CN105925724A - 脑包虫病标志物nad5基因以及多头带绦虫的检测方法和试剂盒 - Google Patents

脑包虫病标志物nad5基因以及多头带绦虫的检测方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于动物疾病诊断领域，具体涉及一种脑包虫病标志物nad5基因以及多头带绦虫的检测方法和试剂盒。对实验室收集多头带绦虫成虫标本和犬粪便提取DNA，以线粒体nad5基因部分序列作为多头带绦虫的靶DNA片段进行PCR扩增。结果显示感染多头带绦虫犬粪便扩增的目的片段与预期片段长度一致，为433bp。经测序鉴定，与多头带绦虫已知株nad5基因部分序列同源性均为99.5％。且特异性和灵敏度高。因此nad5基因可作为脑包虫病标志物。本发明所述多头带绦虫的检测方法能够快速有效的检测犬粪便中的多头带绦虫虫卵，同时具有较高的特异性和灵敏性，可以用于多头带绦虫流行病学调查。

Description

脑包虫病标志物nad5基因以及多头带绦虫的检测方法和试剂盒
技术领域
本发明属于动物疾病诊断领域，具体涉及脑包虫病标志物nad5基因以及多头带绦虫的检测方法和试剂盒。
背景技术
多头带绦虫(Taenia multiceps)是犬小肠内的常见绦虫，其孕节和虫卵常随犬粪便排出外界，被羊、牛等草食动物吞食后进入其体内发育为脑多头蚴，引起脑包虫病。脑包虫病不仅引起羊、牛等家畜死亡，给养殖业造成巨大的经济损失，而且还威胁人类的健康。感染多头带绦虫的犬是脑包虫病的重要传染源，因此及时、准确地掌握流行区犬多头带绦虫的感染情况并控制犬的感染，切断传播途径，达到从传染源控制的目的，从而对控制脑包虫病的流行、综合防制等具有重要意义。
在脑包虫病流行区犬除感染多头带绦虫外，往往还混合感染泡状带绦虫、豆状带绦虫等其他绦虫。目前犬感染多头带绦虫的检测手段主要包括病原学检查和血清学检查。粪便内孕节节片和虫卵检查是犬科动物绦虫感染常用的病原学检测方法。对动物进行粪检虽然还是目前进行流行病学调查的主要方法，但由于带科绦虫虫卵在显微镜下形态极其相似，很难形态观察进行种类鉴别，且此方法的敏感性不高，易漏检。但还没有用于犬多头带绦虫感染监测中能推广应用且较简便的方法，因此，探索一种简便、快速、有效的犬多头带绦虫感染的检测方法对从源头上切断脑包虫病的流行具有十分重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的问题，提供一种脑包虫病的标志物nad5基因以及多头带绦虫的检测方法和试剂盒。
申请人对实验室收集多头带绦虫成虫标本和犬粪便提取DNA，以线粒体nad5基因部分序列作为多头带绦虫的靶DNA片段进行PCR扩增。结果显示感染多头带绦虫犬粪便扩增的目的片段与预期片段长度一致，为433bp。经测序鉴定，与多头带绦虫已知株nad5基因部分序列同源性均为99.5％。且特异性和灵敏度高。
因此本发明提供了nad5基因在制备脑包虫病标志物中的应用。
本发明还提供了nad5基因在制备脑包虫病检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种多头带绦虫的检测方法，以待测样品的DNA为模板，用nad5基因的引物进行PCR扩增。
在一些实施方案中，所述nad5基因的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。
在一些实施方案中，本发明所述多头带绦虫的检测方法中所述PCR扩增的扩增体系如下：2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，nad5基因的上游引物和下游引物各1μL，待测样品的DNA 1.5μL，ddH2O 8.2μL，0.4％-0.6％BSA 0.8μL。
优选的，所述nad5基因的上游引物和下游引物的浓度为10pmol/μL。
本发明所述多头带绦虫的检测方法中所述PCR扩增的扩增条件优选为95℃5min；95℃30s，46℃40s，72℃45s，共30个循环；最后72℃延伸6min。
本发明所述的检测方法中所述待测样品可以采用本领域技术人员公知的任何一种样品，包括但不限于粪便、血液。优选的所述待测样品为粪便。如犬粪便。
本发明还提供了一种多头带绦虫的检测试剂盒，包括nad5基因的引物。
优选的，所述nad5基因的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。
在一些实施方案中，本发明所述试剂盒还包括0.4％-0.6％BSA。
进一步的，本发明所述试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试剂。如TaqPCR MasterMix等。
在一些实施方案中，本发明所述试剂盒还包括对照品和标准品。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种脑包虫病的标志物nad5基因以及多头带绦虫的检测方法和试剂盒。对实验室收集多头带绦虫成虫标本和犬粪便提取DNA，以线粒体nad5基因部分序列作为多头带绦虫的靶DNA片段进行PCR扩增。结果显示感染多头带绦虫犬粪便扩增的目的片段与预期片段长度一致，为433bp。经测序鉴定，与多头带绦虫已知株nad5基因部分序列同源性均为99.5％。且特异性和灵敏度高。因此nad5基因可作为脑包虫病标志物。本发明所述多头带绦虫的检测方法能够快速有效的检测犬粪便中的多头带绦虫虫卵，同时具有较高的特异性和灵敏性，可以用于多头带绦虫流行病学调查。本发明所述多头带绦虫的检测试剂盒组成简单，适用于多头带绦虫的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示人工感染犬粪便的PCR扩增结果，其中泳道M为DL2000DNAMarker，泳道1为多头带绦虫成虫，泳道2为多头带绦虫虫卵；
图2示多头带绦虫分离株nad5基因片段序列比对，FJ495086和GQ228818均为GenBank多头带绦虫序列；KC794850为测定的多头带绦虫；“-”:与FJ495086位置的碱基相同；
图3示PCR特异性试验结果，其中泳道1为空白对照；泳道2为多头带绦虫成虫；泳道3为多头带绦虫虫卵；泳道4为豆状带绦虫；泳道5为泡状带绦虫；泳道6为细粒棘球绦虫；泳道7为犬复孔绦虫；泳道8为孟氏迭宫绦虫；泳道M为DL2000DNA Marker；
图4示PCR灵敏性试验结果，泳道1为1000个虫卵；泳道2为100个虫卵；泳道3为10个虫卵；泳道4为1个虫卵；泳道M为DL2000DNA Marker；
图5示部分流浪犬粪便的PCR扩增结果泳道1-6为检测到带科绦虫虫卵的犬粪；泳道M：DL2000DNA Marker。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。其中，主要试剂：DNA Marker购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒，PCR引物合成和测序由上海英俊生物工程有限公司完成；其它试剂均为国产分析纯。主要材料：多头带绦虫成虫、泡状带绦虫成虫、豆状带绦虫成虫、细粒棘球绦虫成虫、犬复孔绦虫成虫和孟氏迭宫绦虫成虫均由四川农业大学动物寄生虫病研究中心提供。20份流浪狗的粪便采自攀枝花流行病地区流浪狗。
实施例1粪便中虫卵形态学鉴定和收集
称取每只犬粪样0.5g，用饱和食盐水将其搅拌均匀后倒入干净试管中，并补加饱和食盐水至满，使液面凸出管口后放上盖玻片，静置0.5h后，取下盖玻片在显微镜下检查，对虫卵进行形态鉴定并将盖玻片上的带科绦虫虫卵用双蒸水冲洗到干净的EP管中，编号后放到-20℃保存备用。
实施例2引物设计
根据GenBank上已收录多头带绦虫线粒体全基因组(序列号：GQ228818)的nad5基因序列设计1对引物。
上游引物P1：5’-GTGTAGTTGATTTAGTGGGTT-3’(SEQ ID No.1)，
下游引物P2：5’-GGCATTGCATGTAATCATAAC-3’(SEQ ID No.2)。
扩增片段为433bp。引物序列由上海英骏生物技术有限公司合成。
实施例3 DNA的提取
(1)多头带绦虫成虫虫体DNA的提取
将成虫孕卵节片用剪刀剪成碎片后用沸水、液氮反复处理数次后，按照试剂盒方法提取DNA。
(2)粪便虫卵DNA的提取
将从犬粪便收集到的多头带绦虫虫卵分别用沸水、液氮反复处理数次，至大部分虫卵卵壳破裂后，按照试剂盒方法提取DNA。
实施例4 PCR扩增
(1)多头带绦虫成虫虫体DNA PCR扩增
扩增体系为25μL：2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，引物P1、P2(10pmol/μL)各1μL，模板DNA 1.0μL，ddH2O 9.5μL，轻轻混匀后瞬时离心15s。同时，以ddH2O代替模板DNA作空白对照。扩增条件：95℃5min；95℃30s，46℃40s，72℃45s，共30个循环；最后72℃延伸6min。反应结束后取10μL扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果见图1。
(2)犬粪便DNA PCR扩增
扩增体系为25μL：2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，引物P1、P2(10pmol/μL)各1μL，模板DNA 1.5μL，ddH2O 8.2μL，0.4％BSA 0.8μL，轻轻混匀后瞬时离心15s。同时，以ddH2O代替模板DNA作空白对照。扩增条件同成虫DNA PCR扩增的条件。结果见图1。
结果显示，用合成的引物P1、P2，从多头带绦虫成虫虫体和犬粪便虫卵DNA中扩增出了400bp左右的目的片段，条带大小与预期结果相符合，且条带清晰。
实施例5阳性PCR产物测序鉴定
随机抽取成虫孕节和犬粪便DNA为模板扩增的PCR阳性产物各1份，经胶回收试剂盒纯化，将纯化后的产物直接送上海英骏生物技术有限公司测序，并对测序结果进行分析。以GenBank中的多头带绦虫(序列号：GQ228818和FJ495086)的nad5基因序列作为参照，应用DNAman软件对测序序列和参照序列进行多重比较和相似性分析。结果见图2。
图2结果显示两条测序去掉引物序列后，均得到396bp的片段(GenBank登陆号：KC794850)，且相似性为100％。经序列比对，与GQ228818和FJ495086的相似性均为99.5％。进一步验证虫体和虫卵均为多头带绦虫。
实施例6特异性检测
犬小肠内寄生的绦虫除多头带绦虫外，最常见的还有泡状带绦虫、豆状带绦虫、犬复孔绦虫、孟氏迭宫绦虫等其他绦虫。用相同方法提取泡状带绦虫、豆状带绦虫、细粒棘球绦虫、犬复孔绦虫和孟氏迭宫绦虫的DNA，按照实施例4犬粪便DNA PCR扩增的条件进行PCR扩增，1％琼脂糖电泳检测结果。结果见图3。
多头带绦虫成虫DNA PCR扩增反应均产生单一的目的条带，但泡状带绦虫、豆状带绦虫DNA样本及阴性对照均无此扩增条带。表明所述方法具有种特异性，不会发生交叉反应。
实施例7灵敏度测定
显微镜下计数多头带绦虫虫卵个数，按比例稀释(1000、100、10、1个虫卵/200μL)后提取DNA，按照实施例4犬粪便DNA PCR扩增的条件进行PCR检测。结果见图4。
结果显示除1个虫卵的PCR产物无目的条带外，10、100、1000个虫卵/200μL的PCR产物均可见清晰的目的条带。表明所述方法敏感度能达到10个虫卵的鉴定。
实施例8临床粪样应用检测
随机捡取20只流浪狗的粪便，进行饱和食盐水漂浮检查，并提取多头带绦虫阳性粪样的DNA作为扩增模板按照实施例4犬粪便DNA PCR扩增的条件进行PCR检测。PCR反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测。若在400bp位置出现条带，则对应的标本记为阳性。
对20份粪样进行常规虫卵检测，其中6份检测到多头带绦虫虫卵。对其进行PCR检测，有5份为阳性，而其他粪样均无目的条带出现，均为阴性(图5)。说明该PCR方法具有较好的应用价值。

Claims (10)

1.nad5基因在制备脑包虫病标志物中的应用。
2.nad5基因在制备脑包虫病检测试剂盒中的应用。
3.一种多头带绦虫的检测方法，其特征在于，以待测样品的DNA为模板，用nad5基因的引物进行PCR扩增。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述nad5基因的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的扩增体系：2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，nad5基因的上游引物和下游引物各1μL，待测样品的DNA 1.5μL，ddH2O 8.2μL，0.4％BSA 0.8μL。
6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的扩增条件为95℃5min；95℃30s，46℃40s，72℃45s，共30个循环；最后72℃延伸6min。
7.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，待测样品为粪便。
8.一种多头带绦虫的检测试剂盒，其特征在于，包括nad5基因的引物。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，nad5基因的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示。
10.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，还包括0.4％-0.6％BSA。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106755458A (zh) * 2017-01-09 2017-05-31 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测和区分多种以犬为终末宿主的常见大中型绦虫的检测试剂盒
CN109239211A (zh) * 2018-09-11 2019-01-18 江苏省血吸虫病防治研究所 用于鉴别人体感染包虫的血清标志物及检测试剂盒
CN111944910A (zh) * 2020-08-28 2020-11-17 海南热带海洋学院 一种检测粉红副尼丽鱼种群的引物组、试剂盒和方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
范艺凡等: "豆状带绦虫线粒体ｒｒｎＬ 和ｎａｄ５基因的克隆及种系发育研究", 《中国畜牧兽医》 *
贾万忠等: "带科绦虫线粒体基因组全序列研究进展", 《中国人兽共患病学报》 *
郝桂英: "基于线粒体基因对多头带绦虫和泡状带绦虫的种群遗传学研究", 《中国博士学位论文全文数据库》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106755458A (zh) * 2017-01-09 2017-05-31 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测和区分多种以犬为终末宿主的常见大中型绦虫的检测试剂盒
CN106755458B (zh) * 2017-01-09 2020-04-03 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测和区分多种以犬为终末宿主的常见大中型绦虫的检测试剂盒
CN109239211A (zh) * 2018-09-11 2019-01-18 江苏省血吸虫病防治研究所 用于鉴别人体感染包虫的血清标志物及检测试剂盒
CN111944910A (zh) * 2020-08-28 2020-11-17 海南热带海洋学院 一种检测粉红副尼丽鱼种群的引物组、试剂盒和方法

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