CN110904250A - 用于检测多种菌的多重荧光定量pcr引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

用于检测多种菌的多重荧光定量pcr引物、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明实施例公开了用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物、试剂盒及检测方法，其包括针对长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌菌的16SrDNA设计引物对及探针，其中，所述长双歧杆菌、动物双歧杆菌和短双歧杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。本发明还公开一种包含上述PCR引物和探针的多重荧光定量PCR检测试剂盒。本发明实施例提供的用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物和探针，其是按照经过多次实验和设计出的特定序列合成引物和探针，经过实验优化的特定引物和探针可以保证扩增的时候能保证较好的特异性和减少同一个反应体系内的引物探针的相互之间的干扰。

Description

用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明实施例涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物、试剂盒及检测方法。
背景技术
人体肠道微生物与人的健康有着密切的关系，有些重要种类的细菌所占比例对于人体的健康有重要的影响。通过检测肠道微生物中一些重要的菌种的含量和所占比例，对于判断受检者的某些健康状况和辅助治疗有着一定的意义。目前针对细菌数量和种类的常见的检测方法有：1、传统的选择性培养基培养：该方法主要是通过特定的培养基对样本中特定细菌进行培养，通过菌落的数量来反应样本中该种细菌的数量。该方法是经典、常用的方法，检测结果较为准确。该方法的缺点是：培养的周期长，一般需要数天；检测通量低，有很多对培养条件要求严格的细菌很难培养，鉴定的精度一般，多数情况下无法准确的区分亚种或者突变株。无法发现未知的菌种，多数情况无法在同一个培养基中同时检测多种菌。2、生化鉴定：利用待检菌种产生的特异化学物质，通过特异性的化学反应来检测样本中的对应菌种有无。检测时间相对培养基培养的方法短一些，通量有所提高。但是同样存在检测的精度有限，无法区分亚种或者突变株。另外有很多菌无法产生特异的化学物质，无法采用本方法检测；多数情况无法通过同一个反应检测多种菌。3、荧光定量PCR：根据相应菌种的特异DNA序列设计探针和引物，通过对该菌的DNA进行检测来确认该菌种的有无或者含量。本检测方法检测时间短，检测灵敏度高，DNA提取和扩增只需几小时；检测精度高，可以精确到亚种或者突变株；而且可以通过一个反应检测多种菌。缺点是需要知道待检测菌的特异DNA序列，无法检测未知序列的菌或突变的菌株，如果菌的DNA在引物或者探针处发生了SNP突变会影响检测和定量的准确性。4、NGS二代测序：利用宏基因组或者16S方式对样本提取的DNA进行建库，通过二代测序和生物信息学分析获得各种菌的种类和比例。优点是检测通量高，检测灵敏度高，检测结果准确，宏基因组的方式能够检测到一些未知的菌。缺点是检测周期相对较长，检测成本较高。
目前有不少领域需要对样本中的少数几种特定的已知菌进行检测。需要在短时间内检测出样本中是否含有这些菌，以及这些菌在样本中的各自含量。这些检测多数都对检测周期和检测精度要求比较高，从样本开始检测到得出检测结果的时间一般要求一天之内甚至更短，菌也需要精确到种或者亚种水平。因此，荧光定量PCR成为一种常见的检测手段，能在数小时之内得到检测结果，并且可以精确地得到样本中的菌在种，亚种水平的数量。
当前用的较广的荧光定量法检测一般是一管反应体系里面检测一种菌。不仅检测通量相对较低，而且检测成本也比较高。如果使用多重PCR扩增和检测技术，可以在一管反应里检测多种菌，能够极大的提高检测通量和降低了检测成本。
但是多重PCR的难度比普通PCR高很多，其存在以下缺陷：1、引物和探针的特异性：由于有些同一属内的菌的DNA序列同源性较高，如果引物和探针的特异性不高，会造成非特异性的扩增，将DNA序列相近的菌的序列进行扩增，造成假阳性，影响检测的准确性和导致检测的目的菌的数量升高。2、引物探针的相互干扰：对于荧光定量PCR在一个反应体系内检测多个菌来说，由于在同一个反应体系内存在着多个引物和探针，互相之间容易产生干扰，造成检测结果的不准确，所以合适的引物和探针显得尤为重要。3、引物的扩增效率：如果引物的扩增效率相差较多，那么在同一个反应体系中同时进行扩增时，各引物间会由于扩增效率不同，导致样本初始的DNA扩增的不均衡，一些含量低的菌或者引物扩增效率低的菌无法同含量高或者扩增效率高的引物竞争，导致此类菌的扩增产物较少，荧光信号较弱，造成假阴性结果，影响定量的准确性。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物、试剂盒及检测方法，以解决现有技术中由于检测的特异性差，对多个菌种的检测效率低的问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物和探针，其包括针对长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌菌的16SrDNA设计引物对及探针，其中，所述长双歧杆菌、动物双歧杆菌和短双歧杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；
所述长双歧杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:3所示，所述动物双歧杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:4所示，所述短双歧杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:5所示；
所述鼠李糖乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示，所述鼠李糖乳杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:8所示；
所述罗伊氏乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，所述罗伊氏乳杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:11所示；
所述阿克曼氏菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示，所述阿克曼氏菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:14所示；
所述嗜酸乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示，所述嗜酸乳杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:17所示；
所述植物乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示，所述植物乳杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:20所示。
本发明实施例另一方面还提供一种用于检测多种菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂和包括上述所述的用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物和探针。
本发明实施例的用于检测多种菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其还包括含有Mg2+的PCR反应缓冲液、dNTP、以及PCR扩增酶。
优选的，所述检测试剂盒用于同时检测长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌。
优选的，所述PCR引物和探针分成第一组分、第二组分以及第三组分；
其中，所述第一组分包括所述长双歧杆菌、短双歧杆菌和动物双歧杆菌的引物和探针；
所述第二组分包括所述鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的引物和探针；
所述第三组分包括阿克曼氏菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的引物和探针。
本发明实施例另一方面还提供一种检测多种菌的多重荧光定量PCR的方法，其包括利用长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌的16SrDNA作为模板，以及上述所述的PCR引物和探针进行多重荧光定量PCR的过程。
优选的，所述PCR引物和探针分成第一组分、第二组分以及第三组分；
其中，所述第一组分包括所述长双歧杆菌、短双歧杆菌和动物双歧杆菌的引物和探针；
所述第二组分包括所述鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的引物和探针；
所述第三组分包括阿克曼氏菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的引物和探针。
优选的，所述多重荧光定量PCR反应过程包括去污染50℃3min，1cycle，预变性95℃，15min，变性95℃20s，35cycle，退火60℃40s,延伸60℃40s。
本发明实施例具有如下优点：
本发明实施例提供的用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物和探针，其是按照经过多次实验和设计出的特定序列合成引物和探针，经过实验优化的特定引物和探针可以保证扩增的时候能保证较好的特异性和减少同一个反应体系内的引物探针的相互之间的干扰；用该引物和探针制备得到的试剂盒，一就可同时检测8种菌体，通量高，而且检测结果准确，特异性好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例提供的第一组分检测双歧杆菌的荧光定量曲线图，其中曲线A为动物双歧杆菌，曲线B为长双歧杆菌，曲线C为短双歧杆菌；
图2为本发明实施例提供的第二组分检测鼠李糖乳酸杆菌和罗伊式乳酸菌的荧光定量曲线图，其中，曲线A为鼠李糖乳酸杆菌，曲线B为罗伊式乳酸杆菌；
图3为本发明实施例提供的第三组分检测阿克曼和嗜酸乳酸杆菌和植物乳酸杆菌的荧光定量曲线图，其中，曲线A为植物乳酸杆菌，曲线B为嗜酸乳杆菌，曲线C为阿克曼氏菌。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明实施例提供用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物和探针，具体的，该PCR引物和探针用于检测人体肠道内长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌等8种菌，根据该8种菌的各自特异性的16SrDNA序列设计引物和探针，并进行测试。通过不断的根据检测结果，设计和优化PCR引物和探针，并且针对性地调整PCR反应体系。设计出一组在引物和探针的特异性、相互干扰和扩增效率方面都较为理想的荧光定量PCR引物和探针的组合，如表1所示，为本发明实施例的用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物和探针，包括针对长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌的16SrDNA设计引物对及探针，其中，长双歧杆菌、动物双歧杆菌和短双歧杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；长双歧杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:3所示，动物双歧杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:4所示，短双歧杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:5所示；鼠李糖乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示，鼠李糖乳杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:8所示；罗伊氏乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，罗伊氏乳杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:11所示；阿克曼氏菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示，阿克曼氏菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:14所示；嗜酸乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示，嗜酸乳杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:17所示；植物乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示，植物乳杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:20所示。
表1
Figure BDA0002252566130000071
引物、探针设计参考序列均来自NCBI网站Genebank数据库，引物、探针由北京擎科生物科技有限公司合成。
实施例2
将实施例1设计制备得到的PCR引物和探针分成第一组分、第二组分以及第三组分，如表2-表4所示；其中，所述第一组分包括所述长双歧杆菌、短双歧杆菌和动物双歧杆菌的引物和探针以及PCR反应体系所需要的缓冲液和酶；所述第二组分包括所述鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的引物和探针PCR反应体系所需要的缓冲液和酶；所述第三组分包括阿克曼氏菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的引物和探针以及PCR反应体系所需要的缓冲液和酶。
表2
Figure BDA0002252566130000081
表3
Figure BDA0002252566130000091
表4
Figure BDA0002252566130000092
Figure BDA0002252566130000101
本发明实施例的多重荧光定量PCR的方法的反应程序如表5所示。
表5
Figure BDA0002252566130000102
本发明实施例通过多次设计和实验，三个组分中，每一组分对应一个反应管，在3个反应管的PCR反应体系里分别检测长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌这8种菌，可以很明显地提高检测的通量，同时也可以很显著地降低检测成本。
试验实施例
分别提取8种标准菌株长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌的的DNA，并检测DNA的浓度；按照荧光定量PCR的反应体系配制反应液，根据测量的DNA浓度，将规定的量的DNA模板加入到PCR反应体系中。PCR反应体系中，DNA模板的用量为25-50ng，引物、探针的用量均为2nM，dNTPs浓度为2mM/mL，Mg2+浓度为20mM/mL。
按照表5设置的扩增程序，对产物进行扩增，并检测每轮扩增的各荧光信号。分别利用第一组分、第二组分以及第三组分分别对8种标准菌株进行多重定量荧光PCR进行检测，以检测第一组分、第二组分以及第三组分的特异性。其中，所利用的标准菌株信息如表6所示。
表6
Figure BDA0002252566130000111
按照表5所示的反应程序进行反应，对8种标准菌株的多重定量荧光PCR特异性测试结果如表7所示。
表7
Figure BDA0002252566130000112
如图1至图3所示，分别是第一组分检测双歧杆菌、第二组分检测鼠李糖乳酸杆菌和罗伊式乳酸菌、第三组分检测阿克曼和嗜酸乳酸杆菌和植物乳酸杆菌的检测结果，对结果进行分析，得到各种菌的具体含量。
临床试验例
使用本发明实施例的用于检测多种菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒测试儿童以及成人样本共计50例，模板DNA的提取以及多重荧光定量PCR的体系及反应条件如试验实施例所示。对儿童以及成人样本检测结果如表8所示。测试样本为合作医疗单位赠送样本，所有样本均自-80℃冰箱中保存，使用西安天隆生物NP968-S核酸提取仪及其配套试剂提取细菌DNA，提取的核酸测定浓度并使用多重荧光定量PCR的体系进行检测。相同样本同步使用Illumina公司miseq测序仪进行16srDNA测序，检测样本中各种菌在属水平上的含量。同时,参考文献报道的方法，和荧光染料,每管检测中只能进行一种菌的检测。
表8
Figure BDA0002252566130000121
Figure BDA0002252566130000131
使用Illumina公司Miseq测序仪进行上述各样本属水平含量检测结果如表9所示，此方法只能检测到属水平含量比例，不能区分属内个种的准确含量，。
表9
Figure BDA0002252566130000141
Figure BDA0002252566130000151
使用荧光定量PCR对上述样本中各菌的含量进行检测，结果如下：由于采用不同的检测方法，此结果与本发明实施例的多重荧光定量检测结果有一定的出入。
表10
Figure BDA0002252566130000152
Figure BDA0002252566130000161
由表8-表9的检测结果可知，本发明实施例的多重荧光定量PCR检测的结果准确，通量高，特异性好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure BDA0002252566130000171
Figure BDA0002252566130000181
Figure BDA0002252566130000191
Figure BDA0002252566130000201
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序列表
<110> 知几未来（成都）临床医学检验有限公司
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<400> 20
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Claims (8)

1.一种用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物和探针，其特征在于包括针对长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌的16SrDNA设计引物对及探针，其中，所述长双歧杆菌、动物双歧杆菌和短双歧杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；
所述长双歧杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:3所示，所述动物双歧杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:4所示，所述短双歧杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:5所示；
所述鼠李糖乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示，所述鼠李糖乳杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:8所示；
所述罗伊氏乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，所述罗伊氏乳杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:11所示；
所述阿克曼氏菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示，所述阿克曼氏菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:14所示；
所述嗜酸乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示，所述嗜酸乳杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:17所示；
所述植物乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示，所述植物乳杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:20所示。
2.一种用于检测多种菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，
所述PCR检测试剂和包括权利要求1所述的用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物和探针。
3.如权利要求2所述的用于检测多种菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于还包括含有Mg2+的PCR反应缓冲液、dNTP、以及PCR扩增酶。
4.如权利要求2所述的用于检测多种菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，
所述检测试剂盒用于同时检测长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌。
5.如权利要求2所述的用于检测多种菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，
所述PCR引物和探针分成第一组分、第二组分以及第三组分；
其中，所述第一组分包括所述长双歧杆菌、短双歧杆菌和动物双歧杆菌的引物和探针；
所述第二组分包括所述鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的引物和探针；
所述第三组分包括阿克曼氏菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的引物和探针。
6.一种检测多种菌的多重荧光定量PCR的方法，其特征在于包括利用长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌的16SrDNA作为模板，以及权利要求1所述的PCR引物和探针进行多重荧光定量PCR的过程。
7.如权利要求6所述的检测多种菌的多重荧光定量PCR的方法，其特征在于，
所述PCR引物和探针分成第一组分、第二组分以及第三组分；
其中，所述第一组分包括所述长双歧杆菌、短双歧杆菌和动物双歧杆菌的引物和探针；
所述第二组分包括所述鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的引物和探针；
所述第三组分包括阿克曼氏菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的引物和探针。
8.如权利要求6所述的检测多种菌的多重荧光定量PCR的方法，其特征在于，
所述多重荧光定量PCR反应过程包括去污染50℃3min，1cycle，预变性95℃，15min，变性95℃20s，35cycle，退火60℃40s，延伸60℃40s。
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