JP5049016B2 - Ｔｂ耐性アッセイ - Google Patents

Description

本発明は、多剤耐性マイコバクテリウム種（Mycobacterium sp.）、特に、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）についての診断アッセイ、ならびにそのための試薬およびキットに関する。

ヒト型結核菌および近縁種は、結核菌群（Mycobacterium tuberculosis complex：ＭＴＣ）として知られるマイコバクテリウムの小群を構成する。この群は、５つの種−ヒト型結核菌、ネズミ型結核菌（M. microti）、ウシ型結核菌（M. bovis）、カネッティ型結核菌（M. caneti）、およびアフリカ型結核菌（M. africanum）−を含み、これらは、全世界的な結核菌感染（ＴＢ）症例の大部分の原因菌である。

ヒト型結核菌は、全世界で１年に３００万より多くの死因である。ＷＨＯは、世界の人口の３分の１までがヒト型結核菌に感染しており、全世界では１５秒毎にＴＢの死者が出ていると見積もっている。他のマイコバクテリウムもまた、ヒトおよび動物において病原性であり、例えば、トリ型結核菌の副結核亜種（M. avium subsp. paratuberculosis）は、反芻動物でヨーネ病を引き起こし、ウシ型結核菌は、畜牛で結核を引き起こし、トリ型結核菌（M. avium）およびイントラセルラール結核菌（M. intracellulare）は、免疫不全患者（例えば、ＡＩＤＳ患者および骨髄移植患者）で結核を引き起こし、そしてらい菌（M. leprae）は、ヒトでらい病を引き起こす。別の重要なマイコバクテリウム種は、マイコバクテリウム・バッカエ（M. vaccae）である。

疫学データは、旧ソ連の全ての国々でのマイコバクテリウム種感染（ヒト型結核菌感染のようなＭＴＣ感染を含む）の高発症率を示している。ロシアでは、２０００年に90.7／100,000のＴＢ発症率を記録した。同様に、高い割合の薬物耐性（特に、多剤耐性ヒト型結核菌（ＭＤＲＴＢ）により引き起こされる多剤耐性）が報告されており、このことが、低い治癒率の原因となり、ＴＢプログラムの有効性を損なう。エストニアでは、新規に診断された症例のうち１４％もの高い割合でＭＤＲＴＢが報告されている。２０００年には、北ロシアでの少なくとも１つの薬物に対する一次耐性および二次耐性の割合はそれぞれ、アルハンゲリスク州（Archangelsk oblast）で３３％および８５％であると報告された。サマラ（Samara）およびサンクト・ぺテルブルク（St Petersburg）では高い薬物耐性率が報告された。逆に、米国、英国、および他の欧州の国々では、薬物耐性およびＭＤＲＴＢの多くの施設内発生が報告されているが、全体としてのＭＤＲＴＢの発症率および有病率は低い。

微生物耐性の問題には多くの要因が寄与している。１つは、経時的に変異が蓄積されること、ならびに続いて変異遺伝子が他の生物に水平および垂直に転移されることである。したがって、所与の病原に対して、全クラスの抗生物質が不活性になった。さらなる要因は、近年、新規なクラスの抗生物質がないことである。マイコバクテリウム種のような多剤耐性の病原細菌（特に、ＭＴＣの種（例えば、ヒト型結核菌））の出現は、公衆衛生に対して重篤な脅威を示し、新規な形態の治療が緊急に必要とされる。

マイコバクテリウム種（例えば、ヒト型結核菌）における多剤耐性は、２つの薬物−リファンピンおよびイソニアジド−に関して評価される。ＩＮＨおよびＲＩＦに対して耐性であると定義された多剤耐性（ＭＤＲ）株が出現しており、いくつかの発生へのそれらの関与が報告されている。薬物耐性の検出のために現在利用可能な方法としては、喀痰顕微鏡検査、および薬物の存在下の固形または液体培地（通常、ローウェンスタインジャンセン培地）で細菌の増殖を測定する増殖ベースの方法−「薬物感受性試験」（ＤＳＴ）−が挙げられる。増殖ベースの技術の欠点は、それらがマイコバクテリウム種（例えば、ヒト型結核菌）の増殖速度によって制限されることであり、この速度は、１６時間の倍加時間を有する（大腸菌の倍加時間２０分と比較のこと）。したがって、この方法によって薬物耐性マイコバクテリウム種を同定するには、代表的には少なくとも１０〜１４日間（代表的には一次培養物を単離した後２１〜３０日）かかる。また、標準化されていない方法の使用は、ＤＳＴの精度を損なう。

また、マイコバクテリウム種（例えば、ヒト型結核菌）の薬物への曝露後の生存度（したがって薬物耐性）は、マイコバクテリオファージが生物に首尾よく感染する能力を調べることによってモニタリングされ得る。２つの方法が記載されている。１つの方法では、マイコバクテリウム種（例えば、ヒト型結核菌）を薬物で処理し、次いで、ファージを用いてこの薬物処理したヒト型結核菌に感染させる。細胞外ファージを破壊した後、ヒト型結核菌を溶解し、そして迅速に増殖するマイコバクテリウムのローン上でファージを計数する。プラークの数は、生存ヒト型結核菌の数に比例する。第二の方法では、発光ファージを用いて、薬物曝露したマイコバクテリウム種（例えば、ヒト型結核菌）に感染させる。この発光は、生存ヒト型結核菌の数に比例する。これらの各方法の欠点は、それらが共に、薬物耐性マイコバクテリウム種の同定のために約２日かかることである。

少なくとも１１の遺伝子が、主要な抗ＴＢ剤に対する耐性の発達に関与することが報告されている。リファンピン耐性（ＲＩＦ耐性）またはイソニアジド耐性（ＩＮＨ耐性）の検出は、臨床上および公衆衛生上のＴＢ制御に重要である。

リファンピンおよびイソニアジドに対する耐性は、３つの遺伝子における変異によって付与される。ＲＩＦ耐性は、一般に、単一のヌクレオチド置換と関連している。rpoB遺伝子（ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットをコードする）の８１ｂｐコア領域における変異が、ＲＩＦ耐性の９０％以上もの原因となることが知られている。約６０〜７０％の変異が２つのコドン５３１および５２６内で見出されている。

２つの異なる遺伝子における変異が、イソニアジドに対する耐性の原因であることが知られている。７５％より多くの症例において、ＩＮＨ耐性は、katG遺伝子（カタラーゼ−ペルオキシダーゼをコードする）における置換、特にコドン３１５での置換（ＡＧＣ−ＡＣＣ）に起因して生じる。よりまれではあるが、ＩＮＨ耐性は、inhA遺伝子およびahpC遺伝子における変異に起因している。

katG遺伝子のコドン３１５での変異の有病率は、ベイルートでの３５％からラトビアおよびロシアでの９０％以上までの割合で調べた地方によって変動があり、他方、inhA変異の有病率は、３．３％から３２％以上まで地理的に変動している。

ＩＮＨまたはＲＩＦの耐性と関連した特定の単変異は、マイコバクテリウム種核酸（例えば、ヒト型結核菌核酸）のＰＣＲ増幅後のＤＮＡ配列分析によって、１日かからずに検出され得る。

マイコバクテリウム種の特定の単変異の配列分析のための種々の方法が、当該分野で用いられており、例えば、アガロースゲル電気泳動が挙げられる。この方法は、変異特異的増幅を必要とし、ゲル中の得られたＰＣＲ産物の大きさにより、任意の所与の変異の存在が示される。配列分析のための別の方法は、ＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型分析）であり、この方法では、所与の変異を含むＤＮＡの領域をＰＣＲによって増幅し、次いでこのＰＣＲ産物を変性し、そして得られた一本鎖ＤＮＡをアクリルアミドゲルに流すと、代表的な移動パターンが各変異で見られる。配列分析のためのさらなる技術は、融解曲線分析である。融解曲線は、リアルタイムＰＣＲ装置（例えば、LightCycler（Roche））を用いて作成され得、そして各変異は、代表的な曲線を有する。ＰＣＲ産物における変異はまた、蛍光プローブを用いて同定され得る。核酸配列はまた、市販の配列決定装置を用いて決定され得る。

上記の全ての配列決定技術の欠点は、全てのＤＮＡ分析が１つの試験で行うことができる程度にまで多重化できないことである。理論的には、LightCycler PCRアッセイを用いて多数の変異型部位を同定することが可能であるが、実際には、多数の異なる染料を用いる場合、クロストークにより生じる問題がある。したがって、これらの既知の方法は、変異型標的部位の全てを同時に同定することができない。

配列分析のための代替の方法は、逆ハイブリダイゼーションである。目的の変異を含む標識したＰＣＲ産物を作製し、そしてこれを用いて、固体支持体上に固定化した一連のプローブを調べる。ＲＩＦ耐性と関連したrpoBにおける変異を検出するためのシステムが市販されている（INNO-LiPA Rif.TB, Innogenetics, Gent, Belgium）。しかし、スクリーニング目的でのこのキットの応用は、高いＴＢ発症率や高いＭＤＲＴＢ率を有する地方では、費用が相対的に高いことおよびＩＮＨ耐性の分析ができないことによって制限される。

ＩＮＨ耐性またはＲＩＦ耐性を付与することが知られる遺伝子断片の増幅後に変異型および野生型のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを行うことに基づく、非業務用のドットブロットストラテジーは、より費用効果のある方法論であることが分かっている。これは、９０％の症例でＲＩＦ耐性、または７５％の症例でＩＮＨ耐性を推定している。

そこで、多剤耐性マイコバクテリウム種、特に、ＭＴＣのメンバー（例えば、多剤耐性ヒト型結核菌（ＭＤＲＴＢ））を検出するための代替となり、および／または改善されたシステムを提供する必要性がある。この必要性は本発明によって満たされ、これにより、上記の技術的課題の１つ以上が解決される。

したがって、本発明の第１の局面は、試料中の多剤耐性マイコバクテリウム種を検出するためのアッセイに使用される核酸プローブのセットを提供する。このセットは、第１の標的配列ＡＣＣＡＧＣＧＧＣＡまたはその相補体に結合する１０ヌクレオチドの核酸配列を含む、プローブ１；第２の標的配列ＧＣＣＧＧＴＧＧＴＧまたはその相補体に結合する１０ヌクレオチドの核酸配列を含む、プローブ２；第３の標的配列ＴＡＴＣＧＴＣＴＣＧまたはその相補体に結合する１０ヌクレオチドの核酸配列を含む、プローブ３；第４の標的配列ＴＡＴＣＡＴＣＴＣＧまたはその相補体に結合する１０ヌクレオチドの核酸配列を含む、プローブ４；第５の標的配列ＧＡＡＴＴＧＧＣＴＣまたはその相補体に結合する１０ヌクレオチドの核酸配列を含む、プローブ５；第６の標的配列ＣＴＧＧＴＣＣＡＴＧまたはその相補体に結合する１０ヌクレオチドの核酸配列を含む、プローブ６；第７の標的配列ＧＧＴＴＧＴＴＣＴＧまたはその相補体に結合する１０ヌクレオチドの核酸配列を含む、プローブ７；第８の標的配列ＣＣＣＧＡＣＡＧＣＧまたはその相補体に結合する１０ヌクレオチドの核酸配列を含む、プローブ８；第９の標的配列ＧＣＴＴＧＴＧＧＧＴまたはその相補体に結合する１０ヌクレオチドの核酸配列を含む、プローブ９；第１０の標的配列ＣＣＡＧＴＧＣＣＧＡまたはその相補体に結合する１０ヌクレオチドの核酸配列を含む、プローブ１０を含み、１つのプローブがそれぞれの標的配列に結合されると検出可能シグナルが提供される。

各プローブが１５ヌクレオチドの核酸配列を含むことが好ましい。したがって、１つの実施態様では、プローブ１は、第１の標的配列ＡＴＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＡＴＣまたはその相補体に結合する１５ヌクレオチドの核酸配列を含み；プローブ２は、第２の標的配列ＧＡＴＧＣＣＧＧＴＧＧＴＧＴＡまたはその相補体に結合する１５ヌクレオチドの核酸配列を含み；プローブ３は、第３の標的配列ＡＣＣＴＡＴＣＧＴＣＴＣＧＣＣまたはその相補体に結合する１５ヌクレオチドの核酸配列を含み；プローブ４は、第４の標的配列ＡＣＣＴＡＴＣＡＴＣＴＣＧＣＣまたはその相補体に結合する１５ヌクレオチドの核酸配列を含み；プローブ５は、第５の標的配列ＡＴＧＡＡＴＴＧＧＣＴＣＡＧＣまたはその相補体に結合する１５ヌクレオチドの核酸配列を含み；プローブ６は、第６の標的配列ＧＴＴＣＴＧＧＴＣＣＡＴＧＡＡまたはその相補体に結合する１５ヌクレオチドの核酸配列を含み；プローブ７は、第７の標的配列ＧＣＧＧＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＴまたはその相補体に結合する１５ヌクレオチドの核酸配列を含み；プローブ８は、第８の標的配列ＡＡＣＣＣＣＧＡＣＡＧＣＧＧＧまたはその相補体に結合する１５ヌクレオチドの核酸配列を含み；プローブ９は、第９の標的配列ＧＧＣＧＣＴＴＧＴＧＧＧＴＣＡまたはその相補体に結合する１５ヌクレオチドの核酸配列を含み；プローブ１０は、第１０の標的配列ＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＧＡＣＡまたはその相補体に結合する１５ヌクレオチドの核酸配列を含む。

したがって、本発明は、３つの標的遺伝子（katG、inhA、およびrpoB）における変異を単一のアッセイで同時に検出することを可能にする、慎重に選択したプローブのセットの使用に関する。これらの遺伝子の各々の野生型バージョンの部分遺伝子配列は、Genbank登録番号MTU06270、MTU66801、およびZ95972としてそれぞれ提供される。

本発明により提供されるプローブのセットのうち、プローブ１およびプローブ２は、ＩＮＨ耐性に関する第１の遺伝子（katG）を標的とし、プローブ３およびプローブ４は、イソニアジド耐性に関する第２の遺伝子（inhA）を標的とし、そしてプローブ５からプローブ１０は、ＲＩＦ耐性と関連したrpoB内の８１塩基対領域に関する走査アレイを形成する。本発明のプローブは、個々におよび一群としての両面で最適化されており、各々は、非常に特異性が高く、個々の塩基変異が検出されることを可能にする。

本発明のプローブは、所望のパラメーターの選択に基づいて、標的遺伝子配列に結合するように慎重に設計されている。結合条件は、高レベルの特異性が提供されるようなものであること、すなわち、結合が「ストリンジェントな条件」下で生じることが好ましい。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨで特定配列の熱融解温度（Ｔ_ｍ）より約５℃低いように選択される。Ｔ_ｍは、完全に一致したプローブに標的配列の５０％が結合する温度（所定のイオン強度およびｐＨ下で）である。これに関して、本発明の各プローブのＴ_ｍ（ｐＨ７にて約０．０２Ｍ以下の塩濃度で）は、好ましくは６０℃以上であり、より好ましくは約７０℃である。予め混合した結合溶液が入手可能であり（例えば、CLONTECH Laboratories, Inc.からのEXPRESSHYB Hybridisation Solution）、そして結合は、製造者の指示書に従って実施され得る。あるいは、当業者は、これらの結合条件の改変を設計し得る。

結合後、ストリンジェント（好ましくは、高ストリンジェント）な条件下で、核酸分子を洗浄して未結合の核酸分子を除去し得る。代表的なストリンジェント洗浄条件は、５５〜６５℃での0.1％SDSを含む0.5〜2×SSCの溶液中の洗浄を包含する。代表的な高ストリンジェント洗浄条件は、５５〜６５℃での0.1％SDSを含む0.1〜0.2×SSCの溶液中の洗浄を包含する。当業者は、例えば、洗浄溶液中でSSCの代わりにSSPEとすることによって、等価な条件を容易に設計し得る。

自己相補体形成およびダイマー形成（プローブ−プローブ結合）を最小限にするようにプローブをスクリーニングすることが好ましい。本発明の好ましいプローブは、ヒトＤＮＡとの相同性が最小であるように選択される。選択プロセスは、候補プローブ配列とヒトＤＮＡとを比較し、そして相同性が５０％より大きい場合そのプローブを排除することを包含し得る。この選択プロセスの目的は、夾雑するヒトＤＮＡ配列へのプローブのアニーリングを減少させ、それによってアッセイの特異性を改善することである。

１つの実施態様では、本発明は、以下のプローブのセットを提供する。このセットは、配列ＴＧＣＣＧＣＴＧＧＴまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ１；配列ＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ２；配列ＣＧＡＧＡＣＧＡＴＡまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ３；配列ＣＧＡＧＡＴＧＡＴＡまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ４；配列ＧＡＧＣＣＡＡＴＴＣまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ５；配列ＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ６；配列ＣＡＧＡＡＣＡＡＣＣまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ７；配列ＣＧＣＴＧＴＣＧＧＧまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ８；配列ＡＣＣＣＡＣＡＡＧＣまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ９；配列ＴＣＧＧＣＡＣＴＧＧまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ１０を含み、該プローブ１、プローブ２、プローブ３、およびプローブ４の配列内の下線部のヌクレオチドは必須であり、いかなる他のヌクレオチドにも置換され得ない。

好ましい実施態様では、本発明は、以下の１０プローブのセットを提供する。このセットは、配列ＧＡＴＧＣＣＧＣＴＧＧＴＧＡＴまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ１；配列ＡＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ２；配列ＧＧＣＧＡＧＡＣＧＡＴＡＧＧＴまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ３；配列ＧＧＣＧＡＧＡＴＧＡＴＡＧＧＴまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ４；配列ＡＧＣＴＧＡＧＣＣＡＡＴＴＣＡＴＧまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ５；配列ＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧＡＡＣＡまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ６；配列ＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＣＣＣＧＣまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ７；配列ＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＧＧＧＧＴＴまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ８；配列ＴＧＡＣＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ９；配列ＣＴＧＴＣＧＧＣＡＣＴＧＧＧＧＣＣまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ１０を含み、該プローブ１、プローブ２、プローブ３、およびプローブ４の配列内の下線部のヌクレオチドは必須であり、いかなる他のヌクレオチドにも置換され得ない。

各プローブは、好ましくは、１８〜２５ヌクレオチド長である。配列番号１から１０のプローブの各々のうちの１つを含む１０プローブのセットを用いて、特に良好な結果が得られている（以下の表１を参照のこと）。

したがって、本発明は、好ましい実施態様では、以下のプローブのセットを提供する。このセットは、配列番号１の配列またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ１；配列番号２の配列またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ２；配列番号３の配列またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ３；配列番号４の配列またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ４；配列番号５の配列またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ５；配列番号６の配列またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ６；配列番号７の配列またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ７；配列番号８の配列またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ８；配列番号９の配列またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ９；配列番号１０の配列またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ１０を含み、該配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４内の下線部の残基は必須であり、いかなる他のヌクレオチドにも置換され得ない。

本明細書において、本発明の配列に「少なくとも９０％の配列同一性」を有する配列という場合、本発明は、本発明のプローブ配列に好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するプローブ配列も包含する。

本発明のプローブ配列に少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するプローブ配列は、従来のソフトウェア、例えば、Bioedit^ＴＭパッケージ（オンラインにより無料で入手可能）およびSequencher^ＴＭパッケージ（Sequencher Gene Codes Corporation, 640 Avis Drive Suite 310, Ann Arbor MI 48108により提供される）を用いる配列アラインメントによって同定され得る。

本発明のプローブ配列に相同なプローブ配列を決定する代替の方法は、相同配列と本発明の配列との間で異なるヌクレオチドの数を決定することによる。これに関して、本発明は、５ヌクレオチド以下、好ましくは４ヌクレオチド以下、より好ましくは３ヌクレオチド以下、なおより好ましくは２ヌクレオチド以下、および最も好ましくは１ヌクレオチド以下が本発明のプローブ配列とは異なるプローブ配列を包含する。しかし、プローブ１、プローブ２、プローブ３、およびプローブ４の配列内の下線部のヌクレオチドは、いかなる他のヌクレオチドにも置換され得ない。

本発明では、「相補体」または「相補鎖」は、非コード（アンチセンス）核酸鎖を意味し、これは、コード鎖に相補塩基対合を介して結合し得る。したがって、本発明はまた、本明細書中に記載のプローブの相補体の使用も包含する。例を挙げると、上のプローブ１の相補体は、配列ＧＡＧ ＣＴＡ ＣＧＧ ＣＧＡ ＣＣＡ ＣＴＡ ＧＣＧを有し、そして上のプローブ２の相補体は、配列ＣＧＣ ＴＡＧ ＴＧＧ ＴＧＧ ＣＣＧ ＴＡＧ ＣＴＣを有する。コード鎖の配列が知られていれば、相補塩基対合規則を用いることにより相補鎖の配列を解読することは当該分野で周知である。

本発明の１つの実施態様では、プローブは、固体支持体またはプラットフォーム上に固定化され得る。支持体は、硬質固体支持体（例えば、ガラスまたはプラスチック製）であり得、またはそれ以外に、支持体は、ナイロンまたはニトロセルロースメンブレン、または他のメンブレンでもあり得る。３Ｄマトリックスは、本発明での使用に適した支持体である（例えば、ポリアクリルアミドまたはPEGゲル）。１つの実施態様では、固体支持体は、ビーズの形態であり得、これは、大きさまたは蛍光団によって選別され得る。

プローブは、種々の手段によって固体支持体に固定化され得る。例を挙げると、プローブは、ＵＶ架橋によってナイロンメンブレン上に固定化され得る。ビオチン標識プローブは、ストレプトアビジンコーティング基材に結合され得、そしてアミノリンカーを用いて調製されたプローブは、シラン処理表面上に固定化され得る。プローブを固定化する別の手段は、ポリＴテイル（好ましくは、３’末端で）を介することである。ポリＴテイルは、１〜１００の連続するチミジン残基からなり、ターミナルトランスフェラーゼを用いて３’末端でプローブに付加される。好ましくは、１〜２０のチミジン残基が付加される。ポリＴテイルは、次いで固体基材上にベーキングされるか、またはＵＶ架橋される。ポリＴテイルの付加は、２つの機能を有するようである。第一に、ポリＴテイルは、固体支持体上に固定化されるプローブの量を増大させる。第二に、ポリＴテイルは、ハイブリダイゼーションの効率を改善するようにプローブを適合させる。本発明のプローブが標的マイコバクテリウム種（例えば、ヒト型結核菌）核酸に結合されると検出可能シグナルが提供され、これは、公知の手段によって検出され得る。検出可能シグナルは、放射性シグナルであり得るが、好ましくは蛍光シグナル（最も好ましくは、蛍光の変化）またはビオチンもしくはジゴキシゲニンを用いる発色シグナルである。

本発明はまた、試料中で多剤耐性マイコバクテリウム種、特に、ＭＴＣのメンバー（例えば、ヒト型結核菌）を検出する方法を提供する。この方法は、本発明によるプローブのセットを、核酸含有試料と接触させる工程であって、１つのプローブが上記試料中の標的マイコバクテリウム種核酸に結合されると検出可能シグナルが提供される、工程；および上記検出可能シグナルを検出する工程を包含する。

試料は、例えば、食物、下水道、または臨床試料であり得る。この方法の格別な適用は、臨床試料中のマイコバクテリウム種の検出用である。臨床試料としては、気管支肺胞洗浄標本（ＢＡＬＳ）、誘発喀痰（induced sputa）、口腔咽頭洗浄物、血液または他の体液試料が挙げられ得る。

本発明の方法では、上記試料中の多剤耐性マイコバクテリウム種の存在が、プローブ２およびプローブ４とそれらのそれぞれの結合される標的マイコバクテリウム種核酸配列とにより提供される検出可能シグナルを上記試料中に検出する工程；およびプローブ１、プローブ３、プローブ５、プローブ６、プローブ７、プローブ８、プローブ９、およびプローブ１０とそれらのそれぞれの標的マイコバクテリウム種核酸配列とにより提供される検出可能シグナルの不在を検出する工程により確認されることが好ましい。

本発明の方法は、上記試料からの多剤耐性マイコバクテリウム種の不在が、プローブ１、プローブ３、プローブ５、プローブ６、プローブ７、プローブ８、プローブ９、およびプローブ１０とそれらのそれぞれの結合される標的マイコバクテリウム種核酸配列とにより提供される検出可能シグナルを上記試料中に検出する工程；およびプローブ２およびプローブ４とそれらのそれぞれの標的マイコバクテリウム種核酸配列とにより提供される検出可能シグナルの不在を検出する工程によって確認されることが好ましい。

これに関して、プローブ２およびプローブ４は、変異型ヒト型結核菌核酸に結合する。プローブ２は、katG遺伝子内の特異的変異標的部位に結合し、そしてプローブ４は、inhA遺伝子内の特異的変異標的部位に結合する。プローブ２およびプローブ４は、それらの特異的変異配列にのみ結合し、野生型の標的配列を結合しない。したがって、試料中のヒト型結核菌核酸へのプローブ２および／またはプローブ４の結合は、この試料がそれぞれkatGおよび／またはinhAに変異を有する核酸を含むことを示している。プローブ２およびプローブ４により検出される変異は、イソニアジドへの耐性に関与している。

プローブ１、プローブ３、およびプローブ５〜プローブ１０は、野生型ヒト型結核菌核酸に結合する。プローブ１は、katG遺伝子内の標的部位（プローブ２により結合される配列の野生型バージョン）に結合する。プローブ３は、inhA遺伝子内の標的部位（プローブ４により結合される配列の野生型バージョン）に結合する。したがって、試料中の核酸へのプローブ１および／またはプローブ３の結合は、この試料がそれぞれkatGおよび／またはinhAに関して野生型である核酸を含むことを示している。プローブ１およびプローブ３は、野生型配列にのみ結合し、それらの標的配列が変異されている場合は結合しない。

プローブ５〜プローブ１０は、野生型rpoB遺伝子の８１塩基対標的領域内で、野生型のヒト型結核菌核酸にのみ結合する。試料が野生型rpoB核酸を含む場合、プローブ５〜プローブ１０の全部が結合する。他方、試料中の核酸が、リファンピン耐性と関連した特異的なrpoB変異を有する場合、結合するrpoBプローブは６個未満である。

より詳細には、試料において、多剤耐性マイコバクテリウム種核酸の存在が、変異型核酸へのプローブ２およびプローブ４の少なくとも１つの結合を検出する工程（すなわち、プローブ２および／またはプローブ４とそれらのそれぞれの結合される標的配列とにより提供される検出可能シグナルを検出する工程）、および野生型核酸へのプローブ１、プローブ３の少なくとも１つ、およびプローブ５〜プローブ１０の少なくとも１つの結合がないことを検出する工程（すなわち、プローブ１、プローブ３、およびプローブ５〜プローブ１０とそれらのそれぞれの標的配列とにより提供される検出可能シグナルの不在を検出する工程）によって確認される。

他方、プローブ２およびプローブ４が試料中の核酸に結合しない（このことは、プローブ２およびプローブ４とそれらのそれぞれの標的配列とにより提供される検出可能シグナルの不在によって示される）が、プローブ１、プローブ３の両方およびプローブ５〜プローブ１０の全部が試料中の核酸に結合する（このことは、プローブ１、プローブ３およびプローブ５〜プローブ１０とそれらのそれぞれの結合される標的配列とにより提供される検出可能シグナルの検出によって示される）場合、このことは、この試料が多剤耐性ヒト型結核菌核酸を含まないことを示している。

検出可能シグナルがプローブの全部とそれらのそれぞれの標的核酸配列とによって提供される場合、これは、試料中に、野生型rpoB遺伝子を有する（すなわち、リファンピンに対して感受性である）細菌由来のヒト型結核菌核酸が存在することを示している。この試料はまた、katG遺伝子およびinhA遺伝子の変異型を有する（すなわち、イソニアジドに対して耐性である）ヒト型結核菌由来の核酸、ならびにkatG遺伝子およびinhA遺伝子の野生型を有する（すなわち、イソニアジドに対して感受性である）ヒト型結核菌由来の核酸も含む。したがって、ＩＮＨモノ耐性ヒト型結核菌および野生型（ＲＩＦ／ＩＮＨ感受性）ヒト型結核菌の混合物が検出される。

必要に応じて、１０より多くのプローブを用いる、すなわち、本明細書中に詳述した１０のプローブに加えてさらなるプローブを含める。これらのさらなるプローブは、他のマイコバクテリウム種遺伝子における変異の検出、またはマイコバクテリウム種核酸以外の核酸の検出（例えば、他の細菌種の分析のためのより広範な診断アレイの一部として）のために有用であり得る。

１つの実施態様では、上で詳述したプローブ５〜プローブ１０（配列番号５〜１０）の１つ以上が、以下の表１ａに提供されるプローブ（プローブ１１〜プローブ３２、配列番号１１〜配列番号３２）の１つ以上、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２と置き換えられ得るか、または併用され得る。プローブ１１〜プローブ３２の各々は、野生型rpoB遺伝子内で、野生型ヒト型結核菌核酸に結合する。したがって、試料が野生型rpoB核酸を含む場合、プローブ１１〜プローブ３２は、試料中の核酸に結合し、そして試料が変異型rpoB核酸を含む場合、プローブ１１〜プローブ３２の少なくとも１つが試料中の核酸に結合しない。したがって、プローブ１１〜プローブ３２は、リファンピンに対して耐性であるヒト型結核菌を検出するために有用である。

本発明はまた、本発明のプローブ配列１１〜プローブ配列３２に少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するプローブ配列を包含する。

本アッセイは、使用可能なヒト型結核菌核酸の濃度に依存して、事前に増幅工程を行うかまたは行うことなく使用され得る。増幅は、当該分野で公知の方法によって、好ましくは、ＰＣＲによって行われ得る。

好ましくは、核酸含有試料中のマイコバクテリウム種核酸を増幅する工程は、シグナルの検出前に実施される。最も好ましくは、試料中のマイコバクテリウム種核酸を増幅する工程は、プローブのセットを核酸含有試料と接触させる前に行われる。

ヒト型結核菌核酸の増幅は、好ましくは、配列特異的プライマー対を用いて行われる。これらのプライマーは、ヒト型結核菌核酸内の標的部位に結合して伸長され、核酸が合成される。本発明のプライマーは、従来のソフトウェア、例えば、Primer Express（Applied Biosystems）を用いて、所望のパラメーターの選択に基づいて、標的遺伝子配列に結合するように設計される。これに関して、結合条件は、高レベルの特異性が提供されるようなものであることが好ましい。プライマーの融解温度（Ｔ_ｍ）は、好ましくは５０℃以上であり、そして最も好ましくは約６０℃である。本発明のプライマーは、好ましくは、自己相補体形成およびダイマー形成（プライマー−プライマー結合）を最小限にするようにスクリーニングされる。

プライマー対は、順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを含む。順方向プライマーは、標的ヒト型結核菌核酸の相補的な非コード（アンチセンス）鎖に結合するものであり、そして逆方向プライマーは、標的ヒト型結核菌核酸のコード（センス）鎖に結合するものである。

順方向オリゴヌクレオチドプライマーおよび逆方向オリゴヌクレオチドプライマーは、代表的には１〜５０ヌクレオチド長であり、好ましくは１０〜４０ヌクレオチド長であり、より好ましくは１５〜２５ヌクレオチド長である。短いプライマーの使用が一般に好都合である。なぜなら、これにより、標的核酸へのアニーリングをより迅速にすることができるからである。

以下の表２に示す順方向（Ｆ）オリゴヌクレオチドプライマーおよび逆方向（Ｒ）オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、特に良好な結果が得られている。

しかし、上記プライマー配列とは１以上のヌクレオチドが異なる改変体が用いられ得ることが理解される。これに関して、保存的置換が好ましい。また、プライマーが、上記プライマーと５より多くのヌクレオチド位置で異ならないことが好ましい。

プローブは必要に応じて標識される。しかし、プローブは非標識で、代わりに試料中の標的マイコバクテリウム種核酸が標識されることが好ましい。標的核酸は、ＰＣＲ増幅の間に、標識したプライマーを用いることによって標識され得る。したがって、１つの実施態様では、試料中の標的核酸が標識され、そしてアッセイは、標識を検出する工程および標識の存在をマイコバクテリウム種核酸の存在と関連付ける工程を包含する。標識は、放射性標識であり得るが、好ましくは非放射性標識、例えば、ビオチン、ジコキシゲニン、または蛍光シグナル（例えば、フルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ））である。標識は、直接的に（例えば、写真フィルムまたはＸ線フィルムへの曝露により）または間接的に（例えば、二相システムで）検出され得る。間接的な標識検出の一例は、標識への抗体の結合である。別の例では、標的核酸をビオチンで標識し、そして検出可能シグナルを生じる検出可能な分子または酵素に結合したストレプトアビジンを用いて検出する。発色検出システムもまた用いられ得る（例えば、アルカリホスファターゼ＋NBT／BCIP）。

本発明はまた、試料中の多剤耐性マイコバクテリウム種を検出するためのアッセイに使用される単一プローブを提供する。このプローブは、配列ＴＧＣＣＧＣＴＧＧＴもしくはその相補体；またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列もしくはその相補体を含む、プローブ１；配列ＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣもしくはその相補体；またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列もしくはその相補体を含む、プローブ２；配列ＣＧＡＧＡＣＧＡＴＡもしくはその相補体；またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列もしくはその相補体を含む、プローブ３；配列ＣＧＡＧＡＴＧＡＴＡもしくはその相補体；またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列もしくはその相補体を含む、プローブ４；配列ＧＡＧＣＣＡＡＴＴＣもしくはその相補体；またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列もしくはその相補体を含む、プローブ５；配列ＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧもしくはその相補体；またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列もしくはその相補体を含む、プローブ６；配列ＣＡＧＡＡＣＡＡＣＣもしくはその相補体；またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列もしくはその相補体を含む、プローブ７；配列ＣＧＣＴＧＴＣＧＧＧもしくはその相補体；またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列もしくはその相補体を含む、プローブ８；配列ＡＣＣＣＡＣＡＡＧＣもしくはその相補体；またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列もしくはその相補体を含む、プローブ９；配列ＴＣＧＧＣＡＣＴＧＧもしくはその相補体；またはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列もしくはその相補体を含む、プローブ１０からなる群から選択され、プローブ１、プローブ２、プローブ３、およびプローブ４の配列内の下線部のヌクレオチドは必須であり、いかなる他のヌクレオチドにも置換され得ない。

本明細書において、本発明の配列に「少なくとも９０％の配列同一性」を有する配列という場合、本発明は、本発明のプローブ配列に好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するプローブ配列も包含する。

本発明はまた、試料中の多剤耐性マイコバクテリウム種核酸、好ましくは多剤耐性ＭＴＣ核酸（例えば、多剤耐性ヒト型結核菌核酸）の検出用組成物の製造のための、本発明による単一プローブの使用を提供する。

また、本発明によって、多剤耐性マイコバクテリウム種核酸、好ましくは多剤耐性結核菌群（ＭＴＣ）核酸（例えば、多剤耐性ヒト型結核菌核酸）の検出のためのキットが提供され、これは、本発明による単一プローブ、または本発明によるプローブのセットを含む。

本発明の別の局面によれば、試料中の多剤耐性マイコバクテリウム種を検出するためのアッセイに使用される核酸プローブの代替のセットが提供される。このセットは、第１の標的配列ＡＣＣＡＧＣＧＧＣＡまたはその相補体に結合する１０ヌクレオチドの核酸配列を含む、プローブ１；第２の標的配列ＧＣＣＧＧＴＧＧＴＧまたはその相補体に結合する１０ヌクレオチドの核酸配列を含む、プローブ２；第５の標的配列ＧＡＡＴＴＧＧＣＴＣまたはその相補体に結合する１０ヌクレオチドの核酸配列を含む、プローブ５；第６の標的配列ＣＴＧＧＴＣＣＡＴＧまたはその相補体に結合する１０ヌクレオチドの核酸配列を含む、プローブ６；第７の標的配列ＧＧＴＴＧＴＴＣＴＧまたはその相補体に結合する１０ヌクレオチドの核酸配列を含む、プローブ７；第８の標的配列ＣＣＣＧＡＣＡＧＣＧまたはその相補体に結合する１０ヌクレオチドの核酸配列を含む、プローブ８；第９の標的配列ＧＣＴＴＧＴＧＧＧＴまたはその相補体に結合する１０ヌクレオチドの核酸配列を含む、プローブ９；第１０の標的配列ＣＣＡＧＴＧＣＣＧＡまたはその相補体に結合する１０ヌクレオチドの核酸配列を含む、プローブ１０を含み、１つのプローブがそれぞれの標的配列に結合されると検出可能シグナルが提供される。

このプローブの別のセットは、先に記載したプローブのセットとは、プローブ３およびプローブ４（これらはinhA遺伝子を標的とする）が必須でない点で異なる。しかし、このプローブのセットは、プローブ１およびプローブ２（これらはkatG遺伝子を標的とする）と、プローブ５〜プローブ１０（これらはrpoB遺伝子を標的とする）とを含む。したがって、このプローブのセットは、rpoB遺伝子の変異（ＲＩＦ耐性を付与）およびkatG遺伝子の変異（ＩＮＨ耐性を付与）を検出するために有用である。

好ましくは、このプローブの別のセットは、配列ＴＧＣＣＧＣＴＧＧＴまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ１；配列ＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ２；配列ＧＡＧＣＣＡＡＴＴＣまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ５；配列ＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ６；配列ＣＡＧＡＡＣＡＡＣＣまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ７；配列ＣＧＣＴＧＴＣＧＧＧまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ８；配列ＡＣＣＣＡＣＡＡＧＣまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ９；配列ＴＣＧＧＣＡＣＴＧＧまたはそれに少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、プローブ１０を含み、プローブ１、プローブ２、プローブ３、およびプローブ４の配列内の下線部のヌクレオチドは必須であり、いかなる他のヌクレオチドにも置換され得ない。

本発明のこの別の局面によれば、試料中の多剤耐性マイコバクテリウム種の存在または不在を検出する方法も提供され、この方法は、（ａ）上記のようなプローブの代替のセットを、核酸含有試料と接触させる工程であって、１つのプローブが上記試料中のマイコバクテリウム種核酸に結合されると検出可能シグナルが提供される、工程；および（ｂ）上記検出可能シグナルを検出する工程を包含する。したがって、この方法は、katG遺伝子の変異およびrpoB遺伝子の変異が単一のアッセイで同時に検出されることを可能にする。

本発明はまた、多剤耐性マイコバクテリウム種核酸の検出のためのキットを提供し、このキットは、上記のようなプローブの代替のセットを含む。このキットを用いると、rpoB遺伝子の変異およびkatG遺伝子の変異が、単一のアッセイで同時に検出され得る。

本発明の実施態様を、以下に記載の実施例によってより詳細に説明する。実施例で言及した結果は、添付の図面によって図示される。

より詳細には、図１Ａは、６つの異なる非変異型（野生型）rpoB遺伝子プローブ（１）、非変異型katGプローブ（２ａ）、変異型（コドン３１５）katG遺伝子プローブ（２ｂ）、非変異型inhA遺伝子プローブ（３ａ）、変異型（コドン２８０）inhA遺伝子プローブ（３ｂ）および発色コントロールプローブ（４）を含むスクリーニングマクロアレイを図示する。

図１Ｂは、非変異型（野生型）rpoBプローブ（１〜２７）、発色コントロールプローブ（Ｂ）および配向用インクスポット（Ａ）を含む走査マクロアレイを図示する。

図２Ａ、Ｂは、rpoB遺伝子、katG遺伝子、またはinhA遺伝子のいずれにも変異を有しないヒト型結核菌野生型単離株（すなわち、ＲＩＦ／ＩＮＨ感受性単離株）と接触させた展開したマクロアレイメンブレンの外観を図示する。プローブ１、プローブ３、およびプローブ５〜プローブ１０は、試料中に全ての結合された核酸を有し、このことは、ＲＩＦ／ＩＮＨ感受性遺伝子型の存在を示す。

図２Ｃ、Ｄは、rpoBのコドン５３１に変異を有するヒト型結核菌単離株（１）、およびkatGのコドン３１５に変異を有するヒト型結核菌単離株（２）と接触させた展開したマクロアレイメンブレンの外観を図示する。rpoBプローブのうち結合したのは６未満であり、このことは、rpoB変異の検出を示し、そして変異型katGプローブが結合され、このことは、katG変異の検出を示している。したがって、ＲＩＦ／ＩＮＨ耐性（すなわち、多剤耐性）の遺伝子型の存在を示している。

図３Ａは、サマラ単離株におけるＩＮＨ耐性と関連した変異を図示する。変異の92.9％はkatGのみにあり、変異の2.0％はinhAのみにあり、そして変異の5.1％が両遺伝子にある。

図３Ｂは、サマラ単離株におけるＲＩＦ耐性と関連した変異を図示する。走査アレイのプローブ３は、変異の1.3％を検出し、プローブ６は、変異の2.5％を検出し、プローブ９は、変異の1.1％を検出し、プローブ１２は、変異の0.8％を検出し、プローブ１７は、変異の4.2％を検出し、そしてプローブ２２は、変異の90.0％を検出した。

図４Ａは、実施例４（以下）で使用した本発明によるマクロアレイを図示する。スポットの符号は、以下の通りである：
１ インクスポット
２ コントロール
３ ヒト型結核菌rpoBの結核菌群特異的遺伝子座を検出するためのプローブMtbC
４ プローブ１（上記表１の）
５ プローブ２（上記表１の）
６ プローブ３（上記表１の）
７ プローブ４（上記表１の）
８ プローブ５（上記表１の）
９ プローブ６（上記表１の）
１０ プローブ７（上記表１の）
１１ プローブ８（上記表１の）
１２ プローブ９（上記表１の）
１３ プローブ１０（上記表１の）。

図４Ｂは、種々のヒト型結核菌株について得られたパターンを図示する：
パターン１ katG315のＡＧＣ−ＡＣＣ変異＋rpoB526の変異型対立遺伝子を有する株；
パターン２ katG315のＡＧＣ−ＡＣＣ変異＋rpoB遺伝子における挿入（５１４コドンでＴＴＣを挿入）を有する株；
パターン３ 野生型株；
パターン４ rpoB531の変異型対立遺伝子を有する株；
パターン５ katG315のＡＧＣ−ＡＣＡ変異を有する株；
パターン６ mabA-inhAオペロンの調節領域におけるinhA^C-15T変異を有する株；
パターン７ rpoB516の変異型対立遺伝子を有する株。

（実施例１−ヒト型結核菌核酸の増幅）
サマラ（中央ロシア）からのヒト型結核菌の合計234の臨床単離株を、表現型試験および遺伝子型試験の両方のために入手した。

全ての喀痰標本をローウェンスタインジャンセン培地で培養し、それらの正体を増殖；巨視的および微視的外観；ならびにＤＮＡハイブリダイゼーションの試験の組み合わせを用いて確認した。薬物感受性試験を、既知の耐性率法（resistance ratio method）を用いて実施した。

細胞懸濁液を等容量のクロロホルムと共に＋８０℃で３０分間加熱し、次いで氷上で冷却し、そして遠心分離することにより、ＤＮＡを抽出した。上相（粗細胞溶解物）をＰＣＲ増幅のために使用した。

rpoB遺伝子、katG遺伝子、およびinhA遺伝子の領域のマルチプレックスＰＣＲ増幅を、３対のプライマーを用いて行い、次いでナイロンメンブレン細片（Osmonics Inc., USA）上に固定化した正常オリゴヌクレオチドプローブおよび変異型オリゴヌクレオチドプローブ（変異が生じているrpoB遺伝子、katG遺伝子、およびinhA遺伝子の一本鎖断片）との増幅産物のドットハイブリダイゼーションを行った。

より詳細には、ビオチン標識ＰＣＲ産物を、３対のプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲで生成した。第１の対は、ＲＩＦ耐性と一致した変異の検出のために、rpoB遺伝子の８１ｂｐ「コア」領域を含む断片の増幅用であった。第２の対は、コドン３１５を含むkatG遺伝子断片の増幅用であった。第３の対は、調節領域を含むinhA遺伝子断片の増幅用であった。

ＰＣＲを20μl容量で行った。これは、２μlの10×ＰＣＲ緩衝液（Bioline Ltd., London UK）；0.5ユニットのTaq-ポリメラーゼ（Bioline）；0.5μlの２mM dNTP混合物（Bioline）；20μMの６つの各プライマー、および１μlの上記のように調製したＤＮＡ抽出物を含む。温度サイクリングは、Perkin Elmer 9700 Thermocyclerで以下の増幅プログラムパラメーターを用いて行った：
９５℃にて５分維持
９５℃にて１５秒
６５℃にて３０秒を３０サイクル
７２℃にて６０秒
７２℃にて５分維持。

ＰＣＲ産物（長さ260bp；150bp；140bpの３断片）の存在を、た2.0％アガロースゲルでの電気泳動により臭化エチジウムで染色し検出した。次いで、これらのＰＣＲ産物をハイブリダイゼーションのために用い、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ発色システムを使用して結果を可視化した。

（実施例２−ハイブリダイゼーション）
メンブレンに、特定の順序で、スポッティング装置（BioGene, UK）を用いてオリゴヌクレオチドプローブをスポットし、アレイを作製した（図１を参照のこと）。ＵＶ架橋し、0.5×SSC中で２回洗浄した後、メンブレンを風乾し、別々の細片に切断し、２mlプラスチックチューブの中に入れた。

第１のアレイは、単離株をスクリーニングするために使用し、これは、rpoB遺伝子、katG遺伝子、およびinhA遺伝子における最も頻繁な変異を検出するプローブを含んでいた（図１Ａを参照のこと）。rpoB遺伝子のために、アレイは、６つの非変異型プローブを含んでいた（プローブ３は、コドン５１１、５１３および５１４における変異を検出；プローブ６およびプローブ９は、コドン５１３、５１４および５１６用；プローブ１２は、コドン５１６用；プローブ１７は、コドン５２６用；およびプローブ２２は、コドン５３１用）。katG遺伝子の野生型および最も頻繁な変異（コドン３１５でのＡＧＣ→ＡＣＣ）、およびinhA遺伝子の野生型および調節領域での最も頻繁な変異（コドン２８０でのＧ→Ｔ）用のプローブもまた含ませた。

第２の走査アレイを、rpoB遺伝子での他のより一般的ではない変異を検出するために開発した。８１ｂｐコア領域（すなわち、リファンピン耐性の原因となる変異が見出される配列）の全体をカバーするように、rpoB遺伝子用に全部で２７の非変異型オリゴヌクレオチドプローブを設計した（図１Ｂを参照のこと）。

ハイブリダイゼーションを以下の通りに行った。簡潔には、増幅産物を、等容量の変性溶液（0.4M NaOH、0.02M EDTA）を室温で１５分間添加することにより変性した。個々のアレイを含む各チューブ中に、500μlのハイブリダイゼーション溶液（5×SSPE；0.5％ SDS）および20μlの変性したＰＣＲ産物を添加した。ハイブリダイゼーションオーブン中で７２℃にて３０分間チューブを旋回させて、ハイブリダイゼーションを行った。次いで、メンブレンを、0.1M Tris-0.1M NaCl溶液（pH7.5）中で２回洗浄し、そして0.1％ブロッキング試薬溶液（Roche, Mannheim, Germany）中で１分間インキュベートした。ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体溶液（1:100）（BioGenex, San Ramon, USA）中で室温にて３０分間インキュベートし、洗浄した後、メンブレンを、発色のために遮光性コンテナ中で1:250 NBT-BCIP溶液（ニトロブルーテトラゾリウム, USB, Cleveland, USA, 75mg/ml（DMF中）, ブロモ−クロロ−インドリルホスフェート, USB, Cleveland, USA, 50mg/ml（DMF中））中でインキュベートし、洗浄し、そして風乾した。

（配列決定）
選択した単離株のrpoB遺伝子断片およびkatG遺伝子断片の配列決定を行い、マクロアレイ薬物感受性試験の結果を検証した。鋳型ＤＮＡを、クロロホルム抽出により上記のように調製した。増幅産物を水で1:25希釈し、そしてBeckman Coulter SEQ8000 Genetic Analysis Systemを用いて配列決定した。SEQ8000ソフトウェアを用いて配列データを解析した。

（結果）
全てのサマラ培養株（M. fortuitumと同定された一株を除く）が、関連検査室における慣用の表現型試験を用いて、ヒト型結核菌（M. tuberculosis）であると正確に同定された。

ロシアのマイコバクテリウム培養株からの234標本のうち233のマルチプレックス増幅が成功であった（M. fortuitumを除く）。展開したメンブレンの外観を図２に示す。マクロアレイ薬物感受性試験の結果を以下の表３に示す。

全体で、単離株の48.7％がリファンピンに対する耐性と一致した変異を有し、単離株の67.9％がイソニアジドに対する耐性と一致した変異を有し、そして単離株の46.5％がrpoB遺伝子およびkatG（またはinhA）遺伝子の両方において変異を有した。リファンピン耐性と一致した変異を有する、慢性結核の患者から単離したヒト型結核菌株のうち１つを除く全てが、イソニアジド耐性と一致した変異も有した。

遺伝子型（マクロアレイ）薬物感受性試験および表現型薬物感受性試験の結果は、イソニアジド耐性について90.4％およびリファンピン耐性について79.3％で合致した。ほとんどの症例（60％を上回る症例）における相違は、スクリーニングマクロアレイによって同定される耐性と関連した変異が存在しない場合に、表現型では耐性と決定されたことに起因していた。このことは、ＲＩＦまたはＩＮＨのいずれかに対する耐性が、他の変異とも関連し得ることを示唆する。

次いで、本発明者らは、リファンピンおよびイソニアジドに対する耐性と一致した変異のスペクトルを分析した（図３を参照のこと）。90％以上の症例で、ＩＮＨに対する耐性は、katG遺伝子のコドン３１５での変異にのみ起因していた。2.0％の症例では、耐性はinhA遺伝子の変異のみに起因し、そして5.1％の症例では、両方の遺伝子が耐性発達に寄与した（図３Ａを参照のこと）。ＲＩＦ耐性と一致した変異を有する全ての単離株のうち、90.0％がrpoB遺伝子のコドン５３１で、そして4.2％がコドン５２６で変異を有した（図３Ｂを参照のこと）。耐性株の6.0％未満では、他の変異（コドン５１１〜５１６）が検出された。第２のマクロアレイを設計し、前にスクリーニングアレイで「野生型」として決定した２７のヒト型結核菌ＤＮＡ標本において、リファンピン耐性と一致し得る８１ｂｐコア領域内のさらなる変異を検出した（表４を参照のこと）。

既に野生型であると示唆されている２７のヒト型結核菌単離株のうち２０の標本（74.7％）が、リファンピン耐性と一致したさらなる変異を有した。しかし、表現型で耐性であった７つの試料（25.9％）は、コア領域にいかなる変異も有していなかった。

マクロアレイ薬物耐性試験結果を検証するために、選択した単離株においてrpoB遺伝子断片およびkatG遺伝子断片を配列決定した。rpoB遺伝子配列決定を、上記の表現型がリファンピン耐性である７つの単離株について行った。これらの単離株のうち２つが、rpoB遺伝子において点変異を有することが判明した：１つは、コドン５２６でＣＡＣ→ＣＴＣ（Ｈ→Ｙ）置換を有し、そしてもう一方は、コドン５３３でＣＴＧ→ＣＣＧ（Ｌ→Ｐ）置換を有する。別の５つの単離株（リファンピン耐性株の総数のうち4.2％）では、いかなる変異も検出されなかった。このことは、これらの症例では、リファンピン耐性は、他の遺伝子における変異に起因することを示唆した。

katG遺伝子の断片を、マクロアレイ結果に従って選択した６つの耐性単離株および６つの感受性単離株から配列決定した。表現型が感受性である単離株の全てが、野生型であることが判明し、いかなる変異も有していなかった。マクロアレイに従ってkatG遺伝子に変異を有する６つの単離株では、最も一般的な置換ＡＧＣ→ＡＣＣ（Ｓ３１５Ｔ）が検出された。

（考察）
２つのマクロアレイからの結果を組み合わせることにより、表現型がリファンピン耐性であった培養株の95.3％において、および表現型がイソニアジド耐性であった培養株の90.4％において、耐性と一致した変異の検出が可能であった。これらの一致数は、非業務用分子薬物感受性分析システムについて前に報告されたよりも高く、このことは、アレイにさらなるプローブを入れることにより、システム性能が向上することを確証する。rpoB遺伝子およびkatG遺伝子の配列分析は、マクロアレイ法が特異性が高いことを実証した。

（実施例３）
（調べた培養株）
パネル１．ＲＩＦ耐性の併発を伴うまたは伴わない465のヒト型結核菌ＩＮＨ耐性株を用いて、遡及的調査において多剤耐性（ＭＲＤ）スクリーンアレイを評価した。これらの株は全て、１９９８年１月から２００３年１２月までにHPA Mycobacterial Reference Unit（ＭＲＵ）に照会されたＩＮＨ耐性株であった。

パネル２．２００３年９月から１２月の間に同定および薬物感受性試験についてHPA MRUに照会された605のマイコバクテリウム連続培養株を、マクロアレイの性能の予測調査に使用した。

マイコバクテリウム培養株をローウェンスタインジャンセン培地または液体培養培地（MGIT, Becton Dickinson, UKまたはMB BacT Alert, Biomerieux, Cambridge, UKのいずれか）で培養した。培養株を、微視的外観および巨視的外観、増殖特性、生化学試験、およびＤＮＡハイブリダイゼーション（Accuprobe; Genprobe, San Diego, USA）の組み合わせを用いて同定した。イソニアジドおよびリファンピシンに対する耐性を、ローウェンスタインジャンセン培地での耐性率法（ＲＥＦ）を用いて決定した。

（ＤＮＡ抽出）
クロロホルム抽出を用いることによりマイコバクテリウムからＤＮＡを抽出した。細菌培養物のループまたは100μlの液体培養培地をマイクロ遠心チューブに移し、そして100μlの精製水中に懸濁し、そして等容量のクロロホルムを添加した。これらのチューブを８０℃にて２０分間加熱し、５分間冷凍庫中に置き、ボルテックスにより手短に混合し、そして12000ｇで３分間遠心分離し、その直後にＰＣＲに供した。

（ＰＣＲ）
５’末端にビオチン化したプライマーを用いるＰＣＲによって標的ＤＮＡを増幅し、ＰＣＲ産物を標識した。20μlの反応混合物は、5μlの精製水、10μlの2×反応緩衝液、5μlのプライマーミックス、0.2μlのTaq DNAポリメラーゼ（５ユニット/μl、Bioline）、および１μlのＤＮＡ鋳型を含有した。2×反応緩衝液は、2.0mlの10×アンモニウム反応緩衝液（NH₄ Bioline）、600μlの50mM塩化マグネシウム（MgCl₂, Bioline）、40μlの各100mM dNTP（dATP、dCTP、dGTP、およびdTTP, Bioline）および7240μlの精製水を含有した。プライマーミックスは、2.5μlのプライマーkatPGBIOおよびkatP6BIO（各200μM）、10μlのプライマーinhAP、TomiP2BIO、IP1（de Beenhouwerら, 1995）およびBrpoB1420R（各200μM）、および455μlの精製水を含有した。

増幅反応をＤＮＡサーモサイクラー（GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems, UK）で行った。サーモサイクラー反応条件は、９５℃にて３分；９５℃にて１５秒、６５℃にて３０秒、７２℃にて６０秒を３０サイクル；および７２℃にて５分の最終伸長サイクルであった。

（ＭＤＲスクリーンマクロアレイ）
マクロアレイは、ナイロンメンブレン細片（MagnaGraph Nylon Transfer Membrane 0.22 Micron, OSMONICS, USA）上にスポットとして固定化した１１のプローブからなった。第１のプローブ（MRUMtb）は、結核菌群に特異的であった。次の４つのプローブは、イソニアジドに対する耐性を検出するために設計した：２つのプローブ（katGwtおよびinhAwt）は、各遺伝子の野生型領域と相同であり、そしてもう２つ（katGS315TおよびinhAmut）は、最も頻繁に見られた変異と相同であった（katG遺伝子におけるS315T変異およびinhAのプロモーター中の推定リボソーム結合部位の５’末端のinhA^C-15T変異）。次の６つのプローブ（P3、P6、P9、P12、P17、および1371A）を用いて、リファンピシンに対する耐性と関連した変異を検出した。これらの６つのプローブは、rpoB遺伝子の８１ｂｐ超可変領域（RRDR）全体を構成する。

IP1プライマー（de Beenhouwerら, (1995)）を発色コントロールとして使用し、そしてDeskjet 690Cインク（Hewlett-Packard, UK）を配向スポットのために使用した。

（ハイブリダイゼーションおよび色検出）
10μlのＰＣＲ産物を10μlの変性溶液（400mM NaOH、20mM EDTA）中で変性した。固定化プローブを含むナイロン細片へのＰＣＲ産物のハイブリダイゼーションを、500μlのハイブリダイゼーション緩衝液（5×SSPE、0.5％SDS）中でメンブレンを６０℃で１５分間インキュベートすることによって行った。これらの細片を、ストリンジェント洗浄緩衝液（0.4％SSPE、0.5％SDS）中で６０℃にて１０分間洗浄した。この緩衝液を捨て、25mlのリンス緩衝液（0.1M Tris 0.1M NaCl, pH 7.5）を添加し、オービタルシェーカーで１分間攪拌した。次いで、この緩衝液を捨て、そしてこの工程を１回繰り返した。

細片を、25μlのアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（400μg/ml）を含む５mlのSAP緩衝液（リンス緩衝液、0.5％ B-Mブロッキング試薬）中で室温にて１５分間インキュベートし、ハイブリダイズしたビオチン化ＰＣＲ産物を検出した。細片をリンス緩衝液中で２回洗浄し、そして0.1M Tris、0.1M NaCl（pH 9.5）の緩衝液中で平衡化した。最後に、この緩衝液を捨て、そしてメンブレンを、15μlのBCIP（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート）および10μlのNBT（ニトロブルーテトラゾリウム）を含む５mlの同じ緩衝液中で５分間インキュベートした。これらの色素原は、アルカリホスファターゼの基質として働き、細片上にパターンを生じ、これを判断し得た。

（結果）
（遡及的調査）
全部で465のＩＮＨ耐性単離株をＭＤＲスクリーンアレイによって分析した。mabA-inhAの調節領域における変異を、250の単離株で同定した（53.8％）。これらの単離株の中で、プローブinhmut（inhA^C-15T変異を検出するように特に設計した）は、250の単離株のうち240で陽性であった（96.0％）。katGS315Tプローブ（katG遺伝子におけるS315T変異を検出するように特に設計した）は、465単離株のうち161で陽性ハイブリダイゼーションシグナルを示した（34.6％）。katGwtプローブおよびkatS315Tプローブは両方とも９つの単離株でハイブリダイズできなかった（1.9％）。４つの単離株（0.9％）は、katGS315Tでは陽性、そしてinhAmutおよびinhAwtで陰性のパターンを示した。４１の単離株（8.8％）では、薬物感受性のプロフィールを得た。

（予測調査）
ＭＤＲスクリーンを609の臨床単離株に供し、そして結果を、慣用の同定ならびにイソニアジドおよびリファンピシンの感受性試験と比較した。

（結核菌群の検出）
試験期間の間に同定および薬物感受性分析のために受容した609の培養株からは、ＰＣＲ産物が497の培養物から得られた（81.6％）。これらの497の陽性反応のうち、マクロアレイを用いたハイブリダイゼーションによって、356（71.6％）が、結核菌群であると同定され、そして141（28.4％）が、非結核性マイコバクテリウム（ＮＴＭ）として同定された。遺伝子型が結核菌群であると同定された356の培養株のうち353（99.2％）が、表現型試験によって結核菌群であることが確認された。遺伝子型でＮＴＭであると決定した141のうち137（97.2％）が、表現型で確認された。

（感受性ヒト型結核菌単離株の検出）
結核菌群であると同定された356の単離株のうち、マクロアレイを用いて、289（81.2％）が、ＩＮＨおよびＲＩＦに対して感受性であるヒト型結核菌単離株であると同定された。277（95.8％）が、同定および慣用の感受性試験と一致した。３つ（1.1％）は、表現型ではＩＮＨに対して耐性であると分類され、そして１つ（0.3％）は、表現型ではＲＩＦに対して耐性であると分類された。

（ヒト型結核菌rpoB、katG、およびmabA-inhA変異型の検出）
同定された356のＭＴＢ群単離株のうち、３８（10.7％）がＩＮＨモノ耐性株として、１６（4.5％）が多剤耐性（ＭＴＢ）株として、そして１３（3.6％）がＲＩＦモノ耐性株として同定された。マクロアレイ分析によるＩＮＨに対して耐性の３８のヒト型結核菌単離株のうち、３０（78.9％）は、慣用の感受性試験に従って正確に分類され、２つ（5.3％）は、表現型ではＭＤＲ−ＴＢであると分類され、そして５つ（13.2％）は、表現型では感受性のヒト型結核菌単離株であると分類された。これらの５つの単離株のうち、２つは、inhAwtプローブおよびinhAmutプローブに対して陰性ハイブリダイゼーションシグナルを示し、１つの単離株は、katGwtプローブおよびkatGS315Tプローブに対して陽性ハイブリダイゼーションシグナルを有し、そして２つの単離株は、inhAmutプローブに対して陽性のシグナルを有した。inhAmutプローブおよびkatGS315Tは、それぞれ１８単離株および１５単離株について陰性であった。５つの単離株は、両プローブと陰性反応を示した。

ＲＩＦにのみ耐性である１３のヒト型結核菌単離株の中で、８つ（61.5％）は、表現型ではＲＩＦに対して耐性であると同定され、４つ（30.8％）は、表現型ではＭＤＲ−ＴＢであると同定され、そして１つ（7.7％）は、表現型では感受性であると同定された（P3プローブおよびP6プローブについて陰性のハイブリダイゼーションシグナル）。

１６のＭＤＲ−ＴＢは全て、表現型でＭＤＲ−ＴＢとして同定された。これらの１６の単離株のうち、１２はkatGS315Tに対して、１つはinhAmutに対して、そして３つは両プローブに対して陽性のシグナルを有した。

マクロアレイによってＩＮＨまたはＲＩＦのいずれかに耐性であると決定された全ての株を考慮すると、ＩＮＨ耐性については５４のうち４８（88.9％）が、ＲＩＦ耐性については２９のうち２８（96.6％）が一致した。

（考察）
本明細書中に記載のＭＤＲスクリーンマクロアレイは、ヒト型結核菌の検出ならびに臨床単離株におけるＩＮＨおよびＲＩＦ感受性を決定するための迅速かつ感度の高い方法を提供する。この研究で開発したＭＤＲスクリーンアレイの基本原理は、各ヌクレオチド変化が、標的とその対応する野生型プローブ（P3、P6、P9、P17、1371A、katGwtおよびinhAwtプローブ）とのハイブリダイゼーションをブロックするか、または標的とその対応する変異型プローブ（katGS315TおよびinhAmutプローブ）とのハイブリダイゼーションを許容することである。

ＰＣＲ反応は、従来技術によって後に患者と診断された者からの363単離株のうち356（感度98.1％）で結核菌群の検出に関して陽性であった。慣用の同定手順によってヒト型結核菌であると分類された８単離株は、マクロアレイによって同定されなかった。結核菌群に対してＰＣＲが陽性であった356のうち１つの単離株のみが、表現型ではＮＴＭとして同定された（特異性99.7％）。

ＭＤＲスクリーンマクロアレイの結果は、356のヒト型結核菌症例のうち331に対して（93.0％）、および141のＮＴＭ単離株のうち137に対して（97.2％）、従来の同定および感受性試験結果と一致した。結果の異なる単離株のうちのいくつかは、野生型のアレイパターンを示したが、表現型では耐性として分類され（３つはイソニアジドに対して耐性であり、１つはリファンピシンに対して耐性）、あるいはそれらは、表現型でＭＤＲ−ＴＢとして分類され、そしてＲＩＦモノ耐性またはＩＮＨモノ耐性のマクロアレイパターンを有した。以前の研究は、およそ４％のＲＩＦ耐性単離株および30〜40％のＩＮＨ耐性単離株は、それぞれrpoB遺伝子の８１ｂｐ領域（ＲＩＦ耐性と関連した領域）内に、およびmabA-inhAオペロンの制御領域内／katG遺伝子内に、いかなる変異も有さないことを示していた。

95％より多くのＲＩＦ耐性株は、rpoB遺伝子の８１ｂｐ領域内の変異と関連する。この研究で使用したアレイは、アレイ上に貼り付けたプローブが、８１ｂｐの野生型超可変領域全体を構成するので、点変異、挿入および欠失を含む公知の変異を検出することができる。このマクロアレイは、全体的にrpoB変異の分布に顕著な差がないので、広範に使用される可能性を有する。

この研究で使用したアレイは、実施および判定が容易であり、首尾よく実施するために分子生物学の基本知識のみを必要とする。ＤＮＡ配列決定は、既にそれを日常的に実施する研究施設にとっては容易であるが、多くの臨床施設にとっては、装置および維持の費用のために対費用効果のある選択肢とならない。本発明者らのアレイの費用は、その広い適用性に重要な要因である。市販のINNOLiPAキットは、費用が720ＵＳドルであり、しかもＲＩＦに対する耐性のみを検出するのに対し、本アレイの費用は、好都合なことに、５ＵＳドル未満である。

種々の標的を試験できるＭＤＲマクロアレイの可能性が、この研究で示された。本明細書に記載のアレイは、katG遺伝子における他の特異的変異を検出するために拡張され得る。また、疫学マーカーが、株の流行性または散発性の伝播を追跡するために、アレイに追加され得る。

（実施例４）
（細菌単離株）
４０株のヒト型結核菌単離株のパネルを、rpoB RRDR、katG315、およびmabA-inh^-15遺伝子座での遺伝子型の範囲を得るために組み立てた。これらの単離株をＬＪで培養し、そして薬物感受性試験を、ローウェンスタインジャンセン培地で耐性率法を用いて行った。

（ＤＮＡ抽出物の調製）
ＬＪ培地からの細胞ペーストを100μlの精製水に懸濁し、そして等容量のクロロホルムを添加した。チューブを８０℃にて２０分間加熱し、５分間冷凍庫中に置き、そしてボルテックスミキサーを用いて手短に混合した。ＰＣＲ鋳型として使用する直前に、チューブを12000×gで３分間遠心分離した。

（ＰＣＲ）
ビオチン化標的ＰＣＲ産物を20μlのマルチプレックスＰＣＲ中で生成した。これは、1×アンモニウム反応緩衝液（Bioline Ltd., London UK）、各0.2mMのdNTP（Amersham Biosciences, Chalfont St Giles, UK）、1.5mMのMgCl₂（Bioline）、0.25mMのKatGP5IOおよびKatGP6BIOプライマー、1mMのINHAP3BIO、TOMIP2BIO、FTP1BIO、およびBrpoB1420Rプライマー（ThermoHybaid, Ulm, Germany）、１ユニットのTaq-ポリメラーゼ（Bioline）、および1μlのＤＮＡ鋳型を含んだ。プライマー配列を表２に示す。以下のプログラムを用いてPerkin Elmer 9700 Thermocyclerで温度サイクリングを行った：９５℃にて５分、３０×（６５℃にて３０秒、７２℃にて６０秒）、７２℃にて５分にて維持。

（ＭＤＲスクリーンマクロアレイの構築）
ヒト型結核菌rpoBの結核菌群特異的遺伝子座を標的する追加プローブと共に、上記の表１に示した１０個のプローブを用いて、マクロアレイを作製した。表１のプローブ１〜４は、ＩＮＨ耐性と関連した遺伝子座を分析するために設計されたものである。プローブ１およびプローブ３（K315WTCおよびtomiwt）は、katG315およびmabA-inhA^-15で野生型（ＷＴ）の遺伝子型を検出するが、プローブ２およびプローブ４（K315GCおよびtomimut1）はそれぞれ、各遺伝子座で最も頻繁に見られる遺伝子型katG315^AGC→ACCおよびmabA-inhA ^-15C→Tを検出する。プローブ６からプローブ１０（MRURP3、MRURP6、MRURP9、MRURP12、MRURP17、およびMRU1371A）は、ヒト型結核菌rpoBのRRDRのＷＴ遺伝子型の検出のための走査アレイを形成した。アレイ内のプローブ性能を最適化するために、オリゴヌクレオチドプローブを、３’ポリＴテイルを用いて合成した。オリゴヌクレオチドプローブ（Invitrogen, Paisley UK）を、0.001％ブロモフェノールブルーを含む水中で20μMに希釈し、そして手持形アレイ装置（VP Scientific, San Diego USA）を用いてナイロンメンブレン（Magnagraph 0.22μM, Osmonics, Minnetonka USA）に供した。

プローブに加えて、アレイを配向させるために、耐久性インクのスポットをメンブレンに供し、発色コントロールとして2μMのプライマーFTIP1BIOのスポットを供した。プローブをナイロンメンブレンにＵＶ架橋した。メンブレンを0.5％の20×SSC（Sigma, Poole, UK）中で洗浄し、次いで、乾燥し、切断し、そして2mlポリエチレンハイブリダイゼーションチューブ（Alpha Labs, Eastleigh, UK）中に置いた。

（ハイブリダイゼーションおよび色検出）
ビオチン標識したＰＣＲ産物を、等容量の変性溶液（0.4M NaOH、0.02M EDTA）を添加し、そして室温にて１５分間インキュベートすることにより変性した。変性したＰＣＲの20μlアリコートを、アレイおよび500μlハイブリダイゼーション溶液（5×SSPE；0.5％SDS）を含むチューブに添加し、これを６０℃にて１５分間、ハイブリダイゼーションオーブン中で攪拌した。次いで、細片を、ハイブリダイゼーションオーブン中で６０℃にて１０分間、洗浄緩衝液（0.4％SSPE、0.5％SDS）中で洗浄した。アレイを室温（ＲＴ）にて１分間、リンス緩衝液（0.1M Tris 0.1M NaCl, pH 7.5）中で攪拌した。このリンス工程を、0.1％ブロッキング試薬（Roche, Lewes UK）を含むリンス緩衝液を用いて、もう一度繰り返した。アレイを室温にて１５分間、0.1％ブロッキング試薬および1/25希釈のストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体400μg/ml（BioGenex, San Ramon USA）を含むリンス緩衝液中で攪拌した。次いで、メンブレンを、洗浄溶液で２回、そして基質緩衝液（0.1M Tris、0.1M NaCl、pH 9.5）で１回洗浄し、その後、0.34mg/ml NBT（USB, Cleveland, USA）および0.17mg/ml BCIP（USB）を含む基質緩衝液中で室温にて５分間インキュベートした。メンブレンを水で洗浄し、その後、風乾し、そしてハイブリダイゼーションパターンを記録した。

（マクロアレイの判定）
rpoBに対するプローブのいずれかへのハイブリダイゼーションが、その遺伝子座でのＷＴ遺伝子型を示し、逆に、所与のrpoBプローブとのハイブリダイゼーションがないことは、その遺伝子座での変異型遺伝子型を示す。K315WTCとのハイブリダイゼーションは、katG315 WT遺伝子型を示し、一方、それがないことは、この遺伝子座でのまたはこの遺伝子座の周囲での変異型遺伝子型を示す。K315WTCとのハイブリダイゼーションがないこと、およびK315GCとのハイブリダイゼーションは、katG315 AGC＞ACC遺伝子型を示す。同様に、TOMIWTとのハイブリダイゼーションは、mabA-inhA^-15 WT遺伝子型を示し、一方、これがないことは、この遺伝子座でのまたはこの遺伝子座の周囲での変異型遺伝子型を示す。TOMIWTとのハイブリダイゼーションがないこと、およびTOMIMUT1とのハイブリダイゼーションは、mabA-inhA^-15C→T遺伝子型を示す。

（ＤＮＡ配列決定）
単一のプライマー対（上記の表２を参照のこと）を用いて、上記の方法を用いて、rpoB、katG、またはinhAの単一のＰＣＲ産物を生成した。これらを精製水で1/100希釈し、そしてCEQ Quick Start配列決定キットおよびCEQ 8000機器（Beckman Coulter, High Wycombe, UK）を製造者の指示書に従って用いて配列決定した。上記の表２に示した増幅プライマーを用いて、両方向でＰＣＲ産物を配列決定した。

（結果）
４０株のヒト型結核菌単離株のパネルは、３０のＭＤＲ単離株、５つのＲＩＦモノ耐性単離株、１つのＩＮＨモノ耐性単離株、およびＲＩＦおよびＩＮＨに感受性である４つの単離株を含んだ。これらの単離株のrpoBのRRDRの配列決定により、ＷＴに加えて３６の異なる遺伝子型が判明した。ＲＩＦ耐性と最も一般的に関連したコドンの分析により、コドン５３１で２つの異なる変異、コドン５２６で６つの異なる変異、およびコドン５１６で４つの異なる変異が示された。コドン５０９、５１１、５１３、５１５、５２２、５２８、５２９、および５３３における変異もまた見られた。７つの単離株は２つの別個の一塩基置換を含み、４つの単離株は挿入を含み、そして３つが欠失を含んだ。２８の単離株のkatG315およびmabA-inhA^-15遺伝子型が決定された。ＷＴに加えて３つの遺伝子型がkatG315で見られ、そしてmabA-inhA^-15でのＣからＴへの置換がＷＴに加えて見られた。個々の単離株の遺伝子型を、以下の表５に示す。

パネル中の各単離株からのＤＮＡ粗抽出物を、ＭＤＲスクリーンマクロアレイを用いて分析した。その設計を図４に示し、これは、開発したアレイの代表例である。全ての単離株が、アレイを用いて判断可能なハイブリダイゼーションパターンを生じ、そして４０のうち３９が、存在する場合の変異を検出した。アレイを用いて変異型遺伝子型を与えることのできなかった１単離株は、rpoB RRDR中に９塩基の挿入を含んだ。他の単離株は全て、変異型または野生型が正確に同定された。ＲＩＦ耐性単離株の３５全てにおいて変異が検出された。同義変異を本当に有するＲＩＦ感受性単離株においても、変異が検出された。アレイは、３１のＩＮＨ耐性単離株のうち２７で、katG315またはmabA-inhA^-15 での変異を検出し、残りの４つは、これらの遺伝子座で野生型であった。

アミノ酸コドン５１６、５２６、および５３１は、リファンピン耐性に関与する最も普及しているコドンである。これらの３つのコドンは、ＲＩＦ耐性のヒト型結核菌症例の80％の原因となり得る。これらの位置に変異を有する単離株は全て、正確に同定された。rpoB531、rpoB526、およびrpo516の変異型対立遺伝子は、それらのそれぞれのプローブに対して陰性のハイブリダイゼーションシグナルを示した（図４Ｂ、パターン４、１、および７を参照のこと）。

５１１、５１３、５１５、５２２、５２９、および５３３コドンでのあまり頻繁でない他の変異、ならびに６つの二重の単変異、３つの異なる欠失、および２つの挿入が正確に同定された。コドン５２０に９ヌクレオチド（ＡＧＡＡＣＡＡＣＣ）の挿入を有する１つの株のみが、間違って同定された。

４つのＭＤＲ耐性単離株は、katGwtプローブおよびinhAプローブに対して陽性のハイブリダイゼーションシグナルと共に、イソニアジド耐性について野生型のパターンを示した。このことから、イソニアジドに対する耐性は、ヒト型結核菌のいくつかの染色体遺伝子座での種々の変異によって引き起こされると考えられる。katGの変異およびmabA-inhAオペロンの制御領域における変異は、ＩＮＨ耐性のヒト型結核菌単離株のおよそ30〜50％では見出されなかった。

katG遺伝子の関連部分およびmabA-inhAオペロンの制御領域の既知の配列を有する単離株は全て、正確に同定された。katG遺伝子の315位のアミノ酸において異なる変異を有するＩＮＨ耐性ヒト型結核菌単離株が正確に同定された。S315T変異を有するＩＮＨ耐性単離株は、katGwtプローブに対して陰性のハイブリダイゼーションシグナルおよびkatGmutプローブに対しては陽性のハイブリダイゼーションシグナルを有するパターンを有した（図１Ｂ（２））。他の異なる変異（S315 ACA、S315 AAC、またはS315 AGG）は、両プローブに対して陰性のハイブリダイゼーションシグナルを有するパターンを示した（図１Ｂ（５））。inhA^C-15T変異を有するＩＮＨ耐性ヒト型結核菌単離株は、inhAwtプローブに対して陰性のハイブリダイゼーションシグナルを示し、そしてinhAmutプローブに対して陽性のハイブリダイゼーションシグナルを示した（図１Ｂ（６））。

（考察）
遺伝子型の決定によるヒト型結核菌単離株における薬物耐性の検出は、従来の表現型感受性試験に代わる興味深いものである。なぜなら、結果が、生存生物の最小限の操作で、数時間内に生じ得るからである。このアプローチは、薬物耐性に対する遺伝子型マーカーが同定されている場合にのみ用いられ得ることが明白である。これは、ＭＤＲＴＢについては、rpoBのRRDRでのある範囲の変異がＲＩＦ耐性単離株に対して特異性が高く、そして２つの点変異（katGにおける変異およびinhAと関連した変異）がＩＮＨ耐性単離株に対して特異性が高い場合である。これらの３つの異なる遺伝子座を分析することにより、ＭＤＲＴＢが同定され得る。マクロアレイ分析を用いて、これらの全ての遺伝子座が並行して分析され得る。本発明者らは、上記ＭＤＲＴＢの検出に関して、このようなマクロアレイベースのアッセイを記載した。ＭＤＲスクリーンアレイアッセイの原理は、変異が、関連のＷＴプローブに対する標的のハイブリダイゼーションを妨げること、またはkatG315またはinhA遺伝子座の場合は対応する変異型プローブへのハイブリダイゼーションを許容することである。これは、rpoBのRRDRにおける３６の異なる変異のうち３５を、katG315での３つの異なる変異のうち３つを、そしてinhA^-15での１つのうち１つを検出できた。

感受性を遺伝子型により示す場合、より決定度の高い表現型による試験との不一致には３つの原因がある。第一に、耐性単離株は、マーカーを含んでいないことがある。文献によれば、これは、この研究で使用したマーカーを用いて、ＲＩＦ耐性単離株の５％未満で、そしてＩＮＨ耐性単離株の10〜30％の間で見られる。本研究では、この種の不一致が４つのＩＮＨ耐性単離株で見られた。さらなるマーカーを同定してアッセイにこれらを含めることにより、これらの不一致は減少される。第二に、感受性の単離株が同義変異を含むことがあり、この変異は、検出された場合にその単離株を耐性と示してしまう。このアッセイで使用された遺伝子座での同義変異により引き起こされた不一致はいずれも、変異型遺伝子座を配列決定するか、または全ての可能な変異に対するプローブをマクロアレイに含めるかのいずれかによって該変異を同定することにより、減少され得る。本研究では、このようなものとして、１つのrpoB変異型が見られた。不一致となる第三の原因は、存在する変異を正確に検出できないことである。この種の不一致は、使用したプローブの慎重な選択によって、このアレイで最小限になる。所与のプローブおよび標的の組み合わせのハイブリダイゼーション挙動は推測するのが難しいので、標的を行う可能性のある全てのプローブを確認することが必須である。本研究では、１つの変異のみが検出されなかった。これは、２２塩基プローブのMRURP9（表１のプローブ７）の５’末端に３塩基のミスマッチを生じる効果を有する９塩基挿入であって、おそらく、ハイブリダイゼーション二量体を十分に不安定化させず、ハイブリダイゼーションの検出を妨げたものである。

要約すると、上記ＭＤＲスクリーンマクロアレイは、イソニアジドおよび／またはリファンピシン（これら２つは、結核の治療において最も重要な薬物である）に対して耐性の結核菌群の単離株を同定した。本アッセイは、実施および判定が容易であり、そしてＭＤＲヒト型結核菌の有病率が高い地域において最も有用ではあるが、臨床施設の慣用の実施に組み入れることができる。

上記実施例は、マイコバクテリウム種、特に、結核菌群のメンバー（例えば、ヒト型結核菌）におけるＲＩＦおよびＩＮＨ耐性と一致した変異の検出に対して、本発明によるプローブを含むマクロアレイの広い適用性を示す。このシステムは、簡素でかつ使用が安全であり、そしてＭＤＲＴＢの迅速な同定を可能にする。したがって、本アッセイにより、適切な化学療法がより早くに設定され、これにより、個々の治癒の可能性を向上し、一般的に公衆衛生を改善する。

（参考文献）
Kruuner A, Hoffner SE, Sillastu H, Danilovits M, Levina K, Svenson SBら, Spread of drug-resistant pulmonary tuberculosis in Estonia. J.Clin. Microbiol. 2001; 39: 3339-45
World Health Organization, International Union Against Tuberculosis. Anti-tuberculosis drug resistance in the world. Geneva, Switzerland, 2000.
Pablos-Mendez A, Raviglione MC, Laszlo Aら, Global surveillance for antituberculosis-drug resistance, 1994-1997. N Engl J Med 1998; 338:1641-9
Perelman MI. TB control analysis in Russia in 2001. Problemy tuberculeza. 2003; 2:3-11 (ロシア語).
Kruuner A, Sillastu H, Danilovits M, Levina K, Svenson SB Hoffner SE, Kallenius G.ら, Drug resistant tuberculosis in Estonia. Int. J.Tuberc. Lung. Dis. 1998; 2: 130-33
Toungoussova OS, Sandven P, Mariandyshev AO, Nizovtseva NI, Bjune G, Caugant DA. Spread of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype in the Archangel Oblast, Russia. J Clin Microbiol. 2002;40:1930-7
Drobnievski FA, Balabanova YM, Ruddy M, Weldon L, Jeltkova K, Brown T.ら, Rifampin- and Multidrug-resistant tuberculosis in Russian civilians and prison inmates: dominance of the Beijing strain family. Emerg. Infect. Dis. 2002; 8:1320-1326
Mokrousov I, Narvskaya O, Otten Tら, High prevalence of KatG Ser315Thr Substitution among Isoniazid-Resistant Mycobacterium tuberculosis Clinical Isolates from Northwestern Russia, 1996 to 2001. Antimicr Agent Chemother 2002; 46: 1417-24
Munsiff SS, Bassoff T, Nivin B, Li J, Sharma A, Bifani P, Mathema Bら, Molecular epidemiology of multidrug-resistant tuberculosis, New York City, 1995-1997. Emerg Infect Dis. 2002; 8:1230-8
Agerton T,Valway SE, Blinkhorn RJ, Shilkret KL, Reves R, Schluter WWら, Spread of strain W, a highly drug-resistant strain of Mycobacterium tuberculosis, across the United States. Clin. Infect. Dis. 1999; 29: 85-92
Breathnach AS, De Ruiter A. Holdsworth GMC, Bateman NT, O'Sulliovan DGM Rees PJら, An outbreak of multi-drug resistant tuberculosis in a London teaching hospital. J.Hosp. Infect. 1998; 39:111-7
Espinal MA. The global situation of MDR-TB. Tuberculosis 2003; 83:44-51
TB microbiological diagnostics standardization. USSR Ministry of healthcare Order No 558, 8/06/1978. (ロシア語).
Rattan A, Kalia A, Ahmad N. Multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis: molecular perspectives. Emerg Infect Dis. 1998;4:195-209
Bodmer T, Zurcher K, Imboden P, Telenti A. Mutation position and type of substitution in the b-subunit of the RNA polymerase influence in-vitro activity of rifampicins in rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis. J. Antimicr. Chemother. 1995; 35:345-48
Fluit AC, Visser MR, Schmitz RJ. Molecular Detection of Antimicrobial Resistance. Clin. Microbiol.Rev. 2001; 14: 836-71
Musser JM Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria: molecular genetic insights. Clin. Micr. Rev.1995; 8:496-514
Alvarado-Esquivel C, Rossau R, Martinez-Garcia Sら, Characterization of rpoB gene mutations in rifampicin resistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated from pulmonary tuberculosis patients at 5 Mexican public hospitals. Rev Invest Clin 2001; 56:526-530
Bartfal Z, Somoskovi A, Kodmon Cら, Molecular Characterization of rifampin-resistant isolates of Mycobacterium tuberculosis from Hungary by DNA sequencing and the line probe assay. Clin Microbiol. 2001; 39:3736-39
Zhang Y., Heym B., Allen B.ら, The Catalase-peroxydase Gene and isoniazid Resistance of Mycobacterium tuberculosis. Nature. 1992; 358: 591-93
Wilson TM, Collins DM. AhpC, a gene involved in izoniazid resistance of the Mycobacterium tuberculosis complex. Molecular Microbiology. 1996; 19: 1025-34
Garcia de Viedma G. Rapid detection of resistance in Mycobacterium tuberculosis: a review discussing molecular approaches. Clin Microbiol Infect. 2002; 9:349-359
van Rie A, Warren R, Mshanga Iら, Analysis for a limited number of gene codons can predict drug resistance of Mycobacterium tuberculosis in a high-incidence community. Clin. Microbiol. 2001; 39: 636-641.
Collins CH, Grange JM, Yates MD. Tuberculosis bacteriology. Organization and Practice. 第２版 1997; Oxford: Butterworth-Heinemann.
Yates MD, Drobniewski FA, Wilson SM Evaluation of a rapid PCR-based epidemiological typing method for routine studies of Mycobacterium tuberculosis J.Clin. Microbiol 2002; 40:712-4.
Ahmad, S., E. Fares, G. F. Araj, T. D. Chugh, およびA. S. Mustafa. 2002. Prevalence of S315T mutation within the katG gene in isoniazid-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Dubai and Beirut. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 6: 920-926.
Bakonyte, D., A. Baranauskaite, J. Cicenaite, A. Sosnovskaya, およびP. Satakenas. 2003. Molecular characterization of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates in Lithuania. Antimicrob. Agents Chemother. 47: 2009-20011
Martilla, H., H. Soini, E. Eerola, E. Vyshnevskaya, B. Vyshnevskiy, T. Otten, A. Vasilyef, およびM. Viljanen. 1998. A Ser315Thr substitution in KatG is predominant in genetically heterogeneous multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates originating from the St. Petersburg area in Russia. Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2443-2445.
Tracevska, T., I. Jansone, L. Broka, O. Marga, およびV. Baumanis. 2002. Mutations in the rpoB and katG genes leading to drug resistance in Mycobacterium tuberculosis in Latvia. J. Clin. Microbiol. 40: 3789-3792.
Narvskaya, O., Otten, T., Limeschenco, E., Sapozhnikova, N., Graschenkova, N., Steklova, L., Nikonova, A., Filipenko, M.L., Mokrousov, I., Vyshnevskiy. B., 2002. Nosocomial outbreak of multidrug-resistant tuberculosis caused by a strain of Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family in St. Petersburg Russia. Eur. J. Clin Microbiol. Infect Dis. 21, 596-602.
Davies, P.D., 2003. The worldwide increase in tuberculosis: how demographic changes, HIV, infection and increasing numbers in poverty are increasing tuberculosis. Ann. Med. 35-235-243.
De Beenhouwer, H., Liang, Z., Jannes, G., Mijs, W., Machtelinckx, L., Rossau, R., Traore, H., Portaels, F., 1995. Rapid detection of rifampin resistance in sputum and biopsy specimens from tuberculosis patients by PCR and line probe assay. Tubercle Lung. Dis. 76, 425-430.
Collins CH, Grange JM, Yates MD. Tuberculosis bacteriology. Organization and Practice. 第２版 1997; Oxford: Butterworth-Heinemann.
Brown, T., Anthony,R., 2000.The addition of low numbers of 3' thymine bases can be used to improve the hybridization signal of oligonucleotides for use within arrays on nylon supports. J Micro Methods. 42,203-207.
Bifani, P.J., Plikaytis, B., Kapur, V., Stockbauer, K., Pan, X., Lutfey, M.L., Moghazeh, S.L., Eisner, W., Daniel, T.M, Kaplan, M.H., Crawford, J.T., Musser, J.M., Kreiswirth, B.N., 1996. Origin and interstate spread of New York City multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis clone family. JAMA. 275,452-457.

図１は、本発明による個々のマクロアレイの設計を示す。 図２は、展開したマクロアレイメンブレンの外観を示す。 図３は、サマラ単離株において同定された、ＲＩＦ耐性およびＩＮＨ耐性に関与する変異のスペクトルを示す。 図４Ａは、ＭＤＲ−スクリーンマクロアレイの模式図を示す。図４Ｂは、ヒト型結核菌株により生じたパターンを示す。

Claims (20)

1. 試料中の多剤耐性マイコバクテリウム種を検出するための単一のアッセイに同時に使用される核酸プローブのセットであって、該セットが、
   配列ＧＡＴＧＣＣＧＣＴＧＧＴＧＡＴを含む、プローブ１；
   配列ＡＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣを含む、プローブ２；
   配列ＧＧＣＧＡＧＡＣＧＡＴＡＧＧＴを含む、プローブ３；
   配列ＧＧＣＧＡＧＡＴＧＡＴＡＧＧＴを含む、プローブ４；
   配列ＡＧＣＴＧＡＧＣＣＡＡＴＴＣＡＴＧを含む、プローブ５；
   配列ＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧＡＡＣＡを含む、プローブ６；
   配列ＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＣＣＣＧＣを含む、プローブ７；
   配列ＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＧＧＧＧＴＴを含む、プローブ８；
   配列ＴＧＡＣＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣを含む、プローブ９；および
   配列ＣＴＧＴＣＧＧＣＡＣＴＧＧＧＧＣＣを含む、プローブ１０
   を含み、該プローブの各々が１８から２５ヌクレオチド長である、セット。
2. 請求項１に記載のプローブのセットであって、
   プローブ１が配列番号１の配列を含み；
   プローブ２が配列番号２の配列を含み；
   プローブ３が配列番号３の配列を含み；
   プローブ４が配列番号４の配列を含み；
   プローブ５が配列番号５の配列を含み；
   プローブ６が配列番号６の配列を含み；
   プローブ７が配列番号７の配列を含み；
   プローブ８が配列番号８の配列を含み；
   プローブ９が配列番号９の配列を含み；および
   プローブ１０が配列番号１０の配列を含む、セット。
3. 試料中の多剤耐性マイコバクテリウム種を検出するための単一のアッセイに同時に使用される核酸プローブのセットであって、該セットが、
   配列ＧＡＴＧＣＣＧＣＴＧＧＴＧＡＴを含む、プローブ１；
   配列ＡＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣを含む、プローブ２；
   配列ＡＧＣＴＧＡＧＣＣＡＡＴＴＣＡＴＧを含む、プローブ５；
   配列ＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧＡＡＣＡを含む、プローブ６；
   配列ＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＣＣＣＧＣを含む、プローブ７；
   配列ＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＧＧＧＧＴＴを含む、プローブ８；
   配列ＴＧＡＣＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＣを含む、プローブ９；および
   配列ＣＴＧＴＣＧＧＣＡＣＴＧＧＧＧＣＣを含む、プローブ１０
   を含み、該プローブの各々が１８から２５ヌクレオチド長である、セット。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載のプローブのセットであって、配列番号１１から配列番号３２より選択される配列を含む１つ以上のプローブをさらに含む、セット。
5. 前記プローブが固体支持体上に固定化されている、請求項１から４のいずれかに記載のプローブのセット。
6. 前記プローブの各々が３’ポリＴテイルを有する、請求項１から５のいずれかに記載のプローブのセット。
7. 前記多剤耐性マイコバクテリウム種が、結核菌群（ＭＴＣ）の多剤耐性メンバーである、請求項１から６のいずれかに記載のプローブのセット。
8. 前記多剤耐性マイコバクテリウム種が、多剤耐性ヒト型結核菌である、請求項７に記載のプローブのセット。
9. 試料中の多剤耐性マイコバクテリウム種の存在を検出するための方法であって、
   （ａ）請求項１から８のいずれかに記載のプローブのセットを、核酸含有試料と接触させる工程であって、１つのプローブが該試料中のマイコバクテリウム種核酸に結合されると検出可能シグナルが提供される、工程；および
   （ｂ）該検出可能シグナルを検出する工程
   を包含し、該プローブが、固体支持体上に固定化されている、方法。
10. 試料中の多剤耐性マイコバクテリウム種の存在を検出するための方法であって、該方法が、
    （ａ）請求項１または２のいずれかあるいは請求項１または２に基づく請求項４から８のいずれかに記載のプローブのセットを、核酸含有試料と接触させる工程であって、１つのプローブが該試料中のマイコバクテリウム種核酸に結合されると検出可能シグナルが提供される、工程；および
    （ｂ）該検出可能シグナルを検出する工程
    を包含し、該プローブが、固体支持体上に固定化され、そして
    該試料中の多剤耐性マイコバクテリウム種の存在が、
    （ｉ）プローブ２およびプローブ４とそれらのそれぞれの結合される標的マイコバクテリウム種核酸配列とにより提供される検出可能シグナルを該試料中に検出する工程；および
    （ii）プローブ１、プローブ３、プローブ５、プローブ６、プローブ７、プローブ８、プローブ９、およびプローブ１０とそれらのそれぞれの標的マイコバクテリウム種核酸配列とにより提供される検出可能シグナルの不在を検出する工程
    により検出される、方法。
11. 試料中の多剤耐性ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の不在を検出するための方法であって、
    該多剤耐性がｋａｔＧ遺伝子のコドン３１５での変異、ｉｎｈＡ遺伝子のコドン２８０での変異、またはｒｐｏＢ遺伝子の８１塩基対コア領域における変異により引き起こされ、
    （ａ）請求項１または２のいずれかあるいは請求項１または２に基づく請求項４から８のいずれかに記載のプローブのセットを、核酸含有試料と接触させる工程であって、１つのプローブが該試料中のマイコバクテリウム種核酸に結合されると検出可能シグナルが提供される、工程；および
    （ｂ）該検出可能シグナルを検出する工程
    を包含し、該プローブが、固体支持体上に固定化されている、方法。
12. 請求項１１に記載の方法であって、前記試料からの多剤耐性ヒト型結核菌の不在が、
    （ｉ）プローブ１、プローブ３、プローブ５、プローブ６、プローブ７、プローブ８、プローブ９、およびプローブ１０とそれらのそれぞれの結合される標的ヒト型結核菌核酸配列とにより提供される検出可能シグナルを該試料中に検出する工程；および
    （ii）プローブ２およびプローブ４とそれらのそれぞれの標的ヒト型結核菌核酸配列とにより提供される検出可能シグナルの不在を検出する工程
    により検出される、方法。
13. シグナルの検出前に前記試料中のマイコバクテリウム種核酸を増幅する工程をさらに包含する、請求項９から１２のいずれかに記載の方法。
14. 前記増幅工程が、前記プローブのセットを前記核酸含有試料と接触させる前に行われる、請求項１３に記載の方法。
15. 前記増幅工程が、前記マイコバクテリウム種核酸を標識する工程を包含する、請求項１３または１４に記載の方法。
16. 前記検出可能シグナルが蛍光シグナルである、請求項９から１５のいずれかに記載の方法。
17. 前記試料が臨床試料である、請求項９から１６のいずれかに記載の方法。
18. 前記多剤耐性マイコバクテリウム種が、結核菌群（ＭＴＣ）のメンバーである、請求項９から１７のいずれかに記載の方法。
19. 前記多剤耐性マイコバクテリウム種が、ヒト型結核菌である、請求項１８に記載の方法。
20. 多剤耐性マイコバクテリウム種核酸の検出のためのキットであって、請求項１から８のいずれかに記載のプローブのセットを含む、キット。

Images