CN107447048B - DVE强弱毒Real time PCR鉴别诊断的引物、探针及试剂盒 - Google Patents

DVE强弱毒Real time PCR鉴别诊断的引物、探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供鸭病毒性肠炎病毒（DVE）强弱毒实时荧光定量PCR鉴别诊断的引物、探针及试剂盒，所述引物和探针序列如SEQ ID NO.1‑6所示，具有很高的特异性和灵敏度。当前国内外尚未见可同时对鸭病毒性肠炎病毒（DVE）强弱毒鉴别诊断的双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的引物和探针的研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

Description

DVE强弱毒Real time PCR鉴别诊断的引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明提供鸭病毒性肠炎病毒（DVE）强弱毒实时荧光定量PCR鉴别诊断的引物、探针及试剂盒，属于动物传染病学领域。
背景技术
鸭病毒性肠炎(duck virus enteritis, DVE)，又称鸭瘟(duck plague, DP)，是由鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)引起的常见于鸭、鹅及其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性、高度接触性传染病。
我国的研究者从上世纪 60 年代开始研制 DVE 弱毒疫苗，其主要途径是将 DEV强毒先在鸭胚上连续传代，然后再转接到鸡胚上长期连续传代，DEV 病毒对鸡胚毒力增强的同时，逐渐丧失了对鸭的致病性，但对其仍保持较强的免疫原性。目前，我国使用的 DEV毒株为细胞传代致弱毒株，在其免疫鸭后几个小时就可产生一定程度的保护力。
实时荧光定量PCR方法（Real time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高，目前常用的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标molecular Beacon。TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团，如FAM、VIC、ROX、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团，如Eclipse、TAMRA等。实时荧光定量PCR技术在检测病原时不仅可以定性检测病原的有无，而且还可以定量分析病毒含量的多少，在病原核酸检测技术上被广泛使用。多重实时荧光定量PCR是一种特殊的荧光定量PCR形式，其突出的特点是一次实时荧光定量PCR反应可同时检测多种病原，对病原复杂或存在多种基因型的病原鉴别检测十分有效。
在疱疹病毒粒子DNA复制过程中涉及到多种酶，其中，由UL2基因编码的尿嘧啶DNA糖基化酶（Uracil-DNA glycosylase，UDG）是DNA修饰不可缺少的酶，它能将复制过程中dUTP错误插入或是胞嘧啶的脱氨基造成的尿嘧啶残基切除，保证DNA复制的正确性和顺利进行。DEV的UL2是单纯疱疹病毒1型(Herpes sim-plex virus type 1，HSV-1)的UL2的同源基因，后者编码尿嘧啶 DNA 糖基化酶，是一个非必须基因，是对病毒复制发挥重要作用的一种酶。对DVE编码的 UL2 基因核酸序列的同源性进行分析发现，DVE强毒株和DVE弱毒株在UL2基因编码区存在较大差异，DVE弱毒株均发生了一个528bp的片段缺失，这段528bp 的序列占了UL2 基因的一半以上，可能导致 UL2 功能的丧失，提示这个片段缺失很可能与弱毒株的毒力减弱直接相关。因此，建立能够同时对DVE强毒株和弱毒株进行鉴别诊断方法尤为重要。
本发明基于鸭病毒性肠炎病毒强弱毒UL2基因编码区特点，提供鸭病毒性肠炎病毒（DVE）强弱毒实时荧光定量PCR鉴别诊断的引物、探针及试剂盒。其中，鸭病毒性肠炎病毒强弱毒均可检测的实时荧光定量PCR的引物和探针选择鸭病毒性肠炎病毒强弱毒保守的gE基因进行设计，对鸭病毒性肠炎病毒强弱毒均可进行检测。此外，针对鸭病毒性肠炎病毒强弱毒缺失的UL2基因（弱毒在此处缺失528个核苷酸，记为UL2-缺失）设计特异性的引物和探针，该组引物和探针仅针对UL2-缺失的528个核苷酸进行设计，仅鸭病毒性肠炎病毒强毒可检测到阳性荧光信号。本发明建立的鸭病毒性肠炎病毒（DVE）强弱毒实时荧光定量PCR鉴别诊断的引物、探针及试剂盒可对鸭病毒性肠炎病毒强弱毒进行鉴别诊断，可简化操作程序、节约成本，又可快速用于开展鸭病毒性肠炎病毒强弱毒相关病原学致病机理研究。但是，当前国内外尚未见可同时对鸭病毒性肠炎病毒强弱毒进行检测双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的引物和探针的研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域研究空白。
发明内容
本发明提供鸭病毒性肠炎病毒（DVE）强弱毒实时荧光定量PCR鉴别诊断的引物、探针及试剂盒，建立能够同时对鸭病毒性肠炎病毒强弱毒鉴别诊断的检测方法，简化操作程序、节约成本。
为实现上述目的，采用以下技术方案：
用于检测鸭病毒性肠炎病毒（强毒和弱毒均可检测）：
上游引物DVE-1-F：5’- AAGGGTATAGGGTTAAGAC -3’，
下游引物DVE-1-R：5’- GGTGTAGATTCGGTAGAC -3’，
荧光探针DVE-1-P：5’- ACGAATCCTCAGAACACAGACTCAG -3’；
用于检测鸭病毒性肠炎病毒强毒（仅检测强毒为阳性）：
上游引物DVE-强-F：5’- CGGATGTAAAAGTCATCATA -3’，
下游引物DVE-强-R：5’- GGCCGATAATATATTACGTAG -3’，
荧光探针DVE-强-P：5’- AATACCTCTCCGCACGCTGAA -3’；
其中，鸭病毒性肠炎病毒强弱毒均可检测的荧光探针DVE-1-P的5′端标记有荧光报告基团FAM、仅可检测鸭病毒性肠炎病毒强毒的荧光探针DVE-强-P的5′端标记有荧光报告基团ROX；荧光探针DVE-1-P和DVE-强-P的3′端均标记淬灭基团Eclipse。
用于检测鸭病毒性肠炎病毒强弱毒的实时荧光定量PCR方法的试剂盒，包括所述的引物和探针。
双重TaqMan实时荧光定量PCR反应体系为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
双重实时荧光定量PCR方法反应条件为： 95 ℃预变性60 s；95 ℃ 5s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸18 s，40个循环。
实时荧光定量PCR反应结束后，分析试验结果，结果判定如下：
① 在520nm处选择FAM通道见有阳性扩增信号，表明检测样品中存在鸭病毒性肠炎病毒感染（此时无法区分鸭病毒性肠炎病毒强弱毒感染类型）。
需要结合605nm处选择ROX通道进行判定鸭病毒性肠炎病毒强弱毒感染类型，判定如下：
② 若在605nm处选择ROX通道见有阳性扩增信号，表明检测样品中存在鸭病毒性肠炎病毒强毒感染；
③若在605nm处选择ROX通道没有阳性扩增信号，表明检测样品中存在鸭病毒性肠炎病毒弱毒感染；
本发明提供鸭病毒性肠炎病毒强弱毒的实时荧光定量PCR方法的检测引物、探针及试剂盒，具有以下优点和效果：
1、同时检测：建立的方法能够同时对鸭群中鸭病毒性肠炎病毒强弱毒感染类型进行检测，简化操作程序、节约成本。
2、检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过实时荧光定量PCR机器自带的进行结果判定。从核酸提取到结果判定仅需75 min，且一次可以同时进行96个样品检测。
3、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，根据检测待检样品中鸭病毒性肠炎病毒强弱毒感染类型的Ct值，直接对其感染鸭病毒性肠炎病毒强弱毒感染类型及其感染程度进行准确定量。
4、灵敏度高：鸭病毒性肠炎病毒（不区分感染类型）最低可检测26.4个拷贝；鸭病毒性肠炎病毒（强毒）最低可检测31.3个拷贝，较常规PCR检测灵敏度提高100倍。
5、特异性强：和鸭群中的常见传染病如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭腺病毒A型和番鸭细小病毒在FAM通道（520nm）和ROX通道（605nm）均无反应信号。
对35份临床送检疑似鸭瘟病毒感染病料进行双重实时荧光定量PCR检测，用商品化病毒核酸提取试剂盒提取相应的DNA，按照建立双重实时荧光定量PCR体系和条件进行检测。结果发现，在520nm处选择FAM通道见有24份样品阳性扩增信号，表明24份检测样品中存在鸭病毒性肠炎病毒感染（强弱毒类型无法区分），阳性率为68.57%（24/35）。在605nm处选择ROX通道见有21份样品阳性扩增信号，表明21份检测样品中存在鸭病毒性肠炎病毒强毒感染，阳性率为60.0%（21/35）；剩下的3份（24-21）样品存在鸭病毒性肠炎病毒弱毒感染，阳性率为8.57%（3/35）。
附图说明
图1鸭病毒性肠炎病毒实时荧光定量PCR方法的扩增动力学曲线。
图2 鸭病毒性肠炎病毒实时荧光定量PCR方法的标准曲线。
图3鸭病毒性肠炎病毒实时荧光定量PCR方法的特异性试验。图中：1表示鸭病毒性肠炎病毒强毒；2表示鸭病毒性肠炎病毒弱毒；3表示参考株（如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭腺病毒A型和番鸭细小病毒），由于都没有阳性荧光信号，肉眼无法区分。
图4 鸭病毒性肠炎病毒强毒实时荧光定量PCR方法的扩增动力学曲线。
图5 鸭病毒性肠炎病毒强毒实时荧光定量PCR方法的标准曲线。
图6鸭病毒性肠炎病毒强毒实时荧光定量PCR方法的特异性试验。图中：1表示鸭病毒性肠炎病毒强毒；2表示鸭病毒性肠炎病毒弱毒和参考株（如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭腺病毒A型和番鸭细小病毒），由于都没有阳性荧光信号，肉眼无法区分。
具体实施方式
下面实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1
1、 相关试验病原
试验用病原鸭病毒性肠炎病毒强毒株、鸭病毒性肠炎病毒弱毒株、鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭腺病毒A型和番鸭细小病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。
、引物和探针设计
2.1 鸭病毒性肠炎病毒强弱毒均可检测的引物和探针设计
2.1.1 鸭病毒性肠炎病毒gE基因分析
在GenBank数据库中检索鸭病毒性肠炎病毒gE基因，下载鸭病毒性肠炎病毒强毒株CHv株（GenBank登录号EU885419）、CV株（GenBank登录号JQ673560）、2085株（GenBank登录号JF999965）和弱毒株VAC株（GenBank登录号JQ347517）、K株（GenBank登录号KF487736）和C-KCE株（GenBank登录号KF263690）。经Lasergen软件分析比对发现，所有鸭病毒性肠炎病毒强毒株和弱毒株编码的gE基因长度均为1473p，编码490个氨基酸。鸭病毒性肠炎病毒强毒株和弱毒株编码的gE基因核苷酸同源性在99.5%以上。
2.1.2强弱毒均可检测的引物和探针设计
基于鸭病毒性肠炎病毒强毒株和弱毒株编码的gE基因特点，利用Oligo(版本号v7.37)设计特异性的引物和探针（该区域鸭病毒性肠炎病毒强毒株和弱毒株核苷酸序列完全一致），对鸭病毒性肠炎病毒强毒株和弱毒株均可检测，设计的引物和探针为，
上游引物DVE-1-F：5’- AAGGGTATAGGGTTAAGAC -3’，
下游引物DVE-1-R：5’- GGTGTAGATTCGGTAGAC -3’，
荧光探针DVE-1-P：5’- ACGAATCCTCAGAACACAGACTCAG -3’；
其中，鸭病毒性肠炎病毒强弱毒均可检测的荧光探针DVE-1-P的5′端标记有荧光报告基团FAM、3′端标记淬灭基团Eclipse。
2.2仅可鸭病毒性肠炎病毒强毒检测的引物和探针设计
2.2.1 鸭病毒性肠炎病毒强弱毒UL2基因分析
在GenBank数据库中检索鸭病毒性肠炎病毒UL2基因，下载鸭病毒性肠炎病毒强毒株LS株（GenBank登录号JQ248598）、N1株（GenBank登录号JQ043216）、N3株（GenBank登录号JQ248596）、CHv株（GenBank登录号EU885419）、CV株（GenBank登录号JQ673560）、2085株（GenBank登录号JF999965）和弱毒株attenuated strain 1（GenBank登录号JQ347517）、attenuated strain 2（GenBank登录号JQ347518）、VAC株（GenBank登录号JQ347517）、K株（GenBank登录号KF487736）。
经Lasergen软件分析比对发现，所有鸭病毒性肠炎病毒强毒株编码的UL2基因长度均为1002bp，编码333个氨基酸；而所有鸭病毒性肠炎病毒强毒株编码的UL2基因长度均为474bp，编码157个氨基酸。经分析发现，弱毒株和强毒株相比存在一个528bp的连续缺失，缺失的核苷酸序列如下，
GATGCCCCTTTCGTACTGTGAGGGTGGTATTTAACAACAAAACTCCAGCTTTGGCCCATGCCTCTAGGCAGCCATGATCAACAATTTTCGTCTCTGGGTAAGAGCGCCGAACGGCCGATAATATATTACGTAGGCTAGGAGGTATCTGAATACCTCTCCGCACGCTGAATGCGAGCCCGTGAGCCTGGCCGGGTTGATGATATGGATCTTGCCCAACTATGATGACTTTTACATCCGATGGAGCACAGTACCTCGTCCATGTAAATATTTCATTTTTTGGCGGCAGGACTTCTTCGATGTCACAGCGCCGTTCATACTCAAGTAATACTCGAGACCCCACTTCCGATTGTAGCTCTTGGTATAATACTTCCCGCCAAGCATCGCCAATACAATAATCGCCGCTCAATTTTTCCCACTCGGTGGGACTATTAAACCACGAAGGCGCGACCTCACCGCGACCGCTGCTGTTCGACGTCTGAGGTTGTTGTGCTATACCGCCCCCCTCCCTCATACAGGCAACGAAACCCG。
2.2.2仅检测强毒实时荧光定量PCR的引物设计
由于鸭病毒性肠炎病毒编码的UL2基因是反向编码的，在引物设计时需要考虑这一问题。
基于鸭病毒性肠炎病毒强毒株和弱毒株编码的UL2基因却失区（528bp）特点，利用Oligo(版本号v7.37)设计特异性的引物和探针，该特异性的引物和探针仅可对鸭病毒性肠炎病毒强毒株；弱毒株由于该区域存在缺失，不会产生扩增信号，设计的引物和探针为，
上游引物DVE-强-F：5’- CGGATGTAAAAGTCATCATA -3’，
下游引物DVE-强-R：5’- GGCCGATAATATATTACGTAG -3’，
荧光探针DVE-强-P：5’- AATACCTCTCCGCACGCTGAA -3’；
其中，仅可检测鸭病毒性肠炎病毒强毒的荧光探针DVE-强-P的5′端标记有荧光报告基团ROX、3′端标记淬灭基团Eclipse。
2.2.3、引物的特异性分析
利用上述引物（DVE-1-F/ DVE-1-R、DVE-强-F/ DVE-强-R）对鸭病毒性肠炎病毒强毒株、鸭病毒性肠炎病毒弱毒株、鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭腺病毒A型和番鸭细小病毒进行常规PCR扩增，按照2×TransTaq-T PCR SuperMix (+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-TPCR SuperMix反应液25μL、上下游引物（DVE-1-F/ DVE-1-R、DVE-强-F/ DVE-强-R，10μM）各1μL、提取的核酸DNA1μL，补充灭菌去离子水20μL至终体积50μL。反应条件为： 94 ℃ 预变性4 min；94 ℃40 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；循环结束后72 ℃延伸 10 min。反应结束后，进行常规琼脂糖凝胶电泳，对鸭群常见其他病原（如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭腺病毒A型和番鸭细小病毒）均未见特异性条带扩增。上述结果表明设计的实时荧光定量PCR试验的相关引物，特异性强。经NCBI数据库进行BLAST分析，也符合试验预期。
上述引物和探针均在宝日医生物技术（北京）有限公司合成。
3、 鸭病毒性肠炎病毒鉴别诊断的双重实时荧光定量PCR检测方法的建立
3.1 gE基因阳性标准品的构建
由于鸭病毒性肠炎病毒gE基因编码区核苷酸仅存在1-2个碱基的差异（本发明设计的特异性的引物和探针避开了这个碱基存在差异的位置，其扩增鸭病毒性肠炎病毒gE基因时，强毒和弱毒的序列完全一致，核苷酸同源性为100%），无需分别构建鸭病毒性肠炎病毒强毒和弱毒阳性标准品质粒。
根据鸭病毒性肠炎病毒弱毒（鸡胚化弱毒株CVCC AV1222株）gE编码区基因特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：DVE-gE-F：5′-ATTCGCATCTACGTTGAACGCCAG -3′和DVE-gE-R：5′- CTAGTACTCCGAGACCGACT -3′，用于扩增约395 bp的gE基因片段，引物由宝日医生物技术（北京）有限公司合成。
用商品化病毒核酸提取试剂盒提取鸭病毒性肠炎病毒弱毒（鸡胚化弱毒株CVCCAV1222株）核酸DNA，按照2×TransTaq-T PCR SuperMix (+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25μL、上下游引物（DVE-gE-F和DVE-gE-R，10μM）各1μL、提取的核酸DNA1μL，补充灭菌去离子水22μL至终体积50μL。反应条件为：94 ℃ 预变性4 min；94 ℃ 50 s，56 ℃ 30 s，72 ℃35 s，30个循环；循环结束后72 ℃延伸 10 min。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 SimpleCloning Kit克隆连接试剂盒说明书将gE基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（DVE-gE-F和DVE-gE-R）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术（北京）有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T- DVE-gE），分装后置于-20 ℃保存备用。
3.2 UL2基因缺失区阳性标准品的构建
根据鸭病毒性肠炎病毒强毒UL2基因缺失区基因特点，利用引物设计软件Oligo(版本v7.37)设计特异性引物，引物序列为：DVE-UL2deletion-F：5′-GATGCCCCTTTCGTACTGTGA -3′和DVE-UL2deletion -R：5′- CGGGTTTCGTTGCCTGTATGA -3′，用于扩增约528 bp的UL2基因缺失区基因片段，引物由宝日医生物技术（北京）有限公司合成。
用商品化病毒核酸提取试剂盒提取鸭病毒性肠炎病毒强毒（FZ1501株）核酸DNA，按照2×TransTaq-T PCR SuperMix (+dye)说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix反应液25μL、上下游引物（DVE-UL2deletion-F和DVE-UL2deletion -R，10μM）各1μL、提取的核酸DNA1μL，补充灭菌去离子水22μL至终体积50μL。反应条件为： 94 ℃ 预变性4 min；94 ℃ 50 s，58 ℃ 35 s，72℃ 40 s，30个循环；循环结束后72 ℃延伸 10 min。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将UL2基因缺失区基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（DVE-UL2deletion-F和DVE-UL2deletion-R）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术（北京）有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为实时荧光定量PCR的阳性标准品（T- DVE-UL2deletion），分装后置于-20 ℃保存备用。
3.3 反应条件的优化及标准曲线的建立
按照Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)试剂盒说明书配制25 μL的实时荧光定量PCR反应体系，在不同退火温度（56、58、60、62和64 ℃）、引物浓度（2.5-20 μM）及探针浓度（1.25-20 μM）下进行实时荧光定量PCR反应，对反应条件进行优化。以针对gE基因的阳性标准品（T- DVE-gE）和针对UL2基因缺失区阳性标准品（T- DVE-UL2deletion）为模板（待检测样品直接加入2μL提取的核酸DNA。在建立标准曲线时不同质粒浓度的T- DVE-gE和T- DVE-UL2deletion均加入2μL，此时将灭菌去离子水少加2μL，保证反应体系终体积是25μL），在520nm处选择FAM通道、在605nm处选择ROX通道。用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cyclethreshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线）。
结果：优化出的双重实时荧光定量PCR方法最佳反应体系（25 μL）如下表1。
表1双重TaqMan实时荧光定量PCR反应体系为：
Figure 687817DEST_PATH_IMAGE002
结果：双重实时荧光定量PCR方法反应条件为： 95 ℃预变性60 s；95 ℃ 5s，58℃退火10 s，72 ℃延伸18 s，40个循环。
实验结果的判定：
① 在520nm处选择FAM通道见有阳性扩增信号，表明检测样品中存在鸭病毒性肠炎病毒感染（此时无法区分鸭病毒性肠炎病毒强弱毒感染类型）。
需要结合605nm处选择ROX通道进行判定鸭病毒性肠炎病毒强弱毒感染类型，判定如下：
② 若在605nm处选择ROX通道见有阳性扩增信号，表明检测样品中存在鸭病毒性肠炎病毒强毒感染；
③若在605nm处选择ROX通道没有阳性扩增信号，表明检测样品中存在鸭病毒性肠炎病毒弱毒感染；
3.4 gE基因敏感性试验
利用微量核酸测定仪测定阳性标准品（T- DVE-gE）的浓度，计算其拷贝数为2.64×107拷贝/μL，对其进行10倍连续稀释，共进行连续稀释（质粒含量分别为2.64×106、2.64×105、2.64×104、2.64×103、2.64×102、2.64×101和2.64×100拷贝/μL），分装后置于-20℃保存备用。分别以上述不同稀释度阳性标准品（T- DVE-gE）作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线（见图1）。以标准品起始拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线）（见图2），获得其敏感性试验数据。
从图1可以看出，本发明建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为26.4拷贝/μL。以各标准品中质粒含量（C）的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，获得鸭病毒性肠炎病毒实时荧光定量PCR标准曲线（图2），所获得标准曲线斜率为-3.653，Y轴截距为37.47，相关系数为0.998，扩增效率为99.8%，符合实验预期。
3.5 UL2基因缺失区敏感性试验
利用微量核酸测定仪测定阳性标准品（T- DVE-UL2deletion）的浓度，计算其拷贝数为3.13×107拷贝/μL，对其进行10倍连续稀释，共进行连续稀释（质粒含量分别为3.13×106、3.13×105、3.13×104、3.13×103、3.13×102、3.13×101和3.13×100拷贝/μL），分装后置于-20 ℃保存备用。分别以上述不同稀释度阳性标准品（T- DVE-UL2deletion）作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线（见图3）。以标准品起始拷贝数的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线）（见图4），获得其敏感性试验数据。
从图4可以看出，本发明建立的实时荧光定量PCR方法最低检测限为31.3拷贝/μL。以各标准品中质粒含量（C）的常用对数（lgC）为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，获得针对鸭病毒性肠炎病毒强毒株特有的UL2基因缺失区的实时荧光定量PCR标准曲线（图4），所获得标准曲线斜率为-3.162，Y轴截距为34.75，相关系数为0.999，扩增效率为100%，符合实验预期。
3.6特异性检测
用优化后的双重实时荧光定量PCR条件分别对水禽其他常见基因组核酸类型为DNA的常见病原，如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭瘟病毒和番鸭细小病毒进行实时荧光定量PCR检测，以鸭腺病毒A型和鸭腺病毒2型为阳性对照。用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取相应病毒的核酸DNA，按照Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)试剂盒说明书用优化后的反应条件进行检测，评价建立的实时荧光定量PCR方法的特异性。
从图5（520nmFAM通道）可见，用优化后的双重实时荧光定量PCR条件分别对水禽其他常见基因组核酸类型为DNA的常见病原，如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌病、鸭腺病毒A型、番鸭细小病毒进行实时荧光定量PCR检测，均未检测到阳性荧光信号；仅鸭病毒性肠炎病毒强毒和鸭病毒性肠炎病毒弱毒检测到阳性荧光信号。
从图6（605nmROX通道）可见，用优化后的双重实时荧光定量PCR条件分别对水禽其他常见基因组核酸类型为DNA的常见病原，如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌病、鸭腺病毒A型、番鸭细小病毒和鸭病毒性肠炎病毒弱毒进行实时荧光定量PCR检测，均未检测到阳性荧光信号；仅鸭病毒性肠炎病毒强毒检测到阳性荧光信号。
上述结果表明，建立的双重实时荧光定量PCR特异性强，对水禽其他常见基因组核酸类型为DNA的常见病原，如鸭大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、鸭源禽多杀性巴氏杆菌、鸭腺病毒A型和番鸭细小病毒均未见非特异性交叉干扰。
3.7 临床样品的检测
对35份临床送检疑似鸭瘟病毒感染病料进行双重实时荧光定量PCR检测，用商品化病毒核酸提取试剂盒提取相应的DNA，按照建立双重实时荧光定量PCR体系和条件进行检测。结果发现，在520nm处选择FAM通道见有24份样品阳性扩增信号，表明24份检测样品中存在鸭病毒性肠炎病毒感染（强弱毒类型无法区分），阳性率为68.57%（24/35）。在605nm处选择ROX通道见有21份样品阳性扩增信号，表明21份检测样品中存在鸭病毒性肠炎病毒强毒感染，阳性率为60.0%（21/35）；剩下的3份（24-21）样品存在鸭病毒性肠炎病毒弱毒感染，阳性率为8.57%（3/35）。
将605nm处选择ROX通道见有21份样品相关阳性样品实时荧光定量PCR反应结束后的产物利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将UL2基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（DVE-UL2deletion-F和DVE-UL2deletion -R）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术（北京）有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，均为相应的鸭病毒性肠炎病毒强毒的UL2基因片段，符合率为100%。
对仅FAM通道检测阳性（ROX通道检测为阴性）的3份样品，的产物利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将UL2基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（DVE-gE-F和DVE-gE-R）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送宝日医生物技术（北京）有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，均为相应的鸭病毒性肠炎病毒gE基因片段，符合率为100%。此外，还需要对仅FAM通道检测阳性（ROX通道检测为阴性）的3份样品，利用针对UL2缺失区的特异性引物（DVE-强-F和DVE-强-R）进行检测，结果均为阴性，表明这3份样品为鸭病毒性肠炎病毒弱毒株感染，符合率同样为100%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> DVE强弱毒Real time PCR鉴别诊断的引物、探针及试剂盒
<130> 11
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aagggtatag ggttaagac 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggtgtagatt cggtagac 18
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acgaatcctc agaacacaga ctcag 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cggatgtaaa agtcatcata 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggccgataat atattacgta g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aatacctctc cgcacgctga a 21
<210> 7
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gatgcccctt tcgtactgtg agggtggtat ttaacaacaa aactccagct ttggcccatg 60
cctctaggca gccatgatca acaattttcg tctctgggta agagcgccga acggccgata 120
atatattacg taggctagga ggtatctgaa tacctctccg cacgctgaat gcgagcccgt 180
gagcctggcc gggttgatga tatggatctt gcccaactat gatgactttt acatccgatg 240
gagcacagta cctcgtccat gtaaatattt cattttttgg cggcaggact tcttcgatgt 300
cacagcgccg ttcatactca agtaatactc gagaccccac ttccgattgt agctcttggt 360
ataatacttc ccgccaagca tcgccaatac aataatcgcc gctcaatttt tcccactcgg 420
tgggactatt aaaccacgaa ggcgcgacct caccgcgacc gctgctgttc gacgtctgag 480
gttgttgtgc tataccgccc ccctccctca tacaggcaac gaaacccg 528
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<400> 11
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Claims (2)

1.鸭病毒性肠炎病毒强弱毒实时荧光定量PCR鉴别诊断的引物和探针，其特征在于：所述引物和探针包括如下：
用于检测鸭病毒性肠炎病毒，检测强毒和弱毒均为阳性：
上游引物DVE-1-F：5’- AAGGGTATAGGGTTAAGAC -3’，
下游引物DVE-1-R：5’- GGTGTAGATTCGGTAGAC -3’，
荧光探针DVE-1-P：5’- ACGAATCCTCAGAACACAGACTCAG -3’；
用于检测鸭病毒性肠炎病毒强毒，仅检测强毒为阳性：
上游引物DVE-强-F：5’- CGGATGTAAAAGTCATCATA -3’，
下游引物DVE-强-R：5’- GGCCGATAATATATTACGTAG -3’，
荧光探针DVE-强-P：5’- AATACCTCTCCGCACGCTGAA -3’；
其中，鸭病毒性肠炎病毒强弱毒均可检测的荧光探针DVE-1-P的5′端标记有荧光报告基团FAM、仅可检测鸭病毒性肠炎病毒强毒的荧光探针DVE-强-P的5′端标记有荧光报告基团ROX；荧光探针DVE-1-P和DVE-强-P的3′端均标记淬灭基团Eclipse。
2.一种用于鸭病毒性肠炎病毒强弱毒实时荧光定量PCR鉴别诊断的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针。
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Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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鸭瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立;万春和等;《福建农林大学学报（自然科学版）》;20181118;722-728 *
鸭瘟病毒UL2基因的原核表达及鉴别鸭瘟病毒强弱毒株PCR方法的建立;尹雪琴;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20140315;D050-473 *
鸭瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其强弱毒株UL2基因差异分析;马腾飞;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20160415;D050-321 *
鸭肠炎病毒囊膜糖蛋白gＥ基因序列分析及真核表达载体的构建;文晶亮等;《中国兽药杂志》;20140520;5-10 *
鸭肠炎病毒强毒和疫苗弱毒鉴别诊断PCR方法的建立;万春和等;《福建农业学报》;20180315;219-224 *
鸭肠炎病毒疫苗株EvaGreen实时荧光定量PCR方法的建立;万春和等;《畜牧兽医学报》;20180715;1558-1566 *

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