA, nebo RNA, tj. genomová DNA nebo messengerová DNA nebo jejich amplifíkovaná verse. Tyto molekuly jsou také nazývány polynukleovými kyselinami.
Termín „proby“ označuje jednořetězcovou sekvenci specifických oligonukleotidů, jejichž sekvence je komplementární k cílové sekvenci, která má být detekována.
Termín komplementární, tak, jak je zde použit, znamená, že sekvence jednořetězcové proby je přesně komplementární k cílové jednořetězcové sekvenci, s cílovou sekvencí definovanou jako sekvence, kde je umístěna mutace, která má být detekována. Protože nové aplikace vyžadují detekci chybného umístění jednotlivých párů bází, jsou vyžadovány velmi přísné podmínky pro hybridizaci, v zásadě dovolující pouze hybridizaci přesně komplementárních sekvencí. Nicméně, variace jsou možné v délce prob (viz níže), a mělo by být zmíněno že, jelikož centrální část proby je základní pro její hybridizační charakteristiky, možné odchylky sekvence proby oproti cílové sekvenci jsou dovoleny na začátku a konci proby, je-li použita delší sekvence proby. Tyto
- 5 CZ 298020 B6 variace, které si lze představit z obecných znalostí v oboru, by měl nicméně být vždy hodnoceny experimentálně, aby se ověřilo, zda vedou k ekvivalentním hybridizačním charakteristikám jako přesně komplementární proby.
Preferovaně jsou proby délky od 5 do 50 nukleotidů, ještě lépe od 10 do 25 nukleotidů. Nukleotidy, jak je použito v předkládaném vynálezu, mohou být ribonukleotidy, deoxyribonukleotidy nebo modifikované nukleotidy jako je inosin nebo nukleotidy, obsahující modifikované skupiny, které nealterují zásadně jejich hybridizační charakteristiky. Sekvence prob jsou reprezentovány v celé specifikaci jako jednořetězcová DNA oligonukleotidy od 5' do 3' konce. Odborníkům v oboru je zřejmé, že jakákoliv z dále specifikovaných prob může být použita jako taková, nebo v její komplementární formě, nebo v její RNA formě (kde T je nahrazeno U).
Proby podle vynálezu mohou být připraveny klonováním rekombinantních plasmidů obsahujících inserty zahrnující korespondující nukleotidové sekvence, jestliže je potřeba pozdějšího štěpení z klonujícího plasmidů za užití adekvátní nukleasy a jejich získání, tj. frakcionací podle molekulární hmotnosti. Proby podle předkládaného vynálezu mohou být také syntetisovány chemicky, například konvenční fosfo-triesterovou metodou.
Termín „pevný nosič“ může označovat jakýkoliv substrát, ke kterému může být oligonukleotidová proba navázána, který umožňuje zachování jejích hybridizačních charakteristik a který umožňuje, že původní úroveň hybridizace zůstává nízká. Obvykle bude pevným substrátem mikrotitrační plotna, membrána (tj. nylonová nebo nitrocelulosová) nebo mikrosfera (korálek). Před aplikací na membránu nebo fixací je vhodné modifikovat nukleovou kyselinu proby tak, aby se usnadnila fixace nebo vylepšila účinnost hybridizace. Takové modifikace mohou zahrnovat připojení homopolymeru, který je spojený s různými reaktivními skupinami, jako je alifatická skupina, NH2 skupina, SH skupina, karboxylová skupina, nebo je spojený s biotinem, hapteny nebo proteiny.
Termín „značený“ označuje užití značených nukleových kyselin. Značení může být provedeno použitím značených nukleotidů inkorporovaných v průběhu polymerázových kroků amplifikace jak doložit Saiki et al. (1988) nebo Bej et al. (1990), nebo použitím značených primerů, nebo jakoukoliv jinou metodou v oboru známou. Zdrojem značek mohou být izotopy (32P, 35S atd.) nebo neizotopy (biotin, digoxigenin atd.).
Termín „primer“ označuje jednořetězcovou oligonukleotidovou sekvenci schopnou účinkovat jako iniciační bod pro syntézu rozšířeného příměrového produktu, kteiý je komplementární k řetězci nukleových kyselin, který má být kopírován. Délka sekvence primeru musí být taková, že dovoluje započetí syntézy extenčního produktu. Preferovaně je primer okolo 5 až 50 nukleotidů délky. Specifická délka a sekvence budou záviset na komplexitě žádaného DNA nebo RNA cílem, stejně tak jako na podmínkách užití primeru jako je teplota nebo iontové síle.
Fakt, že amplifikované primery nemusí přesně padnout korespondujících templátovým sekvencím k zabezpečení vlastní amplifikace je bohatě dokumentován v literatuře (Kwok et al., 1990).
Užitou amplifikační metodou může být buď polymerázová řetězová reakce (PCR, Saiki et al., 1988), ligasová řetězová reakce (LCR, Landgren et al., 1988, Wu a Wallace, 1989, Barany, 1991), amplifikace založená na sekvenci nukleových kyselin (NASBA, Guatelli et al., 1990, Compton, 1991), amplifikační systém založený na transkripci (TAS, Kwoh et al., 1989), řetězcová přeskupovací amplifikace („strand displacement amplification“) (SA, Duck 1990, Walker et al., 1992), nebo amplifikace prostředky Q3 replikasy (Lizardi et al., 1988, Loneli et al., 1989) nebo jakoukoliv jinou vhodnou metodou kamplifikaci molekul nukleových kyselin v oboru známou.
Oligonukleotidy použité jako primery nebo proby mohou také obsahovat nukleotidová analoga jako jsou fosforothiaty (Matsukura et al., 1987), alkylfosforothiaty (Miller et al., 1979) nebo
- 6 CZ 298020 B6 peptidy nukleových kyselin (Nielsen et al., 1991, Nielsen et al., 1993) nebo mohou obsahovat interkalační agens (Asseline et al., 1984).
Jako většina jiných variací a modifikací zavedených od původních DNA sekvencí vynálezu budou tyto variace vyžadovat adaptaci s ohledem na podmínky, za kterých bude oligonukleotid použit k získání žádoucí sensitivity a specifity. Nicméně, eventuální výsledky hybridizace budou v podstatě stejné jako ty, které byly získány s nemodifikovanými oligonukleotidy.
Zavedení těchto modifikací může být výhodné v pozitivním ovlivnění charakteristik jako je hybridizační kinetika, reversibilita tvoření hybridů, biologická stabilita oligonukleotidové molekuly atd.
„Vzorek“ může být biologický materiál odebraný buď přímo z infikovaného člověka (nebo zvířete), nebo po kultivaci (obohacení). Biologickým materiálem může být jakákoliv expektorace, brochoalveolámí laváž, krevní kožní tkáň, biópsie, kultivační materiál krevních lymfocytů, kolonie, tekuté kultury, půda, vzorky stolice, moč atd.
Proby podle vynálezu jsou projektovány pro dosažení optimálního provedení za stejných hybridizačních podmínek jako jsou ty, které jsou používány pro simultánní hybridizaci; toto vysoce zvyšuje využitelnost těchto prob a vede k signifikantnímu zisku času a práce. Je jasné, že kdyby byly preferovány jiné hybridizační podmínky, všechny proby by musely být adaptovány v souladu s tím přidáním nebo deletováním množství nukleotidů na jejich koncích. Mělo by být zřejmé, že tyty konkomitantní adaptace by měly být v podstatě tytéž výsledky, zejména když příslušné proby stále specificky hybridizují definovaný cíl. Takové adaptace také mohou být nezbytné, jestliže by amplifikovaným materiál měla být přirozená RNA a ne DNA, jako je to v případě NASBA systému.
Pro projektované proby s požadovanými charakteristikami mohou být aplikovány následující směrnice odborníkům v oboru známé.
Protože rozsah a specifita hybridizačních reakcí jako jsou ty, které jsou zde popsané, je ovlivňována množstvím faktorů, manipulace s jedním nebo více z těchto faktorů bude určovat přesnou specifitu a sensitivitu jednotlivé proby, ať je přesně komplementární k cíli či nikoliv. Význam a efekt různých podmínek zkoušky, zde vysvětlený dále, je odborníkům známý.
Za prvé, stabilita [proba:cíl] hybridu nukleových kyselin by měla být vybrána tak, aby byla kompatibilní s podmínkami zkoušky. Toto může být provedeno vyhnutím se dlouhým, AT bohatým sekvencím, ukončením hybridu G:C párem bází, a projektováním proby ve vhodném Tm. Počáteční a koncové body proby by měly být vybrány tak, aby délka a %GC vedly k Tm okolo 2 až 10 °C vyšší, než je teplota, ve které bude provedena finální zkouška. Kompozice bází proby je signifikantní, protože G-C páry bází vykazují vyšší teplotní stabilitu ve srovnání s A-T páry bází díky adiční vodíkové vazbě. Tak hybridizace zahrnující komplementární nukleové kyseliny s vyšším obsahem G-C budou stabilnější při vyšších teplotách.
Podmínky jako je iontová síla a inkubační teplota, za kterých bude proba použita, by měly také vzaty v úvahu při projektování proby. Je známé, že hybridizace bude narůstá se zvyšující se iontovou sílou reakční směsi, a že teplotní stabilita hybridů se mohou zvyšovat se zvyšující se iontovou silou. Na druhou stranu, chemická reagens, jako je formamid, močovina, DMSO a alkohol, která narušují vodíkové můstky, budou zvyšovat přísnost hybridizace. Destabilizace vodíkových můstků takovými reagens může silně redukovat Tm. Obecně, optimální hybridizace pro syntetické oligonukleotidové proby je asi 10 až 50 bází dlouhá a probíhá při teplotě asi o 5 °C nižší, než je teplota tání pro daný duplex. Inkubační teplota nižší než optimum může vést k chybnému navázání hybridizovaných sekvencí bází a tak vést k redukované specificitě.
- 7 CZ 298020 B6
Je žádoucí mít proby, které hybridizují pouze za podmínek vysoké přísnosti. Za vysoce přísných podmínek budou formovány pouze vysoce komplementární hybridynukleových kyselin; hybridy bez dostatečného stupně komplementarity nebudou tvořeny. V souladu s tím, přísnost podmínek zkoušky určují stupeň komplementarity, který je potřebný mezi dvěma řetězci nukleových kyselin formujících hybrid. Stupeň přísnosti je vybrán tak, aby maximalizoval rozdíl stability mezi hybridy formovanými s cílovou a necílovou nukleovou kyselinou. V předkládaném případě je potřebná detekce změny jednotlivého páru bází, což vyžaduje podmínky velmi vysoké přísnosti.
Za druhé, proby by měly být projektovány tak, aby minimalizovaly stabilitu [probamecílová] nukleová kyselina hybridů. Toto může být provedeno minimalizováním délky přesně komplementarity knecílovým organismům vynecháním GC-bohatých regionů homologních knecílovým sekvencím a projektováním proby tak, aby překlenula co možná nejvíce destabilisujících chybných umístění. To, je-li sekvence proby užitečná k detekci pouze specifického typu organismu zálež zejména na rozdílu termální stability mezi [proba:cíl] hybridy a [proba:noncíl] hybridy. V projektovaných probách by měly být rozdíly v těchto Tm hodnotách tak velké, jak je možné (tj. alespoň 2 °C a preferovaně 5 °C).
Délka cílové sekvence nukleových kyselin a, v souladu s tím, délka sekvence proby mohou také být důležité. V některých případech zde může být mnoho sekvencí z jednotlivého regionu, které se liší v umístění a délce, které mohou vytvářet proby s požadovanými hybridizačními charakteristikami. V jiných případech, jedna sekvence může být signifikantně lepší než druhá, od které se liší pouze v jedné bázi. Zatímco pro hybridizaci nukleové kyseliny je možné, že nejsou perfektně komplementární, delší řetězce perfektně komplementárních sekvencí bází budou normálně především určovat stabilitu hybridu. Zatímco oligonukleotidové proby různých délek a kompozicí bází mohou být užity, preferované oligonukleotidové proby vynálezu jsou mezi 5 až 50 (lépe 10 až 25) bází dlouhé a mají dostatečně dlouhý úsek sekvence, která je perfektně komplementární k cílové sekvenci nukleových kyselin.
Za třetí, oblasti cílové DNA a RNA, o kterých je známo, že vytvářejí silnou vnitřní strukturu inhibující hybridizaci jsou méně preferovány. Stejně tak by měly být vyloučeny proby s extensivní vlastní komplementaritou. Jak bylo vysvětleno výše, je hybridizace spojením dvou jednotlivých řetězců komplementárních nukleových kyselin za vytvoření dvojřetězce vodíkovými vazbami. Je implicitní, že jestliže bude jeden ze dvou řetězců celkově nebo částečně zahrnut do hybridu tak bude méně schopný účastnit se vytváření hybridu nového. Mohou zde být intramolekulámí a intermolekulámí hybridy vytvářené uvnitř molekul jednoho typu prob, jestliže mají dostatečnou vlastní komplementaritu. Takové struktury musí být vyloučeny v průběhu pečlivého projektování prob. Projektováním proby tak, že podstatná část sekvence je jednořetězcová, může být stupeň a rozsah hybridizace značně zvýšen. Počítačové programy jsou vhodné k vybrání tohoto typu interakcí. Nicméně, v určitých případech, nemusí být možné vyvarovat se těmto typům interakcí.
Předkládaný vynález poskytuje v nejobecnější formě metodu pro detekci spektra antibiotické resistence Mycobacterium species přítomný ve vzorcích, pravděpodobně ve spojení s identifikací přítomného Mycobacterium species, kde tato metoda zahrnuje:
(i) uvolnění, izolování a koncentraci polynukleových kyselin přítomných ve vzorku, (ii) amplifikace relevantní části genů antibiotické resistence přítomných ve zmíněném vzorku s alespoň jedním vhodným párem primerů (iii) hybridizaci polynukleových kyselin kroku (i) nebo (ii) s alespoň jednou z rpoB genových prob, jak je zmíněno na tabulce 2, za vhodných hybridizačních a promývacích podmínek, (iv) detekce hybridů vytvořený v kroku (iii) (v) určení spektra antibiotické resistence Mycobacteria, a pokud možno druh Mycobacteria obsažený v různých hybridizačních signálech získaných v kroku (iv).
- 8 CZ 298020 B6
Relevantní část genů antibiotické resistence označuje oblasti vrpoB, katG, inhA, 16S rRNA, rpsL a gyrasovém genu nesoucích mutace, které způsobují resistenci na rifampicin, izoniazid, streptomycin a (fluoro)chinolony jak je popsáno výše.
Podle preferovaného provedení předkládaného vynálezu je krok (iii) proveden pomocí setu prob pečlivě projektovaných tak, aby vykazovaly žádoucí hybridizační výsledky, jestliže jsou použity za stejných hybridizaěních a promývacích podmínek.
Přesněji, vynález poskytuje metodou pro detekci rifampicinové (a/nebo rifambutinové) resistence M. tuberculosis přítomného v biologických vzorcích, kde tato metoda zahrnuje kroky:
(i) uvolnění, izolování a koncentraci polynukleových kyselin přítomných ve vzorku, (ii) amplifikace relevantních částí rpoB genu přítomného ve zmíněném vzorku s alespoň jedním vhodným párem primerů, (iii) hybridizace polynukleových kyselin kroku (i) nebo (ii) s vybranou sadou rpoB prob divokého typu za vhodných hybridizaěních a promývacích podmínek, zda zmíněná sada obsahuje alespoň jednu z následujících prob (viz Tabulka 2):
Sil
S33
S44
S444
S4444
S55
S555
S5555
S55C
S55M
S66 (SEQ ID NO 1), (SEQ ID NO 2), (SEQ ID NO 3), (SEQ ID NO 4), (SEQ ID NO 5), (SEQ ID NO 6), (SEQ ID NO 7), (SEQ ID NO 43), (SEQ ID NO 8), (SEQ ID NO 9), (SEQ ID NO 10), (SEQ ID NO 39), (SEQ ID NO 40), (SEQ ID NO 44), (SEQ ID NO 45), (SEQ ID NO 11), (SEQ ID NO 12), (iv) detekci hybridů vytvořený v kroku (iii) (v) určení citlivosti na rifampicin (sensitivita versus resistence) M. tuberculosis přítomného ve vzorku z různých hybridizačních signálů získaných v kroku (iv).
Termín „vnímavost“ označuje fenotypickou charakteristiku kmenů M. tuberculosis, jestli jsou buď resistentní, nebo sensitivní na lék, jak je určeno in vitro kultivačními metodami, přesněji na rifampicin (a/nebo rifambutin). Resistence na rifampicin je odhalena absencí hybridizace s alespoň jednou S-prob.
Standardní hybridizační a promývací podmínky jsou například 3X SSC (sodný salinický citrát), 20% deionizovaný FA (formamid) při 50 °C. Jiné roztoky (SSPE (sodný salinický fosfát EDTA), TMAC1 (tetramethylammoniumchlorid), atd.) a teploty mohou být také použity pokud je určena specificita a sensitivita prob. Je-li to potřeba, mohou být provedeny mírné modifikace v délce a sekvenci prob k zachování sensitivity a specificity žádoucí za daných okolností. Při užití prob vynálezu vede změna podmínek na 1.4X SSC, 0,07% SDS při 62 °C ke stejným hybridizačním výsledkům jako za standardních podmínek, bez potřeby adaptace sekvence či délky prob.
- 9 CZ 298020 B6
Vhodné páry primerů mohou být vybrány ze seznamu párů primerů popsaného níže.
V preferovanějším provedení, výše zmíněné polynukleové kyseliny z kroků (i) nebo (ii) jsou hybridizovány alespoň se dvěma, třemi, čtyřmi, pěti, šesti, sedmi, osmi, devíti, desíti, jedenácti, dvanácti, třinácti, čtrnácti, patnácti, šestnácti nebo sedmnácti z výše zmíněných S-prob, preferovaně s 5 nebo 6 S-probami, které dohromady pokryjí „mutační region“ rpoB genu.
Termín ,„mutační region“ znamená region rpoB genové sekvence, kde jsou umístěny nejčastější, jestliže ne všechny mutace odpovědné za resistenci na rifampicin. Tento mutační region je předložen na obr. 1.
V ještě preferovanějším provedení, výše zmíněné polynukleové kyseliny z kroků (i) nebo (ii) jsou hybridizovány s vybranou sadou prob ropB- divokého typu, kde řečená sada zahrnuje alespoň jednu, a výhodněji všechny, následující proby (viz Tabulku 2):
| Sil S2 S33 S4444 S55 nebo S5555 | (SEQ ID NO 2) (SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 5) (SEQ ID NO 8) (SEQ ID NO 10 nebo 40) |
V jiném jednotlivém provedení může být set S-prob popsaný výše, nebo alespoň jedna z nich, kombinována s jednou či více SIL-prob, detekujících silentní mutace v rpoB genu. Preferovanou SIL- probou pro SIL-1 (SEQ ID NO 13, viz Tabulka 2).
V jiném provedení vynálezu může být set S-prob a podle možností SIL-prob kombinován s alespoň jednou R-probou detekující specifické mutace asociované s rifampicinovou resistenci.
R-proby jsou vybrány z následující skupiny prob (viz Tabulka 2):
| R1 | (SEQ ID NO 4) |
| R2 | (SEQ ID NO 14) |
| R2B | (SEQ ID NO 47) |
| R2C | (SEQ ID NO 48) |
| R3 | (SEQ ID NO 49) |
| R4A | (SEQ ID NO 15) |
| R44A | (SEQ ID NO 16) |
| R444A | (SEQ ID NO 17) |
| R4B | (SEQ ID NO 18) |
| R44B | (SEQ ID NO 19) |
| R444B | (SEQ ID NO 20) |
| R4C | (SEQ ID NO 50) |
| R4D | (SEQ ID NO 51) |
| R4E | (SEQ ID NO 52) |
| R5 | (SEQ ID NO 21) |
| R55 | (SEQ ID NO 22) |
| R5B | (SEQ ID NO 53) |
| R5C | (SEQ ID NO 54) |
Preferovaně může být set S-prob a pokud možno SIL-prob kombinován s alespoň dvěmi, třemi, čtyřmi, pěti, šesti nebo více R-prob.
Ještě lépe je set S-prob a pokud možno SIL-prob kombinován s alespoň jednou z omezené skupiny R-prob:
- 10 CZ 298020 B6
R2
R444A
R444B
R55 (SEQ ID NO 14) (SEQ ID NO 17) (SEQ ID NO 20) (SEQ ID NO 22)
V případě, že jsou kombinovány S a R proby je resistence na rifampicin objasněna absencí hybridizace s jednou z S-prob a pokud možno pozitivním hybridizačním signálem s korespondující R-probou.
Jelikož některé mutace se mohou vyskytovat častěji než jiné, tj. v jistých geografických oblastech (viz. Tabulka 5) nebo za jistých specifických okolností (tj. v dosti těsných komunitách) může být vhodné pro skríning pouze specifických mutací užití vybraného setu S a/nebo R prob. Toto povede k jednoduššímu testu, který pokryje za jistých okolností potřebu. Podle Telentiho et al., (1993a a b) je většina mutací popsána v jeho publikaci relativně vzácná (3% nebo méně), predominantní mutace jsou S53IL (51,6%), H526Y (12.5%), D516V (9,4%) a H526D (7,8%).
(SEQ ID NO 8) (SEQ ID NO 10 nebo 40)
V jednotlivém provedení vynálezu jsou užity vybrané sety dvou nebo tří S-prob, kde příslušnými sety prob jsou:
S4444
S55 (nebo S5555) nebo
S2
S4444
S55 (nebo S55555) (SEQ ID NO 3) (SEQ ID NO 8) (SEQ ID NO 10 nebo 40)
Užitím těchto omezených setů S-prob může být detekována většina případů resistence na rifampicin absencí hybridizačního signálu s alespoň jednou z těchto prob.
V jiném jednotlivém provedení vynálezu je užita alespoň jedna R-proba, pokud možno kombinovaná s vybraným setem dvou nebo tří S-prob jak je popsáno výše, kde zmíněná R-proba bude vybrána z následujícího seznamu prob:
| R2 R444A R44B R55 | (SEQ ID NO 14) (SEQ ID NO 17) (SEQ ID NO 20) (SEQ ID NO 22) |
V tomto případě, specifická mutace odpovědná za fenotyp resistentní na rifampicin může být odvozena z pozitivního hybridizačního signálu s jednou zR-prob a/nebo absencí hybridizace s odpovídající S-probou.
V jiném provedení vynálezu mohou být výše zmíněné S, SIL nebo R proby kombinovány s alespoň jednou z druhově specifických prob pro M. tuberculosis dovolujíc tak simultánní identifikaci Mycobacterium tuberculosis a detekci resistence na rifampicin, kde zmíněná druhově specifická proba je vybrána z následující skupiny prob (viz Tabulka 2):
MT-POL-1
MT-POL-2
MT-POL-3
MT-POL-4
MT-POL-5 (SEQ ID NO 23) (SEQ ID NO 24) (SEQ ID NO 25) (SEQ ID NO 26) (SEQ ID NO 27)
Nejvýhodnější M. tuberculosis druhově specifická proba je:
(SEQ ID NO 23)
V ještě jiném provedení vynálezu mohou být zmíněné S,SIL,R nebo MT-POL proby kombinovány s alespoň jednou z druhově specifických prob pro M. paratuberculosis, M. avium, M. scrophulaceum, M. Kansassi, M. Intracelullare (a MAC-kmeny) nebo M. leprae kde zmíněnými probami jsou odpovídajícím způsobem MP-POL-1 (SEQ ID NO 28), MA-POL-1 (SEQ ID NO 29), MSPOL-1 (SEQ Dl NO 38), MK-POL-1 (SEQ ID NO 55), MI-POL-1 (SEQ ID NO: 68), a MLPOL-1 (SEQ ID NO 57 (viz Tabulka 2B) nebo jakákoliv jiná druhově specifická proba odvozená ze sekvence relevantní části rpoB genu M. paratuberculosis (SEQ ID NO 35), M. avium (SEQ ID NO 36), M.S crophulaceum (SEQ ID NO 37), M. kansasii (SEQ ID NO 56), nebo MAC kmenů (SEQ ID NO 69, jak jsou odpovídajícím způsobem reprezentovány na obrázku 5, 6, 7, 8 a 11. Mělo by být zmíněno, že sekvence reprezentované na obr. 5-8 a 11 jsou nové. Sekvence rpoB genového fragmentu M. intracelullare a M. leprae byly popsány jinými (Guerrero et al., 1994, Honoře and Cole, 1993).
Termín „MAC-kmeny“ značí „M. Avium komplex“ kmenů, které jsou známé odborníkům v taxonomii mykobakterií. Tato dosti heterogenní skupina MAC kmenů může nicméně obsahovat kmeny, které jsou genotypicky dosti podobné M. intracelulare. To je také případ izolátu ITG 926, jehož poB sekvence je ukázána na obr. 11. MI-POL-1 proba derivovaná ze SEQ ID NO 69 a publikovaná M. intracelulare rpoB sekvence je proto specifická společně pro kmeny M. intracelulare a MAC kmeny.
Mělo by být zdůrazněno, že všechny výše zmíněné proby, včetně druhově specifických prob, jsou obsaženy v sekvenci rpoB genu, a přesněji v sekvenci amplifikovaného rpoB genového fragmentu. Navíc, jak je ilustrováno dále v příkladech, proby popisované výše jsou „preferenční“ jsou projektovány takovým způsobem, že mohou všechny být použity simultánně, za stejných hybridizačních a promývacích podmínek. Tato dvě kriteria naznačují, že jednotlivý amplifikační a hybridizační krok je dostačující pro simultánní detekci resistence na rifampiin a identifikaci druhu obsaženého mycobacteria.
V preferovaném provedení, a cestou příkladů, je objasněna metoda pro detekci M. tuberculosis a jeho resistence na rifampicin, která obsahuje tyto kroky:
(i) uvolnění, izolování a koncentraci polynukleových kyselin přítomných ve vzorku, (ii) amplifikace relevantní části rpoB genu přítomného ve zmíněném vzorku s alespoň jedním vhodným párem primerů, (iii) hybridizaci polynukleových kyselin kroku (i) nebo (ii) s následující sadou prob za vhodných hybridizačních a promývacích podmínek:
MT-POL-1
Sil
S2
S33
S4444
S55 nebo S5555
R2
R444A
R444B
R55 (iv) detekci hybridů vytvořených v kroku (iii), (v) určení přítomnosti M. tuberculosis a jeho citlivosti na rifampicin z různých hybridizačních signálů získaných v kroku (iv).
- 12 CZ 298020 B6
K detekci mycobacteriálních organismů a/nebo jejich resistence pomocí vybraného setu prob může být použita jakákoliv hybridizační metoda v oboru známá (konvenční dot-blot, Southem blot, sandwich, atd.).
Nicméně, aby se získaly výsledky rychle a snadno při použití většího množství prob, je nejvhodnější použití reverzního hybridizačního formátu.
V preferovaném provedení je vybraný set prob imobilizován na pevném nosiči. V jiném preferovaném provedení je vybraný set prob imobilizován na membránovém proužku jako linie. Zmíněné proby mohou být imobilizovány individuálně nebo jako směs nelineárních míst na pevném nosiči.
Specifickým a uživateli velmi oblíbeným provedením zmíněné preferenční metody je LiPa metoda, kde zmíněný set prob je imobilizován v paralelních liniích na membráně, jak dále popisují příklady.
Výše zmíněné R proby detekují mutace, které již byly v oboru popsány dříve (Telenti et al., 1993a a 1993b). Nicméně, jak dále ilustrují příklady, čtyři nové mutace asociované s resistencí na rifampicin u M. tuberculosis, dosud jinými popsané, jsou popsány tímto vynálezem. Užitím S-prob tohoto vynálezu mohou být detekovány nové mutace stejně jako mutace již dříve v oboru popsané. Jedinečný koncept užití setu S-prob, který pokrývá kompletní region rpoB genu, které jsou odpovědné za resistenci na rifampicin, třebaže tyto mutace dosud nebyly popsané.
Čtyři nové mutace rpoB (D516G, H526C, H526T, R529Q) jsou označeny v tabulce 1 hvězdičkou. Prostřednictvím příkladů, sekvence rpoB mutantní alely H526C je reprezentována na Obr. 2 (SEQ ID NO 34).
Vynález také poskytuje proby nebo sety primerů projektované pro specifickou detekci nebo specifické amplifikaci těchto nových mutací rpoB genu, a metody nebo křty pro užití zmíněných setů primerů nebo prob.
V jiném provedení vynálezu také poskytuje metodu pro detekci resistence na rifampicin (a/nebo rifambutin) u M. leprae přítomného v biologickém vzorku, která obsahuje tyto kroky:
(i) uvolnění, izolování a koncentraci polynukleových kyselin přítomných ve vzorku, (ii) amplifikace relevantních částí rpoB genu přítomného ve zmíněném vzorku s alespoň jedním vhodným párem primerů, (iii) hybridizace polynukleových kyselin kroku (i) nebo (ii) s vybranou sadou rpoB prob divokého typu za vhodných hybridizačních a promývacích podmínek, zda zmíněná sada obsahuje alespoň jednu z následujících prob (viz Tabulka 2):
ML-S1
ML-S2
ML-S3
ML-S4
ML-S5
ML-S6 (SEQ ID NO 58) (SEQ ID NO 59) (SEQ ID NO 60) (SEQ ID NO 61) (SEQ ID NO 62) (SEQ ID NO 63 (iv) detekci hybridů vytvořených v kroku (iii), (v) určení citlivosti na rifampicin (sensitivity versus resistence) M. leprae přítomného ve vzorku z různých hybridizačních signálů získaných v kroku (iv).
Resistence v rifampicin je odhalena absencí hybridizace s alespoň jednou z ML-S prob.
- 13 CZ 298020 B6
V jiném provedení vynálezu mohou být výše zmíněné ML-S proby kombinovány s druhově specifickou probou pro M. leprae, ML-POL-1, umožňujíc tak simultánní identifikaci M. leprae a detekci resistence na rifampicin, kde zmíněná druhově specifická proba je reprezentována SEQ ID NO 57.
Je nutné zmínit, že zmíněné ML-S proby a ML-POL-1 proby jsou obsaženy ve stejném amplifikovaném rpoB genovém fragmentu M. leprae a jsou projektovány tak, že mohou být použity za stejných hybridizačních a promývacích podmínek.
Vynález dále poskytuje jakékoliv zvýše popsaných prob jakož i kompozice obsahující alespoň jednu z výše popsaných prob.
Vynález také poskytuje sety příměrů, které dovolují amplifikaci mutačního regionu rpoB genu M. tuberculosis. Sety primerů mohou být vybrány z následující skupiny setů (viz Tabulku 2):
PlaP5 (SEQ ID NO 30 a 33)
P3aP4 (SEQ ID NO 31 a 32)
P7aP8 (SEQ ID NO 41 a 42)
P2 a P6 v kombinaci s (PÍ a P5) nebo (P3 a P4) nebo (P7 a P8)
Nejlépe je set primerů následující:
P3aP4 (SEQ ID NO 31 a 32)
Vynález dále poskytuje sety primer dovolující amplifikaci mutačního regionu rpoB genu mykobakterií obecně, tj. alespoň u M. tuberculosis, M. avium, M. paratuberculosis, M. intracelulare, M. leprae, M. scrophulaceum. Tyto všeobecné primery mohou být použity ve vzorcích, ve kterých je předpokládána přítomnost jiného mykobakteria než M. tuberculosis a kde je žádoucí mít obecnější metodu detekce. Sety primerů jsou složeny z 5 primerů, vybraných z následující sady:
MGRPO-1 (SEQ ID NO64)
MGRPO-2 (SEQ ID NO65) a 3-primerů, vybraných z následující sady:
MGRPO-3 (SEQ ID NO66)
MBRPO-4 (SEQ ID NO67.
Sekvence těchto primerů je ukázána na Tabulce 2B.
Primery mohou být označeny značkou volby (tj. biotinem). Různé na příměrech založené cílené amplifíkační systémy mohou být užity, preferovaně PCR amplifikace, jak je dáno v případech. Může být použita jednotlivě probíhající nebo společná („nested“) PCR.
Vynález také poskytuje kity pro určení spektra antibiotické resistence mukobakterií přítomných v biologických vzorcích, pokud možno ve spojení s identifikací druhu obsažených mykobakterií, které zahrnují následující kroky:
(i) uvolnění, izolování a koncentraci polynukleových kyselin přítomných ve vzorku, (ii) alespoň jeden z výše zmíněných setů primerů (iii) alespoň jednu z prob definovaných výše, pokud možno fixovanou na pevný nosič, (iv) hybridizační pufr, nebo komponenty nezbytné pro přípravu takového pudru, (v) promývací roztok nebo komponenty nezbytné pro přípravu takového roztoku, (ví) prostředky pro detekci hybridů vzešlých z předchozí hybridizace.
- 14 CZ 298020 B6
Termín „hybridizační pufr“ znamená pufr umožňující proběhnutí hybridizační reakce mezi probami a polynukleovými kyselinami přítomnými ve vzorku, nebo amplifikovanými produkty, za vhodných přísných podmínek.
Termín „promývací roztok“ znamená roztok umožňující promývání hybridů formovaných za vhodných přísných podmínek.
Přesněji poskytuje vynález kity, které jsou popsány výše, pro simultání detekci M. tuberculosis a jeho resistence na rifampicin.
V jiném specifickém případě poskytuje vynález kity, které jsou popsány výše, pro simultánní detekci M. leprae a jeho resistenci na rifampicin.
Legenda k tabulkám
Tabulka 1 shrnuje nukleotidové a aminokyselinové změny (které popsal Telenti et al., (1993a a b), Kapure et al., 1994 a předkládaný vynález) a rpoB genové fragmentu rifampicinové resistence u M. tuberculosis izolátů. Číslování kodonů je jako na Obrázku 1. Nové mutace popsané tímto vynálezem jsou označeny hvězdičkou (*).
Tabulka 2 je seznamem sekvencí primerů a prob selektovaných z rpoB genu
2A: M. tuberculosis
2B: jiné druhy mykobakterií
Tabulka 3 ukazuje výsledky hybridizace získané s probou MT-POL-1, s DNA z různých mykobakteriálních a nemykobakteriálních druhů.
Tabulka 4 ukazuje některé reprezentativní výsledky získané LiPa pro izoláty M. tuberculosis, které byly sekvenovány a interpretaci různých LiPa vzorků.
Tabulka 5 ukazuje výskyt různých mutací rpoB vM. tuberculosis v různých geografických oblastech. Zkratky: Bel = Belgie, Bengla = Bangladéš, Bur-Fa = Burkina Faso, Buru = Burundi, Can = Kanada, Chi = Chile, Col = Kolumbie, Egy = Egypt, Gui = Guinea, Hon = Honduras, Pa = Pákistán, Rwa = Rwanda, Tun = Tunisko.
Tabulka 6 ukazuje srovnání výsledků LiPa s určením resistence na rifampicin v kultuře pro M. tuberculosis. S = sensitivní, R = resistentní.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 reprezentuje nukleotidovou sekvenci a aminokyselinovou sekvenci mutačního regionu příslušných rpoB genu a β-podjednotky divokého typu RNA polymerázy (tj. ne-resistentní) Mycobacterium tuberculosis kmenů (ITG 9081). Číslování kodonů (aminokyselin) je jako u Telentiho et al. (1993a). Nukleotidy nebo aminokyseliny zahrnuté v resistenci indukujících změnách jsou podtrženy. Pozorované mutace jsou orámečkovány. Horizontální proužky indikují pozice některých oligonukleotidových prob (jedna proba na skupinu je indukována).
Obr. 2 ukazuje parciální nukleotidovou sekvenci nově popsané rpoB mutantní alely kmenu M. tuberculosis ITG 9003 (SEQ ID NO 34).
Obr. 3 ukazuje výsledky získané na LiPA - proužcích s probami S44 a S4444 použitých v různých koncentracích na membránovém proužku. Jako cílový materiál byly použity přípravky nukleových kyselin kmenů M. tuberculosis ITG 8872 a ITG 9081.
- 15 CZ 298020 B6
Obr. 4 dává srovnání chování prob S44 a S444 v Line prob assay konformaci. Proby na proužku A a B jsou identické s výjimkou S44 a S4444. Hybridizace byla provedena s použitím amplifikovaného materiálu pocházejícího z kmenu M. tuberculosis ITG 8872.
Obr. 5 ukazuje parciální nukleotidovou sekvenci předkládaného rpoB genu M. paratuberculosis 316F (SEQ ID NO 35).
Obr. 6 ukazuje parciální nukleotidovou sekvenci předkládaného rpoB genu M. avium ITG 5887 (SEQ ID NO 36).
Obr. 7 ukazuje parciální nukleotidovou sekvenci předpokládaného rpoB genu m. scrofulaceum ITG 4979 (SEQ ID NO 37).
Obr. 8 ukazuje parciální nukleotidovou sekvenci předpokládaného rpoB genu M. kansasii ITG 4987 (SEQ ID NO 56).
Obr. 9 ukazuje některé rpoB mutace M. tuberculosis a jejich korespondující LÍPA vzorky. Nomenklatura těchto mutací je stejná jako v Tabulce 1. Nomenklatura LÍPA vzorků je následující:
wt = pozitivní hybridizace se všemi S-probami, a negativní hybridizace se všemi R-probami.
Sl—5= absence hybridizace s příslušnou S-probou, R2, 4A, 4B, 5 = pozitivní hybridizace s příslušnou R-probou a absenci hybridizace s korespondující S-probou.
C= pozitivní kontrolní linii, měla by být pozitivní, je-li test proveden odpovídajícím způsobem.
Mtb= MT-POL probu.
Je zmíněna pouze jedna proba z každé skupiny, ale reprezentuje celou skupinu, tj. S5 reprezentuje S5, S55, S555, S5555, S55C, S55M.
Obr. 10 ukazuje frekvenci různých mutací zjištěnou v kmenech M. tuberculosis resistentních na rifampicin analyzovaných LiPa. Nomenklatura je stejná jako na Obr. 9. „Mix“ znamená, že ve vzorku byla přítomna směs kmenů. „Double“ znamená přítomnost dvou mutací v jednom kmenu.
Obr. 11 ukazuje parciální nukleotidovou sekvenci předpokládaného rpoB genu MAC kmenu ITG 926 (SEQ ID NO 69).
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Amplifikace rpoB genového fragmentu M. tuberculosis
Po extrakci nukleových kyselin z mykobakteriálních izolátů (buď kultivovaných, nebo přítomných v tělesných tekutinách nebo tkáních) byly použity 2μ1 produkty k amplifikaci relevantní části rpoB genu užitím jedné nebo více kombinací mezi 5-primery (PÍ(SEQ ID NO 30), P2, P3 (SEQ ID NO 31) a P7 (SEQ ID NO 41)) a 3-primery (P4 (SEQ ID NO 32), P5 (SEQ ID NO 33), a P6 a P8 (SEQ ID NO 42).
Sekvence těchto primerů je dána v Tabulce 2, Pl, P3, P4, P5, P7 a P8 jsou nové sekvence příměrů, popsané předkládaným vynálezem. P2 a P6 byly popsány dříve (Telenti et al., 1993a).
Tyto primeiy mohou být označeny značkou volby (tj. biotinem). Různé na primerech založené cílené amplifíkační systémy mohou být použity. Pro amplifikaci užitím PCR jsou podmínky použití popsané dále. Jednokolové amplifikace s primery Pl a P3 vyžaduje 35 cyklů 45 s/94 °C, 45
- 16 CZ 298020 B6 s/58°C, 45 s/72 °C. Jestliže je preferována společná PCR, byly užity primery druhého kola P3 a P4 a 25 cyklů (45 s/94 °C, 60 s/68 °C) bylo provedeno s počátečním 1 μΐ produktu prvního kola.
Jestliže byly použity P3 a P4 primery pro jednokolovou PCR, byl použit následující protokol cyklů: 30 cyklů 1 min/95 °C, 1 min/55 °C, 1 min/72 °C. Stejný protokol cyklů byl použit pro set primerů P2/P6.
PCR bylo obvykle provedeno v celkovém množství 50 μΐ obsahujícím 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCI (pH 8.3), 2,2 mM MgCl2 200 μΙ každého dNTP, 0,01 % želatiny a 1U Taq polymerázy.
Koncentrace primerů byla mezi 10 a 25 pmol/reakci.
Protože set primerů P3/P4 dávek signifikantně silnější signál po hybridizaci než set primerů P2/P6, byl pro všechny další hybridizační experimenty použit první set primerů. Set primerů P2/P6 byl použit pro sekvenční analýzu. Společná PCR užitím P2 a P6 jako zevních primerů a P3 a P4 jako vnitřních (biotinylovaných) primerů byla použita pouze pro přímou detekci v biologických vzorcích (expektoracích a biopsiích).
Délka amplifkovaných produktů, jako byla monitorována gelovou elektroforesou na agarose, je následující:
Set primerů P1/P5: 378 párů bází
Set primerů P3/P4: 257 párů bází
Set primerů P2/P6: 411 párů bází
Set primerů P7/P8: 339 párů bází
Příklad 2: Sekvencování rpoB genových fragmentů z kmenů M. tuberculosis.
DNA extrahovaná z mukobakteriálních izolátů, o kterých je víme, že jsou resistentní nebo sensitivní na rifampicin byla amplifikována za použití setu primerů P2/P6 (ze kterých P6 byla biotinylovaný na 5 - konci). Přímé sekvencování jednořetězcového PCR produktu bylo provedeno za použití streptavidinem potažených korálků a Taq Dye Deoxy Terminator/Cycle Sequencing kitu na ABI373A DNA sekvenátoru (Applied Biosystems, Forster City, CA, USA) podle doporučení výrobce. Primery použité pro sekvencování byly stejné jako ty, které byly použity pro amplifikaci (P2 nebo P6).
Jak bylo očekáváno, všechny sensitivní (= sensitivní v kultuře a sensitivní v LiPA vzorcích) sekvencované kmeny (7) dávaly divoký typ sekvence (žádná mutace). Ve většině resistentních kmenů mohly být mutace identifikovány. Většina z těchto mutací byla dříve popsána (Telenti et al., 1993a, 1993b, Kapur et al., 1994). Nicméně, 4 nové mutace jsou popsány v předkládaném vynálezu: D516G, H526C, H526T a R529Q (viz také Tabulka 1 (*)). Kompletní sekvence amplifikovaného rpoB fragmentu mutantní alely H526C (izolát ITG 9003) je ukázána na obr. 2 (SEQ ID NO 34) jako příklad.
Několik kmenů (3/180, viz tabulka 6) byly resistentní na rifampicin v kultuře, ale ukázaly divoký typ LiPA vzorku. Po sekvencování všechny tyto izoláty vykazovaly divoký typ rpoB sekvence, který potvrzoval výsledky hybridizace. Je proto možné, že pro tyto izoláty funguje jiný molekulární mechanismus resistence na rifampicin.
Příklad 3: Vývoj Line prob assay (LiPA) - proužků
Princip a protokol „line prob assay“ byl stejný jako byl popsán dříve (Stuyver et al., 1993) s několika výjimkami. Místo inkorporace biotinylované dUTP byly použity biotinylované prime
- 17 CZ 298020 B6 ty a hybridizace a přísné promývání bylo provedeno při 50 °C v 3 x SSC/20% deionizovaného formamidu.
Mutace v rpoB genu vedoucí k resistenci na rifampicin byly zejména lokalizovány v malé oblasti genu v rozsahu 67 nukleotidů (23 aminokyselinových kodonů). Alespoň 17 nukleotidů, rovnoměrně uložených v tomto regionu, je zahrnuto v mutacích, které vedou k nejméně 28 různých změnám aminokyselin. Taková komplexiva nukleotidových změn přenáší problémy pro detekci všech těchto změn v jednom hybridizačním kroku. V podstatě bude potřeba najedno mutované místo jedna proba divokého typu a na nukleotidovou změnu jedna mutantní proba specificky detekující tuto jednotlivou mutaci. Proto bude hybridizační test vyžadovat alespoň 35 sekvenčně specifických oligonukleotidových prob, které by měly učinit tento test komplexním k výrobě a užití, a následně komerčně méně atraktivním.
Proto byl jednotlivý přístup projektován pro užití pečlivě vybraných S-prob, kde každá zabírá více než jedno polymorfiní místo a přesahuje kompletní oblast důležitosti (viz obr. 1). Při tomto provedení může být s alespoň 10 prob divokého typu redukován na celkový počet pěti nebo šesti prob. Tyto proby byly pečlivě experimentálně upraveny tak, že přítomnost každé resistenci způsobující mutace v rpoB mutačním regionu vedla k jasně detekovatelnému snížení ve stabilitě hybridu mezi cílem a alespoň jednou z těchto prob za stejných hybridizačních a promývacích podmínek.
Protože touto kombinací prob mohou být všechny dosud popsané relevantní mutace detekovány, může být monitorována resistence na rifampicin v izolátech M. tuberculosis. Tento set prob je také schopný detekovat přítomnost nepopsaných mutací tj. TGC mutace na posici 526 kmenu ITG 9003.
Ačkoliv je - přesně vzato - přidání mutantních (R-) prob k selektovanému panelu prob divokého typu osbolentní, pro vědecké účely může být informativní přesná detekce přítomných bodových mutací. Proto byly projektovány 4 mutantní proby (R2, R4A, R4B, R5), které korespondují s nejčastěji se vyskytujícími mutacemi a které jsou dohromady schopné pozitivně identifikovat více než 70 % všech resistentních případů (viz obr. 10). Další mutantní proby (tj. Rl, R2B, R2C, R3, R4C, R4D, R4E, R5B, R5C) mohou být přidány k tomuto setu 4 prob tak, aby pozitivně identifikovaly většinu klinicky relevantních případů.
Přidání těchto prob také zvyšuje důvěryhodnost zkoušky, protože objevení se mutantní proby může nevyhnutelně vést ve zmizení proby divokého typu, jestliže není v kontaktu se smíšenou infekcí. V některých případech může být pro kliniku důležité rozlišit mezi různými mutacemi pravděpodobně přítomné. Tato situace se může vyskytnout například pro aminokyselinovou pozici 516. Jestliže se normálně (divoký typ) přítomná aminokyselina (kyselina aspartátová) změní na Valin nebo Tyrosin, je indukována vysoká nebo střední úroveň resistence na rifampicin; nicméně, nepublikovaná data zřejmě ukazují, že sensitivita na rifambutin je zachována. Proto, pro infekci kmeny s touto mutací bude rifambutin stále efektivní zatímco rifampiicin nikoliv. Totéž může platit pro kodon 511, ale, podle našich znalostí, je zde pouze jedno mutační místo, pro které se může lišit efekt rifampicinu a rifambutinu; obvykle jsou kmeny resistentní na rifampicin také resistentní na rifambutin.
Pro vývoj LiPA proužků pro detekci přítomnosti mutací generujících resistenci na rifampicin (a/nebo na rifambutin) u M. tuberculosis bylo syntetizováno celkem 36 oligonukleotivých prob a byly hodnoceny v reverzním hybridizačním testu. Sekvence těchto prob je ukázána v Tabulce 2A (divoký typ a mutační proby). První testovaný set prob byl: Sl, S2, S3, S4, S5, R2, R4A, R4B, a R5. Za podmínek užitých pro reverzní hybridizaci nefungovala většina prob tak, jak bylo očekáváno, a musely být vloženy modifikace, které vedly k syntéze a hodnocení následujících dodatečných prob: Sil, S33, S44, S4444, S5555, R44A, R444A, R444B a R55. Z celkového panelu prob byly vybrány pro další použití proby vykazující nej optimálnější vlastnosti s ohledem na specificitu a sensitivitu, za stejných experimentálních podmínek. Preferované proby se
- 18 CZ 298020 B6 sekvencí divokého typu (S-proby), které společně přesahují celý rpoB region zájmu, jsou: Sil S2, S33, S444, a S55 nebo S5555 (viz Tabulku 2). Resistence bude detekována ztrátou hybridizačního signálu s jakoukoliv z těchto S-prob.
Preferované mutační proby (R-proby) jsou: R2, R444A, R444B a R55 (viz. Tabulka 2). V některých případech resistence může být ztráta hybridizačního systému s S probami doprovázena pozitivním hybridizačním signálem s korespondující R-probou.
Jako příklady jsou některé rpoB mutace ajejich korespondující LÍPA vzorky ukázány na Obr. 9.
Ačkoliv se proby ze stejné skupiny (tj. proby S4, S44, S444 a S4444) liší od sebe pouze jemně, jejich hybridizační charakteristiky se mohou lišit značně. Toto je ilustrováno jako příklad v experimentu, ve kterém je srovnáno chování prob S44 a S4444 použitím PCR produktů pocházejících ze dvou kmenů M. tuberculosis (ITG 8872 a ITG 9081), které oba vykazují divoký typ sekvence v cílovém regionu prob S44 a S4444. Rozdíl mezi oběma probami je ukázán níže:
S44 GGTTGACCCACAAGCGCCGA
S4444 TTGACCCACAAGCGCCGACTGTC
Proba S44 byla vybrána na teoretickém základě ze znalostí genové sekvence (Telenti et al., 1993). Tato proba by teoreticky měla být nejlepší probou pro rozlišení chyb v CAC - kodonu (podtržený), protože tento kodon je centrální částí proby. Nicméně, v protikladu k obecným pravidlům, chování proby S4444 se ukázalo být signifikantně lepší (jak je popsáno v následujícím experimentu).
Obě proby byly aplikovány do nitrocelulosových proužků v rozdílném množství (2.4, 1.2 a 0.6 pmol/proužek). Po fixaci a blokování proužků byly proby hybridizovány biotynylovanými PCR fragmenty (z kmenů IGT 8872 a ITG 9081), jak bylo popsáno dříve. Výsledky jsou ukázány na Obr. 3.
Za použitých hybridizačních podmínek (3 X SSC, 20% deionizovaný formamid, 50 °C) jsou signály získané s probou S44 velmi slabé. Na druhou stranu generuje proba S4444 velmi silné a důvěryhodné signály. V důsledku toho je proba S4444 preferována před S44 pro použití na LÍPA - proužcích. Tento dramatický efekt nemůže být přisouzen pouze rozdílu v délce obou těchto prob, ale jejich umístění se také zdá být důležitým. Nejpravděpodobněji silně ovlivňuje hybridizační charakteristiky sekundární struktura cílového regionu proby.
Na obr. 4 jsou uvedeny výsledky jiného experimentu, ve kterém je chování obou prob srovnáváno v kontextu s jinými probami. Oba proužky A a B jsou zpracovány identicky užitím amplifíkovaného produktu pocházejícího ze kmenu ITG 8872. Oba proužky jsou téměř identické s výjimkou toho, že proužek A obsahuje probu S44 (0.65 pmol) a proužek B probu S4444 (0.1 pmol) a pořadí prob aplikovaných na proužek je odlišné. Na proužku A je proba S44 negativní, zatímco na proužku B je proba S4444 jasně pozitivní, ačkoliv v obou případech je perfektní spárování mezi cílem a probou a v obou případech byly očekávány pozitivní výsledky.
Tyto výsledky jasně ilustrují, že projektování prob, zejména za pevně daných podmínek reverzního hybridizačního formátu (stejné podmínky pro každou probu) není jednoduché a proby musí být pečlivě zhodnoceny před použitím v reverzně hybridizačním formátu.
Obecně můžeme prohlásit, že vhodné proby nemohou být vždy odvozeny na teoretickém základě za znalosti genové sekvence.
- 19 CZ 298020 B6
Ačkoliv mezi testovanými izoláty v předkládaném vynálezu to nebylo detekováno, může přítomnost silentních mutací způsobit nárůst resistentních vzorků na proužcích (ztráta jedné proby divokého typu), ačkoliv je kmen sensitivní. Dosud byla popsána pouze jedna silentní substituce (v kodonu 528: CGT...CGT, Telenti et al., 1993a). Tato mutace vedla kdestabilizaci hybridu s probou S-4444. Nicméně přidáním proby specifické pro silentní mutaci (Proba SIL-1, Tabulka 2) do proužku mohla být tato silentní mutace odlišena od resistenci indukujících mutací a bylo možné předejít chybné interpretaci pozorovaných vzorků. Navíc, SIL-proby mohou být aplikovány na proužky ve stejném umístění jako korespondující S-proby (smíšené proby). při tomto postupu nebyla pozorována žádná ztráta hybridizačního signálu v důsledku silentní mutace.
Aby se detekovaly inserční mutace udělujících resistenci na rifampicin 514insF a 514insFM (viz Obr. 1), byly projektovány dvě nové proby divokého typu S6 a S66, jejichž sekvence je reprezentována na Tabulce 2. Hybridizace s nukleovou kyselinou pocházející ze kmenů nesoucích tyto inserění mutace vedla k absenci hybridizačního signálu s S6 a S66 (viz. také Tabulku 1).
Aby se pozitivně identifikovalo více mutací než je detekováno setem R2, R4A, R4B, a R5 bylo projektováno množství dalších R-prob, které mohou být přidány do LiPa proužků za použití stejných hybridizačních a promývacích podmínek. Spolu s výše zmíněnými R-probami dovolující adiční R-proby (Rl, R2B, R2C, R3, R4C, R4D, R4E, R4B, R5C) pozitivní identifikace mutací nejčastěji nacházených v kolekci kmenů testovaných v předkládané aplikaci.
Příklad 4: Proba specifická pro komplex M. tuberculosis „Line prob assay“ byla vyvinut atak, aby umožňovala simultánní detekci mutací způsobujících resistenci na rifampicin přímo spojenou s detekcí patogenu in času M. tuberculosis.
Protože schopnost simultánně detekovat přítomnost M. tuberculosis a přítomnost nebo absenci genů nebo mutací způsobujících lékovou resistenci je nesmírně výhodná, bylo cílem vyvinout M. tuberculosis probu obsahující ve stejném PCR fragmentu alespoň jede relevantní markér resistence, který může být identifikován. Proto byly sekvenovány rpoB geny non-M. tuberculosis izolátů. Těmito organismy byly: M. paratuberculosis 316F, M. avium ITG 5887, M. scrophulaceum, ITG 4979, a M. kansasii ITG 498. Sekvence korespondujících rpoB genových fragmentů jsou ukázány na Obr. 5 až 8, v příslušném pořadí. Navíc, sekvence rpoB genových fragmentů M. leprae a M. intracelulare byly známé z literatury (Honoře and Cole, 1993, Guerrero et al., 1949). Srovnání těchto sekvencí s rpoB genovou sekvencí M. tuberculosis umožňuje ohraničení specifického regionu (mimo region odpovědný za resistenci) v rpoB genovém fragmentu, ze kterého se jeví proveditelným vývoj prob potenciálně specifických pro M. tuberculosis. Oligonukleotidová proba (dále označována jako MT-POL-1) derivovaná z tohoto regionu s následující sekvencí:
GGA CGT GGA GGC GAT CAC ACC (SEQ ID NO 23) byla dále hodnocena s ohledem na její sensitivitu a specificitu hybridizací na LiPa proužcích. Amplifikační a hybridizační podmínky byly stejné jako ty, které jsou popsány výše. Výsledky jsou sumarizovány v Tabulce 3. Navíc ke čtyřem kmenům M. tuberculosis uvedeným v Tabulce 3 bylo testováno 521 dalších M. tuberculosis uvedených v Tabulce 3 bylo testováno 521 dalších M. tuberculosis izolátů, všechny izoláty dávaly pozitivní hybridizační signál. Zjevně, také M. bovis kmeny hybridizovaly s probou, ale pro tento účel není klinicky relevantní rozlišení mezi M. tuberculosis a M. bovis. Fakticky v této aplikaci může být termín „M. tuberculosis“ nahrazen „M. tuberculosis komplex“, který označuje M. tuberculosis s.s., M. bovis, M. africanum a M. microti, bez narušení signifikance výsledků.
Ačkoliv při užití setu primerů popsaných v příkladu 1 mohou být PCR produkty získány z DNA některých jiných Mycobacterium druhů a i přes některé geneticky nepříbuzné mikroorganismy, které mohou být také přítomné v respiračním traktu, nevykazovaly žádné z těchto bakterií hybridizací s vybranou MT-POL-1 probou. Na závěr můžeme tvrdit, že selektovaná proba je
- 20 CZ 298020 B6 vysoce specifická pro M. tuberculosis komplex kmenů na 100% sensitivní pro M. tuberculosis. Také jiné proby z tohoto regionu mohou být užitečné pro specifickou detekci M. tuberculosis komplexu kmenů, jako je: MT-POL-2, MT-POL-3, MT-POL-4 a MT-POL-5 (viz Tabulka 2).
Stejným způsobem mohou být následující proby použity k rozlišení M. avium, M. paratuberculosis, M. scrophulaceum, M. kansasii, a M. leprae kmenů od sebe a od jiných mykobakterií: MA-POL-1, MP-POL-1, MK-POL-1, MI-POL-1 a ML-POL-1 v příslušném pořadí (viz Tabulku 2B).
Příklad 5: Hodnocení LiPa proužků pro M. tuberculosis
LÍPA proužky byly připraveny přenesením následujících prob (navíc k pozitivní kontrolní linii): MT-POL-1, Sil, S2, S33, S4444, S5555, R2, R444A, R444B, R55.
Proužky byly hybridizovány s PCR produkty z M. tuberculosis kmenů, pro které byla určena relevantní rpoB genová sekvence. Některé reprezentativní výsledky jsou shrnuty v Tabulce 4.
Výsledky hybridizace kompletně korelují s výsledky sekvencování, ukazují atak, že užité proby mohou rozlišovat na úrovni jednotlivého chybného umístění. Každá mutace byla vyhledávána pro možnost detekce buď absencí jedné z prob divokého typu (S-proby), nebo absencí proby divokého typu spolu s přítomností korespondující mutantní proby (R-proby). V dalším případě mohla být přesná mutace, která byla přítomná, odvozena z výsledků hybridizace. Nicméně, znalost přesné mutace, která je přítomná, není nezbytná k určení toho, jestli vytváří kmen resistentním na rifampicin či nikoliv, protože každá mutace je zkoušena na vytváření resistence. Sensitivní kmeny, tj. kmeny bez mutace v relevantní části rpoB genu, dávají pozitivní reakci na všechny S-proby, zatímco všechny R-proby jsou negativní (= wt-vzorky).
Příklad 6: Přímá detekce kmenů M. tuberculosis a resistence na rifampicin v klinických vzorcích
Šedesát osm klinických vzorků pocházejících z různých geografických oblastí (13 a 35 vzorků sputa z Belgie a Rwandy a 20 biopsií lymfatických uzlin z Burundi), všechny kultivačně pozitivní na M. tuberculosis a přechovávané při -20 °C, bylo analyzováno. Příprava vzorků pro amplifikaci byla založena na postupu podle Boom et al. (1990) modifikovaného De Beenhouwerem et al. (doloženo). „Nested“ PCR přístup pro relevantní region rpoB genu byl proveden s biotynylovanými vnitřními primery (P3 a P4). Po termálním cyklování byl amplifikovaný produkt indukován s LiPA proužky. Resistence na rifampicin byla určena na Lówenstein-Jensen užitím proporční metody podle Canetti et al. (1963). Pro resistentní kmeny byla určena MIC (Minimální Inhibiční Koncentrace) rifampicinu na 7H10 agaru (Heifets, 1988).
Mikroskopicky bylo 20 (29,4%) vzorků negativních, 15 (22,1 %) slabě pozitivních (1+ nebo méně podle škály Američan Thoracic Society) a 33 (48,5 %) silně pozitivních (> +2) při barvení Ziehl-Nielsenově.
LiPA detekovala sensitivitu na rifampicin u 49 vzorků (pouze M. tuberculosis a proby divokého typu pozitivní) a resistenci u 19 vzorků (proba M. tuberculosis pozitivní, jedna chybějící proba divokého typu a eventuálně jedna mutační proba pozitivní). Testování citlivosti na rifampicin in vitro potvrdilo tyto výsledky se třemi výjimkami. Pro všechny sensitivní kmeny byly pozorovány sensitivní vzorky prob ukazujíc tak, že možné silentní mutace nebyly detekovány v této sérii. Všechny kmeny vykazující vzorky resistence byly konvenčními technikami shledány resistentními. Pro tři vzorky (od tří pacientů s mohutnou lékovou resistencí ze Rwandy) byly PCR-LiPa získány sensitivní vzorky, zatímco kultivace ukázala resistenci (MIC > 2 pg/ml na 7H10). Sekvencování rpoB regionu těchto kmenů potvrdilo divoký typ genové sekvence, pravděpodobně tak naznačujíc odlišný mechanismus resistence na rifampicin v těchto případech nebo mutaci
- 21 CZ 298020 B6 v jiné části rpoB genu. Je také zajímavé zmínit, že „nested“ PCR systém dával pozitivní výsledky pro všechny testované vzorky pozitivní v kultuře včetně 20 Ziehl-Nielsen negativních vzorků, v jiném experimentu (data nejsou předložena) obsahujícím 17 vzorků sputa v nátěru negativních z klinicky suspektních případů tuberculosy negativních v kultuře nebyl získán žádný signál LiPa systémem, naznačujíc tak, že infekce nebyla pravděpodobně způsobena M. tuberculosis.
V následujícím experimentu byla testována na LiPA velká kolekce klinických vzorků z různých geografických oblastí. Výsledky jsou ukázány v Tabulce 5. Ze 137 nalezených resistentních kmenů může být dosti velké množství přisouzeno jedné z mutací reprezentovanými R-probami (R2, R4A, R4B, R5). Zajímavé je, že některé mutace se zdají být častějšími v některých zemích ve srovnání s jinými (tj. v Tunisu a Egyptě: R4B (=H526D), ve Rwandě: R5 (S53L)). To může eventuálně vést k různým provedením testu v různých zemích.
V celkovém počtu 213 kmenů resistentních na rifampicin analysovaných LiPA v předkládaném vynálezu mohlo být 151 (71 %) přisouzeno mutacím S531L, H526D, D516V nebo H526Y a mohly tak být detekovány pozitivním signálem s příslušnými probami R5, R4B, R2 a R4A (viz. obr. 10).
V celkovém počtu 180 kmenů, které byly analyzovány jak kultivačně, tak LiPA, byla správná identifikace (sensitivní/resistentní) provedena u 164 (=91,1 %) kmenů (viz. Tabulka 6). U tří resistentních kmenů ukázaly LiPA výsledky a sekvencování divoký typ rpoB genového fragmentu, což naznačuje, že mechanismus resistence na rifampicin nemůže být přisouzen mutacím ve zkoumané části rpoB genu.
Třináct ze 180 analyzovaných kmenů byly resistentní vLiPA, ale jevily se být sensitivními kultivačně. Nicméně, po rekultivaci 2 z těchto 13 kmenů v syntetickém 7H11 médiu místo tradičního Lowenstein Jensenova média se ukázaly být v každém případě resistentní na rifampicin. Tento dosud nepublikovaný objev ukazuje, že konvenční Lowenstein Jensenovo médium není doporučováno pro určení antibiotické citlivosti mykobakterií (pravděpodobně díky přítomnosti stopového množství antibiotik, které je nacházeno v komerčně dostupných vejcích užívaných k přípravě Lowenstein Jensenova média). Proto procento diskrepantních kmenů, které jsou resistentní v LiPA, ale sensitivní v kultuře (v tomto případě 13/180 = 7,2 %), lze očekávat o mnoho nižší (a pravděpodobně 0 %), je-li kultivace provedena na syntetickém medu jako je 7H11.
Je zajímavé, že většina izolátů resistentních na rifampicin (>90 %) zkoumaných v předkládaném vynálezu byla navíc resistentní na izoniazid, a tak mnohotně resistentní na léky (definice mnohotné léky resistence = resistence alespoň na izoniazid a rifampicin). Resistence na rifampicin může proto být považována za potenciální markér pro mnohotnou lékovou resistenci, a výše zmíněný LiPA test může proto být důležitým nástrojem pro kontrolu mnohotně lékově resistentní tuberculosy.
Závěrem výše popsaná metoda dovoluje korektní identifikaci M. tuberculosis a simultánní detekci resistence na rifampicin přímo v klinických vzorcích bez kultivace. Umožňuje snadnou detekci resistence na rifampicin přímo v klinických vzorcích za méně než 24 hodin.
Příklad 7: Detekce resistence na rifampicin u M. leprae
Výše popsaný přístup detekce může také být aplikován na detekci M. leprae přítomného v biologických vzorcích spojenou s detekcí restitence na rafimpicin. Sekvence rpoB genu byla popsána dříve Honoré and Cole (1993). Ti pouze identifikovali omezený počet mutací odpovědných za resistenci na rifampicin u M. leprae. Může být opodstatněné tvrdit, že, stejně jako u M. Tuberculosis, mnoho dalších mutací může způsobovat resistenci na rifampicin u M. leprae, a že mnoho z těchto mutací bude lokalizováno v dosti omezené oblasti rpoB genu, korespondující s „mutačním regionem“ popsaným dříve v této aplikaci.
- 22 CZ 298020 B6
Proto je vybrán set prob divokého typu, které přesahují domnělý mutační region rpoB genu M. leprae (viz. Tabulka 2B):
ML-S1
ML-S2
ML-S3
ML-S4
ML-S5
ML-S6 (SEQ ID NO 58) (SEQ ID NO 59) (SEQ ID NO 60) (SEQ ID NO 61) (SEQ ID NO 62) (SEQ ID NO 63).
Resistence na rifampicin je odhalena absencí hybridizace s alespoň jednou z těchto ML-S prob. Tento set ML-S prob bude detekovat mutace způsobující resistencí na rifampicin v tomto regionu, ačkoliv sekvence těchto mutací nebyla doposud specifikována.
Výše zmíněné ML-S proby byly pečlivě projektovány takovým způsobem, aby mohly být použity za stejných hybridizačních a promývacích podmínek. Totéž platí pro druhově specifickou ML-POL-1 probu, se kterou ML-S proby mohou být kombinovány, aby dovolily simultánní detekci M. leprae a jeho resistence na rifampicin.
Všechny proby zmíněné v tomto příkladu jsou obsaženy ve stejném rpoB genovém fragmentu M. leprae, který může být získán PCR za použití setu primerů vybraného ze MGRPO-1 nebo MGRPO-2 (5-primery) a MGRPO-3 nebo MGRPO-4 (3 primery).
- 23 CZ 298020 B6
Tabulka <u
| O Ί 44 0> 4-» Φ x> | | Mutant proba | 1 | 1 | I | 1 | 1 | 1 | 1 | l | 1 | Ol | 1 | |
| > o £> O | <1 a | co | CO | co | 1—< »»||J CO | CO | CO | Ό CO | S1-S2- S6 | CO 1 C4 CO | OJ 00 | Ol 00 | Ol 00 |
| CLt ' | VV | Pro | L< | Thr | Leu | ! Lys | Phe | 2 <U E Σ | His | <1 | Tyr | ' Val | Glu j |
| sekvence | s | O y | CGG | ACC | < H O | í AAA | TTC | TTC ATG | <1 | <1 | TAC | GTC | a < o |
| mutační | ♦ r-H 44 » C | o | o | o | E— | < | TTC | TTC ATG | <1 | <3 | E- | E- | o |
| < < | Leu | Leu | Ser | Gin | Gin | - | 1 | c ϋ a x λ jí O £ S < | a a VI —< < o | I Asp | Asp | Asp | |
| divokého typu | c O Ό O 44 | 1 CTG | CTG | AGC | CAA | < < Ol | 1 | 1 | 1 AA TTC ATG G | GAC CAG i | O < Ol | U <1 o | U < O |
| sekvence | —l 44 3 C | (— | H | < | o | 1 | AA TTC ATG G | GAC CAG | o | < | o | ||
| «9 ja o | kodon 1 | r-~< io | 512 | cn m | cn V) | 514 | 514 | 514-516 | 516-517 | 516 | 516 | 516 | |
| r—< o a | rH 34 Z | Ch | Gh | Γ4 | ΙΓΊ | o | Ό | 15-23 1 i | 23-28 | ΓΊ Ol | XT Ol | 04 | |
| zkr. | L511P ... ... | L511R | S512T | Q513L | CO O | 514 ins F | 514 ins FM | Δ514-516 | Oun I Ό <1 | II D516Y | D516V | D516E |
- 24 CZ 298020 B6
| J | 1 | R444A | R444B 1,— | l | 1 | l | 1 | - | 1 | 1 | R55 | 1 | |||||
| rM OQ | ’C4 | ťN <Z> | : S33 | S4444 | S4444 | S4444 | ' S4444 | S4444 | S4444 | S4444 | , S4444 _ | xt Mxt OO | S4444 | tn tn tn tn cn | S5555 | S5555 | S5555 |
| >> 6 | <1 | <1 | Leu | u, >·» H | Asp | Asn | Cys | < | Pro | Gin | Leu | Thr | Gin | : Gin | Leu | Trp | L>> H |
| GGC | <1 | <1 | O P | TAC | GAC | AAC | TGC | í CGC | U Ol o | O < < | CTC | ACC | CAA | Φ a | [ TTG | TGG | t-w E- |
| o | <1 | <1 | H | t— | O | < | O | o | o | o | 1 AC | < | CA | H | O | < | |
| Asp | Gin Asn | Asn | Ser | His ___ | (A £ | His | <Λ re | His | (Λ • ·—< | His | His | His | Li < | Ser | Ser | Ser | Ser |
| GAC | CAG AAC j | AAC | O y | CAC | CAC | CAC | CAC | CAC | CAC | U < O | CAC | o <1 d | CGC | O d H | TCG | O y | TCG |
| < | CAG AAC i | AAC i | o | o | u | O | CA | < | < | o | < | CA j | O | TC | O | o | CG |
| xO tn | 517-518 | 518 : | 522 | 526 | XO CM *n | VO CN oo | \o CM tn | 526 | xO CM tn | \o CM tn | 526 | 526 | σχ CM tn | m tn | m tn | cn tn | 531 |
| CM | 26-31 | cn cA CM | CM Tt | m ΜΊ | m tn | ΓΌ tn | ' 53-54 | Tt MO | Tt tn | VO oo | Tf<n | 53-54 | <n xO | GT\ XC 1 OO XC | CA | CA | O ΓcA XC |
| í-*' o Ό OO Q | Δ517-5Ι8 | OO ICl <1 | S522L | X0 ΓΜ tn X | H526D | H526N | ♦ o o r4 vo ΣΓ | H526R | H526P | H526Q | H526L | í“ xo ΓΜ tn X | ♦ o ca CN 00 04 | S531Q | S531L | S531W | S53IY |
| 1 | |
| •η | *n |
| tn | tn |
| tn | tn |
| tn | un |
| CC | ÍO |
| cn tn | o 1— |
| o | 0- |
| H | O |
| O | |
| O | |
| Γ” c | o |
| u. | ~3 |
| <υ | <L> |
| (Λ | |
| Ol | o |
| Ol | f Ί |
| H | o |
| CG | H |
| cn | |
| cn | cn |
| tn | tn |
| o | |
| tn | |
| □X O | r-~ |
| O | pXi |
| m | |
| cn | cn |
| <n | tn |
| t/2 | l—J |
Tabulka 2
Příměry a proby vybrané z rpoB genu
2A: M. tuberculosis
Primery SEQ ID NO
PÍ GAGAATTCGGTCGGCGAGCTGATCC30
P2 TACGGTCGGCGAGCTGATCC
P3 GGTCGGCATGTCGCGGATGG31
P4 GCACGTCGCGGACCTCCAGC32
P5 CGAAGCTTGACCCGCGCTACACC33
P6 TACGGCGTTTCGATGAACC
P7 CGGCATGTCGCGGATGGAGCG41
P8 CGGCTCGCTGTCGGTGTACGC42
Proby spécies-specifické proby
MT-POL-1 GGACGTGGAGGCGATCACACC23
MT-POL-2 CGATCACACCGCAGACGTTGATC24
MT-POL-3 CATCCGGCCGGTGGTCGC25
MT-POL-4 CTGGGGCCCGGCGGTCT26
MT-POL-5 CGGTCTGTCACGTGAGCGTG27 proby divokého typu
CAGCCAGCTGAGCCAATTCATG1
Sil CAGCCAGCTGAGCCAATTCAT2
TTCATGGACCAGAACAACCCGC3
AACCCGCTGTCGGGGTTGA4
S33 AACCCGCTGTCGGGGTTGACC5
GTTGACCCACAAGCGCCGA6
S44 GGTTGACCCACAAGCGCCGA7
S444 TTGACCCACAAGCGCCGACTGT43
S4444 TTGACCCACAAGCGCCGACTGTC8
GACTGTCGGCGCTGGGG9
S55 CGACTGTCGGCGCTGGGGC10
S555 GACTGTCGGCGCTGGGGCC39
S5555 GACTGTCGGCGCTGGGGC40
S55C GCCCCAGCGCCGACAGTCG44
S55M CGACTGTCGGCGTTGGGGC45
TGAGCCAATTCATGGACCAGAA11
S66 CTGAGCCAATTCATGGACCAGA12
SIL-I CCACAAGCGTCGACTGTCG13
- 27 CZ 298020 B6
| mutant | proby | |
| R2 | AATTCATGGTCCAGAACAACCCG | 14 |
| R4A | GGTTGACCTACAAGCGCCGA | 15 |
| R44A | GGGTTGACCTACAAGCGCCGA | 16 |
| R444A | TTGACCTACAAGCGCCGACTGTC. | 17 |
| R4B | GTTGACCGACAAGCGCCGA | 18 |
| R44B | GGTTGACCGACAAGCGCCGA | 19 |
| R444B | TTGACCGACAAGCGCCGACTGTC | 20 |
| R5 | CGACTGTTGGCGCTGGGG | 21 |
| R55 | CGACTGTTGGCGCTGGGGC | 22 |
| R1 | CAGCCAGCCGAGCCAATTCAT | 46 |
| R2B | AATTCATGTACCAGAACAACCCG | 47 |
| R2C | ATGGACCAGAACCCGCTGTCG | 48 |
| R3 | AACCCGCTGTTGGGGTTGACC | 49 |
| R4C | rrGACCCGCAAGCGCCGACTGTC | 50 |
| R4D | TTGACCCCCAAGCGCCGACTGTC | 51 |
| R4E | TTGACCTGCAAGCGCCGACTGTC | 52 |
| R5B | CGACTGTGGGCGCTGGGGC | 53 |
| R5C | ACTGTGGGCGCCGGGnrrr | * |
2B: jiné mykobakteriální druhy primery
MGRPO-1
MGRPO-2
MGRPO-3
MGRPO-4
CCAAAACCAGATCCGGGTCGG
GTCCGGGAGCGGATGACCAC
GGGTGCACGTCGCGGACCTC
GGGCACATCCGGCCGTAGTG proby
| MP-POL-1 | CATCCGTCCCGTCGTGGC | 28 |
| MA-POL-l | CATCCGTCCAGTCGTGGC.G | 29 |
| MS-POL-1 | GCCGGTCGTGGCCGCG | 38 |
| MK-POL-l | AGCGCCGGCTTTCGGCGC | 55 |
| ML-POL-1 | GA CGCTGATCAATATCCGTCCGG | 57 |
| MI-POL-1 | ATCCGGCCGGTCGTCGCC | 68 |
| ML-Sl: | CAGCCAGCTGTCGCAGrrCATG | 58 |
| ML-S2: | GTTCATGGATCAGAACAACCCTC | 59 |
| ML-S3: | AACCCTCTGTCGGGCCTGACC | 60 |
| MI.-S4: | ACCCACAAGCGCCGGCTGTC | 61 |
| ML-S5: | GGCTGTCGGCGCTGGGC | 62 |
| ML-S6: | CTGTCGCAGTTCATGGATCAGA | 63 |
- 28 CZ 298020 B6
Tabulka 3 : Hybridizační výsledky získané s probou MT-POL-1
| Species | kmen | MT-POL-1 | |
| 1 | M. tuberculosis | ATCC 27294 | 4- |
| 2 | M. tuberculosis | NCTC 7417 | + |
| 3 | M. tuberculosis | ITG 8017 | + |
| 4 | M. tuberculosis | ITG 9173 | |
| 5 | M. bovis | BCG (Kopen) | + |
| 6 | M. bovis | patient isolate | 4 |
| 7 | M. avium | ITG 5872 | - |
| 8 | M. avium | ITG 5874 | |
| 9 | M. intracellulare | ITG 5913 | |
| 10 | M. intracellulare | ITG 5918 | |
| 11 | M. paratuberculosis | 2 E | |
| 12 | M. kansasii | ITG 4987 | |
| 13 | M. marinum | ITG 7732 | |
| 14 | M. scrofulaceum | ITG 4988 | |
| 15 | M. gordonae | ITG 4989 | |
| 16 | Bordetella pertussis | NCTC 8189 | |
| 17 | Bordetella parapertussis | NCTC 7385 | |
| 18 | Bordetella bronchiseptica | NCTC 8761 | |
| 19 | Moraxella catarrhalis | LMG 5128 | |
| 20 | Moraxella catarrhalis | LMG 1133 | |
| 21 | Móraxella catarrhalis | LMG 4200 | |
| 22 | Moraxella catarrhalis | LMG 4822 | |
| 23 | Haemophilus influenzae | NCTC 8143 | |
| 24 | Haemophilus influenzae | ITG 3877 | |
| 25 | Streptococcus pneumoniae | H90-11921 | |
| 26 | Streptococcus pneumoniae | H91-04493 | |
| 27 | Streptococcus pneumoniae | H90-11780 | |
| 28 | Pseudomonas cepacia | ATCC 25609 | |
| 29 | Acinetobacter calcoaceticus | ATCC 23055 | |
| 30 | Staphylococcus aureus | 6420 | - |
| 31 | Staphylococcus aureus | 6360 | - |
| 32 | Pseudomonas aeruginosa | 5682 | - |
| 33 | Pseudomonas aeruginosa | 5732 | - |
- 29 CZ 298020 B6
Φ
| o to | MM | Μ Ή W Ή Μ Ή Μ Ή M | |||||
| G G | G | G | C G | G | G G G | ||
| +> | c | 4-> | 4-» | 4-> -H | P | +>+>+* | |
| v | > | C G | a | c | G q | C | G C C |
| u | •tm | φ φ | φ | Φ | φ φ | Φ | Φ Φ Φ |
| CL | 4-» | 4-1 4_> | +> | +-* | 4> 4-> | -P | 4-J4-> 44 |
| •*M | V> M | w | ΙΛ | v> tn | W | WWW | |
| <D | N | ··“* ·»-< | •w | •w | •M -rM | •Mí *ιΜ -iH | |
| G | N N | N | N | N N | N | N N N | |
| Φ | Φ 0) | Φ | Φ | Φ Φ | <D | Φ φ Φ | |
| W | íh | M 44 | P | M u μ | |||
| E |
Tabulka 4: Interpretace LiPA-výsledků pro detekci rifampicínové rezistence v M.tuberculosis
| Φ υ <0 -ρ 5 Ρ » | (ověřeno sekvenování | - ίζ ΓΏ ’ί -1 C cvo e c oo in Gin Q ^ · X I w |
| í w -< o -4 J > | *4 — ri m < cO mo >οοοοΏοο(Λμ-χ±οοϊ} | |
| Hybridizační výsledky s probami | R55 | 1 1 1 1 1 1 1 1 1 + |
| R444B | 1 1 1 1 1 1 1 + 1 1 | |
| R444A | 1 1 1 1 1 1 + 1 1 1 | |
| 04 | 1 1 1 + 1 1 1 ί 1 1 | |
| un un co | + + + + + + + + 1 1 | |
| S4444 | + + + + + 1 1 1 + + | |
| ΓΊ m CO | + + + + 1 + + + + + | |
| Ol tz> | + + i 1 + + + + + + | |
| 00 | + 1 + + + + + + + + | |
| MT- POL-1 | ++++++++++ |
- 30 CZ 298020 B6
Tabulka 5: Výskyt různých mutací v m.tuberculosis kmenech, pocházejících z různých zemí
Tabulka 6: Porovnání LiPA výsledků proti stanovení rifampicinové rezistence v kultuře M.Tuberculosis
| Kultura | |||
| S | R | ||
| lípa | S | 71 | 3 |
| R | 13 | 93 |
Odkazy:
Asseline U, Delarue M, Lancelot G, Toulme F, Thuong N (1984) Nucleic acidbinding molecules with high afinity and base sequence specificity : intercalanting agents covalently linked to oligodeoxynucleotides. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81(11):3297-301.
Banerjee A., Dubnae E., Quemard A., et al. inhA, a gene econding a target for Izoniazid and Entianamide in Mycobacterium tuberculosis. Science 1994; 263: 227-30.
Barany F., Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase. Proč. Nati Acad Sci USA 1991; 88: 189-193.
Bej A. Mahbubani M, Miller R, Di Cesare J. Haff L, Atlas R. Mutiplex PCR amplification and immobilized capture probes for detection of bacterial pathogens and indicators in water. Mol Cell Probes 1990; 4:353-365.
Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin Microbiol 1990; 28: 495-503.
Canetti G., Froman S., Grosset J., et al. Mycobacteria: laboratory methods for testing drug sensivity and resistance. Bull WHO 1963; 29; 565-79.
Claridge J.E., Shawar R.M., Shinninck T.M. and Plikaytis B.B. Large-scale use of polymeráze schain reaction fof detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. J Clin Microbiol 1993; 31: 2049-56.
Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nátuře 1991; 350: 91-92.
Culliton B. Drug resistant Tb may bring epidemie. Nátuře 1992; 356: 473.
Douglas J., Steyn L.M. A ribosomal gene mutation in streptomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis izolates. J. infect. Dis. 1939; 167: 1505-1506.
Duck P. Probe amplifier systém based on chimeric eyeling oligonucleotides. Biotecniques 1990; 9:142-147.
Finken M., Kirschner P., Meier A., Wrede A., and Bottger E. Molecular basis of streptomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis: Altemations of the ribosomal protein S12 gene and point mutations within a functional 16S ribosomal RNA pseudoknot. Mol. Microbiol 1993; 9: 1239—46.
Guatelli J. Whitfierld K, Kwoh d, Barringer K, Richman D, Gengeras T. Izothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proč Nati Acad Sci USA 1990; 87: 1874-1878.
- 32 CZ 298020 B6
Guerrero et al. Evaluation of the rpoB gene in rifampicin susceptible and resistant M. aviun and M. intracelullulare, J.A ntimicrob. Chemotherapy 1994: 33: 661-663.
Heifets L. Qualitative and quantitative drug-susceptibility test in mycobacteriology. Pulmonary perspective. Am Rev Respir Dis 1988; 137: 1217-122.
Honoře N. and Cole S. Molecular basis of rifampicin resistance in M. leprae Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1939: 37: 414—418.
Kapur V., Li L., Iordanescu S., et al. Characterization by automated DNA sequencing of mutations in the gena (rpoB) encoding the RNA polymeráze β subunin in rifampicin resistant Mycobacterium tuberculosis strains from New York City and Texas. J. Clin. Microbiol. 1994; 32: 1095-1098.
Kwoh D, Davis G., Whitfield K, Chappelle H., Dimichele L, Gingeras T. Transcription-based amplifícation systém and detection of amplifíed human immunodefíciency virus type 1 with a baed-based sandwich hybridization formát. Proč Nati Acad Sci USA 1989; 86: 1173-1177.
Kwok S, Kellogg D, McKinney N, Spasic D. Goda L, Levenson C, Sinisky J. Effects of primertemplate mismathches on the polymeráze chain reaction: Human immunodefíciency views type 1 model studies. Nucl. Acids Res. 1990; 18: 999.
Landgren U., Kaiser R, Sanders J. Hood L, A ligase-mediated gene detection techniques. Science 1988; 241.1077-1080.
Lomeli H, Tyagi S, Printchard C, lisardi P, Kramer F. Quantitative assays based on the use of replicatable hybridization probes. Clin Chem 1989; 35: 1826-1831.
Matsukura M. Shinozuka K, Zon G, Mitsuya H, Reitz M. Cohen J, Broder S (1987) Phiosphorothioate analogs of oligodeoxynucleotides : Inhibitors of replication and cytopathic effects of human immunodefíciency virus. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84(21): 7706-10.
Middlebrook G., (1954a). Izoniazid-resistance and catalase activity of tubercle bacilli. Am. Rev. Tuberc., 69: 471-472.
Middlebrook G., Cohn M.L., Schaefer W.B., (1954b). Studies on izoniazid and tubercle bacilli, III. The izolation, drug-sesceptibility, and catalase-testing of tubercle bacilli from izoniazid-theated patients. Am. Rev. Tuberc., 70: 852-872.
Miller P, Yano J. Yano E, Carroll C, Jayaram K, Ts' P (1979) Nonionic nucleic acid analogues. Synthesis and characterization of dideoxyribonucleoside mythelphosphonates. Biochemistry 18(23):5134-43.
Nair J, Rouse D A, Bai G H, Morris S L. The rspL gene and streptomycine resistance in single and multiple drug-resistant strains or Mycobacterium tuberculosis. Mol. Microbiol. 1993; 10: 521-527.
Mielsen P., Egholm M., Berg R, Buchardt O (1991) Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Scince 254(5037): 1497-500.
Nielsen P, Egholm M, Berg R, Buchardt O (1993) Sequence specifíc inhibition of DNA restriction enzyme cleavage by PNA. Nucleic-Acids-Res. 21(2): 197-200.
Saiki R, Walsh P, Levenson C, Erlich H. Genetic analysis of amplifíed DNA with immobilized sequence-specifíc oligonucleotide probes Prob Nati Acad Sci USA 1989; 86:6230-6234.
Stoeckle Μ Y., Guan L, Riegler N et al. Catalase-peroxidáze gene sequences in Izoniazid-sensitive and-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis from New York City. J. Inf. Dis. 1993; 168: 1063-65.
Stuyver L, Rossau, R, Wyseur A, et al. Typing of hepatitis C virus izolates and characterization of new subtypes using a line probe assay. J. Gen. Virol. 1993; 74: 1093-1102.
- 33 CZ 298020 B6
Telenti A., Imboden P., Marchesi F., et al. Detection of rifampicin-resistance mutation in Mycobacterium tuberculosis Lancet 1993a; 341: 647-50.
Telenci A., Imboden P., Marchesi F., et al., Directm, automated detection of Rifampinresistant Mycobacterium tuberculosis by polymeráze chain reaction and single-strand conformation polymorphism analysis. Antimicrob Agents Chemother 1993b; 37: 2054-58.
Wu D, Wallace B. The ligation amplification reaction (LAR) - amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation. Genomics 1989; 4: 560-569.
Youatt J. (1969). A. review of the action of izoniazid. Am. Rem. Respir. Dis., 99: 729-749.
Zhang Y., Heym B., Allen B., Young D. and Cole S. The catalase-peroxidáze gene and izoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis. Nátuře 1993; 358: 591-93.
Claims (34)
1. Způsob pro detekci resistence Mycobacterium species přítomných ve vzorku vůči rafampicinu a/nebo rifabutinu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
(i) podle potřeby uvolnění, izolování nebo koncentrování polynukleových kyselin přítomných ve vzorku;
(ii) podle potřeby amplifikaci relevantní části rpoB genu s alespoň jedním vhodným párem primerů, (iii) hydridizaci polynukleových kyselin z kroku (i) nebo (ii) se setem prob divokého typu, přičemž každá proba z tohoto setu zabírá více než jedno polymorfní místo a set přesahuje kompletní oblast mutace rpoB genu, za patřičných hybridizačních a promývacích podmínek;
(iv) detekce hybridů vytvořených v kroku (iii);
(v) stanovení citlivosti na rifampicin (sensitivita versus resistence) Micobacterium species přítomného ve vzorku z hybridizačního signálu nebo různých hybridizačních signálů získaných v kroku (iv).
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že set prob divokého typu sestává ze 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 nebo 9 prob divokého typu.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že set prob divokého typu v kroku (iii) je dále kombinován s alespoň jednou z druhově specifických prob pro M. tuberculosis, M. paratuberculosis, M. avium, M. scrophulaceum, M. kansasii, M. intracellurare (a MACkmeny) nebo M. leprae.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že druhově specifická proba pro M. tuberculosis je vybrána nebo druhově specifické proby pro M. tuberculosis jsou vybrány ze souboru sestávajícího z:
MT-POL-1
MT-POL-2
MT-POL-3 MT-POL-A
MT-POL-5 (SEQ ID NO 23), (SEQ ID NO 24), (SEQ ID NO 25), (SEQ ID NO 26) a (SEQ ID NO 27).
5. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že druhově specifická proba pro M. paratuberculosis je vybrána nebo druhově specifické proby pro M. paratuberculosis jsou vybrány ze souboru sestávajícího z:
- 34 CZ 298020 B6
MT-POL-1 (SEQ ID NO 28) a jakákoli specifická proba pro M. paratuberculosis je odvozena od sekvence relevantní části rpoB genu M. paratuberculosis (SEQ ID NO 35).
6. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že druhově specifická proba pro M. avium je vybrána nebo druhově specifické proby pro M. avium jsou vybrány ze souboru sestávajícího z:
MT-POL-1 (SEQ ID NO 29) a jakýkoli specifická proba pro M. avium je odvozena od sekvence relevantní části rpoB genu M. avium (SEQ ID NO 36).
7. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že druhově specifická proba pro M. scrophulaceum je vybrána nebo druhově specifické proby pro M. scrophulaceum jsou vybrány ze souboru sestávajícího z:
MT-POL-1 (SEQ ID NO 3 8) a jakákoli specifická proba pro M. scrophulaceum je odvozena od sekvence relevantní části rpoB genu M. scrophulaceum (SEQ ID NO 37).
8. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že druhově specifická proba pro M. kansasii je vybrána nebo kruhově specifické proby pro M. kansaii jsou vybrány ze souboru sestávajícího z:
MT-POL-1 (SEQ ID NO 55) a jakákoli specifická proba pro M. kansasii je odvozena od sekvence relevantní části rpoB genu M. kansasii (SEQ ID NO 56).
9. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že druhově specifická proba pro M. intracellurare (a MAC-kmeny) je vybrána nebo druhově specifické proby pro M. intracellulare (a MAC-kmeny) jsou vybrány ze souboru sestávajícího z:
MT-POL-1 (SEQ ID NO 68) a jakákoli specifická proba pro MAC-kmeny je odvozena od sekvence relevantní části rpoB genu MAC-kmeny (SEQ ID NO 69).
10. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že druhově specifická proba pro M. leprae sestává z:
MT-POL-1 (SEQ ID NO 57).
11. Způsob podle jakéhokoli z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že set prob divokého typu v kroku (iii) je dále kombinován s alespoň jednou probou rpoB silentní mutace.
12. Způsob podle jakéhokoli z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že set prob divokého typu v kroku (iii) je dále kombinován s alespoň jednou probou rpoB mutace.
13. Způsob podle jakéhokoli z nároků lažlO, vyznačující se tím, že Mycobacterium species je M. tuberculosis.
14. Způsob podle jakéhokoli z nároku 13, vyznačující se tím, že set prob divokého typu v kroku (iii) obsahuje alespoň jednu S-probu vybranou ze souboru sestávajícího z:
Sil (SEQ ID NO 1), (SEQ ID NO 2), (SEQ ID NO 3),
- 35 CZ 298020 B6
15. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že set prob divokého typu obsahuje alespoň jednu S-probu vybranou ze souboru sestávajícího z:
16. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že set prob divokého typu obsahuje alespoň jednu dále uvedenou S-probu:
S4444 (SEQ ID NO 8) a
S 5 5 nebo S5 5 5 5 (SEQ ID NO 10) nebo (SEQ ID NO 40).
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že set prob divokého typu obsahuje všechny dále uvedené S-proby:
18. Způsob podle jakéhokoli z nároků 13 až 17, vyznačující se tím, že set prob divokého typu v kroku (iii) je dále kombinován s alespoň jednou probou rpoB silentní mutace.
19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že proba rpoB silentní mutace sestává z:
20. Způsob podle jakéhokoli z nároků 13 až 19, vyznačující se tím, že set prob divokého typu v kroku (iii) je dále kombinován s alespoň jednou probou rpoB mutace.
21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že proba rpoB mutace, proby rpoB mutace, R-proba nebo R-proby je vybrána nebojsou vybrány ze souboru sestávajícího z:
- 36 CZ 298020 B6
22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že R-proba je vybrána nebo R-proby jsou vybrány ze souboru sestávajícího z:
23. Způsob podle jakéhokoli z nároků 13 až 22, vyznačující se tím, že použije proby nebo setu primerů projektovaných ke specifické detekci nebo amplifikaci dále uvedených nových rpoB generových mutací:
- D516G, představující mutaci v kodonu 516 rpoB genu, vedoucí ke změně aminokyseliny D na G,
- H526C, představující mutaci v kodonu 526 rpoB genu, vedoucí ke změně aminokyseliny H na C,
- H526T, představující mutaci v kodonu 526 rpoB genu, vedoucí ke změně aminokyseliny H na T a
- R529Q, představující mutaci v kodonu 529 rpoB genu, vedoucí ke změně aminokyseliny R na Q, jak je specifikováno v tabulce 1.
24. Způsob podle jakéhokoli z nároků lažlO, vyznačující se tím, že Mycobacteriums pecies je M. leprae.
25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že set pro divokého typu v kroku (iii) zahrnuje alespoň jednu S-probu vybranou ze souboru sestávajícího z:
26. Způsob podle jakéhokoli z nároků 1 až 25, vyznačující se tím, že proby jsou imobilizovány na pevném nosiči.
- 37 CZ 298020 B6
27. Set prob divokého typu pro detekci resistence Mycobacterium species vůči rafampicinu a/nebo rifabutinu, vyznačující se tím, že každá proba zabírá více než jedno polymorfní místo a set přesahuje kompletní oblast mutace rpoB genu.
28. Set prob divokého typu podle nároku 27, v y z n a č u j í c í se tím, že set sestává z 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 nebo 9 prob divokého typu.
29. Set prob divokého typu podle nároku 27 nebo 28, pro detekci resistence M. tuberculosis vůči rafampicinu a/nebo rifabutinu, vyznačující se tím, že tento set prob zahrnuje alespoň jednu probu divokého typu vybranou ze souboru sestávajícího z:
Sil
S33
S44
S444
S4444
S55
S555
S5555
S55C
S55M
S66 (SEQ ID NO 1), (SEQ ID NO 2), (SEQ ID NO 3), (SEQ ID NO 4), (SEQ ID NO 5), (SEQ ID NO 6), (SEQ ID NO 7), (SEQ ID NO 43), (SEQ ID NO 8), (SEQ ID NO 9), (SEQ ID NO 10), (SEQ ID NO 39), (SEQ ID NO 40), (SEQ ID NO 44), (SEQ ID NO 45), (SEQ ID NO 11) a (SEQ ID NO 12),
30. Set prob divokého typu podle nároků 27 nebo 28, pro detekci resistence M. leprae vůči rafampicinu a/nebo rifabutinu, vyznačující se tím, že tento set zahrnuje alespoň jednu probu divokého typu vybranou ze souboru sestávajícího z:
31. Kompozice obsahující jakýkoli set prob divokého typu, vyznačující se tím, že obsahuje set jaký je definován v jakémkoli z nároků 27 až 30.
32. Kit pro stanovení spektra antibiotické resistence mykobakterií přítomných v biologickém vzorku, pokud možno ve spojení s identifikací přítomného druhu mykobakterií, vyznačující se t í m, že zahrnující následující složky:
(i) je-li to vhodné, tak prostředky pro uvolnění, izolování nebo koncentrování polynukleových kyselin přítomných ve vzorku;
(ii) je-li to vhodné, tak set primerů pro amplifikaci rpoB genu;
(iii) alespoň jeden set prob divokého typu, jak jsou definovány v jakémkoli z nároků 27 a 28, pokud možno fixovanou na pevný nosič;
(iv) hybridizační pufr, nebo komponenty nezbytné pro produkci zmíněného pufru;
(v) promývací roztok, nebo komponenty nezbytné pro produkci zmíněného roztoku;
- 38 CZ 298020 B6 (vi) je-li to vhodné, tak prostředky pro detekci hybridů vzešlých z předchozí hybridizace.
33. Kit podle nároku 32 pro detekci resistence M. tuberculosis vůči rifampicinu a/nebo rifabutinu, vyznačující se tím, že set prob divokého typu v kroku (iii) sestává ze setu
5 definovaného v nároku 29.
34. Kit podle nároku 32 pro detekci resistence M. leprae vůči rifampicinu (a/nebo rifabutinu), vyznačující se tím, že set prob divokého typu v kroku (iii) sestává ze setu definovaného v nároku 30.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP94870093 | 1994-06-09 | ||
| PCT/EP1995/002230 WO1995033851A2 (en) | 1994-06-09 | 1995-06-09 | Method for the detection of the antibiotic resistance spectrum of mycobacterium species |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ361296A3 CZ361296A3 (en) | 1997-07-16 |
| CZ298020B6 true CZ298020B6 (cs) | 2007-05-23 |
Family
ID=8218646
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0361296A CZ298020B6 (cs) | 1994-06-09 | 1995-06-09 | Zpusob pro detekci rezistence Mycobacterium sp., set prob divokého typu, kompozice obsahující tentoset a kit pro stanovení spektra antibiotické resistence |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US6329138B1 (cs) |
| EP (1) | EP0771360B1 (cs) |
| JP (1) | JP4558105B2 (cs) |
| AT (1) | ATE261496T1 (cs) |
| AU (1) | AU703947B2 (cs) |
| BR (1) | BR9507960B8 (cs) |
| CA (1) | CA2192364C (cs) |
| CZ (1) | CZ298020B6 (cs) |
| DE (1) | DE69532675T2 (cs) |
| DK (1) | DK0771360T3 (cs) |
| ES (1) | ES2217280T3 (cs) |
| PT (1) | PT771360E (cs) |
| RU (1) | RU2204608C2 (cs) |
| WO (1) | WO1995033851A2 (cs) |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR9507960B8 (pt) | 1994-06-09 | 2014-09-30 | Fujirebio Europ N V | Processos e kits para deteção de resistência à rifampicina e/ou rifabutina de espécies de mycobacterium. |
| WO1998046342A2 (en) | 1997-04-15 | 1998-10-22 | Ciba Specialty Chemicals Holding Inc. | Preparation of low-dust stabilisers |
| DE19734940A1 (de) * | 1997-08-12 | 1999-02-18 | Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh | Nucleinsäuremolekül-Satz für Salmonella-Nachweis, Nucleinsäuren, Kit und Verwendung |
| US7108968B2 (en) * | 1998-04-03 | 2006-09-19 | Affymetrix, Inc. | Mycobacterial rpoB sequences |
| AU1543000A (en) * | 1998-12-11 | 2000-07-03 | Visible Genetics Inc. | Method and kit for the characterization of antibiotic-resistance mutations in (mycobacterium) tuberculosis |
| EP1076099A3 (en) * | 1999-08-03 | 2003-03-05 | Nisshinbo Industries, Inc. | Kit for diagnosis of tubercle bacilli |
| KR100363615B1 (ko) * | 1999-10-27 | 2002-12-06 | 주식회사 제니스라이프사이언스 | ｒｐｏＢ 유전자 단편 및 이를 이용한 결핵균과 비결핵마이코박테리아의 동정방법 |
| AU2001241934A1 (en) | 2000-03-03 | 2001-09-17 | Beckman Coulter Inc. | Multiplex hybridization system for identification of pathogenic mycobacterium and method of use |
| KR100451108B1 (ko) * | 2000-05-30 | 2004-10-06 | 주식회사 바이오메드랩 | 마이코박테리아 균동정 및 약제내성 탐지를 위한 유전자진단키트 및 그 키트의 제조방법 |
| WO2002000165A2 (en) * | 2000-06-28 | 2002-01-03 | Bakulesh Mafatlal, Khamar | Agent for reversal of drug resistance in mycobacterium tuberculosis |
| US6902894B2 (en) * | 2001-09-07 | 2005-06-07 | Genetel Pharmaceuticals Ltd. | Mutation detection on RNA polmerase beta subunit gene having rifampin resistance |
| CA2443534C (en) * | 2001-09-18 | 2010-01-12 | Gen-Probe Incorporated | Detection of rpob sequences of mycobacterium tuberculosis |
| US7094542B2 (en) | 2001-09-18 | 2006-08-22 | Gen-Probe Incorporated | Detection of rpoB sequences of Mycobacterium tuberculosis |
| KR100454585B1 (ko) * | 2001-10-09 | 2004-11-02 | 주식회사 에스제이하이테크 | 마이코박테리아의 균주 감별, 결핵균의 스트레인 감별과항생제 내성을 검출하기 위한 프로브를 포함하는마이크로어레이와 이를 이용한 검출 방법 및 진단 키트 |
| FI115637B (fi) * | 2003-12-19 | 2005-06-15 | Mobidiag Oy | Diagnostinen menetelmä hengitystieinfektioita aiheuttavien bakteerien osoittamiseksi ja tunnistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen alukeseos |
| GB0403039D0 (en) * | 2004-02-11 | 2004-03-17 | Health Prot Agency | TB resistance assay |
| US7445895B2 (en) * | 2004-04-28 | 2008-11-04 | Asiagen Corporation | Methods, kits and assay system for detecting drug-resistant Mycobacterium tuberculosis |
| ITRM20050068A1 (it) * | 2005-02-17 | 2006-08-18 | Istituto Naz Per Le Malattie I | Metodo per la rivelazione di acidi nucleici di agenti patogeni batterici o di parassiti nelle urine. |
| ITRM20050067A1 (it) * | 2005-02-17 | 2006-08-18 | Istituto Naz Per Le Malattie I | Metodo per la rivelazione di acidi nucleici virali o di origine virale nelle urine. |
| US7914982B2 (en) * | 2005-02-17 | 2011-03-29 | Trovagene, Inc. | Methods for detecting pathogen specific nucleic acids in urine |
| RU2376387C2 (ru) * | 2005-12-26 | 2009-12-20 | Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН | Способ одновременного обнаружения микобактерий туберкулезного комплекса и идентификации мутаций в днк микобактерий, приводящих к устойчивости микроорганизмов к рифампицину и изониазиду, на биологических микрочипах, набор праймеров, биочип и набор олигонуклеотидных зондов, используемые в способе |
| US9234247B2 (en) | 2006-03-13 | 2016-01-12 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Method for detection of mutant gene |
| PL2612926T3 (pl) * | 2007-08-22 | 2018-07-31 | Trovagene, Inc. | Metody wykorzystania mirna do wykrywania śmierci komórkowej in vivo |
| US7946758B2 (en) * | 2008-01-31 | 2011-05-24 | WIMM Labs | Modular movement that is fully functional standalone and interchangeable in other portable devices |
| JP2009189283A (ja) * | 2008-02-13 | 2009-08-27 | Nipro Corp | 結核菌および非結核性抗酸菌検出試薬 |
| KR100990756B1 (ko) | 2008-05-22 | 2010-10-29 | 엠앤디 (주) | 결핵균 약제 내성 진단용 프로브 및 그 키트 |
| KR101001368B1 (ko) * | 2008-05-22 | 2010-12-14 | 엠앤디 (주) | 나균 리팜핀 내성 진단용 프로브 및 그 키트 |
| ES2606145T3 (es) * | 2010-11-10 | 2017-03-22 | Brandeis University | Procedimientos y kits para la detección e identificación de micobacterias |
| TWI614345B (zh) * | 2012-06-22 | 2018-02-11 | Taichung Veterans General Hospital | 檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之探針、晶片、套組與方法 |
| RU2552214C2 (ru) * | 2013-04-03 | 2015-06-10 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение науки Институт химический биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН (ИХБФМ СО РАН) | СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ УСТОЙЧИВЫХ К ПИРАЗИНАМИНУ ИЗОЛЯТОВ Mycobacterium tuberculosis |
| KR101472993B1 (ko) * | 2013-08-20 | 2014-12-18 | 한국생명공학연구원 | 마이크로박테리움 속 hy-17 균주로부터 생산되는 신규한 알카리 내성 글리코시드 하이드로레이즈 패밀리 10 자일라나제 |
| CN116042880A (zh) * | 2014-10-10 | 2023-05-02 | 新泽西鲁特格斯州立大学 | 结核分枝杆菌的聚合酶链反应引物和探针 |
| WO2016203267A2 (en) * | 2015-06-19 | 2016-12-22 | Cambridge Enterprise Limited | Diagnosis and treatment of infectious disease |
| WO2018026141A1 (ko) * | 2016-08-04 | 2018-02-08 | 주식회사 옵티팜 | 퀀타매트릭스 어세이 플랫폼 기반 결핵 및 비결핵 항산균의 검출 및 동정과 결핵균의 리팜핀 내성여부를 동시 확인할 수 있는 진단법 및 그 키트 |
| RU2659958C2 (ru) * | 2016-10-17 | 2018-07-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ФПИ" Минздрава России) | Способ оценки лекарственной чувствительности Mycobacnerium tuberculosis на основе результатов определения иммунологических показателей крови у больного туберкулезом легких человека |
| EP3877550A4 (en) * | 2018-11-09 | 2022-08-10 | Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC | RAPID PCR METHODOLOGY |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993022454A1 (en) * | 1992-04-30 | 1993-11-11 | Institut Pasteur | Rapid detection of antibiotic resistance in mycobacterium tuberculosis |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4775361A (en) * | 1986-04-10 | 1988-10-04 | The General Hospital Corporation | Controlled removal of human stratum corneum by pulsed laser to enhance percutaneous transport |
| WO1988003957A1 (en) * | 1986-11-24 | 1988-06-02 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms |
| EP0398960B1 (en) * | 1988-01-21 | 1995-12-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Transport of molecules across tissue using electroporation |
| US5749847A (en) * | 1988-01-21 | 1998-05-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Delivery of nucleotides into organisms by electroporation |
| US5423803A (en) * | 1991-10-29 | 1995-06-13 | Thermotrex Corporation | Skin surface peeling process using laser |
| US5713845A (en) * | 1991-10-29 | 1998-02-03 | Thermolase Corporation | Laser assisted drug delivery |
| US5246436A (en) * | 1991-12-18 | 1993-09-21 | Alcon Surgical, Inc. | Midinfrared laser tissue ablater |
| US5165418B1 (en) * | 1992-03-02 | 1999-12-14 | Nikola I Tankovich | Blood sampling device and method using a laser |
| US5633131A (en) * | 1992-04-30 | 1997-05-27 | Institut Pasteur | Rapid detection of isoniazid resistance in mycobacterium tuberculosis probes for selecting nucleic acid encoding isoniazid resistance, and methods and kits |
| US5851763A (en) | 1992-09-17 | 1998-12-22 | Institut Pasteur | Rapid detection of antibiotic resistance in mycobacterium tuberculosis |
| US5464386A (en) * | 1992-08-17 | 1995-11-07 | Genetronics, Inc. | Transdermal drug delivery by electroincorporation of vesicles |
| US5462520A (en) * | 1992-08-17 | 1995-10-31 | Genetronics, Inc. | Transsurface drug delivery by electrofusion of microbubbles to the tissue surface |
| US5643252A (en) * | 1992-10-28 | 1997-07-01 | Venisect, Inc. | Laser perforator |
| US5462743A (en) * | 1992-10-30 | 1995-10-31 | Medipro Sciences Limited | Substance transfer system for topical application |
| US5458140A (en) * | 1993-11-15 | 1995-10-17 | Non-Invasive Monitoring Company (Nimco) | Enhancement of transdermal monitoring applications with ultrasound and chemical enhancers |
| US5556612A (en) * | 1994-03-15 | 1996-09-17 | The General Hospital Corporation | Methods for phototherapeutic treatment of proliferative skin diseases |
| US5505726A (en) * | 1994-03-21 | 1996-04-09 | Dusa Pharmaceuticals, Inc. | Article of manufacture for the photodynamic therapy of dermal lesion |
| US5643723A (en) | 1994-05-26 | 1997-07-01 | Roche Molecular Systems, Inc. | Detection of a genetic locus encoding resistance to rifampin in mycobacterial cultures and in clinical specimens |
| BR9507960B8 (pt) * | 1994-06-09 | 2014-09-30 | Fujirebio Europ N V | Processos e kits para deteção de resistência à rifampicina e/ou rifabutina de espécies de mycobacterium. |
| US5554153A (en) * | 1994-08-29 | 1996-09-10 | Cell Robotics, Inc. | Laser skin perforator |
-
1995
- 1995-06-09 BR BRPI9507960-2B8A patent/BR9507960B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1995-06-09 PT PT95923283T patent/PT771360E/pt unknown
- 1995-06-09 ES ES95923283T patent/ES2217280T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-09 RU RU97100176/13A patent/RU2204608C2/ru active
- 1995-06-09 DE DE69532675T patent/DE69532675T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-09 AT AT95923283T patent/ATE261496T1/de active
- 1995-06-09 EP EP95923283A patent/EP0771360B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-09 AU AU27896/95A patent/AU703947B2/en not_active Expired
- 1995-06-09 CZ CZ0361296A patent/CZ298020B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-06-09 US US08/750,088 patent/US6329138B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-09 DK DK95923283T patent/DK0771360T3/da active
- 1995-06-09 WO PCT/EP1995/002230 patent/WO1995033851A2/en active IP Right Grant
- 1995-06-09 JP JP50037496A patent/JP4558105B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-09 CA CA002192364A patent/CA2192364C/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-11-28 US US09/722,319 patent/US6632607B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-01-10 US US10/339,604 patent/US7252936B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-06-27 US US11/819,472 patent/US20090068651A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993022454A1 (en) * | 1992-04-30 | 1993-11-11 | Institut Pasteur | Rapid detection of antibiotic resistance in mycobacterium tuberculosis |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Telenti, A. et al.: "Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis" Lancet 341(8846):647-650, 1993 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU703947B2 (en) | 1999-04-01 |
| EP0771360B1 (en) | 2004-03-10 |
| EP0771360A1 (en) | 1997-05-07 |
| RU2204608C2 (ru) | 2003-05-20 |
| US20030152982A1 (en) | 2003-08-14 |
| DK0771360T3 (da) | 2004-07-12 |
| CA2192364A1 (en) | 1995-12-14 |
| DE69532675T2 (de) | 2005-02-24 |
| DE69532675D1 (de) | 2004-04-15 |
| BR9507960A (pt) | 1997-09-02 |
| CZ361296A3 (en) | 1997-07-16 |
| ES2217280T3 (es) | 2004-11-01 |
| US20090068651A1 (en) | 2009-03-12 |
| WO1995033851A3 (en) | 1996-02-08 |
| JPH10500857A (ja) | 1998-01-27 |
| US6632607B1 (en) | 2003-10-14 |
| US6329138B1 (en) | 2001-12-11 |
| US7252936B2 (en) | 2007-08-07 |
| BR9507960B1 (pt) | 2010-08-10 |
| CA2192364C (en) | 2009-01-20 |
| ATE261496T1 (de) | 2004-03-15 |
| PT771360E (pt) | 2004-07-30 |
| WO1995033851A2 (en) | 1995-12-14 |
| AU2789695A (en) | 1996-01-04 |
| JP4558105B2 (ja) | 2010-10-06 |
| BR9507960B8 (pt) | 2014-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ298020B6 (cs) | Zpusob pro detekci rezistence Mycobacterium sp., set prob divokého typu, kompozice obsahující tentoset a kit pro stanovení spektra antibiotické resistence | |
| RU2154106C2 (ru) | Одновременное определение, идентификация и дифференциация эубактериальных таксонов с помощью гибридизационного анализа | |
| JP5049016B2 (ja) | Ｔｂ耐性アッセイ | |
| US8628926B2 (en) | Probe and primer for tubercle bacillus detection, and method of detecting human tubercle bacillus therewith | |
| Smole et al. | Clinical and epidemiological correlates of genotypes within the Mycobacterium avium complex defined by restriction and sequence analysis of hsp65 | |
| JP2008263994A (ja) | 結核菌中のイソニアジド抵抗性の迅速検出 | |
| US20030054339A1 (en) | Method for detection of drug-induced mutations in the HIV reverse transcriptase gene | |
| JP3408564B2 (ja) | 結核菌中のイソニアジド抵抗性の迅速検出 | |
| JP3833152B2 (ja) | ヒトヘルペスウイルス６型（ｈｈｖ−６）ｄｎａの検出及びサブタイプ識別方法 | |
| JP3439492B2 (ja) | ヒトヘルペスウイルス６型（ｈｈｖ−６）ｄｎａの検出及びサブタイプ識別方法 | |
| Sheikholslami et al. | Comparison of polymerase chain reaction single-strand conformation polymorphism with DNA sequencing to detect drug resistance of mycobacterium tuberculosis isolates | |
| JP2002238563A (ja) | マイコバクテリア特異的ヌクレオチド配列の同定およびマイコバクテリア種の鑑別診断法の開発 | |
| EP1233076A2 (en) | Differential diagnosis for mycobacterial and pseudomonas species using species-specific upstream p34 gene region probes | |
| US20030027174A1 (en) | Identification of nucleotide sequences specific for mycobacteria and development of differential diagnosis strategies for mycobacterial species | |
| CA2354197A1 (en) | Identification of nucleotide sequences specific for mycobacteria and development of differential diagnosis strategies for mycobacterial species | |
| JP2007061084A (ja) | ヒトヘルペスウイルス６型（ｈｈｖ−６）ｄｎａの検出及びサブタイプ識別方法 | |
| KR20000075179A (ko) | 마이코박테리움 첼로네의 내부전사지역의 염기서열 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20150609 |