CN107447047B - Dve强弱毒鉴别的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒 - Google Patents

Dve强弱毒鉴别的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种鸭病毒性肠炎（DVE）病毒强弱毒鉴别的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒，所述引物序列如SEQ ID NO.1‑3所示，具有很高的特异性和灵敏度。当前国内外尚未见可基于SYBR GreenⅠ检测鸭病毒性肠炎病毒强弱毒毒株的实时荧光定量PCR检测方法的引物研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

Description

DVE强弱毒鉴别的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒
技术领域
本发明提供鸭病毒性肠炎病毒强弱毒鉴别的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒，属于动物传染病学领域。
背景技术
鸭病毒性肠炎(duck virus enteritis, DVE)又称鸭瘟(duck plague, DP)，是由鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)引起的常见于鸭、鹅及其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性、高度接触性传染病。
我国的研究者从上世纪 60 年代开始研制 DVE 弱毒疫苗，其主要途径是将 DEV强毒先在鸭胚上连续传代，然后再转接到鸡胚上长期连续传代，DEV 病毒对鸡胚毒力增强的同时，逐渐丧失了对鸭的致病性，但对其仍保持较强的免疫原性。目前，我国使用的 DEV毒株为细胞传代致弱毒株，大量临床数据和实验室检测证实，在其免疫鸭后几个小时就可产生一定程度的保护力。
实时荧光定量PCR方法（Real time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。双重实时荧光定量PCR是一种特殊的荧光定量PCR形式，其突出的特点是一次实时荧光定量PCR反应可同时检测两种病原，对病原复杂或存在多种基因型的病原鉴别检测十分有效。
在疱疹病毒粒子DNA复制过程中涉及到多种酶，在这些酶中，由UL2基因编码的尿嘧啶DNA糖基化酶（Uracil-DNA glycosylase，UDG）是DNA修饰不可缺少的酶，它能将复制过程中dUTP错误插入或是胞嘧啶的脱氨基造成的尿嘧啶残基切除，保证DNA复制的正确性和顺利进行。DEV的UL2是单纯疱疹病毒1型(Herpes sim-plex virus type 1，HSV-1)的UL2的同源基因，后者编码尿嘧啶DNA糖基化酶，是一个非必须基因，是对病毒复制发挥重要作用的一种酶。对DVE编码的UL2基因核酸序列的同源性进行了分析发现，DVE强毒株和DVE弱毒株在UL2基因编码区存在较大差异，DVE弱毒株均发生了一个528bp的片段缺失，这段528bp的序列占了UL2 基因的一半以上，可能已导致 UL2 功能的丧失，提示这个片段缺失很可能与弱毒株的毒力减弱直接相关。因此，建立能够同时对DVE强毒株和弱毒株进行鉴别诊断方法尤为重要。
通常，对两个病原进行双重实时荧光定量PCR鉴别诊断的检测时需要分别设计特异性的引物（每个病原2条特异性引物，2个病原需要4条特异性引物），再分别建立方法的后组合优化条件后建立双重实时荧光定量PCR鉴别诊断方法。本发明基于鸭病毒性肠炎病毒强弱毒UL2基因编码区特点，设计一种仅需3条特异性引物即可对鸭病毒性肠炎病毒强弱毒进行鉴别诊断，可简化操作程序、节约成本，又可快速用于开展鸭病毒性肠炎病毒强弱毒相关病原学致病机理研究。当前，国内外尚未见仅需3条特异性引物即可对鸭病毒性肠炎病毒强弱毒进行鉴别诊断的双重实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
发明内容
本发明提供鸭病毒性肠炎病毒强弱毒鉴别的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒，建立能够同时对鸭病毒性肠炎病毒强弱毒进行鉴别的实时荧光定量PCR方法，简化操作程序、节约成本。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
鸭病毒性肠炎病毒强弱毒鉴别的实时荧光定量PCR检测引物，包括如下：
用于检测鸭病毒性肠炎病毒强毒株：
上游引物DVE-F1：5’- CAGATTTGACTATTTTTGACCAAC-3’，
下游引物DVE-R1：5’- AGACGAAAATTGTTGATCATGGCT-3’，
用于检测检测鸭病毒性肠炎病毒弱毒株：
上游引物DVE-F1：5’- CAGATTTGACTATTTTTGACCAAC-3’，
下游引物DVE-R2：5’- TAGGCTCCCGTCTCCGTCCCA-3’，
其中，共用一条上游引物DVE-F1，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
用于检测鸭病毒性肠炎病毒强弱毒鉴别的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒，包括所述的引物。
实时荧光定量PCR反应体系为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
双重实时荧光定量PCR方法反应条件为： 95 ℃预变性120 s；95 ℃ 10s，62 ℃延伸15 s，40个循环；循环结束后，做出溶解曲线。
结果判断：
双重实时荧光定量PCR反应结束后，观察溶解曲线峰值（Tm值）分析试验结果：若在Tm=（85.42±0.24）℃出现单一的特异性峰判为鸭病毒性肠炎病毒强毒阳性；若在Tm=（90.62±0.28）℃出现单一的特异性峰判为鸭病毒性肠炎病毒弱毒阳性；若Tm=（85.42±0.24）℃和Tm=（90.62±0.28）℃均出现峰值，表明鸭病毒性肠炎病毒强毒和鸭病毒性肠炎病毒弱毒混合感染。
本发明提供检测鸭病毒性肠炎病毒强弱毒鉴别的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒，具有以下优点和效果：
1、同时检测：建立的方法能够同时对鸭群中鸭病毒性肠炎病毒强弱毒感染进行检测，简化操作程序、节约成本。实时荧光定量PCR反应结束后，通过观察其Tm值即可直接对结果进行判断。
2、检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的进行结果判定。从核酸提取到结果判定仅需90 min，且一次可以同时进行96个样品检测。
3、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，可根据检测待检样品中鸭病毒性肠炎病毒强弱毒的Ct值，可直接对其鸭病毒性肠炎病毒强弱毒进行准确定量。
4、灵敏度高：鸭病毒性肠炎病毒强毒最低可检测45.7个拷贝；鸭病毒性肠炎病毒弱毒最低可检测52.5个拷贝，较常规PCR检测灵敏度提高100倍。
5、特异性强：和鸭群中的常见传染病（基因组核酸类型为DNA）如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭腺病毒A型和番鸭细小病毒均无反应信号，仅对鸭病毒性肠炎病毒强弱毒检测出现荧光信号，但两者存在特异性溶解曲线峰值（Tm值）。
对49份临床送检鸭源病料进行鸭病毒性肠炎病毒强弱毒感染的双重实时荧光定量PCR检测，用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取相应的DNA，按照建立双重实时荧光定量PCR体系和条件进行检测。结果发现，在Tm=（85.42±0.24）℃出现单一的特异性峰的样品有9份（Tm值分别为85.6℃、85.4℃、85.3℃、85.3℃、85.4℃、85.5℃、85.4℃、85.6℃和85.5℃、），即存在鸭病毒性肠炎病毒强毒感染阳性样品9份，阳性率为18.37%（9/49）；在Tm=（90.62±0.28）℃出现单一的特异性峰的样品有3份（Tm值分别为90.6℃、90.6℃和90.5℃），即存在鸭病毒性肠炎病毒弱毒感染阳性样品3份，阳性率为6.128%（3/49）；且还有一份样品出现双峰值（Tm值分别为85.5℃和90.6℃），即存在鸭病毒性肠炎病毒强毒和鸭病毒性肠炎病毒弱毒混合感染阳性样品1份，阳性率为2.04%（1/49）。
附图说明
图1 实时荧光定量引物的特异性试验，其中M：DL2000分子量标准；1：DVE强毒；2：DVE弱毒； 3：鸭大肠杆菌；4：鸭疫里氏杆菌；5：鸭源禽多杀性巴氏杆菌；6：鸭腺病毒A型；7：番鸭细小病毒；8：阴性对照。
图2 DVE强毒实时荧光定量PCR方法的扩增动力学曲线。
图3 DVE强毒实时荧光定量PCR方法的标准曲线。
图4 DVE弱毒实时荧光定量PCR方法的扩增动力学曲线。
图5 DVE弱毒实时荧光定量PCR方法的标准曲线。
图6 DVE强毒实时荧光定量PCR方法的特异性试验。
图7 DVE弱实时荧光定量PCR方法的特异性试验。
图8 DVE强弱毒双重实时荧光定量PCR的溶解曲线Tm值分析。其中， 1：DVE强毒阳性；2：DVE弱毒阳性； 3：其他的阴性对照（如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭腺病毒A型、番鸭细小病毒和阴性对照）（上述阴性对照均没有特异性Tm值，肉眼无法区分）。
具体实施方式
下面实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1
1、相关试验病原
试验用病原鸭病毒性肠炎病毒强毒株、鸭病毒性肠炎病毒弱毒株、鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭腺病毒A型和番鸭细小病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。
、实时荧光定量PCR的引物设计与分析
2.1 鸭病毒性肠炎病毒强弱毒UL2基因分析
在GenBank数据库中检索鸭病毒性肠炎病毒UL2基因，下载鸭病毒性肠炎病毒强毒株LS株（GenBank登录号JQ248598）、N1株（GenBank登录号JQ043216）、N3株（GenBank登录号JQ248596）、CHv株（GenBank登录号EU885419）、CV株（GenBank登录号JQ673560）、2085株（GenBank登录号JF999965）和弱毒株attenuated strain 1（GenBank登录号JQ347517）、attenuated strain 2（GenBank登录号JQ347518）、VAC株（GenBank登录号JQ347517）、K株（GenBank登录号KF487736）。
经Lasergen软件分析比对发现，所有鸭病毒性肠炎病毒强毒株编码的UL2基因长度均为1002bp，编码333个氨基酸；而所有鸭病毒性肠炎病毒强毒株编码的UL2基因长度均为474bp，编码157个氨基酸。经分析发现，弱毒株和强毒株相比存在一个528bp的连续缺失，缺失的核苷酸序列如下，
GATGCCCCTTTCGTACTGTGAGGGTGGTATTTAACAACAAAACTCCAGCTTTGGCCCATGCCTCTAGGCAGCCATGATCAACAATTTTCGTCTCTGGGTAAGAGCGCCGAACGGCCGATAATATATTACGTAGGCTAGGAGGTATCTGAATACCTCTCCGCACGCTGAATGCGAGCCCGTGAGCCTGGCCGGGTTGATGATATGGATCTTGCCCAACTATGATGACTTTTACATCCGATGGAGCACAGTACCTCGTCCATGTAAATATTTCATTTTTTGGCGGCAGGACTTCTTCGATGTCACAGCGCCGTTCATACTCAAGTAATACTCGAGACCCCACTTCCGATTGTAGCTCTTGGTATAATACTTCCCGCCAAGCATCGCCAATACAATAATCGCCGCTCAATTTTTCCCACTCGGTGGGACTATTAAACCACGAAGGCGCGACCTCACCGCGACCGCTGCTGTTCGACGTCTGAGGTTGTTGTGCTATACCGCCCCCCTCCCTCATACAGGCAACGAAACCCG。
实时荧光定量PCR的引物设计
由于鸭病毒性肠炎病毒编码的UL2基因是反向编码的，在引物设计时需要考虑这一问题（设计引物时鸭病毒性肠炎病毒强毒的参考株为LS株、鸭病毒性肠炎病毒弱毒株的参考株为attenuated strain 1株，设计引物时选择其反向编码序列进行实时荧光定量PCR的引物设计）。
2.2.1 上游引物的设计
其中公用的上游引物DVE-F1位于鸭病毒性肠炎病毒强毒的参考株为LS株反向编码序列的237-260位核苷酸序列、上游引物DVE-F1位于鸭病毒性肠炎病毒弱毒的参考株为attenuated strain 1株反向编码序列的237-260位核苷酸序列，核苷酸同源性均为100%。
2.2.2 下游引物的设计
针对鸭病毒性肠炎病毒强毒株特异性的下游引物DVE-R1位于鸭病毒性肠炎病毒强毒的参考株为LS株反向编码序列的351-374位核苷酸序列，而鸭病毒性肠炎病毒弱毒株此处均存在缺失，没有相关序列。DVE-F1和DVE-R1预期扩增鸭病毒性肠炎病毒强毒片段大小为138bp。
针对鸭病毒性肠炎病毒弱毒株特异性的下游引物DVE-R2位于鸭病毒性肠炎病毒弱毒的参考株为attenuated strain 1株反向编码序列的317-337位核苷酸序列，DVE-F1和DVE-R2预期扩增鸭病毒性肠炎病毒弱毒片段大小为101bp。
此外，还需要说明的是，下游引物DVE-R2在鸭病毒性肠炎病毒强毒株中也特异性编码，位于鸭病毒性肠炎病毒强毒的参考株为LS株反向编码序列的845-865位核苷酸序列，DVE-F1和DVE-R2预期扩增鸭病毒性肠炎病毒强毒片段大小为629 bp。为了解决这一可能存在的荧光信号干扰问题，本发明对实时荧光定量PCR方法的条件进行延伸条件优化（采用退火和延伸合二为一，控制时间为15s，该条件下最多可扩增150bp以内的片段），使DVE-F1和DVE-R2对鸭病毒性肠炎病毒强毒在优化后的条件下无法有效扩增，没有荧光信号。
充分考虑上述鸭病毒性肠炎病毒强弱毒基因组特点，利用引物设计软件Oligo(版本号v7.37)设计特异性的实时荧光定量PCR引物如下：
上游引物DVE-F1：5’- CAGATTTGACTATTTTTGACCAAC-3’；
下游引物DVE-R1：5’- AGACGAAAATTGTTGATCATGGCT-3’；
下游引物DVE-R2：5’- TAGGCTCCCGTCTCCGTCCCA-3’；
其中上游引物DVE-F1和下游引物DVE-R1检测鸭病毒性肠炎病毒强毒株；其中上游引物DVE-F1和下游引物DVE-R2检测鸭病毒性肠炎病毒弱毒株，共用一条上游引物DVE-F1，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
DVE-F1和DVE-R1预期扩增鸭病毒性肠炎病毒强毒片段大小为138bp和DVE-F1和DVE-R2预期扩增鸭病毒性肠炎病毒弱毒片段大小为101bp，经常规琼脂糖凝胶电泳无法有效区分（见图1）。
、引物的特异性分析
利用上述引物（DVE-F1/ DVE-R1、DVE-F1/ DVE-R2）对鸭病毒性肠炎病毒强毒株、鸭病毒性肠炎病毒弱毒株、鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭腺病毒A型和番鸭细小病毒进行常规PCR扩增，按照2×TransTaq-T PCR SuperMix (+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCRSuperMix反应液25μL、上下游引物（DVE-F1/ DVE-R1、DVE-F1/ DVE-R2，10μM）各1μL、提取的核酸DNA1μL，补充灭菌去离子水20μL至终体积50μL。反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃40 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，30个循环；循环结束后72 ℃延伸 10 min。反应结束后，进行常规琼脂糖凝胶电泳。
结果可见（见图1），仅DVE-F1/ DVE-R1对鸭病毒性肠炎病毒强毒株、DVE-F1/ DVE-R2对鸭病毒性肠炎病毒弱毒株出现特异性目的条带，但上述条带经常规琼脂糖凝胶电泳无法科学有效区分；对其他病原（如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭腺病毒A型和番鸭细小病毒）均未见特异性条带扩增。上述结果表明设计的实时荧光定量PCR试验的相关引物，特异性强。经NCBI数据库进行BLAST分析，也符合试验预期。
、鸭病毒性肠炎病毒强弱毒的双重实时荧光定量PCR检测方法的建立
3.1 鸭病毒性肠炎病毒强毒株实时荧光定量PCR方法的建立
3.1.1 阳性标准品的构建
根据鸭病毒性肠炎病毒强毒（FZ1501株）UL2基因特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：DVE-F5：5′- TGCAATCACGTTGCGTTGTACT -3′和DVE -R5：5′- GATTTCTGGGTTTTTGCTGGAC -3′，用于扩增约1311bp的UL2基因完整基因编码区片段，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取鸭病毒性肠炎病毒强毒（FZ1501株）核酸DNA，按照2×TransTaq-T PCR SuperMix (+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25μL、上下游引物（DVE-F5和DVE -R5，10μM）各1μL、提取的核酸DNA1μL，补充灭菌去离子水22μL至终体积50μL。反应条件为： 94 ℃ 预变性4 min；94 ℃ 50 s，56 ℃ 35 s，72 ℃90 s，35个循环；循环结束后72 ℃延伸 10 min。
用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将UL2基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（DVE-F5和DVE -R5）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T-DVE-强），分装后置于-20 ℃保存备用。
实时荧光定量PCR方法的建立
以鸭病毒性肠炎病毒强毒阳性标准品（T-DVE-强）为模板，进行连续稀释（质粒浓度为4.57×106、4.57×105、4.57×104、4.57×103、4.57×102和4.57×101拷贝/μL），在不同退火温度（54、56、58、60、62和64 ℃）、引物浓度（2.5、5.0、10和20 μmol/L）下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线），获得其敏感性试验数据。
从图2可以看出，建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为45.7拷贝/μL。以各标准品中质粒含量（C）的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，获得鸭病毒性肠炎病毒强毒实时荧光定量PCR标准曲线（图3），所获得标准曲线斜率为-3.491，Y轴截距为37.36，相关系数为0.999，扩增效率为99.8%，符合实验预期。
观察溶解曲线峰值（Tm值）分析试验结果：在Tm=（85.42±0.24）℃出现单一的特异性峰判为鸭病毒性肠炎病毒强毒阳性（图6）。对其他病原（如鸭病毒性肠炎病毒弱毒、鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭腺病毒A型和番鸭细小病毒）均未见特异性溶解曲线峰值（图6）。
鸭病毒性肠炎病毒弱毒株阳性标准品的构建
3.2.1 阳性标准品的构建
根据鸭病毒性肠炎病毒弱毒疫苗株（鸡胚化弱毒株CVCC AV1222株）UL2基因特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：DVE-F6：5′-CAATCACGTTGCGTTGTAC -3′和DVE -R6：5′- TTTCTGGGTTTTTGCTGGA -3′，用于扩增约777 bp的UL2基因完整基因编码区片段，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取鸭瘟病毒鸡胚化弱毒（CVCC AV1222株）核酸DNA，按照2×TransTaq-T PCR SuperMix (+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25μL、上下游引物（DVE-F6和DVE-R6，10μM）各1μL、提取的核酸DNA1μL，补充灭菌去离子水22μL至终体积50μL。反应条件为： 94 ℃ 预变性4 min；94 ℃ 50 s，56 ℃ 30 s，72℃ 45 s，35个循环；循环结束后72 ℃延伸 10 min。
用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将UL2基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（DVE-F6和DVE -R6）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T-DVE-弱），分装后置于-20 ℃保存备用。
实时荧光定量PCR方法的建立
以鸭病毒性肠炎病毒鸡胚化弱毒构建的阳性标准品（T-DVE-弱）为模板，进行连续稀释（质粒浓度为5.25×106、5.25×105、5.25×104、5.25×103、5.25×102和5.25×101拷贝/μL），在不同退火温度（54、56、58、60、62和64℃）、引物浓度（2.5、5.0、10和20 μmol/L）下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cyclethreshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线），获得其敏感性试验数据。
从图4可以看出，建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为52.5拷贝/μL。以各标准品中质粒含量（C）的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，获得鸭病毒性肠炎病毒弱毒实时荧光定量PCR标准曲线（图5），所获得标准曲线斜率为-3.218，Y轴截距为34.95，相关系数为0.999，扩增效率为100%，符合实验预期。
观察溶解曲线峰值（Tm值）分析试验结果：在Tm=（90.62±0.28）℃出现单一的特异性峰判为鸭病毒性肠炎病毒弱毒阳性（图7）。对其他病原（如鸭病毒性肠炎病毒强毒、鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭腺病毒A型和番鸭细小病毒）均未见特异性溶解曲线峰值（图7）。
双重实时荧光定量PCR反应条件的优化
按照SYBR® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus)试剂盒（RR420A，TAKARA公司）说明书配制20 μL的实时荧光定量PCR反应体系，在不同退火温度（54，56，58，60，62和64℃）、引物浓度（2.5-20 μM）下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。
结果：优化出的双重实时荧光定量PCR方法最佳反应体系（20 μL）如下表1。
表1 优化后的双重实时荧光定量PCR反应体系
Figure 782269DEST_PATH_IMAGE002
化出的双重实时荧光定量PCR方法最佳反应条件为：95 ℃预变性120 s；95 ℃10s，62 ℃延伸15 s，40个循环；循环结束后，做出溶解曲线。
双重实时荧光定量PCR方法结果判断及特异性分析
双重实时荧光定量PCR反应结束后，观察溶解曲线峰值（Tm值）分析试验结果：若在Tm=（85.42±0.24）℃出现单一的特异性峰判为鸭病毒性肠炎病毒强毒阳性（见图6）；若在Tm=（90.62±0.28）℃出现单一的特异性峰判为鸭病毒性肠炎病毒弱毒阳性（见图7）；若Tm=（85.42±0.24）℃和Tm=（90.62±0.28）℃均出现峰值，表明鸭病毒性肠炎病毒强毒和鸭病毒性肠炎病毒弱毒混合感染（见图8）。
对其他病原（如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒）均未见特异性溶解曲线峰值（见图8）。
临床样品的检测
对49份临床送检鸭源病料进行鸭病毒性肠炎病毒强弱毒感染的双重实时荧光定量PCR检测，用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取相应的DNA，按照建立双重实时荧光定量PCR体系和条件进行检测。结果发现，在Tm=（85.42±0.24）℃出现单一的特异性峰的样品有9份（Tm值分别为85.6℃、85.4℃、85.3℃、85.3℃、85.4℃、85.5℃、85.4℃、85.6℃和85.5℃、），即存在鸭病毒性肠炎病毒强毒感染阳性样品9份，阳性率为18.37%（9/49）；在Tm=（90.62±0.28）℃出现单一的特异性峰的样品有3份（Tm值分别为90.6℃、90.6℃和90.5℃），即存在鸭病毒性肠炎病毒弱毒感染阳性样品3份，阳性率为6.128%（3/49）；且还有一份样品出现双峰值（Tm值分别为85.5℃和90.6℃），即存在鸭病毒性肠炎病毒强毒和鸭病毒性肠炎病毒弱毒混合感染阳性样品1份，阳性率为2.04%（1/49）。
将相关阳性样品实时荧光定量PCR反应结束后的产物利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将UL2基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒（其中混合感染样品需要多挑取质粒鉴定，因为存在DVE强毒阳性重组质粒和DVE弱毒阳性重组质粒，需要分别测序鉴定）送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，均为相应的鸭病毒性肠炎病毒强毒和鸭病毒性肠炎病毒弱毒UL2基因片段，和建立的双重实时荧光定量PCR符合率为100%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> DVE强弱毒鉴别的实时荧光定量PCR检测引物及其试剂盒
<130> 8
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<170> PatentIn version 3.3
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cagatttgac tatttttgac caac 24
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agacgaaaat tgttgatcat ggct 24
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taggctcccg tctccgtccc a 21
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gatgcccctt tcgtactgtg agggtggtat ttaacaacaa aactccagct ttggcccatg 60
cctctaggca gccatgatca acaattttcg tctctgggta agagcgccga acggccgata 120
atatattacg taggctagga ggtatctgaa tacctctccg cacgctgaat gcgagcccgt 180
gagcctggcc gggttgatga tatggatctt gcccaactat gatgactttt acatccgatg 240
gagcacagta cctcgtccat gtaaatattt cattttttgg cggcaggact tcttcgatgt 300
cacagcgccg ttcatactca agtaatactc gagaccccac ttccgattgt agctcttggt 360
ataatacttc ccgccaagca tcgccaatac aataatcgcc gctcaatttt tcccactcgg 420
tgggactatt aaaccacgaa ggcgcgacct caccgcgacc gctgctgttc gacgtctgag 480
gttgttgtgc tataccgccc ccctccctca tacaggcaac gaaacccg 528
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Claims (2)

1.一种鸭病毒性肠炎病毒强弱毒鉴别的实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于：所述引物包括如下：
上游引物DVE-F1：5’- CAGATTTGACTATTTTTGACCAAC-3’，
下游引物DVE-R1：5’- AGACGAAAATTGTTGATCATGGCT-3’，
下游引物DVE-R2：5’- TAGGCTCCCGTCTCCGTCCCA-3’，
其中上游引物DVE-F1和下游引物DVE-R1检测鸭病毒性肠炎病毒强毒株；
其中上游引物DVE-F1和下游引物DVE-R2检测鸭病毒性肠炎病毒弱毒株。
2.一种用于检测鸭病毒性肠炎病毒强弱毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
An attempt to develop a detection method specific for virulent duck plague virus strains based on the UL2 gene B fragment;Liji Xie等;《AVIAN PATHOLOGY》;20170718;第46卷(第6期);652–657 *
鸭瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立;万春和等;《福建农林大学学报（自然科学版）》;20181118;722-728 *
鸭瘟病毒UL2基因的原核表达及鉴别鸭瘟病毒强弱毒株PCR方法建立;尹雪琴;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20140315;D050-473 *
鸭瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其强弱毒株UL2基因差异分析;马腾飞;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20160415;D050-321 *
鸭肠炎病毒强毒和疫苗弱毒鉴别诊断PCR方法的建立;万春和等;《福建农业学报》;20180315;219-224 *
鸭肠炎病毒疫苗株EvaGreen实时荧光定量PCR方法的建立;万春和等;《畜牧兽医学报》;20180715;1558-1566 *

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