CN108411016A - 快速检测骨关节感染常见细菌的pcr检测试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒及方法，所述试剂盒包括：引物组，所述引物组包括：金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌nuc基因引物、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因引物、化脓链球菌spyM基因引物和铜绿假单胞菌oprI基因引物。由于本发明的检测骨关节感染常见细菌的试剂盒及方法中引物组的设计可以显著降低儿童骨关节常见细菌感染的检测耗时。

Description

快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种快速检测儿童骨关节感染常见细菌的多重PCR检测试剂盒及方法。
背景技术
儿童软组织、骨关节的感染相对其他部位来说是较少发生的。然而由于儿童免疫系统发育不成熟、免疫功能尚不完善，儿童软组织、骨关节一旦发生感染，轻则延长疗程、增加患儿痛苦，重则引起相关急性并发症。因此对儿童骨科常见细菌的快速、准确检测和鉴别对儿童骨科感染诊断及治疗具有重要意义。儿童骨关节感染的常见细菌有金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓链球菌和铜绿假单胞菌等四种。
国内外对细菌性疾病的检测和诊断技术种类繁多，主要有细菌革兰氏染色、分离培养及生化鉴定、分子生物学技术以及免疫学技术等。其中，聚合酶链式反应(PCR)技术因其简便、快速、高敏感性和高特异性等特点而被广泛应用于细菌的快速检测。然而目前还没有同时针对金黄色葡萄球菌 (MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、化脓链球菌、铜绿假单胞菌四种细菌的快速检测和鉴别的方法。
发明内容
本发明针对现有技术中儿童骨关节感染常见细菌还没有快速检测和鉴别的方法，目的在于提供一种新的检测骨关节感染常见细菌的试剂盒。
本发明的快速检测骨关节感染常见细菌的试剂盒包括：
引物组，所述引物组包括：金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌nuc基因引物、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因引物、化脓链球菌 spyM基因引物和铜绿假单胞菌oprI基因引物。
所述nuc基因引物包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物序列和如SEQ ID NO:2所示的下游引物序列；
所述mecA基因引物包括如SEQ ID NO:3所示的上游引物序列和如SEQ ID NO:4所示的下游引物序列；
所述spyM基因引物包括如SEQ ID NO:5所示的上游引物序列和如SEQ ID NO:6所示的下游引物序列；
所述oprI基因引物包括如SEQ ID NO:7所示的上游引物序列和如SEQ ID NO:8所示的下游引物序列。
引物组明细表
在本发明的PCR检测试剂盒中，所述nuc基因引物、mecA基因引物、 spyM基因引物和oprI基因引物的上游引物和下游引物的原始浓度分别为 9～11μmol/L优选10μmol/L。
在本发明的PCR检测试剂盒中，所述多重PCR缓冲液的体积为12.5μL；在所述引物组中，所述nuc基因引物的上游引物和下游引物的体积各为 0.3μL，所述spyM基因引物的上游引物和下游引物的体积各为0.15μL，所述 mecA基因引物的上游引物和下游引物的体积各为0.4μL，所述oprI基因引物的上游引物和下游引物的体积各为0.3μL。
所述PCR检测试剂盒还包括多重PCR缓冲液和多重PCR DNA聚合酶混合液，所述多重PCR缓冲液的体积为12.5μL(多重PCR缓冲液例如可以是TaKaRa公司的RR062A)
在本发明的PCR检测试剂盒中，包括无菌水的阴性对照。
在本发明的PCR检测试剂盒中，还包括DNA标记即DNA Marker。所述DNA标记是以金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、铜绿假单胞菌标准菌株基因组为模板分别采用PCR扩增纯化后的等体积比混合物。等比例混合物中加入有1/10体积的10×loading buffer(DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液，9157，TaKaRa)，作为PCR检测凝胶电泳DNAmarker，分子量从大到小依次为336bp、233bp、158bp、109bp，于-20℃保存。
本发明的另一目的在于提供一种使用本发明所述的试剂盒快速检测骨关节感染常见细菌的方法。所述方法包括如下步骤：
步骤S1基于待检测样品上的细菌制备得到PCR模板；
步骤S2在引物组的特异性的结合下根据PCR模板在PCR反应液中进行PCR扩增；
步骤S3对扩增产物进行电泳检测，与DNA标记对比判断是否感染了金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓链球菌和/或铜绿假单胞菌。
在步骤S2中，具体PCR反应液包括：12.5μL多重PCR缓冲液(即 Multiplex PCRBuffer(Mg2+，dNTP plus))，0.125μL多重PCR DNA聚合酶混合液(Multiplus PCR EnzymeMix)，10μmol/L nuc基因引物的上游引物如SEQ ID NO:1所示和下游引物如SEQ ID NO:2所示体积各0.3μL，10μmol/L spyM基因引物的上游引物如SEQ ID NO:5所示和下游引物如SEQID NO:6 所示体积各0.15μL，10μmol/L mecA基因引物的上游引物如SEQ ID NO:3所示和下游引物如SEQ ID NO:4所示体积各0.4μL，10μmol/L oprI基因引物的上游引物如SEQ IDNO:7所示和下游引物如SEQ ID NO:8所示体积各0.3μL， 8.075μL无菌水和2μL模板；PCR反应条件为94～95℃预变性3～5min；94～95℃下变性15～20s，60～61℃下退火15～20s，72℃下延伸20s，扩增35个循环； 72℃延伸5min。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供的引物组具有这样的特征，引物对SEQID NO:1所示的序列和SEQ ID NO:2所示的序列用于扩增的目的片段的大小是233bp；引物对SEQ ID NO:3所示的序列和SEQ ID NO:4所示的序列用于扩增的目的片段大小为158bp；引物对SEQ ID NO:5所示的序列和 SEQ ID NO:6所示的序列用于扩增的目的片段大小为336bp；SEQ ID NO:7 所示的序列和SEQ ID NO:8所示的序列用于扩增的目的片段大小为109bp。本发明通过改进引物长度，并且控制GC含量和相接近的解链温度，设计出合适的引物组。经验证，本发明的引物组不仅在单对引物扩增时具有很高的特异性和和灵敏度，而且在按照本发明的引物比例混合扩增后仍然保持特异性和灵敏度，各引物之间无交叉反应。本发明引物组扩增产物的大小均经过特异设计，最大产物不高于350bp，可降低扩增延伸时间，有效缩短整体检测时间；且各产物大小相差不低于49bp，经140v电压、2.5％琼脂糖凝胶电泳40分钟后，在凝胶成像系统下对照本发明DNA marker可肉眼直接辨别产物大小，得出检测结果。
本发明的检测骨关节感染常见细菌的试剂盒及方法可以显著降低儿童骨关节常见细菌感染的检测耗时，从样本收集至出具检测结果整体耗时约4小时，明显低于传统微生物培养检测的耗时(2～7天)。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1A～1D分别为本发明的PCR检测方法在58℃、59℃、60℃和61℃退火下扩增产物的电泳检测结果图；
其中“1”代表金黄色葡萄球菌，“2”代表耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，“3”代表化脓链球菌，“4”代表铜绿假单胞菌，“—”为阴性对照，“M”代表实验室常用DNA marker DL2000
图2为本发明特异性评价实验中PCR扩增产物的电泳检测结果图；
其中1代表金黄色葡萄球菌；2代表耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；3代表化脓链球菌；4代表铜绿假单胞菌；5～7代表耐甲氧西林金黄色葡萄球菌； 8～14分别代表无乳链球菌、肠道沙门氏菌、阴沟肠杆菌、流感嗜血杆菌、奥斯陆莫拉菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌；15代表无菌水
图3A为金黄色葡萄球菌的PCR检测敏感性检测结果照片；
其中，M代表DL2000marker(DNA分子量指示标记)；1代表1290pg(单位皮克)；2代表129pg；3代表12.9pg；4代表1.29pg；5代表0.129pg；“—”为阴性对照；“+”为阳性对照，模板为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓链球菌和铜绿假单胞菌混合DNA。
图3B为化脓链球菌的PCR检测敏感性检测结果照片；
其中，M代表DL2000marker；1代表490pg；2代表49pg；3代表4.9pg；4代表0.49pg；5代表0.049pg；“—”为阴性对照；“+”为阳性对照，模板为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓链球菌和铜绿假单胞菌混合DNA。
图3C为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的PCR检测敏感性检测结果照片；
其中，M代表DL2000marker；1代表520pg；2代表52pg；3代表5.2pg； 4代表0.52pg；5代表0.052pg；“—”为阴性对照；“+”为阳性对照，模板为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓链球菌和铜绿假单胞菌混合DNA。
图3D为铜绿假单胞菌的PCR检测敏感性检测结果照片；
其中，M代表DL2000marker；1代表51.35pg；2代表5.135pg；3代表 0.514pg；4代表0.051pg；“—”为阴性对照；“+”为阳性对照，模板为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓链球菌和铜绿假单胞菌混合DNA。
图4为12例临床样本用本发明的PCR检测方法进行检测结果照片；
其中，M1和M2代表本发明DNA marker，“—”为阴性对照，“+”为阳性对照，模板为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓链球菌和铜绿假单胞菌混合DNA。
具体实施方式
实施例1～4
步骤1样品预处理
基因组抽提试剂盒(Qiagen公司QIAamp DNA Mini Kit，51304)抽提儿童骨关节疑似感染组织样本。
1、样本处理：取儿童骨关节疑似感染组织的脓液样本100-200μL， 12000rpm/min离心3min，弃上清，或取组织样本20mg，尽量剪碎，加入180μL 组织裂解液(ATL)，再加入20μL蛋白酶K，涡旋20s，56℃金属浴震荡 30～40min，短时离心。
2、加入200μL高盐细胞裂解液(AL)，涡旋20s，70℃金属浴震荡10min，再加入200μL无水乙醇，涡旋20s，短时离心。
3、将以上混合液全部加入吸附柱中，置于一个2mL收集管中，8000rpm/ min离心1min，弃收集管；将离心柱置于一个新的收集管，加入500μL去蛋白洗脱缓冲液1(AW1)，8000rpm/min离心1min，弃收集管；将吸附柱置于一个新的收集管，加入500μL溶液盐离子洗脱缓冲液(AW2)，14000rpm/min 离心3min，弃收集管；将吸附柱置于一个新的收集管，14000rpm/min离心 1min，弃收集管；
4、将吸附柱置于一个1.5mL离心管中，往吸附柱中加入100μLDNA溶解缓冲液(AE)，室温静置5min，8000rpm/min离心1min，完成基因组DNA 抽提，于-20℃保存，作为后续的PCR模板。
步骤2PCR扩增
将上述提取到的DNA样本进行四重PCR检测，PCR反应体系的原料为： 12.5μL 2×Multiplex PCR Buffer(TaKaRa公司的RR062A)(Mg2+,dNTP plus)，Multiplus PCR EnzymeMix 0.125μL，10μmol/L nuc基因引物的上游引物如SEQ ID NO:1所示和下游引物如SEQ IDNO:2所示体积各0.3μL， 10μmol/L spyM基因引物的上游引物如SEQ ID NO:5所示和下游引物如SEQ ID NO:6所示体积各0.15μL，10μmol/L mecA基因引物的上游引物如SEQ ID NO:3所示和下游引物如SEQ ID NO:4所示体积各0.4μL，10μmol/L oprI基因引物的上游引物如SEQ ID NO:7所示和下游引物如SEQ ID NO:8所示体积各 0.3μL，8.075μL无菌水和2μL模板。
PCR扩增条件：预定PCR反应参数条件为94℃预变性5min；94℃下变性20s，T℃下退火20s，72℃下延伸20s，扩增35个循环；72℃延伸5min。
实施例 退火温度T
1 60
2 61
3 58
4 59
步骤3电泳检测
分别以金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、铜绿假单胞菌标准菌株基因组作为模板分别进行四重PCR检测扩增(PCR反应体系条件同步骤2)后，将PCR产物纯化回收定量后等量混合(336bp PCR 产物100ng/μL，233bp PCR产物150ng/μL，158bpPCR产物100ng/μL，109bp PCR产物80ng/μL分别取50μL混匀)，再加入20μL的10×loadingbuffer，作为四重PCR检测凝胶电泳DNA marker，分子量从大到小依次为336bp、 233bp、158bp、109bp，于-20℃保存。
取5μL步骤2的PCR扩增产物和步骤3得到DNA marker，点样于2.5％琼脂糖凝胶电泳板孔中，在140V电压下，电泳40min，于凝胶成像系统下拍照得到电泳结果。在凝胶成像系统下参考DNA marker可肉眼直接辨别产物大小，得出检测结果。对电泳结果进行判定的前提条件为阴性对照无任何条带出现，当电泳结果出现336bp条带判定为化脓链球菌，当电泳结果出现 233bp和158bp条带判定为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，当电泳结果只出现233bp条带判定为金黄色葡萄球菌，当电泳结果出现109bp条带判定为铜绿假单胞菌。
结果分析：
如图1A～1D分别是58℃、59℃、60℃、61℃退火温度下扩增产物的电泳检测效果评价，58℃、59℃退火时阴性对照均有非特异条带，60℃、61℃退火时则均没有非特异条带，且可检出各目的菌株。
因此可以得出，退火温度应当严格控制在60℃至61℃，在58℃或59℃退火时，阴性对照(模板是无菌水)在100bp左右可能产生非特异条带，造成假阳性判断，而在60℃和61℃退火时没有产生假阳性结果(经过多次重复试验，均未发现假阳性结果)。PCR反应中退火温度越高，有可能会降低扩增效率，故本发明选择60℃作为最佳退火温度。
效果实施例1特异性评价
选取无乳链球菌、肠道沙门氏菌、阴沟肠杆菌、流感嗜血杆菌、奥斯陆莫拉菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓链球菌和铜绿假单胞菌按照实施例1的方法进行PCR检测。按照实施例1的方法进行处理，PCR扩增后产物于2.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
如图2结果显示，以金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、铜绿假单胞菌分别作为模板或混合作为模板，均可扩增到特异性条带；而对其他细菌等对照样品扩增，PCR结果均为阴性。说明本发明的引物组的特异性强，采用该引物组建立的四重PCR检测方法可以准确、快速、稳定、特异性地将金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、铜绿假单胞菌与其它菌区别开来。
效果实施例2敏感性评价
分别接种金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、铜绿假单胞菌至LB液体培养基中，37℃摇菌至OD600＝1.0，分别取其中1mL 菌液，按照细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302天根生物技术有限公司)进行操作，分别提取细菌基因组。分别梯度稀释后，各吸取5μL加入同实施例1 的PCR反应体系，按照实施例1的扩增条件进行PCR扩增，根据试验结果测定上述引物组对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、铜绿假单胞菌的敏感性。
结论：金黄色葡萄球菌的基因组检测下限是1.29pg；化脓链球菌的基因组的检测下限是4.9pg；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测下限是0.52pg；铜绿假单胞菌的检测下限是0.514pg。
应用实施例1
回顾性检测12例某儿童医院骨科感染样本，按照实施例1的方法进行 PCR检测操作。
结果如图4所示，回顾性检测12例某儿童医院骨科感染样本，共检出3 例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、1例金黄色葡萄球菌、1例铜绿假单胞菌、1 例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌混合感染。所有检测结果与微生物培养结果完全一致。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心
<120> 快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒及方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 1
agataacggc gtaaatagaa gtgg 24
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<400> 2
taaatgcact tgcttcagga ccata 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcusaureus)
<400> 3
gtagaaatga ctgaacgtcc gatga 25
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcusaureus)
<400> 4
acgttgcgat caatgttacc g 21
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400> 5
ccacgactaa tgtcagcttg ctca 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400> 6
gggacttgat gttggctcga aaacg 25
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400> 7
agcagccact ccaaagaaac cgaagc 26
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400> 8
ccagagcttc gtcagccttg cgata 25

Claims (10)

1.一种快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：
引物组，所述引物组包括：金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌nuc基因引物、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因引物、化脓链球菌spyM基因引物和铜绿假单胞菌oprI基因引物。
2.如权利要求1所述的快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述nuc基因引物包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物序列和如SEQ ID NO:2所示的下游引物序列；
所述mecA基因引物包括如SEQ ID NO:3所示的上游引物序列和如SEQ ID NO:4所示的下游引物序列；
所述spyM基因引物包括如SEQ ID NO:5所示的上游引物序列和如SEQ ID NO:6所示的下游引物序列；
所述oprI基因引物包括如SEQ ID NO:7所示的上游引物序列和如SEQ ID NO:8所示的下游引物序列。
3.如权利要求1或2所述的快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述nuc基因引物、mecA基因引物、spyM基因引物和oprI基因引物的上游引物和下游引物的原始浓度分别为9～11μmol/L优选10μmol/L。
4.如权利要求3所述的快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，在所述引物组中，所述nuc基因引物的上游引物和下游引物的体积各为0.3μL，所述spyM基因引物的上游引物和下游引物的体积各为0.15μL，所述mecA基因引物的上游引物和下游引物的体积各为0.4μL，所述oprI基因引物的上游引物和下游引物的体积各为0.3μL。
5.如权利要求1或2所述的快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒还包括多重PCR缓冲液和多重PCR DNA聚合酶混合液，所述多重PCR缓冲液的体积为12.5μL，所述多重PCR DNA聚合酶混合液的体积为0.125μL。
6.如权利要求1或2所述的快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒包括无菌水的阴性对照。
7.如权利要求1或2所述的快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒还包括DNA标记。
8.如权利要求7所述的快速检测骨关节感染常见细菌的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述DNA标记是以金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、铜绿假单胞菌标准菌株基因组为模板分别采用PCR扩增纯化后的等体积比混合物。
9.一种使用权利要求1或2所述的PCR检测试剂盒快速检测骨关节感染常见细菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤S1基于待检测样品上的细菌制备得到PCR模板；
步骤S2在引物组的特异性的结合下根据PCR模板在PCR反应液中进行PCR扩增；
步骤S3对扩增产物进行电泳检测，与DNA标记对比判断是否感染了金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓链球菌和/或铜绿假单胞菌。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：在步骤S2中，具体PCR反应液包括：12.5μL多重PCR缓冲液，0.125μL多重PCR DNA聚合酶混合液，10μmol/L nuc基因引物的上游引物如SEQ ID NO:1所示和下游引物如SEQ ID NO:2所示体积各0.3μL，10μmol/L spyM基因引物的上游引物如SEQ ID NO:5所示和下游引物如SEQ ID NO:6所示体积各0.15μL，10μmol/LmecA基因引物的上游引物如SEQ ID NO:3所示和下游引物如SEQ ID NO:4所示体积各0.4μL，10μmol/L oprI基因引物的上游引物如SEQ ID NO:7所示和下游引物如SEQ ID NO:8所示体积各0.3μL，8.075μL无菌水和2μL模板；PCR反应条件为94～95℃预变性3～5min；94～95℃下变性15～20s，60～61℃下退火15～20s，72℃下延伸20s，扩增35个循环；72℃延伸5min。
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