CN108060270A - 一种伪狂犬病毒pcr-lfd检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测猪伪狂犬病毒的PCR‑LFD检测试剂盒及其应用。该试剂盒中包含了两条伪狂犬病毒特异性引物和一条探针，分别标记生物素（Biotin）和异硫氰酸荧光素（FITC），能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到猪伪狂犬病毒，并可区分猪伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗株和野毒株；结果读取采用了横向流动试纸条技术（Lateral flow dipstick,LFD）替代琼脂糖凝胶电泳，简便快速，能够肉眼直观的判定检测结果，且避免了溴化乙锭（EB）等化学试剂对环境的污染。该试剂盒能较好满足目前对猪伪狂犬病毒现场检测的迫切需要，可用于进出口检疫、基层兽医实验室、畜牧饲养场等的临场检测，易于大范围推广应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和免疫学技术领域，涉及一种猪伪狂犬病毒野毒株PCR与横向流动试纸条技术（Lateral flow dipstick,LFD）相结合的检测试剂盒及其应用方法。
背景技术
猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由疱疹病毒科，a-疱疹病毒亚科的伪狂犬病毒（Pseudorabies viurse，PRV）引起的多种动物的一种高度接触性传染病。猪是唯一的自然宿主。该病可导致怀孕母猪的流产、死胎、木乃伊胎和种猪不育等症状；哺乳仔猪常出现神经症状和死亡；成年猪一般呈亚临床或隐性感染，成为病毒的贮存宿主，长期排毒，但是自2011年后，我国多地区猪场中出现伪狂犬病毒变异毒株，造成免疫猪群大规模发病，保育猪和育肥猪群也出现典型神经症状和较高死亡率，给养猪业带来了巨大损失。因此，建立特异、敏感、快速且便于临床应用检测方法，对该病的防控至关重要。
伪狂犬病毒gE基因是其主要毒力决定因子，为病毒复制的非必需基因，也是世界动物卫生组织所规定基因缺失疫苗的缺失基因。以gE序列作为靶序列建立的诊断技术，能够区分基因缺失疫苗接种与野毒感染。王香玲等根据猪伪狂犬病毒g E基因序列保守区段，设计一对特异性引物，通过优化反应条件，建立了可区分猪伪狂犬病毒野毒株与基因缺失疫苗株的 PCR检测方法，该方法的敏感性为1.1pg，有较高的特异性。张志等建立了能够特异性检测 PRV 野毒株的套式 PCR 方法，该方法检测极限可达10个病毒拷贝/μL。发明专利“一种双巣式PCR检测伪狂犬病毒野毒株和基因缺失疫苗毒株的方法及其应用（公开号CN201710682619.9）”提供了一种伪狂犬病毒双巢氏PCR检测引物，以及采用该引物的双巣式PCR检测伪狂犬病毒野毒株和基因缺失疫苗毒株方法。上述方法为常规PCR方法，需要对产物凝胶电泳后进行图像采集和分析，耗时长，且由于反应体系中的干扰因素较多，有时会出现假阳性结果。田云等建立了检测伪狂犬病病毒野毒株的荧光定量PCR方法，该方法的灵敏度可达4拷贝。发明专利“猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒及引物和探针（公开号CN201610634845）”、发明专利“猪伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒（公开号CN201410217702）”分别描述了检测伪狂犬病毒野毒株的荧光定量PCR方法，但是荧光定量PCR虽然敏感性高于PCR，可实时观看检测结果，但是需要昂贵的设备和试剂成本，不适用于基层实验室和规模化猪场使用。此外，发明专利“检测伪狂犬病毒野毒株的交叉等温扩增引物组、试剂盒及应用（公开号CN201710066184）”提供了一种基于环介导等温扩增的伪狂犬病毒野毒株检测方法，但是该方法在操作中会形成大量气溶胶污染，很容易产生假阳性结果。
通过横向流动试纸条技术结合分子生物学检测方法对疾病进行检测已有报道。发明专利“单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用（公开号CN 102520172）”描述了一种分别用生物素和地高辛标记上下游引物的单增李斯特氏菌检测方法，但是除了目的扩增片段外，扩增过程中产生的非特异性扩增、引物二聚体也会带有生物素和地高辛两种标记，在使用横向流动试纸条检测时，会出现假阳性的结果。本研究建立了一种基于猪伪狂犬病毒gE基因的PCR-LFD检测方法，该方法是将PCR技术与LFD试纸相结合的一种可视化检测方法。为了增加扩增反应的特异性，本专利在引物设计时只将一条引物标记了异硫氰酸荧光素(FITC)或生物素（Biotin），PCR反应后，体系中再加入了一条标记生物素（Biotin）或异硫氰酸荧光素(FITC)的探针（探针和引物的标记物不相同），杂交过程中只有目的基因的PCR扩增产物才能与探针结合，杂交形成的复合体带有Biotin和FITC两种标记。将横向流检测试纸条插入检测缓冲液后，PCR扩增产物与样品结合垫中胶体金标记的抗异硫氰酸荧光素的抗体结合形成三元复合物，通过层析作用，结合到试纸条的生物素抗体标记的检测线上，呈现棕红色条带。阴性PCR产物、假阳性PCR和引物二聚体不具有双重标记，不能与样品结合垫中的胶体金标记的抗异硫氰酸荧光素抗体结合形成三元复合物，因此检测线不显色。该方法在PCR扩增后15min内即可目测判定结果，与传统凝胶电泳法相比更快速，且避免使用溴化乙锭（EB）等核酸染料造成的环境污染。
发明内容
本发明的一个目的是克服现有技术的缺点与不足，提供用于检测猪伪狂犬病毒野毒的PCR-LFD试纸条检测试剂盒，该试剂盒无需琼脂糖凝胶电泳，通过试纸条可直观判断检测结果。
本发明的另一个目的是提供一种快速检测猪伪狂犬病毒野毒的方法。
本发明的再一个目的是提供用于猪伪狂犬病毒PCR-LFD试纸条检测试剂盒的使用方法。
为实现上述目的本发明提供如下的技术方案：
一种用于检测猪伪狂犬病毒的LAMP试剂盒，其特征包含如下组分：
（1）基因扩增试剂：含有2 X GC bufferI 10μL；dNTPs 2μL；PRV-F 1μL，PRV-R 1μL
其中的引物指的是：
PRV-F CCGGCCCATCTGGTGAACGT SEQ ID NO：1
PRV-R CCCACCGCCACAAAGAACACG SEQ ID NO：2
所述引物PRV-F和PRV-R中的一条引物标记了异硫氰酸荧光素（FITC）或生物素（Biotin）。
（2）用于检测伪狂犬病毒的特异性探针，其特征在于；
Prv-T GACCTGGTGCTGGGCCGCGCCT SEQ ID NO：3
所述探针标记了与引物不同的另一种标记，异硫氰酸荧光素（FITC）或生物素（Biotin）。
（3）RNase-free 水
（4）rTaq DNA聚合酶(8 U/μL)
（5）LFD试纸条及其样品稀释液
本发明进一步公开了用于检测猪伪狂犬病毒野毒的PCR-LFD试纸条检测试剂盒的制备方法，其特征是包括下述步骤：
（1）基因扩增反应体系为：基因扩增试剂14μL；rTaqDNA聚合酶0.5μL；加入样品DNA模板1至5μL；用RNase-free水补充至终体积20μL。
（2） 扩增反应过程：95℃预变性 5min，进入循环；94℃ 30s，56℃30s，72℃30s，进行30个循环；72℃延伸 5min，4℃ 5min。
（3）扩增反应结束，打开PCR管盖子，加入1μL探针Prv-T。
（4）探针杂交反应过程：94℃ 30s，57℃30s，4℃5min。
（5）取扩增产物10μL加入到100μL缓冲液中，混合均匀，将LFD试纸条插入混匀后的液体中3min。取出后在5至7min内读取检测结果。
（4）结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现棕红色带，检测结果为阳性，则说明样品中含有伪狂犬病毒野毒；试纸条只有质控线出现条带，检测结果为阴性；如只有检测线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。
本发明更进一步公开了检测猪伪狂犬病毒野毒的PCR-LFD检测试剂盒用于鉴别伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗毒株和伪狂犬病毒野毒中的应用。主要是采用试剂盒检测样品中是否含有伪狂犬病毒野毒DNA。试验结果表明：本发明的试剂盒具有很好的特异性，只能检测伪狂犬病毒野毒株，不能检测到伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗株和猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型等其它9种猪病病原，因此，可以专属用于猪伪狂犬病毒野毒株的检测。
本发明公开的伪狂犬病毒PCR-LFD检测试剂盒与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）由于猪伪狂犬病毒弱毒疫苗为gE基因缺失疫苗株，而临床感染毒株为完整病毒，含有gE基因，因此，本发明公开的伪狂犬病毒PCR-LFD检测试剂盒可用于区分猪伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗株和含gE基因的野外强毒株，适用于临床病例、病料、细胞培养物和DNA样品的检测。
（2）本发明将PCR技术与横向流动试纸条技术相结合，应用试纸条检测PCR扩增产物，可在15分钟内眼观判定结果，用时更短，且无须任何设备，使检测更为便捷。同时，试验结果表明，横向流动试纸条可通过免疫学反应放大检测信号，使灵敏度比琼脂糖凝胶电泳方法提高10倍。该方法既可用于专业实验室和出入境检验检疫，又可用于设施设备条件较差的养殖场、基层兽医防疫和动物卫生监督部门在现场实时快速检测，对于及时监控猪伪狂犬病的发生发展、制定行之有效的防制措施，弥补我国基层检验检疫机的猪伪狂犬病的快速检测缺乏的现状具有重要意义。
（3）该方法不需要进行琼脂糖凝胶电泳，避免了EB或荧光染料染色等有毒试剂对环境的污染。
（4）本发明在PCR扩增反应之后，增加了核酸探针杂交反应步骤，减少和降低了非特异性扩增条带对结果判定的干扰，进一步提高了反应的特异性。
附图说明
图1 为试剂盒特异性试验结果图；自左向右依次为1，伪狂犬病毒SC株；2、伪狂犬病毒R13028株；3、伪狂犬病毒R13139株；4、伪狂犬病毒Bartha-K61 株（gE-）；5、猪圆环病毒2型；6、猪瘟病毒；7、日本乙型脑炎病毒；8、细小病毒；9、猪繁殖与呼吸综合征病毒；10、猪流感病毒；11、猪肺炎支原体；12、副猪嗜血杆菌；13、猪链球菌2型；14、空白对照；M、DL2000DNA Marker；
图2 为试剂盒敏感性试验结果图；自左向右依次为1，阴性水对照；2、101 TCID50 ；3、102 TCID50 ；4、103 TCID50 ；5、104 TCID50 ；6、105 TCID50 ；M、 DL2000 DNA Marker。其中TCID50（Tissue culture infective dose），又称50%组织细胞感染量，即指能在半数细胞培养板孔或试管内病毒引起细胞病变(cytopathic effect, CPE)的病毒量，是一种计算病毒含量的单位；
图3为PCR琼脂糖凝胶电泳灵敏度试验结果图；从左至右依次为1、阴性对照；2、103倍稀释的PCR产物；3、102倍稀释的PCR产物；4、10倍稀释的PCR产物；5、原倍PCR产物；M、DL2000DNA Marker；
图4为PCR-LFD试剂盒灵敏度试验结果图；从左至右依次为1、阴性对照；2、103倍稀释的PCR产物；3、102倍稀释的PCR产物；4、10倍稀释的PCR产物；5、原倍PCR产物；M、DL2000 DNAMarker。
具体实施方式：
为了更充分地解释本发明的实施方法，提供了用于检测猪伪狂犬病毒野毒PCR-LFD试纸条检测试剂盒的实施实例。这些实施实例仅仅是解释，而不是限制本发明的范围。其中所用的原料均有市售。本发明所述的伪狂犬病毒野毒的PCR引物和探针序列见表1。
实施例1
表1
PRV-F CCGGCCCATCTGGTGAACGT SEQ ID NO：1
PRV-R CCCACCGCCACAAAGAACACG SEQ ID NO：2
所述引物PRV-F和PRV-R中的一条引物标记了异硫氰酸荧光素（FITC）或生物素（Biotin）。
（2）用于检测伪狂犬病毒的特异性探针，其特征在于；
Prv-T GACCTGGTGCTGGGCCGCGCCT SEQ ID NO：3
所述探针标记了与引物不同的另一种标记，异硫氰酸荧光素（FITC）或生物素（Biotin）。
实施例1
伪狂犬病毒PCR-LFD试纸条检测试剂盒特异性试验
1 材料与方法
1.1 供试病毒株和菌株
1.2 主要试剂
rTaq DNA聚合酶、dNTP、2XGCbuffer I、DL2000 DNA Marker均购自大连宝生物工程有限公司；核酸提取试剂盒购自金瑞鸿捷生物科技有限公司；横向流动试纸条购自杭州忧思达生物技术有限公司。
1.3 扩增反应体系：扩增反应的总体积为20μL，其各种成分及终浓度分别为： 10μL 2×GC buffer I、0.5μL rTaqDNA聚合酶(8 U/μL)、2μL dNTPs(2.5 mmol/L)、1μL PRV-F(10μmol/L)、1μL PRV-R(10μmol/L)、5.0μL模板DNA、0.5μL超纯水。
1.4 扩增反应过程：95℃预变性 5min，进入循环；94℃ 30s，56℃30s，72℃30s，进行30个循环；72℃延伸 5min，4℃ 5min。
1.5 打开PCR管盖子，加入1μL探针Prv-T。进行探针杂交反应，94℃ 30s，57℃30s，4℃5min。
1.6 取扩增产物10μL加入到100μL缓冲液中，混合均匀，将LFD试纸条插入混匀后的液体中3min。取出后在5至7min内读取检测结果。
1.7 结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现棕红色带，检测结果为阳性，则说明样品中含有伪狂犬病毒野毒；试纸条只有质控线出现条带，检测结果为阴性；如只有检测线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。结果见图1。
2 结果说明：
从图1可知，本专利的试剂盒具有很好的特异性，只能检测伪狂犬病毒野毒株，不能检测到伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗株和对照其他菌毒株株，可以用于猪伪狂犬病毒野毒株的检测。
实施例2
伪狂犬病毒PCR-LFD试纸条检测试剂盒敏感性试验
1 材料与方法
1.1 主要试剂
rTaq DNA聚合酶、dNTP、2XGCbuffer I、DL2000 DNA Marker均购自大连宝生物工程有限公司；核酸提取试剂盒购自金瑞鸿捷生物科技有限公司；横向流动试纸条购自杭州忧思达生物技术有限公司。
1.2 敏感性试验：将已知TCID50的伪狂犬病毒稀释为101-105个TCID50，按常规方法提取DNA，分别取5μL作为模板，其它反应条件不变进行PCR扩增。探针杂交后，用LFD试纸条分别检测扩增产物，确定所建立方法的敏感性。
1.3 扩增反应体系：扩增反应的总体积为20μL，其各种成分及终浓度分别为： 10μL 2×GC buffer I、0.5μL rTaqDNA聚合酶(8 U/μL)、2μL dNTPs(2.5 mmol/L)、1μL PRV-F(10μmol/L)、1μL PRV-R(10μmol/L)、5.0μL模板DNA、0.5μL超纯水。
1.4 扩增反应过程：95℃预变性 5min，进入循环；94℃ 30s，56℃30s，72℃30s，进行30个循环；72℃延伸 5min，4℃ 5min。
1.5 打开PCR管盖子，加入1μL探针Prv-T。进行探针杂交反应，94℃ 30s，57℃30s，4℃5min。
1.6 取扩增产物10μL加入到100μL缓冲液中，混合均匀，将核酸检测免疫胶体金试纸条插入混匀后的液体中3min。取出后在5至7min内读取检测结果。
1.7 结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现棕红色带，检测结果为阳性，则说明样品中含有伪狂犬病毒野毒；试纸条只有质控线出现条带，检测结果为阴性；如只有检测线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。结果见图2。
2 结果说明：
从图2可知，本专利的试剂盒的敏感性可达到102TCID50/100μL，具有较高的敏感性。
实施例3
琼脂糖凝胶电泳和PCR-LFD试纸条方法灵敏度比较
1 材料与方法
1.1 主要试剂
rTaq DNA聚合酶、dNTP、2XGCbuffer I、DL2000 DNA Marker均购自大连宝生物工程有限公司；核酸提取试剂盒购自金瑞鸿捷生物科技有限公司；横向流动试纸条购自杭州忧思达生物技术有限公司。
1.2琼脂糖凝胶电泳与PCR-LFD试纸条灵敏度比较
以伪狂犬病毒SC株DNA为模板按照优化后的PCR条件进行扩增，反应结束后，测定PCR扩增产物的核酸含量，并用水做10倍、100倍、1000倍稀释。分别取出20μL稀释产物，加入1μL核酸探针，探针杂交反应后，用琼脂糖凝胶电泳法和LFD试纸条分别检测扩增产物，比较两种方法的差异。
1.3 扩增反应体系：扩增反应的总体积为20μL，其各种成分及终浓度分别为： 10μL 2×GC buffer I、0.5μL rTaqDNA聚合酶(8 U/μL)、2μL dNTPs(2.5 mmol/L)、1μL PRV-F(10μmol/L)、1μL PRV-R(10μmol/L)、5.0μL模板DNA、0.5μL超纯水。
1.4 扩增反应过程：95℃预变性 5min，进入循环；94℃ 30s，56℃30s，72℃30s，进行30个循环；72℃延伸 5min，4℃ 5min。
1.5 打开PCR管盖子，加入1μL探针Prv-T。进行探针杂交反应，94℃ 30s，57℃30s，4℃5min。
1.6 取扩增产物10μL加入到100μL缓冲液中，混合均匀，将LFD试纸条插入混匀后的液体中3min。取出后在5至7min内读取检测结果。
1.7 结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现棕红色带，检测结果为阳性，则说明样品中含有伪狂犬病毒野毒；试纸条只有质控线出现条带，检测结果为阴性；如只有检测线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。结果见图3。
2 结果说明：
从图3、图4可知，当PCR产物稀释100倍后，已很难通过琼脂糖凝胶电泳观察到阳性结果，但是LFD试纸条仍可见较为清晰的红色检测线。说明PCR-LFD试纸条的灵敏度是琼脂糖凝胶电泳的10倍。
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津市畜牧兽医研究所
<120> 一种伪狂犬病毒PCR-LFD试纸条检测试剂盒及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccggcccatc tggtgaacgt 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccaccgcca caaagaacac g 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gacctggtgc tgggccgcgc ct 22
Claims (8)
1.一种用于检测伪狂犬病毒野毒株的特异性引物和特异性探针，其特征在于：
所述引物组包括：
PRV-F CCGGCCCATCTGGTGAACGT SEQ ID NO：1
PRV-R CCCACCGCCACAAAGAACACG SEQ ID NO：2
所述探针为：
Prv-T GACCTGGTGCTGGGCCGCGCCT SEQ ID NO：3。
2.权利要求1所述的检测伪狂犬病毒野毒株的特异性引物和特异性探针，其特征在于其两条引物中任选一条引物标记生物素分子（Biotin）或异硫氰酸荧光素（FITC），而探针可选择标记生物素分子（Biotin）或异硫氰酸荧光素（FITC）中的另一种标记。
3.一种用于检测伪狂犬病毒的检测试剂盒，其组成包括：
（1）基因扩增试剂：含有2 X GC bufferI 10μL；dNTPs 2μL；PRV-F 1μL，PRV-R 1μL
其中的引物指的是：
PRV-F CCGGCCCATCTGGTGAACGT SEQ ID NO：1
PRV-R CCCACCGCCACAAAGAACACG SEQ ID NO：2
所述引物PRV-F和PRV-R中的一条引物标记了异硫氰酸荧光素（FITC）或生物素（Biotin）；
（2）用于检测伪狂犬病毒的特异性探针，其特征在于；
Prv-T GACCTGGTGCTGGGCCGCGCCT SEQ ID NO：3
所述探针标记了与引物不同的另一种标记，异硫氰酸荧光素（FITC）或生物素（Biotin）；
（3）RNase-free 水
（4）rTaq DNA聚合酶(8 U/μL)
（5）LFD试纸条及其样品稀释液。
4.权利要求3所述的伪狂犬病毒检测试剂盒，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。
5.权利要求3所述的伪狂犬病毒检测试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含有猪伪狂犬病毒gE基因保守序列的质粒。
6.一种采用权利要求3所述试剂盒用于检测伪狂犬病毒的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）基因扩增反应体系为：基因扩增试剂14μL；rTaqDNA聚合酶0.5μL； 加入样品DNA模板1至5μL；用RNase-free水补充至终体积20μL；
（2）扩增反应过程：95℃预变性 5min，进入循环；94℃ 30s，56℃30s，72℃30s，进行30个循环；72℃延伸 5min，4℃ 5min；
（3）扩增反应结束，打开PCR管盖子，加入1μL探针；
（4）探针杂交反应过程：94℃ 30s，57℃30s，4℃5min；
（5）取扩增产物10μL加入到100μL缓冲液中，混合均匀，将LFD试纸条插入混匀后的液体中3min；
取出后在5至7min内读取检测结果；
（4）结果判定：试纸条的质控线和检测线均出现棕红色带，检测结果为阳性，则说明样品中含有伪狂犬病毒野毒；试纸条只有质控线出现条带，检测结果为阴性；如只有检测线出现条带或不出现任何条带，则检测结果为无效。
7.权利要求3所述试剂盒用于鉴别伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗毒株和伪狂犬病毒野毒中的应用。
8.权利要求3所述试剂盒用于检测样品中是否含有伪狂犬病毒野毒DNA的方法中的应用。
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| CN201810110357.3A Pending CN108060270A (zh) | 2018-02-05 | 2018-02-05 | 一种伪狂犬病毒pcr-lfd检测试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108060270A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108950085A (zh) * | 2018-08-27 | 2018-12-07 | 河南省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种用于检测猪圆环病毒3型和猪伪狂犬病毒野毒株的引物组和试剂盒 |
| CN114703177A (zh) * | 2022-03-29 | 2022-07-05 | 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室 | 一种基于rpa等温扩增和免疫层析技术的伪狂犬病毒检测组合物、方法及试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101775443A (zh) * | 2010-01-06 | 2010-07-14 | 天津市畜牧兽医研究所 | 用于检测猪伪狂犬病毒的lamp试剂盒及其制备方法 |
| CN106834549A (zh) * | 2017-04-02 | 2017-06-13 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 检测伪狂犬病病毒野毒株的交叉引物扩增‑免疫层析试纸联用法的引物和探针组以及试剂盒 |
| CN107488741A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-12-19 | 长江大学 | 一种双巣式pcr检测伪狂犬病毒野毒株和基因缺失疫苗毒株的方法及其应用 |
-
2018
- 2018-02-05 CN CN201810110357.3A patent/CN108060270A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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| Title |
|---|
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| CN114703177A (zh) * | 2022-03-29 | 2022-07-05 | 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室 | 一种基于rpa等温扩增和免疫层析技术的伪狂犬病毒检测组合物、方法及试剂盒 |
| CN114703177B (zh) * | 2022-03-29 | 2023-08-11 | 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室 | 一种基于rpa等温扩增和免疫层析技术的伪狂犬病毒检测组合物、方法及试剂盒 |
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