CN102181556A - 用于检测马梨形虫的试剂盒及制备与使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于鉴别诊断马属动物是否感染梨形虫病的检测试剂盒及其制备与使用方法。本发明的检测马梨形虫试剂盒内有检测马梨形虫的检测膜和梨形虫通用引物。本发明的试剂盒的使用方法是从待检马匹血液中提取DNA，再用梨形虫通用引物进行扩增，将扩增产物与检测膜结合，将PCR产物末端的生物素与链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase)作用后，能催化过氧化物酶的底物增强化学发光试剂(ECL-detection)发出荧光，使X感光胶片曝光；胶片经显影和定影处理后，与检测膜上探针与PCR产物发生特异性杂交的相对应的区域出现阴影，根据胶片上有无留下阴影来判断被检动物是否有患有梨形虫病。

Description

用于检测马梨形虫的试剂盒及制备与使用方法

技术领域

本发明涉及一种动物寄生虫的分子生物学鉴别检测技术，确切地讲本发明提供一种用于鉴别诊断马属动物是否感染梨形虫病的检测试剂盒及其制备与使用方法。

背景技术

马梨形虫病(equine piroplasmosis)是驽巴贝斯虫和马泰勒虫寄生于马属动物(马、驴、骡和斑马)的红细胞内所引起一种急性、亚急性或慢性的原虫性寄生虫病，其传播媒介是蜱，主要以引起动物发热(有时呈周期性)、贫血、黄疽、肝脾肿大为特点，病程后期动物常出现胆红素尿和血红蛋白尿等症状。驽巴贝斯虫(Babesia caballi Nutall etStrickland，1910)(旧名马焦虫，proplasma caballi)是原生生物界(Protista)的原生动物亚界(Protozoa)、顶复门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoea)、梨形虫亚纲(Piroplasmia)、梨形虫目(Piroplasmida)中的巴贝斯科(Babesiidae)巴贝斯属(Babesia)的一个成员。驽巴贝斯虫寄生于马属动物的红细胞内，所引起的疾病称为驽巴贝斯虫病。马泰勒虫(Theileria equi Mehlhorn，Schein 1998)(旧名纳氏焦虫)是梨形虫亚纲(Piroplasmia)、梨形虫目(Piroplasmida)中的泰勒科(Theileriidae)、泰勒虫属(Theileria)的一个新成员(旧名马巴贝斯虫(Babesia equi Laveran，1901)，原来属于巴贝斯科(Babesiidae)巴贝斯属(Babesia)的成员)，参见Mehlhorn，H.，Schein，E.，1998.Redescription of Babesia equi Laveran.1901as Theileria equi.Parasitol.Res.84，467-475.。马泰勒虫可寄生于马属动物(包括马、驴、骡和斑马)的巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内，所引起的寄生虫病称为马泰勒虫病。马梨形虫病在世界许多国家和地区流行，国际兽疫局(Office International Des Epizooties，OIE)将马梨形虫病列为B类疫病(OIE.Equine piroplasmosis.2008)，我国将其列为二类疫病。在我国，驽巴贝斯虫病主要流行于东北、内蒙古东部、青海及新疆等地，其主要的传播媒介是革蜱属的草原革蜱、森林革蜱、银盾革蜱、中华革蜱。马泰勒虫病主要流行于新疆、内蒙古西部及南方各省，其主要的传播媒介是革蜱属和扇头蜱属的蜱：包括草原革蜱、森林革蜱、银盾革蜱、镰形扇头蜱等。(汪明主编.兽医寄生虫学[M].北京：中国农业出版社，2008：366-369)。马梨形虫病的季节流行性很强，多呈急性经过，发病率和死亡率均很高，尤其对引进疫区的外来马属动物、纯种马以及杂交马的危害极大，是制约发展中国家马属动物养殖产业发展的主要疾病之一。目前，马梨形虫病的检测和诊断主要有下列几类手段：(1)血涂片染色显微镜检测、淋巴结穿刺试验、体外培养、临床诊断和动物接种试验等传统方法，此类方法检出率低，对检测人员的素质要求非常高。(2)血清学方法，如：补体结合试验(CFT)、间接荧光抗体试验(IFAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和竞争酶联免疫吸附试验(C-ELISA)等，参见Donnelly，J.，Phipps，L.P.，Watkins，K.L.，1982.Evidence of maternal antibodies to Babesia equi and B.caballi in foals of seropositive mares.Equine Vet.J.14，126-128.；Weiland，G.，Aicher，B.M.，Boch，J.，1984.Serodiagnosis and therapy control of equinepiroplasmosis by CFT and IFAT.Berl.Munch.Tierarztl.Wochenschr.97，34134-34139.；Knowles Jr.，D.P.，Perryman，L.E.，Goff，W.L.，Miller，C.D.，Harrington，R.D.，Gorham，J.R.，1991. A monoclonal antibody defines a geographically conserved surface proteinepitope of Babesia equi mero

发明内容

本发明提供一种用于检测马梨形虫的试剂盒及其制备与使用方法。

本发明的检测马梨形虫试剂盒内有检测马梨形虫的检测膜和梨形虫通用引物，其中：

检测马梨形虫的检测膜是在Biodyne C膜的不同区域分别固定有如下述的五种核苷酸序列的探针：

梨形虫通用探针(C-all)CTGTCAGAGGTGAAATTCT；

巴贝斯虫通用探针(B-all)CCTTRGTAATGGTTAATAGGAA；

驽巴贝斯虫特异探针(B-cab)AAACCCTCGCCAGAGTAACAATT；

泰勒虫通用探针(T-all)WVCCRRAGTAATGGTTAATAGG；

马勒虫特异探针(T-equi)TTTTAGGAGCCRGAGTAATGGTTA；

以上序列中的R、W或V是兼并碱基，其中：R＝A或G；W＝A或T；V＝A或C或G

梨形虫通用引物为：

上游引物RLB-F：(5’-gaggtagtgacaagaaataacaata-3’)；

下游引物RLB-R：(biotin-5’-tcttcgatcccctaactttc-3’)。

本发明的用于检测马梨形虫的试剂盒中的检测膜制备方法是：

1)首先人工合成如下五种核苷酸序列：

梨形虫通用探针(C-all)CTGTCAGAGGTGAAATTCT；

巴贝斯虫通用探针(B-all)CCTTRGTAATGGTTAATAGGAA；

驽巴贝斯虫特异探针(B-cab)AAACCCTCGCCAGAGTAACAATT；

泰勒虫通用探针(T-all)WVCCRRAGTAATGGTTAATAGG；

马勒虫特异探针(T-equi)TTTTAGGAGCCRGAGTAATGGTTA，

将上述各序列的5’端用氨基团进行修饰后待用，

2)将各核酸探针按下述用量稀释于150μL的pH 8.4的500mM NaHCO₃中待用：

梨形虫通用探针(C-all)5p～50p mol；巴贝斯虫通用探针(B-all)12p～100p mol；驽巴贝斯虫特异探针(B-cab)50p～100p mol；泰勒虫通用探针(T-all)50p～100p mol；马勒虫特异探针(T-equi)10p～100p mol；

3)将Biodyne C膜剪成预定的尺寸并标记顺序后用去离子水配制10mL新鲜的16％(w/v)的EDAC溶液，将前述Biodyne C膜放在盛有16％的EDAC溶液的容器内，在室温下不断地旋转容器，进行孵育、活化处理；将活化的Biodyne C膜用去离子水漂洗2后放入洁净的印迹仪内并除去印迹仪孔槽中残留的液体；

4)将150μL稀释好的各探针溶液分别加入印迹仪的目标孔槽中，其中第一个和最后一个孔不加探针，用2×SSPE将墨水稀释后加入第一个孔和最后一个孔，未加探针的多余孔槽用2×SSPE缓冲液填充，再在室温条件下孵育2分钟后除去各个孔槽内的液体，所用的2×SSPE缓冲液为pH7.4，用0.2M Na₂HPO₄，、3.0M NaCl和20mM EDTA配制而成；将经前处理的膜用新鲜配制250mL的100mM NaOH溶液孵育膜10分钟，使Biodyne C膜钝化后再用去离子水漂洗；

5)用250mL的2×SSPE/0.1％SDS缓冲液在60℃温度条件下漂洗经前处理的膜，再用100mL 20mM pH 8.0的EDTA溶液在室温条件下，漂洗膜，再将该Biodyne C膜在4℃条件下密封保存直至使用。

本发明的试剂盒的使用方法是从待检马属动物的血液中提取基因组DNA为模板，用梨形虫通用引物进行PCR扩增，将其扩增产物变性后与检测膜上的探针进行杂交，与探针发生特异性结合的PCR产物末端的生物素与链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶(streptavidin-peroxidase)作用后，能催化过氧化物酶的底物增强化学发光氨试剂(ECL-detection)发出荧光，使X感光胶片曝光；胶片经显影和定影处理后，与检测膜上探针与PCR产物发生特异性杂交的相对应的区域出现阴影，根据胶片上有无留下阴影来判断被检动物是否有患有梨形虫病。

为便于鉴别检测工作，本发明的试剂盒内最好还有如下内容：

a)标准马泰勒虫阳性的动物基因组DNA；

b)标准驽巴贝斯虫阳性的动物基因组DNA；

c)标准马梨形虫阴性的马基因组DNA；

d)标准马梨形虫阴性的驴基因组DNA；

e)灭菌超纯水；

本发明实际上是采用反向线性印迹微量检测技术(reverse line blottingmacroarrays)，是以多个梨形虫虫种18S rRNA基因序列(包括国内流行的驽巴贝斯虫株和马泰勒虫株)的V4高变区为目标设计的一种检测和鉴别马梨形虫的方法。采用本发明的方法鉴别诊断马梨形虫时有五大优点：

第一、在本发明的检测膜上不同区域内同时固定有驽巴贝斯虫特异性DNA探针和马泰勒虫特异性DNA探针，所以采用本发明的检测膜不但可以很方便地鉴别驽巴贝斯虫和马泰勒虫，还可以检测出二者混合感染情况(如图5所示)，这对于马属动物群发性梨形虫病的流行病调查有重要的意义。

第二、由于在本发明的检测膜上还固定有梨形虫通用DNA探针、巴贝斯虫通用DNA探针和泰勒虫通用DNA探针，所以本发明检测膜上的探针不但可以对多种梨形虫的进行检测和分类，扩大检测范围，还可以利用该方法发现感染马属动物的梨形虫新种(未知种或株)。

第三、利用本发明的检测膜检测的敏感性和特异性高于普通检测方法和常规PCR方法，有利于马梨形虫病的早期检测和低染虫率的梨形虫病例的检测，及时采取措施进行防控。

第四、在具体实施本发明时，以被检动物的血液基因组DNA为模板，只用一对梨形虫通用引物，经一次PCR扩增，如果PCR产物经电泳检测呈阳性就能确定被检动物感染了梨形虫病；PCR产物再经检测膜进一步检测后，还能确定所感染的梨形虫的具体种类、混合感染等情况，这为梨形虫病的快速检测、虫种鉴定和流行病学调查提供了重要的工具。

第五、采用本发明的检测膜时进行检测时，可对45个样品同时进行检测，而并不明显增加检测时所用的时间；而且检测膜上与探针杂交的PCR产物很容易洗脱除去，而探针仍然留在检测膜上，检测膜的检测特性不发生改变，所以检测膜可以反复用于检测；且检测膜密封后在4℃条件下能长期保存，检测方法相对简单，检测过程耗时较少，成本低廉。这在进行较大规模、长周期的马梨形虫病流行病学调查时有极大的优势，能节约时间，节省大量的人力物力。

附图说明

图1为本发明实施例的检测膜上固定的五种探针的位置和分布模式示意图，其中竖排如图所示的长条形区域从左边起第一排和最后一排用墨水作标记，第2～6排的相应区域分别固定五种DNA探针，其中竖排标记的Ca对应于梨形虫通用DNA探针C-all，Ba对应于巴贝斯虫通用DNA探针B-all，Bc对应于驽巴贝斯虫特异性DNA探针B-cab，Ta对应于泰勒虫通用DNA探针T-all，Te对应于马泰勒虫特异性DNA探针T-equi。

图2为PCR产物与检测膜上的探针杂交模式图。其中：检测膜上竖排标注的探针名称与图1中一致。利用印迹仪在检测膜上从上到下的每一个横排的长条形区域内，添加一个来源于被检动物基因组DNA为模板进行PCR扩增后经稀释和变性处理过的PCR产物样品，即可与检测膜上的五种探针同时进行杂交，一张14cm×14cm正方形大小的检测膜能同时检测45个样品。

图3为用于检测马梨形虫的试剂盒内的检测膜对14种梨形虫的标准样品检测模拟图。检测膜上竖排固定的探针标注名称与图1中一致，其中竖排标记的Ca对应于梨形虫通用DNA探针C-all，Ba对应于巴贝斯虫通用DNA探针B-all，Bc对应于驽巴贝斯虫特异性DNA探针B-cab，Ta对应于泰勒虫通用DNA探针T-all，Te对应于马泰勒虫特异性DNA探针T-equi。横排标注的是PCR产物加样顺序及其模板来源，14种梨形虫的标准样品、一份混合感染样品、两份阴性对照和一份空白对照分别对应位置是：1、大巴贝斯虫，2、牛巴贝斯虫，3、牛巴贝斯虫未定种，4、卵形大巴贝斯虫，5、双芽大巴贝斯虫，6、莫氏巴贝斯虫，7、驽巴贝斯虫，8、马泰勒虫，9、环形泰勒虫，10、瑟氏泰勒虫，11、中华泰勒虫，12、羊泰勒虫，13、尤氏泰勒虫，14、吕氏泰勒虫，15、驽巴贝斯虫/马泰勒虫混合感染样品，16、阴性对照(马基因组DNA)，17、阴性对照(驴基因组DNA)，18、空白对照(水)。经序列分析预期检测为阳性在图中用黑色小方块标出，杂交过的检测膜与链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase)作用后，黑色小方块区域内结合的过氧化物酶能催化底物——增强化学发光试剂(ECL-detection)发生化学反应，同时发出的荧光能使X感光胶片对应区域曝光。

图4为用梨形虫通用引物对14个梨形虫虫种基因组DNA标准样品进行PCR扩增后的电泳检测的结果。图中M是DNA分子标准DL5000DNA Marker，1～18道PCR产物对就应的模板分别为：1、大巴贝斯虫，2、牛巴贝斯虫，3、牛巴贝斯虫未定种，4、卵形大巴贝斯虫，5、双芽大巴贝斯虫，6、莫氏巴贝斯虫，7、驽巴贝斯虫，8、马泰勒虫，9、环形泰勒虫，10、瑟氏泰勒虫，11、中华泰勒虫，12、羊泰勒虫，13、尤氏泰勒虫，14、吕氏泰勒虫，15、驽巴贝斯虫/马泰勒虫混合感染样品，16、阴性对照(马基因组DNA)，17、阴性对照(驴基因组DNA)，18空白对照(水)

图5为用检测膜对驽巴贝斯虫、马泰勒虫等14种梨形虫基因组DNA标准样品进行检测后X感光胶片显影的结果扫描截图。图5与图3的左上角PCR与探针杂交的区域相对应，也就是说与预期结果一致。图5中竖排标注的是与检测膜上对应的核酸探针名称与图1中一致；横排所标出的是与检测膜上探针杂交的PCR产物的模板来源，左侧标出的是中文名称，右侧标出的是对应的英文名称，左右对应一致。胶片上出现的小的类正方形的黑色区域表示检测结果呈阳性，其对应的检测膜上的探针和相应的PCR产物发生了特异性杂交。没有出现阴影的区域表示检测结果呈阴性，即表示PCR产物没有与探针发生特异性结合。阴性对照和空白对照均没有出现阴影，且14种梨形虫的检测结果都与预期结果一致，说明检测系统正常。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例。

一、用于检测马梨形虫的检测膜的制备过程：

基于梨形虫通用引物(RLB-F/RLB-R)扩增的目的基因——梨形虫18S rRNA基因V₄高变区序列，利用专业软件分别设计了梨形虫的通用DNA探针、属特异性DNA探针(2种)、种特异性DNA探针(2种)。探针经人工合成后并用氨基团修饰的核酸探针能够共价结合到带负电荷的尼龙膜(

0.45μm)膜上。

具体操作程序如下：

1、用于检测马梨形虫的特异性DNA探针的合成与修饰

按表1中所述分别合成梨形虫的通用DNA探针C-all、巴贝斯虫通用DNA探针B-all、泰勒虫通用DNA探针T-all、驽巴贝斯虫特异性DNA探针B-cab和马泰勒虫特异性DNA探针T-equi，并将这五种DNA核酸探针5’端碱基上C6位置分别用氨基团N-(trifluoroacetamidohexyl-cyanoethyl，N，N-diisopropyl phosphoramidite[TFA])进行修饰。

表1检测马梨形虫的检测膜上固定的探针名称、碱基序列和修饰方式及其用量

备注：*表1中探针序列中的R、W或V是兼并碱基，其中：R＝A或G；W＝A或T；V＝A、C或G。

2、用于检测马梨形虫的检测膜的制备过程

氨基团修饰的DNA核酸探针(带正电)能够通过化学反应共价结合在带负电的尼龙膜(0.45μm)膜上，五种探针同时固定在同一张检测膜上能同时对PCR产物进行检测。

具体操作如下：

1)将表1中所述合成并修饰的五种核酸DNA探针分别以其最佳用量稀释于150μL的500mM NaHCO₃(pH 8.4)缓冲液中待用。

2)将孔径为0.45μm规格的尼龙膜(

美国Pall公司生产)裁剪成14cm×14cm正方形大小，记号笔标记膜的一角，以便在以后的操作中辨别膜的正反面和探针的固定顺序。

3)用去离子水新鲜配制10mL 16％(w/v)的EDAC(即1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)溶液，将尼龙膜放在盛有16％的EDAC溶液的杂交瓶内，在室温下不断地旋转杂交瓶，孵育10分钟使尼龙膜活化。

4)将活化的尼龙膜从杂交瓶中取出后放在塑料容器中用去离子水漂洗2分钟，然后将其放入洁净的印迹仪内，固定好位置，加上支持气垫后旋紧手柄，通过抽吸装置除去印迹仪孔槽中残留的液体。

5)将150μL稀释好的各探针溶液按图1中所示方式分别加入印迹仪相应位置的目标孔槽中(作好记录)，其中第一个和最后一个孔槽不加探针，而用2×SSPE缓冲液(0.2M Na₂HPO₄，3.0M NaCl，20mM EDTA，pH7.4)将墨水稀释后加入第一个孔和最后一个孔，未加探针的多余孔槽用2×SSPE填充。所有的样品加入以后，在室温条件下孵育2分钟后，通过抽吸装置除去印迹仪各个孔槽内的液体。

6)用镊子从印迹仪中取出尼龙膜，用新鲜配制250mL的100mM NaOH溶液在塑料容器中孵育膜10分钟，期间不断摇动使尼龙膜钝化。

7)用去离子水漂洗尼龙膜1次。

8)用250mL的2×SSPE/0.1％SDS缓冲液(20mM Na₂HPO₄，0.3M NaCl，2mM EDTA，pH7.4，0.1％SDS)在60℃温度条件下轻微摇动漂洗尼龙膜5分钟。

9)在塑料容器中用100mL的20mM(pH 8.0)EDTA溶液在室温条件下，轻轻摇动漂洗膜15分钟。到此时在该尼龙膜上已固定了探针，即得到本发明试剂盒内的用于检测马梨形虫的检测膜，各探针在检测膜上位置关系模式如图1所示。将该检测膜在4℃条件下密封保存直至用于PCR产物的检测(用塑料制品密封避免膜脱水)。

二、被检动物血液基因组DNA的提取方法和梨形虫基因组DNA标准样品的制备

1、从待检动物血液中提取基因组DNA的通用方法

1)将300μL血液加入盛有900μL的BRC Lysis Solution的1.5mL离心管中，颠倒10次，在室温孵育1至3分钟(即尽量使红细胞完全裂解，液体澄清透明)。

2)2000×g离心2分钟，小心弃去上清，保留离心管底部可见的白色沉淀和大约10～20μL液体，涡旋20秒混匀或用吸头吹打混匀。

3)每管中加入300μL Cell Lysis Solution，吹打混匀。

4)加入100μL Protein Preciptation Solution，蜗旋20秒混匀或用吸头吹打，直至出现棕褐色沉淀颗粒。

5)13000×g离心3分钟后，将上清液移至标记过新的离心管中，加入300μL异丙醇，颠倒50次。

6)13000×g离心5分钟，吸弃上清，在洁净的滤纸上小心倒置，将残留的液体吸干。

7)加入300μL 70％乙醇。13000×g离心3分钟，小心除去上清液，用吸水纸吸干残留的液体。

8)室温或37℃空气干燥3～5分钟。

9)加入100μL DNA Hydration Solution，蜗旋5秒混匀或用吸头吹打多次。

10)65℃温育5分钟以溶解基因组DNA。

11)然后室温摇动数小时或过夜，-20℃保存备用。

2、标准驽巴贝斯虫阳性的动物基因组DNA样品的制备

用经鉴定过的并在液氮中保存的驽巴贝斯虫活虫种的血液接种实验马属动物，当红细胞的染虫率达到0.1％以上时，以20％枸橼酸钠作为抗凝剂，通过静脉采集血液样品，将所采集的抗凝血液4℃条件下1000×g离心10分钟，弃去上清，尽量将上层白细胞吸弃。用2％枸橼酸钠洗涤三次(同前处理，1000×g离心10分钟)，最后将上清去掉，红细胞分装入1.5mL离心管中，-20℃保存备用。由此血液提取的动物基因组DNA即为标准驽巴贝斯虫基因组DNA样品，在对被检动物进行检测时作为驽巴贝斯虫基因组DNA标准阳性对照。

3、标准马泰勒虫阳性的动物基因组DNA检测样品的制备

用经鉴定过的并在液氮中保存的含马泰勒虫活虫种的血液分别接种实验马属动物，当红细胞的染虫率达到0.1％以上时，同上处理。由此血液提取的动物基因组DNA即为标准马泰勒虫基因组DNA样品，在对被检动物进行检测时作为马泰勒虫基因组DNA标准阳性对照。

4、其它梨形虫虫种基因组DNA标准样品的获得

本发明具体实施时为了鉴定检测膜上各探针的特异性，使用了经过鉴定的感染牛的大巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、双芽大巴贝斯虫、卵形大巴贝斯虫、牛巴贝斯虫未定种(新疆株)和感染羊的莫氏巴贝斯虫的基因组DNA同时作为巴贝斯虫属虫种的阳性对照；用感染牛的环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫和感染羊的羊泰勒虫、尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫作为泰勒虫属虫种的阳性对照。分别提取其感染呈阳性的动物基因组DNA后就获得相应虫种的标准基因组DNA样品。

5、马梨形虫阴性的标准动物基因组样品的获得

将长期(采血前、后各20天以上)经血涂片检查和PCR检测驽巴贝斯虫和马泰勒虫均为阴性的马属动物(马、驴)，经静脉采集抗凝血，提取其动物基因组DNA后获得马梨形虫阴性的标准动物血液基因组DNA样品，-20℃保存备用。在对被检动物进行梨形虫检测时作为阴性对照使用。

三、检测马梨形虫的试剂盒的标准操作程序

1、梨形虫通用引物的准备

将试剂盒内提供的人工合成并用生物素标记的一对梨形虫通用引物用超纯水稀释至10μM的浓度，-20℃温度条件下保存待用。该对梨形虫通用引物的具体序列和标记方式分别是：

上游引物RLB-F的序列为(5’-gaggtagtgacaagaaataacaata-3’)；

下游引物RLB-R用生物素标记，其序列和标记方式为：(biotin-5’-tcttcgatcccctaactttc-3’)。

2、对被检动物血液基因组DNA样品进行PCR扩增和检测的标准方法

分别以按前述方法提取的待检动物的基因组DNA为模板，用PCR扩增试剂盒和梨形虫通用引物(RLB-F/RLB-R)对目的基因进行扩增，经检测结果为阳性的PCR产物就是生物素标记的PCR产物。

按以下比例配制PCR反应的缓冲液扩增体系(按一个反应体系用量)：

将反应管中试剂混合均匀后，瞬时离心后置于PCR扩增仪中进行PCR扩增反应，扩增程序为：94℃/3min；94℃/1.5min，55℃/1.5min，72℃/1.5min，40个循环；72℃/3min；4℃/保存。

取3μL PCR产物置于1.0％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL的溴化乙锭)中，在75伏的电压条件下进行电泳分析，观察扩增结果。经电泳检测确定目的基因大小在500bp左右的PCR产物就是生物素标记的PCR产物(如图4中PCR产物电泳结果的1-15道检测为阳性)。检测呈阳性的PCR产物再利用本发明试剂盒内提供的用于马梨形虫检测膜进行进一步检测。

3、利用马梨形虫检测膜鉴定马梨形虫的标准方法

生物素标记的PCR产物经变性后，用“十”字交叉法在印迹仪中与固定在检测膜上的DNA探针进行杂交(如图2所示)。DNA探针只与PCR产物的靶序列能发生结合，非特异性杂交的PCR产物会被洗脱除去；结合在膜上的PCR产物末端的生物素与链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase)结合后，能催化过氧化物酶的底物——增强化学发光试剂(Westen Blotting Luminol Reagent)发生化学反应发出荧光(如图3中黑色小方块区域所示)，在暗室内能使X感光胶片曝光；胶片经显影和定影处理后，与检测膜上探针与PCR产物发生特异性杂交的相对应的区域出现阴影。可根据胶片上有无留下阴影及其与探针对应的位置来判断被检动物感染梨形虫的情况。

具体操作步骤如下：

1)准备下面的缓冲液，所有的缓冲液使用前要预热。(按一张膜的量)：

250mL 2×SSPE/0.1％SDS，60℃；

500mL 2×SSPE/0.5％SDS(2×SSPE+0.5％SDS)，60℃；

500mL 2×SSPE/0.5％SDS，42℃；

500mL 2×SSPE，室温。

2)将以被检动物血液基因组DNA为模板进行PCR扩增获得的生物素标记的PCR产物各取20μL，分别稀释于150μL的2×SSPE/0.1％SDS缓冲液中。

3)将稀释的PCR产物在99℃温度条件下热激变性10分钟，然后立即在冰浴中冷却。

4)在60℃温度条件下用250mL的2×SSPE/0.1％SDS漂洗已固定了DNA探针的用于检测马梨形虫的检测膜5分钟。

5)按照检测膜上固定的核酸探针线方向与印迹仪的加样孔槽呈垂直的方向(如图2所示)将检测膜放入印迹仪中，固定好位置，加上支持气垫，旋紧手柄。

6)通过抽吸装置除去印迹仪中残留的液体。

7)分别将150μL经变性的各个待检的PCR产物稀释液，分别依次填充印迹仪的孔槽(同时作好记录)，在60℃温度条件下在水平面上静置杂交10分钟。

8)通过抽吸装置逐个除去印迹仪各个孔槽中的液体。

9)旋开印迹仪的手柄，用镊子将已杂交过的检测膜取出，在60℃温度条件下用250mL2×SSPE/0.5％SDS在塑料容器中摇动漂洗检测膜10分钟；换漂洗液后再重复漂洗一次。

10)将检测膜放置在杂交瓶中使其冷却至室温(以免下一步因过氧化物酶失活)。

11)取2.5μL浓度为500U/mL的链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(Streptavidin-PODConjugate，Roche公司生产)在10mL的2×SSPE/0.5％SDS中进行稀释，将此溶液加入放置检测膜的杂交瓶中，在杂交炉中42℃温度条件下旋转杂交瓶，孵育检测膜45-60分钟。

12)用250mL的2×SSPE/0.5％SDS溶液在42℃温度条件下摇动漂洗检测膜10分钟；换漂洗液后再重复漂洗一次。

13)用250mL的2×SSPE缓冲液在室温下摇动漂洗检测膜5分钟；换漂洗液后再重复漂洗一次。

14)取免疫印迹发光氨试剂盒(Wwsten Blotting Luminol Reagent，推荐用Santa cruz

生产，产品编号sc-2048)中的试剂A和试剂B各1mL在试管中混匀。

15)沥去检测膜上多余的水分，将半干的检测膜放置在两张边长大于16em×16em的透明的塑料布(或透明的打印胶片纸)之间的正中位置，检测膜的四边与塑料布(纸)的四边要平行，用塑料薄膜封口机封闭塑料布(纸)的三边，从开口的一边将发光氨试剂A、B混合液均匀地滴加在膜上探针与PCR产物杂交的区域，然后再用封口机快速对塑料布(纸)的第四边进行封口。

16)将密封好的检测膜放置在曝光储片夹内，膜的探针与PCR产物杂交的一面向上，在暗室内将一张X感光胶片紧贴放在密封的检测膜的上面(在胶片的一角打折为了以后辨认方向)，储片夹安装好后让其曝光10～30分钟。

17)在暗室内，从储片夹中取出X感光胶片后，立即放入显影液中显影5分钟，用水漂洗X感光胶片2分钟后，转入定影液中定影5分钟，再用水漂洗，充分洗去定影液后观察曝光结果。如果X感光胶片上的信号太弱或太强，可直接在另一张X光胶片重新曝光，适当延长或缩短曝光时间。

3、结果判定

所有的DNA探针仅与它们各自的靶序列进行特异性结合。生物素标记的PCR产物与特异性探针结合后，PCR产物末端与链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接后，能催化化学发光氨试剂产生荧光(如图3中黑色小正方形所示区域发出荧光)，荧光穿过透明的塑料膜使紧贴其放置的X感光胶片对应区域曝光，X感光胶片经显影和定影后出现黑色类似正方形的阴影，产生阳性信号(如图5中胶片上出现的黑色类似正方形的阴影表示检测结果呈阳性)。非特异性杂交和没有杂交的PCR产物会从膜上洗脱除去，膜的相应区域无荧光信号产生，所以X感光胶片的相应区域不能曝光，X感光胶片上不会留下阴影。我们通过X感光胶片上是否留下阴影来判定被检样品的PCR产物是否与探针发生特异性杂交(即检测呈阳性)，通过阴影的位置所对应于检测膜上固定的特异性探针名称和种类，能准确地判定被检动物感染的梨形虫虫种类；再结合前述的PCR扩增产物的电泳检测结果分析后，能综合评价被检动物感染梨形虫病的情况。

用本发明试剂盒检测马梨形虫时，若被检马属动物单纯感染了驽巴贝斯虫时，以该动物血液基因组DNA为模板进行PCR扩增后电泳分析时应出现500bp左右的目的基因(应与图4中第7道的检测结果一致)。进一步用本发明试剂盒中的检测膜检测后，其PCR产物能与检测膜上的三个探针——梨形虫通用DNA探针(C-all)、巴贝斯通用DNA探针(B-all)和驽巴贝斯虫探针(B-cab)都能发生特异性结合，同时检测为阳性，而与探针T-all和T-equi不反应(如图5中第7行所示一致)。若是被检动物仅感染马泰勒虫时，对此被检动物的血液基因组DNA进行PCR检测时呈阳性(应与图4中第8道的检测结果一致)，用检测膜进一步检测时PCR产物能被检测膜上的梨形虫通用DNA探针(C-all)，泰勒虫通用DNA探针(T-all)和马泰勒虫探针(T-equi)三个核苷酸探针同时识别为阳性，而无法被另外两个探针识别(应与图5中第8行所示一致)。若是被检动物同时感染了两种马梨形虫(包括驽巴贝斯虫和马泰勒虫)时，用该试剂盒对其进行检测时，PCR检测结果为阳性；从理论上讲，用检测膜进一步检测时，检测膜上五种DNA探针都可能识别为阳性(例如图5中第15行所示相似)。但是由于每个来源于驽巴贝斯虫和马泰勒虫混合感染样品中有两种模板，且其比例可能各不相同，导致这两种模板扩增的PCR产物中五种探针识别位点的序列数量和比例差异较大，所以用检测膜上的进行检测时，这五种探针有的可能检测为强阳性，有的探针检测为弱阳性，有的探针可能检测为假阴性，要根据具体情况来综合判定被检动物感染梨形虫的情况。对于单纯感染梨形虫(驽巴贝斯虫或马泰勒虫)的动物，也要根据具体情况综合判定。

4、用于检测马梨形虫的试剂盒内的检测膜的重复利用

与检测膜上的固定的探针结合的PCR产物在高温条件可以从检测膜上分离出来，而检测膜上的探针的特性不发生明显改变。一张膜可以重复使用大约15～20次。具体操作如下：

1)用1％的SDS溶液在80℃温度条件下漂洗杂交过的检测膜15分钟，重复漂洗一次，共30分钟。

2)在室温条件下用20mM EDTA(pH 8.0)溶液漂洗检测膜15分钟一次。

3)用保鲜膜等塑料制品将检测膜密封后，4℃保存膜直到再次使用(以避免膜脱水)。

四、检测实例一：使用本发明试剂盒对14种梨形虫基因组DNA标准样品进行检测

1、利用梨形虫通用引物进行PCR扩增及其检测

用检测马梨形虫的试剂盒内提供的一梨形虫通用引物，对经过鉴定的14份梨形虫感染呈阳性的动物基因组DNA标准样品(大巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、牛巴贝斯虫未定种、卵形大巴贝斯虫、双芽大巴贝斯虫、莫氏巴贝斯虫、驽巴贝斯虫、马泰勒虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫、羊泰勒虫、尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫)、一份驽巴贝斯虫与马泰勒虫混合感染的动物基因组DNA样品、2份阴性对照(正常马基因组DNA、正常驴基因组DNA)、和1份空白对照(水)进行了PCR检测。

PCR扩增反应体系和扩增程序参照前面叙述的PCR标准方法和程序进行。

取3μL PCR产物置于1.0％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL的溴化乙锭)中，在75伏的电压条件下进行电泳分析，观察扩增结果。18个标准样品的PCR产物电泳结果分别如图4所示。结果显示：梨形虫通用引物能很特异地扩增出500bp左右大小的目的基因，而两个阴性对照和空白对照没有检测到相同大小的PCR产物，与预期结果一致，说明扩增体系和程序正常。

2、用检测马梨形虫的试剂盒内提供的检测膜进行检测

用试剂盒内提供的检测膜对上述这18份PCR产物的样品进一步进行检测，其检测程序按前述的标准方法进行，这18份PCR产物的结果如图5所示。

结果显示，检测膜上的梨形虫通用DNA探针C-all能识别所有来源于14种梨形虫基因组DNA的PCR产物，对两个正常动物基因组DNA阴性对照和一个空白对照样品检测时呈阴性，说明梨形虫通用DNA探针C-all非常有效，与预期结果一致。检测膜上的巴贝斯虫通用DNA探针B-all能识别5种巴贝斯虫(包括驽巴贝斯虫)，而无法识别两种巴贝斯虫(大巴贝斯虫、牛巴贝斯虫)，说明这两个种的目的基因上探针结合位点变异较大，可视为发现了两个巴贝斯虫新种；也与泰勒虫属的虫种无交叉反应，两个正常动物基因组DNA阴性对照和一个空白对照均呈阴性；说明巴贝斯虫通用DNA探针B-all能有效地把驽巴贝斯虫和其它泰勒虫(包括马泰勒虫)鉴别开，所以对于用来检测和鉴别马梨形虫来说，应用本发明试剂盒中的检测膜上的探针B-all能达到预期结果。检测膜上的泰勒虫通用DNA探针T-all能与所有来源于泰勒虫的PCR产物产生杂交阳性信号，而与所有巴贝斯虫的PCR产物均无交叉反应，所有的阴性对照和空白对照均没有阳性信号出现，达到了预期效果，说明泰勒虫通用探针T-all能有效地鉴别泰勒虫属的梨形虫虫种和巴贝斯虫属的梨形虫虫种。检测膜上的驽巴贝斯虫特异性DNA探针B-cab只能识别驽巴贝斯虫的PCR产物，与其它13种梨形虫(包括6种巴贝斯虫)的PCR产物均无交叉反应，检测两个正常动物基因组DNA阴性对照和一个空白对照时也均呈阴性，与预期结果一致，说明本发明设计的驽巴贝斯虫特异性DNA探针非常特异。检测膜上的马泰勒虫特异性DNA探针T-equi仅与马泰勒虫来源的PCR产物特异性结合，产生阳性信号，能把马泰勒虫和其它13种梨形虫(包括6种泰勒虫)的PCR产物鉴别开，也能鉴别出正常动物和感染马泰勒虫的动物，空白对照也与预期结果一致，说明本发明设计的马泰勒虫特异性DNA探针T-equi也非常特异。总之，梨形虫通用DNA探针、两个属特异探针(B-all和T-all)和两个种特异探针(B-cab和T-equi)都能鉴别和区分相应属、种的梨形虫，也能区分感染马梨形虫的动物和未感染马梨形虫的正常马属动物，达到了本发明设计的要求。

换个角度来讲，用本发明用于检测马梨形虫的试剂盒进行检测时，单纯感染马泰勒虫的动物基因组DNA标准样品经PCR检测时呈阳性，出现500bp大小目的片段；继续用检测膜检测时能被检测膜上的梨形虫通用DNA探针(C-all)，泰勒虫通用DNA探针(T-all)和马泰勒虫探针(T-equi)三个核苷酸探针同时识别为阳性，而无法被另外两个探针识别。单纯感染驽巴贝斯虫的动物的基因组DNA标准样品为模板进行PCR扩增后检测呈阳性，其产物能被检测膜上的三个探针——梨形虫通用DNA探针(C-all)、巴贝斯通用DNA探针(B-all)和驽巴贝斯虫探针(B-cab)发生特异性结合，同时检测为阳性，而与探针T-all和T-equi不结合。所有的梨形虫虫种都能被检测膜上的梨形虫通用DNA探针(C-all)识别。五种巴贝斯属的梨形虫也能被巴贝斯虫通用DNA探针B-all识别出来，而大巴贝斯虫和牛巴贝斯虫陕县株却不能被B-all识别(如图5中所示)，可视为感染牛的大巴贝斯虫和牛巴贝斯虫陕县株是新发现的两个梨形虫种。七种泰勒虫虫种还能被泰勒虫属特异探针T-all识别，而无法被巴贝斯属B-all探针识别。总而言之，用本发明用于检测马梨形虫的试剂盒对经过鉴定的14个感染特定梨形虫病的动物血液基因组DNA标准样品的进行检测时，以特定梨形虫基因组DNA标准样品为模板进行PCR扩增的产物均可与检测膜上五种探针中至少一种探针的产生杂交产生阳性信号；检测时所设立的阴性对照和空白对照没有出现阳性反应，证明检测系统正常，检测结果可靠。同样，设计的泰勒虫属特异性探针(T-all)可以检测出所有已知的泰勒虫，包括马泰勒虫，而不能识别巴贝斯虫属的梨形虫虫种；设计的巴贝斯虫属特异性探针B-all可检测出大部分已知的巴贝斯虫虫种(包括驽巴贝斯虫)。同时，设计的两个种特异性探针B-cab和T-equ也非常特异，能够分别鉴别驽巴贝斯虫和马泰勒虫，与其它梨形虫虫种和对照均无交叉反应。

综上所述，使用本发明——用于检测马梨形虫的试剂盒，能非常有效的区分和鉴别驽巴贝斯虫和马泰勒虫，检测过程相对快捷，操作相对简单，成本相对低廉。这对于马梨形虫的鉴别与诊断、开展研究和大规模的流行病学调查时提供了一种快捷有效的工具，有非常重要的意义。

Claims (3)

1.用于检测马梨形虫的试剂盒，其特征是试剂盒内有检测马梨形虫的检测膜和梨形虫通用引物，其中：

检测马梨形虫的检测膜是在Biodyne C膜的不同区域分别固定有如下述的五种核苷酸序列的探针：

梨形虫通用探针(C-all)CTGTCAGAGGTGAAATTCT；

巴贝斯虫通用探针(B-all)CCTTRGTAATGGTTAATAGGAA；

驽巴贝斯虫特异探针(B-cab)AAACCCTCGCCAGAGTAACAATT；

泰勒虫通用探针(T-all)WVCCRRAGTAATGGTTAATAGG；

马勒虫特异探针(T-equi)TTTTAGGAGCCRGAGTAATGGTTA；

以上序列中的R、W或V是兼并碱基，其中：R＝A或G；W＝A或T；V＝A或C或G；

梨形虫通用引物为：

上游引物RLB-F：(5’-gaggtagtgacaagaaataacaata-3’)；

下游引物RLB-R：(biotin-5’-tcttcgatcccctaactttc-3’)。

2.权利要求1所述的用于检测马梨形虫的试剂盒中的检测膜制备方法，其特征是人工合成如下五种核苷酸序列：

梨形虫通用探针(C-all)CTGTCAGAGGTGAAATTCT；

巴贝斯虫通用探针(B-all)CCTTRGTAATGGTTAATAGGAA；

驽巴贝斯虫特异探针(B-cab)AAACCCTCGCCAGAGTAACAATT；

泰勒虫通用探针(T-all)WVCCRRAGTAATGGTTAATAGG；

马勒虫特异探针(T-equi)TTTTAGGAGCCRGAGTAATGGTTA，

将各序列的5′端用氨基团进行修饰后待用，

1)将各核酸探针按下述用量稀释于150μL的pH 8.4的500mM NaHCO₃中待用：

梨形虫通用探针(C-all)5～50p mol；巴贝斯虫通用探针(B-all)12～100p mol；驽巴贝斯虫特异探针(B-cab)50～100p mol；泰勒虫通用探针(T-all)50～100p mol；马勒虫特异探针(T-equi)10～100p mol；

2)将Biodyne C膜剪成预定的尺寸并标记方向和顺序后，用去离子水配制10mL新鲜的16％(w/v)的EDAC溶液，将前述Biodyne C膜放在盛有16％的EDAC溶液的容器内，在室温下不断地旋转容器，进行孵育、活化处理；将活化的Biodyne C膜用去离子水漂洗2后放入洁净的印迹仪内并除去印迹仪孔槽中残留的液体；

3)将150μL稀释好的各探针溶液分别加入印迹仪的目标孔槽中，其中第一个和最后一个孔不加探针，用2×SSPE将墨水稀释后加入第一个孔和最后一个孔，未加探针的多余孔槽用2×SSPE缓冲液填充，再在室温条件下孵育2分钟后除去各个孔槽内的液体，所用的2×SSPE缓冲液为pH7.4，用0.2M Na₂HPO₄，、3.0M NaCl和20mM EDTA配制而成；将经前处理的膜用新鲜配制250mL的100mM NaOH溶液孵育膜10分钟，使Biodyne C膜钝化后再用去离子水漂洗；

4)用250mL的2×SSPE/0.1％SDS缓冲液在60℃温度条件下漂洗经前处理的膜，再用100mL 20mM pH 8.0的EDTA溶液在室温条件下，漂洗膜，再将该Biodyne C膜在4℃条件下密封保存直至使用。

3.权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征是从待检马属动物的血液中提取基因组DNA，再用梨形虫通用引物进行PCR扩增，将扩增产物变性后与检测膜上的探针进行杂交，特异性结合在检测膜上的PCR产物末端的生物素与链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase)作用后，能催化过氧化物酶的底物增强化学发光氨试剂(ECL-detection)发出荧光，使X感光胶片曝光；胶片经显影和定影处理后，与检测膜上探针与PCR产物发生特异性杂交的相对应的区域出现阴影，根据胶片上有无留下阴影来判断被检动物是否有患有梨形虫病。

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