CN111748652A - 鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量pcr检测的引物和探针 - Google Patents
鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量pcr检测的引物和探针 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量PCR检测的引物和探针，所述引物和探针的序列如SEQ.ID.No.1‑SEQ.ID.No.6所示。利用所述引物和探针建立的双重实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，可用于鸭圆环病毒分型检测，为后续科学研究两种鸭圆环病毒基因型致病机理和开展分子流行病学奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于动物病毒学领域，具体涉及一种鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2 型双重实时荧光定量PCR检测的引物和探针。
背景技术
实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。实时荧光定量PCR在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量 PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、 FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标(molecular Beacon)。TaqMan探针法是指Real-time PCR扩增时在加入一对引物时，还同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC、Cy5、 JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团，如Eclipse、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号。随着Real-time PCR 的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与Real-time PCR产物形成完全同步，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。由于TaqMan实时荧光定量探针在常规SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的基础上，加入一条更特异性的探针，使检测目的基因只有和TaqMan探针特异性的结合，才能检测到阳性扩增信号，使检测结果更特异性，避免了SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法可能导致的结果误读误判，被广泛应用于动物传染病学检测领域。此外，不同荧光报告基团 (Reporter，R)标记，可同时对单一样本(尤其针对样品难以获取或病原载量较低样本)开展多种病原学检测，具有高通量、成本低廉、结果迅速等优点，在新发传染病等领域被广泛使用。
鸭圆环病毒(duck circovirus,DuCV)最早由Hattermann等2003年在番鸭中首次发现。鸭感染DuCV的主要临床表现为感染鸭羽毛凌乱、生长发育不良及体重轻等，对感染鸭的组织病理学研究发现DuCV主要引起鸭法氏囊淋巴细胞减少、萎缩和组织细胞增生等，经原位荧光检测证实DuCV感染鸭的脾脏、胸腺和法氏囊中形成明显的病灶，提示DuCV感染可引起病毒诱导性淋巴组织损伤，从而使感染宿主易并发或继发感染其它病原。DuCV为无囊膜、二十面体对称的病毒，其基因组为单股负链环状DNA，编码两个大的蛋白(ORF-V1和ORF-C1)。
研究发现鸭群中流行的DuCV可划分为两大基因型：鸭圆环病毒1型 (DuCV-1)和鸭圆环病毒2型(DuCV-2)，其中DuCV-1分支包括DuCV欧洲株、 DuCV美洲株、国内部分浙江株、部分山东株和部分福建株，基因组长度为 1988bp-1996bp；而DuCV-2分支包括了所有台湾株和部分福建株，DuCV-2分支内DuCV基因组全长均为1988bp。2015年，四川农业大学利用感染性克隆技术获得DuCV-GH01株(属于DuCV-2)，病毒对非免疫雏樱桃谷鸭(10d)的致病性，结果发现雏鸭感染GH01株后可见典型的DuCV临床感染症状(如消瘦、羽毛凌乱和体重减轻等)，其胸腺、脾脏、法氏囊、肝脏和肺脏等多脏器出现不同程度的病理损伤，显著引起宿主靶细胞凋亡，造成免疫器官损伤导致鸭免疫抑制。2018年，韩国学者对D11-JW-008株(属于DuCV-1分支)对北京鸭(24d)致病性研究发现，北京鸭感染后其法氏囊可检测到细胞凋亡，但实验组和对照组类似，并未观察到典型的DuCV临床感染症状(如消瘦、羽毛凌乱和体重减轻等)。上述研究表明，DuCV-1和DuCV-2对雏鸭存在致病力强弱差异。目前，尚未见可特异性性对DuCV-1和DuCV-2感染进行鉴别诊断的实时荧光定量引物组和探针组的研究报道，该方法不仅可用于流行病学检测(达到常规PCR检测效果，但敏感度更高)且可对DuCV-1和DuCV-2具体亚型感染情况进行精准定量的同时进行精准区分不同感染型。本发明的用于鸭圆环病毒1型和2型鉴别诊断的引物组和探针组，为后续开展DuCV-1和DuCV-2型间致病机理差异和开展型特异性流行病学调查奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量 PCR检测的引物和探针，建立能够同时对鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型进行检测的方法，该方法不仅可用于流行病学检测且可对DuCV-1和DuCV-2具体亚型感染情况进行精准定量的同时进行精准区分不同感染型，为后续开展DuCV-1和 DuCV-2型间致病机理差异和开展型特异性流行病学调查奠定基础，同时填补尚未见可特异性性对DuCV-1和DuCV-2感染进行鉴别诊断的实时荧光定量引物组和探针组研究报道的空白。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量PCR检测的引物和探针，包括如下：
用于检测鸭圆环病毒1型：
上游引物DuCV-1-F：5’-GACTGGCTCACCAACTCGAAG-3’，
下游引物DuCV-1-R：5’-TTCCTGAACCTTCGAAGTAACGC-3’；
探针DuCV-1-probe：5’-AGGCTCTTCCTCCCAGCGACTCCTCAA -3’；
用于检测鸭圆环病毒2型：
上游引物DuCV-2-F：5’-CAGTTTGTKGCTAARACVTTG-3’，
下游引物DuCV-2-R：5’-AGTTTATTGGRAASGGGAGG-3’；
探针DuCV-2-probe：5’-TTTGATTTGTCCGCCTTAT-3’；
其中，探针DuCV-1-probe的5’-端标记荧光报告基团Cy5，3’-端标记荧光淬灭基团BHQ2；探针DuCV-2-probe的5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记MGB；K＝G/T，R＝A/G，V＝A/C/G，S＝C/G。
利用所述引物和探针进行鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量PCR检测时，以待检样品的核酸DNA为模板，用优化后的双重TaqMan 实时荧光定量PCR反应体系以及双重TaqMan实时荧光定量PCR反应条件进行实时荧光定量PCR反应，实时荧光定量PCR反应结束后，分析试验结果，特异性的对鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2进行检测；
其中，优化后的双重TaqMan实时荧光定量PCR反应体系为：
优化后的双重TaqMan实时荧光定量PCR反应条件为：95℃600s预变性； 95℃10s、56℃30s，共45个循环。
实时荧光定量PCR反应结束后，分析试验结果，当Cy5通道出现阳性扩增信号，结果判定为鸭圆环病毒基因1型(DuCV-1)阳性；当FAM通道出现阳性扩增信号，结果判定为鸭圆环病毒基因2型(DuCV-2)阳性；当Cy5通道和 FAM通道均出现阳性扩增信号，结果判定为鸭圆环病毒基因1型(DuCV-1)和鸭圆环病毒基因2型(DuCV-2)混合感染；当Cy5通道和FAM通道均无阳性扩增信号，结果判定为鸭圆环病毒阴性。
本发明还提供所述的引物和探针在制备用于鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2 型检测试剂盒中的应用。
本发明还提供一种鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量 PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物和探针。
本发明提供鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量PCR检测的引物、探针以及试剂盒，具有以下优点和效果：
1.同时检测、检测快速、高效：利用所述引物和探针能够建立同时对鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型进行检测的方法，能简化操作程序、节约成本，同时，该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。
2.定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，根据检测待检样品中的Ct 值，直接对两种鸭圆环病毒基因型(DuCV-1和DuCV-2)感染给出判定，并可对其感染程度进行准确定量。
3.灵敏度高：最低可检测57.8拷贝/μL(DuCV-1)和39.5拷贝/μL(DuCV-2)。
4.特异性强：和鸭中的常见传染病[如鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒 (MDPV)、鸭腺病毒A型(DAdV-A)、鸭瘟病毒(DEV)、鸭大肠杆菌(E.coli)、鸭疫里氏杆菌(R.A.)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)]均均无反应信号，仅对鸭圆环病毒及其特异的基因型(DuCV-1和DuCV-2)感染检测出现荧光信号。
5.重复性好：建立的实时荧光定量PCR检测方法进行DuCV-1和DuCV-2 检测的组内变异系数均小于2.0％，组间变异系数均小于2.50％。
附图说明
图1是实时荧光定量PCR检测鸭圆环病毒1型扩增曲线；1：DuCV-1扩增曲线；2阴性对照。
图2是实时荧光定量PCR检测鸭圆环病毒2型扩增曲线；1：DuCV-2扩增曲线；2阴性对照。
图3是实时荧光定量PCR检测鸭圆环病毒1型标准曲线。
图4是实时荧光定量PCR检测鸭圆环病毒2型标准曲线。
图5是实时荧光定量PCR检测鸭圆环病毒1型敏感性试验的结果图；1：模板浓度为5.78×104拷贝/μL的扩增曲线；2：模板浓度为5.78×103拷贝/μL的扩增曲线；3：模板浓度为5.78×102拷贝/μL的扩增曲线；4：模板浓度为5.78×101拷贝/μL的扩增曲线；5：模板浓度为5.78×100拷贝/μL的扩增曲线。
图6是实时荧光定量PCR检测鸭圆环病毒2型敏感性试验的结果图。1：模板浓度为3.95×105拷贝/μL的扩增曲线；2：模板浓度为3.95×104拷贝/μL的扩增曲线；3：模板浓度为3.95×103拷贝/μL的扩增曲线；4：模板浓度为3.95×102拷贝/μL的扩增曲线；5：模板浓度为3.95×101拷贝/μL的扩增曲线；6：模板浓度为3.95×100拷贝/μL的扩增曲线.
图7是双重实时荧光定量PCR检测DuCV-1特异性试验；1：DuCV-1； Controls：DuCV-2、GPV、MDPV、DAdV-A、DAdV-3、DEV、E.coli、R.A.和 P.M.对照样品。
图8是双重实时荧光定量PCR检测DuCV-2特异性试验；1：DuCV-2； Controls：DuCV-1、GPV、MDPV、DAdV-A、DAdV-3、DEV、E.coli、R.A.和 P.M.对照样品。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
实施例1
1.相关试验病原
1.1试验用毒株
鸭圆环病毒基因1型(DuCV-1，JX209株)和鸭圆环病毒基因2型(DuCV-2， FJ1815株)由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离、鉴定和保存。
1.2试验对照毒株和菌株
鸭群中常见核酸类型为DNA的病原，如鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鸭腺病毒A型(DAdV-A)、鸭瘟病毒(DEV)、鸭大肠杆菌(E.coli)、鸭疫里氏杆菌(R.A.)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。
2.TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的引物设计
2.1引物和探针的设计
根据鸭圆环病毒基因1型(DuCV-1)核苷酸序列分析比对结果，利用引物设计软件PrimerExpress设计特异性的引物和探针。
上游引物DuCV-1-F：5’-GACTGGCTCACCAACTCGAAG-3’
下游引物DuCV-1-R：5’-TTCCTGAACCTTCGAAGTAACGC-3’
探针DuCV-1-probe：5’-AGGCTCTTCCTCCCAGCGACTCCTCAA -3’；
探针DuCV-1-probe的5’-端标记荧光报告基团Cy5，3’-端标记荧光淬灭基团BHQ2。
根据鸭圆环病毒基因2型(DuCV-2)核苷酸序列分析比对结果，设计特异性的引物和探针。
上游引物DuCV-2-F：5’-CAGTTTGTKGCTAARACVTTG-3’
下游引物DuCV-2-R：5’-AGTTTATTGGRAASGGGAGG-3’
探针DuCV-2-probe：5’-TTTGATTTGTCCGCCTTAT-3’
探针DuCV-2-probe的5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记MGB。
上述引物和探针均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
3.阳性标准品的构建
3.1 DuCV-1阳性标准品的构建
利用Oligo 7引物设计软件设计引物，上游引物DuCV-F1：5＇-TCATGTTBTAGAGTTTTGCACG-3＇和下游引物DuCV-R1：5＇- AGATWACATAAGTCGTRGGGAA-3＇，预期扩增片段大小为344bp。上述引物均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
用商品化病毒核酸提取试剂盒提取鸭圆环病毒基因1型(DuCV-1，JX209株) 核酸DNA，使用PCR扩增试剂(2×PCR Master试剂)推荐的100μL体系进行扩增，其中2×PCRMaster Mix反应液50μL、上/下游引物(DuCV-F1/DuCV-R1) (引物浓度为20μmol·L-1)各1μL、提取的(JX209株)核酸DNA模板2μL，补充灭菌去离子水至终反应体系100μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为94℃预变性5min后进入循环，94℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环结束后，72℃终延伸10min。
PCR反应结束后，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养 14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物 (DuCV-F1/DuCV-R1)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。经Blast分析后，符合实验预期的阳性重组质粒作为本研究的标准品(P-DuCV-1)。利用分光光度计测定其浓度后，计算相应的拷贝数为5.78×109拷贝/μL。经线性化酶切后，进行连续 10倍倍比稀释，将获得的浓度分别为5.78×108拷贝/μL至5.78×100拷贝/μL，均冻存于-20℃备用。
3.2 DuCV-2阳性标准品的构建
利用Oligo 7引物设计软件设计引物，上游引物DuCV-F2：5＇-TTACTCGGGAAATGACGTAGT-3＇和下游引物DuCV-R2：5＇- AGAAAACCAGATAATGCGACC-3＇，预期扩增片段大小为612bp。上述引物均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成
用商品化病毒核酸提取试剂盒提取鸭圆环病毒基因2型(DuCV-2，FJ1815 株)核酸DNA，使用PCR扩增试剂(2×PCR Master试剂)推荐的100μL体系进行扩增，其中2×PCRMaster Mix反应液50μL、上/下游引物(DuCV-F2/ DuCV-R2)(引物浓度为20μmol·L-1)各1μL、提取的DuCV-2(FJ1815)核酸DNA 模板2μL，补充灭菌去离子水至终反应体系100μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为94℃预变性5min后进入循环，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸 50s，35个循环结束后，72℃终延伸10min。
PCR反应结束后，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养 14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物 (DuCV-F2/DuCV-R2)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。经Blast分析后，符合实验预期的阳性重组质粒作为本研究的标准品(P-DuCV-2)。利用分光光度计测定其浓度后，计算相应的拷贝数为3.95×109拷贝/μL。经线性化酶切后，进行连续 10倍倍比稀释，将获得的浓度分别为3.95×107拷贝/μL至3.95×100拷贝/μL，均冻存于-20℃备用。
4.TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测DuCV-1方法的建立
4.1 TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测DuCV-1反应条件优化
按照Probe qPCR Mix试剂盒说明书配制20μL的实时荧光定量PCR反应体系，筛选出的最佳反应体系为：Probe qPCR Mix(2×)混合液10μL、上/下游引物(DuCV-1-F和DuCV-1-R)(10μmol/L)各0.4μL、探针(DuCV-1-probe)(10 μmol/L)0.8μL、DNA模板1μL、水(Nuclease-free Water)补足至20μL。优化后的最佳反应条件为：95℃600s预变性；95℃10s、60℃30s，共45个循环(扩增曲线见图1)。
分别以标准品(P-DuCV-1)含量为5.78×107拷贝/μL-5.78×103拷贝/μL的标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，Ct值)为纵坐标，推导出标准线性回归方程(标准曲线，见图3)，获得实时荧光定量PCR 标准曲线的线性方程的斜率为-3.383，Y轴截距为41.04，相关系数为1.000，扩增效率为98％，表明建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系。
分别以标准品(P-DuCV-1)含量为5.78×104拷贝/μL至5.78×100拷贝/μL的标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得本发明的最低检测限为 57.8拷贝/μL(图5)。
4.2 TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测DuCV-1重复性试验
用建立的实时荧光定量PCR方法分别对质粒含量为5.78×106、5.78×104、 5.78×102的标准品进行检测，每种质粒含量重复3次，计算组内(intra-group) 变异系数。分别将上述不同质粒含量的标准品分装后置于-20℃保存，每隔7d 取出，用建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，共检测3次，计算组间(inter-group)变异系数。建立的实时荧光定量PCR检测方法进行的组内变异系数为0.34％-1.55％，组间变异系数0.59％-2.23％，表明建立的实时荧光定量PCR 检测方法重复性好。
5.TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测DuCV-2方法的建立
5.1 TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测DuCV-2反应条件优化
按照Probe qPCR Mix试剂盒说明书配制20μL的实时荧光定量PCR反应体系，筛选出的最佳反应体系为：Probe qPCR Mix(2×)混合液10μL、上/下游引物(DuCV-2-F和DuCV-2-R)(10μmol/L)各0.4μL、探针(DuCV-2-probe)(10 μmol/L)0.8μL、DNA模板1μL、水(Nuclease-free Water)补足至20μL。优化后的最佳反应条件为：95℃600s预变性；95℃10s、56℃30s，共45个循环(扩增曲线见图2)。
分别以标准品(P-DuCV-2)含量为3.95×108拷贝/μL至3.95×103拷贝/μL的标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，Ct值)为纵坐标，推导出标准线性回归方程(标准曲线，见图4)，获得实时荧光定量PCR 标准曲线的线性方程的斜率为-3.363，Y轴截距为43.56，相关系数为1.000，扩增效率为98％，表明建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系。
分别以标准品(P-DuCV-2)含量为3.95×105拷贝/μL至3.95×100拷贝/μL的标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得本发明的最低检测限为 39.5拷贝/μL(图6)。
5.2 TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测DuCV-2重复性试验
用建立的实时荧光定量PCR方法分别对质粒含量为3.95×106、3.95×104、 3.95×102的标准品进行检测，每种质粒含量重复3次，计算组内(intra-group) 变异系数。分别将上述不同质粒含量的标准品分装后置于-20℃保存，每隔7d 取出，用建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，共检测3次，计算组间 (inter-group)变异系数。建立的实时荧光定量PCR检测方法进行的组内变异系数为0.48％-1.63％，组间变异系数0.61％-2.34％，表明建立的实时荧光定量PCR 检测方法重复性好。
6.双重TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测DuCV-1和DuCV-2方法的建立
6.1反应条件的优化及标准曲线的建立
按照Probe qPCR Mix试剂盒说明书配制20μL的实时荧光定量PCR反应体系，在不同退火和延伸温度(52℃、54℃、56℃、58℃、60℃以及62℃)、引物浓度(2.5-20μmol/L)及探针浓度(2.5-20μmol/L)下进行实时荧光定量PCR 反应，对反应条件进行优化。以鸭圆环病毒基因1型阳性标准品(P-DuCV-1)和鸭圆环病毒基因2型阳性标准品(P-DuCV-2)为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数(lgC)为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，Ct值)为纵坐标，推导出标准线性回归方程(标准曲线)。
结果：优化出的双重实时荧光定量PCR方法最佳反应体系为：Probe qPCR Mix(2×)混合液10μL、上/下游引物(DuCV-1-F、DuCV-1-R、DuCV-2-F、 DuCV-2-R)(10μmol/L)各0.2μL、探针(DuCV-1-probe和DuCV-2-probe)(10 μmol/L)各0.4μL、DNA模板1μL、水(Nuclease-free Water)补足至20μL。优化出的双重实时荧光定量PCR方法最佳反应条件为：95℃600s预变性；95℃10 s、56℃退火和延伸共30s，共45个循环。
结果判定：
实时荧光定量PCR反应结束后，分析试验结果。当Cy5通道出现阳性扩增信号，结果判定为鸭圆环病毒基因1型(DuCV-1)阳性；当FAM通道出现阳性扩增信号，结果判定为鸭圆环病毒基因2型(DuCV-2)阳性；当Cy5通道和 FAM通道均出现阳性扩增信号，结果判定为鸭圆环病毒基因1型(DuCV-1)和鸭圆环病毒基因2型(DuCV-2)混合感染；当Cy5通道和FAM通道均无阳性扩增信号，结果判定为鸭圆环病毒阴性。
6.2特异性检测
用优化后的双重实时荧光定量PCR条件，分别对DuCV-1、DuCV-2、GPV、 MDPV、DAdV-A、DAdV-3、DEV、E.coli、R.A.和P.M.进行检测。提取相应病毒或菌株的核酸DNA，按照ProbeqPCR Mix试剂盒说明书用优化后的反应条件进行检测，评价建立的双重实时荧光定量PCR方法的特异性(见图7、图8)。
从图7可知：用优化后的双重实时荧光定量PCR条件分别对DuCV-1、 DuCV-2、GPV、MDPV、DAdV-A、DAdV-3、DEV、E.coli、R.A.和P.M.进行实时荧光定量PCR检测，从Cy5通道，仅对DuCV-1出现阳性扩增，对DuCV-2、GPV、 MDPV、DAdV-A、DEV、E.coli、R.A.和P.M.(图中的Controls)均未见阳性扩增信号。
从图8可知：用优化后的双重实时荧光定量PCR条件分别对DuCV-1、 DuCV-2、GPV、MDPV、DAdV-A、DAdV-3、DEV、E.coli、R.A.和P.M.进行实时荧光定量PCR检测，从FAM通道，仅对DuCV-2出现阳性扩增，对DuCV-1、 GPV、MDPV、DAdV-A、DEV、E.coli、R.A.和P.M.(图中的Controls)均未见阳性扩增信号。
上述结果表明，建立的双重TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测DuCV-1和 DuCV-2的方法特异性强，对鸭中的常见传染病，如鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鸭腺病毒A型(DAdV-A)、鸭瘟病毒(DEV)、鸭大肠杆菌(E. coli)、鸭疫里氏杆菌(R.A.)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)均无反应信号，仅对鸭圆环病毒基因1型和鸭圆环病毒基因2型感染检测出现荧光信号。
7.临床应用
使用建立的鸭圆环病毒DuCV-1和DuCV-2双重实时荧光定量PCR鉴别诊断方法，对临床收集的86份生长不良鸭泄殖腔棉拭子进行鸭圆环病毒分型检测。结果显示：13份样品Cy5通道出现阳性扩增信号，为DuCV-1阳性，阳性率为 15.12％；29份样品FAM通道出现阳性扩增信号，为DuCV-2阳性，阳性率为 33.72％；Cy5通道和FAM通道均出现阳性荧光信号样品8份，为DuCV-1和 DuCV-2混合感染，阳性率为9.30％。对86份样品利用文献(Li Z,et al.,Evidence of Possible Vertical Transmission of Duck Circovirus.VetMicrobiol.2014Nov 7；174(1-2):229-32.doi:10.1016/j.vetmic.2014.09.001.)介绍的PCR方法进行鸭圆环病毒分型检测，其中DuCV-1阳性11份(且该11份样品经本发明的方法检测均为阳性，在Cy5通道均出现阳性扩增信号)，阳性率为12.79％；DuCV-2阳性 23份(且该23份样品经本发明的方法检测均为阳性，在FAM通道均出现阳性扩增信号)，阳性率为26.74％；DuCV-1和DuCV-2双阳性5份(且该5份样品经本发明的方法检测均为阳性，在Cy5通道和FAM通道均出现阳性扩增信号)，阳性率为5.81％。需要说明的是，利用文献检测为阳性的样品，经本发明建立的方法均符合特异的型，符合率为100％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量PCR检测的引物和探针
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gactggctca ccaactcgaa g 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ttcctgaacc ttcgaagtaa cgc 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
cagtttgtkg ctaaracvtt g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
agtttattgg raasgggagg 20
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
aggctcttcc tcccagcgac tcctcaa 27
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
tttgatttgt ccgccttat 19
Claims (3)
1.鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于：所述引物和探针包括如下：
用于检测鸭圆环病毒1型：
上游引物DuCV-1-F：5’-GACTGGCTCACCAACTCGAAG-3’
下游引物DuCV-1-R：5’-TTCCTGAACCTTCGAAGTAACGC-3’
探针DuCV-1-probe：5’-AGGCTCTTCCTCCCAGCGACTCCTCAA-3’
用于检测鸭圆环病毒2型：
上游引物DuCV-2-F：5’-CAGTTTGTKGCTAARACVTTG-3’
下游引物DuCV-2-R：5’-AGTTTATTGGRAASGGGAGG-3’
探针DuCV-2-probe：5’-TTTGATTTGTCCGCCTTAT-3’
其中，探针DuCV-1-probe的5’-端标记荧光报告基团Cy5，3’-端标记荧光淬灭基团BHQ2；探针DuCV-2-probe的5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记MGB。
2.如权利要求1所述的引物和探针在制备用于鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型检测试剂盒中的应用。
3.一种鸭圆环病毒1型和鸭圆环病毒2型双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针。
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