CN114763578B - 检测乳酸杆菌的寡核苷酸及其用于检测乳酸杆菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供检测乳酸杆菌的寡核苷酸及其用于检测乳酸杆菌的方法。具体地，提供用于鉴定植物乳酸杆菌特定菌株的组合物和方法，该特定菌株例如存放在DSMZ登录号为DSM 28632的植物乳酸杆菌植物亚种PS128(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum PS128)。
Description
技术领域
本公开涉及用于检测包括乳酸杆菌属物种的核酸、探针、试剂盒和方法。
背景技术
乳酸菌(Lactic acid bacteria，以下称为LAB)是能够将碳水化合物底物转化为有机酸(主要是乳酸)并产生多种代谢物的细菌。LAB被发现对动物具有许多有益健康的作用。例如，由于LAB具有调节宿主肠道菌群的能力，因此可有效帮助肠道健康，并且可有效预防或治疗腹痛、腹泻、便秘和腹胀。
LAB还可以调节宿主对心理压力的心理和生理反应。压力是引起人和动物情绪障碍和神经化学变化的因素之一，并且可以导致压力引起的疾病，包括焦虑、抑郁和肠道易激综合征(irritable bowel syndrome)。因此，除了传统的精神科药物之外，LAB可以作为补充物，治疗压力引起的疾病，因为已显示LAB可影响宿主的肠脑轴(gut-brain axis，GBA)。例如，鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillus rhamnosus)可通过迷走神经改变健康小鼠的中枢神经系统功能，而遭受压力的大鼠补充婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)益生菌菌株后，可逆转强迫游泳试验(forced swimming test，FST)的行为缺陷，并恢复脑干中基础去甲肾上腺素(noradrenaline，NA)的量。
但是，乳酸菌是一个异质性群体的组成，其存在于与植物和动物物质相关的多种营养丰富的环境中，以及人类的呼吸道、胃肠道和生殖道中。在厚壁菌门(Firmicutesphylum)中，LAB成员属于乳杆菌目(Lactobacillales)，并包括以下各属：气球菌属(Aerococcus)、异球菌属(Alloiococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、乳酸球菌属(Lactococcus)、白念珠球菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、小球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、徘徊球菌属(Vagococcus)以及魏斯氏菌属(Weissella)。其中，乳酸杆菌属是LAB群体中最大的属，共超过100个种。例如，从中国台湾客家族群传统上制备的自然发酵的芥菜产品“福菜”和“酸菜”中，分析了500株LAB分离株，并经鉴定为分属于5个属18个种的119个代表性菌株，包括了肠球菌属(1个种)、乳酸杆菌属(11个种)、白念珠球菌属(3个种)、小球菌属(1个种)和魏斯氏菌属(2个种)。
此外，因为这些细菌为适应不同的环境而演化，LAB的益生菌特性为具有菌株特异性(strain-specific)。因此，有必要能够从菌株中鉴别出特定的LAB菌株，尤其是在发现该LAB菌株具有某些有益健康的特性时。例如，如欧洲专利号EP 2937424B1所示，LAB菌株PS128可以降低受试者的血清皮质酮并减缓由压力引起的疾病或精神疾病。PS128的情绪镇定作用可扩展到其他非人类动物，例如狗(WO2020/156418A1)。LAB菌株PS128还可治疗功能性胃肠道疾病，例如便秘和功能性消化不良(US 10188684B2)。LAB菌株PS128还显示出可通过调节基底神经节中的多巴胺神经传递来预防或治疗运动障碍，例如抽动障碍(ticdisorders)和基底神经节疾病(WO 2018/014225 A1)。此外，LAB菌株PS128也显示出可增加耐力并减少肌肉疲劳或肌肉损伤，进而增强个体的体力和表现(WO 2020/156417 A1)。
因此，需要一种将LAB菌株与其他菌株进行特异性鉴定和区别的方法。
发明内容
本公开提供了一种用于检测乳酸杆菌属的植物乳酸杆菌植物亚种PS128(以下简称PS128)的方法。PS128以DSMZ登录号DSM 28632寄存。该方法包括扩增PS128的核酸序列。该方法进一步包括检测经扩增的产物。本公开也涵盖可作为引物的核酸，该引物可用于扩增PS128基因组核酸序列。在一个实施例中，作为引物的核酸在非任意杂交条件下与PS128的特定序列杂交。在一个实施例中，由引物扩增的PS128核酸序列是PS128菌株独有的。引物可以是化学合成的寡核苷酸，其具有序列5’-TGTTGGGATGTTCTCTGCCT-3’(SEQ ID NO：1)或5’-ACATTTACTGCGTTCTGTGC-3’(SEQ ID NO：2)或相应的互补序列。例如，作为引物的核酸具有包含上述核苷酸的至少12、13、14、15、16、17、18或19个连续核苷酸或该全长序列，只要它们可以与PS128的核酸序列进行特异性杂交并产生扩增产物。在一个实施例中，由上述序列的引物进行扩增的扩增产物约为900个碱基对(bp)，例如890bp、895bp、900bp、905bp、910bp、915bp、920bp、925bp和930bp。在另一个实施例中，扩增产物是915个碱基对。
在一个实施例中，可以在检测试剂盒中提供引物(或探针)。该试剂盒还可以包括上述物种的阳性和阴性对照组。阳性对照组可以是含有待扩增靶标DNA的任何样品，包括菌种本身，且含量超过检测极限。阴性对照组是不包含待扩增的靶标DNA的样品。
在一个实施例中，本公开方法的扩增步骤通过聚合酶链反应(PCR)完成。在一些实施例中，扩增反应可以选自聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(strand displacementamplification，SDA)、核酸序列依赖性扩增(nucleic acid sequence basedamplification，NASBA)、滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)、T7聚合酶介导的扩增、T3聚合酶介导的扩增和SP6聚合酶介导的扩增。
在一个实施例中，通过凝胶电泳、质谱或单链DNA检测技术例如荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)来检测扩增产物。
一方面，本公开提供了反应混合物。在一些实施例中，反应混合物包含：(i)包含核酸模板的样品；(ii)一个或多个寡核苷酸对，其被配置为检测PS128独特基因组序列的存在与否。在一些实施例中，该寡核苷酸对检测PS128的独特基因组序列区域。在一些实施例中，该一个或多个寡核苷酸对包含具有SEQ ID NO：1序列的正向引物、或SEQ ID NO：1的互补序列，和SEQ ID NO：2的反向引物、或SEQ ID NO：2的互补序列。在一些实施例中，该核酸模板包含基因组DNA。在一些实施例中，反应混合物进一步包含聚合酶和三磷酸脱氧核苷(dNTPs)。
另一方面，提供了试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包含寡核苷酸对，其特异性地鉴定PS128独特基因组序列的存在与否。在一些实施例中，一个或多个寡核苷酸对包含具有SEQ ID NO：1序列的正向引物、或SEQ ID NO：1的互补序列，和SEQ ID NO：2的反向引物、或SEQ ID NO：2的互补序列。
根据本公开的以下详细描述，本公开的其他优点和特征将变得显而易见。
附图说明
图1是电泳凝胶的照片，其显示了使用PS128作为样品，并使用具有SEQ ID NO：1序列的正向引物和具有SEQ ID NO：2序列的反向引物的PCR扩增结果(Lane 2)。Lane 1为估计PCR产物大小的100bp的阶梯标准品。Lane 3为使用植物乳酸杆菌(L.plantarum)ATCC14917T作为样品的阴性对照组。
图2是电泳凝胶的照片，其显示了使用具有SEQ ID NO：1序列的正向引物和具有SEQ ID NO：2序列的反向引物对下列样品进行PCR的扩增结果，样品分别为Lane 2为PS128、Lane 3为L.plantarum 299v、Lane 4为L.plantarum LP-115、Lane 5为L.plantarum 14D、Lane 6为L.plantarum LPLDL、Lane 7为L.plantarum TWK-10、Lane 8为L.plantarum GL208以及Lane 9为L.plantarum ATCC 14917T。Lane 1和Lane 10为估计PCR产物大小的100bp的阶梯标准品。
图3是电泳凝胶的照片，其显示了使用具有SEQ ID NO：3序列的正向引物和具有SEQ ID NO：4序列的反向引物进行PCR的扩增结果，样品分别为PS128(Lane 2)、L.plantarum299v(Lane 3)、L.plantarum LP-115(Lane 4)、L.plantarum 14D(Lane 5)、L.plantarum LPLDL(Lane 6)、L.plantarum TWK-10(Lane 7)、L.plantarum GL208(Lane 8)以及L.plantarum ATCC 14917T(Lane 9)，并使用鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillusrhamnosus GG)(Lane 10)作为阴性对照组。Lane 1和Lane 11为估计PCR产物大小的100bp的阶梯标准品。Lane 2至9均显示248bp的带。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语通常与本领域技术人员所理解的具有相同的含义。一般而言，本文所用的命名法和以下所述的细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交的实验室方法是本领域众所周知和常用的。标准技术用于核酸和肽合成。一般而言，酶促反应和纯化步骤根据制造商的说明书进行。本文全文中提供的技术和步骤通常根据本领域的常规方法和各种一般参考文献进行(例如，Green andSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.(2012).ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.及Ausubel,ed.,CurrentProtocols in Molecular Biology,1990-2017,John Wiley Interscience)。本文以下所用的命名法以及分析化学和有机合成的实验方法是本领域众所周知和常用的。使用标准技术方法或其修改版本进行化学合成和化学分析。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文可互换使用，是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸及其聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或键的核酸，这些核苷酸是合成的、自然存在的和非自然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以参考核苷酸相似的方式代谢。这种类似物的示例包括但不限于硫代磷酸酯(phosphorothioates)、氨基磷酸酯(phosphoramidates)、甲基磷酸酯(methylphosphonates)、手性甲基磷酸酯(chiral-methyl phosphonates)、2-O-甲基核糖核苷酸(2-O-methyl ribonucleotides)和肽-核酸(peptide-nucleic acids，PNA)。
除非另有说明，否则特定的核酸序列也涵盖其保守修饰的变体(例如简并的密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，简并的密码子取代可通过产生其中一个或多个所选的(或全部的)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。术语“核酸”可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和聚核苷酸互换使用。
用语“非任意杂交条件”是指将探针与其靶标子序列(target subsequence)杂交但不与其他序列杂交的条件，通常是在核酸的复杂混合物中。非任意条件取决于序列，并且在不同情况下会有所不同。较长的序列在较高温度时进行特异性杂交。广泛的核酸杂交操作指南出自Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,“Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid assays”(1993)。一般而言，非任意条件可以是在限定的离子强度pH下比特定序列的热熔点低约5至10℃的严格条件。Tm是指(在一定的离子强度、pH和核酸浓度下)50％与靶标互补的探针与靶标序列杂交并处于平衡状态的温度(因为靶标序列过量存在，于Tm温度时，50％的探针处于平衡状态)。严格的条件可以是盐浓度小于约1.0M钠离子，通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH 7.0至8.3，且使用短探针(例如10至50个核苷酸)时的温度至少约30℃，使用长探针(例如大于50个核苷酸)时的温度至少约60℃。严格的条件也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺而实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少为背景值的两倍，任选地为杂交背景值的十倍。示例性的严格杂交条件如下：50％甲酰胺、5×生理食盐水-柠檬酸钠(SSC)和1％十二烷基硫酸钠(SDS)在42℃进行反应，或5×SSC和1％的SDS在65℃进行反应，用0.2×SSC洗涤，在65℃用0.1％的SDS洗涤。
如果核酸所编码的多肽实质上相同，则在严格条件下不彼此杂交的核酸仍实质上相同。例如，当一套核酸复本使用遗传密码允许的最大密码子简并取代时，就会发生这种情况。在这种情况下，核酸通常在中等严格的杂交条件下杂交。示例性的“中等严格的杂交条件”包括在37℃使用40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液进行杂交，并在45℃以1×SSC洗涤。杂交呈阳性至少为背景值的两倍。本领域普通技术人员将轻易知道可以利用替代的杂交和洗涤条件来提供相似严格的条件。
用语“选择性地(或特异性地)杂交”是指在特定的杂交条件下，当序列在复杂混合物中存在时(例如，总细胞DNA或RNA，或DNA或RNA库)，该分子仅与特定核苷酸序列结合、双链结合(duplexing)或杂交。
核酸的扩增可以通过Seiki等人(Science,230,1350(1985))所开发的PCR方法进行。该方法包括制备两条寡核苷酸链，在待检测的特定核酸序列区域的两端，一条寡核苷酸链辨识正链(plus strand)并且与其杂交，另一条辨识负链(minus strand)并且与其杂交，使其作为根据模板核苷酸进行聚合反应的引物，核酸样品因为热变性作用(heatdenaturation)而呈单链的形式，将所得双链核酸分开为单链，并再次进行相同的反应。通过重复这个连续过程，介于两个引物之间区域的复本数增加，进而可以检测该区域。
以下具体实施例用于说明本公开。本领域普通技术人员可以轻易地想到本公开的其他优点和效果。本公开还可以通过不同的实施或应用来实现，并且在不脱离本公开的精神下，基于不同观点和应用，也可以对操作说明的细节进行各种修改和改变。
以多个实施例说明本公开，以下实施例不应被视为对本公开内容范围的限制。
实施例
实施例1：使用聚合酶链反应(PCR)鉴定植物乳酸杆菌植物亚种PS128
使用针对PS128独特基因组序列区域进行扩增而设计的特异性引物进行PCR，以区分具有高度序列相似性的菌种。
使用表1中列出的试剂，在表2所示的条件下，使用从PS128萃取的20ng DNA进行PS128的PCR。使用从此菌株萃取的DNA作为模板，对获得的扩增产物进行电泳分析，结果显示于图1，其中使用的引物由以下SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2表示。
正向引物：5’-TGTTGGGATGTTCTCTGCCT-3’(SEQ ID NO：1)
反向引物：5’-ACATTTACTGCGTTCTGTGC-3’(SEQ ID NO：2)
表1.PCR反应溶液成分(每PCR试管25μL)
*Takara Bio U.S.A.,Inc.
表2.PCR条件
如图1所示，Lane 1为DNA阶梯标准品(100至3,000bp)，Lane 2为以PS128的DNA作为DNA模板得到的约900bp的扩增产物，Lane 3为作为阴性对照组的植物乳酸杆菌ATCC14917T的PCR结果。
实施例2：PCR方法检测PS128的特异性
为了测试本公开的PCR方法的特异性，使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2序列的引物扩增植物乳酸杆菌的其他菌株。
总共取得了7种不同的植物乳酸杆菌菌株，如下表3所示。
表3.其他测试的植物乳酸杆菌菌株
使用如上述实施例1所述的具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2序列的一对引物，根据表1和2中所示的PCR试剂和条件，对取得的七株不同的植物乳酸杆菌菌株进行扩增反应。如图2所示，这七株菌株中没有一个显示出大小约为900bp的扩增产物，结果表示该对引物对于鉴定PS128具有菌株特异性。
作为比较，Song等报导了通过PCR鉴定人类肠道植物乳酸杆菌菌株的一对引物(Song YL,Kato N,Liu CX,Matsumiya Y,Kato H,Watanabe K.(2000)“Rapididentification of 11human intestinal Lactobacillus species by multiplex PCRassays using group-and species-specific primers derived from the 16S-23S rRNAintergenic spacer region and its flanking 23S rRNA.”FEMS Microbiol.Lett.187:167-173)，其正向引物序列为5’-ATTCATAGTCTAGTTGGAGGT-3’(SEQ ID NO：3)，反向引物序列为5’-CCTGAACTGAGAGAATTTGA-3’(SEQ ID NO：4)。在与前述相同的条件下，使用Song等报导的引物对7种不同的植物乳酸杆菌菌株和PS128重复进行PCR。结果如图3所示，除鼠李糖乳酸杆菌之外，Song等报导的引物对于所有测试的共八种植物乳酸杆菌产生了类似的带，其PCR产物大小为248bp。
尽管上文已经详细描述了本公开的一些实施例，但是，对于本领域普通技术人员来说，可以在不实质上背离本公开的教导和优点的情况下，对所示的特定实施例进行各种修改和改变。这样的修改和改变包含在阐述于本公开权利要求中的精神和范围内。
生物材料寄存
寄存信息：植物乳酸杆菌植物亚种PS128在2014年4月17日寄存于中国台湾财团法人食品工业发展研究所，并取得登录编号为BCRC910622。
国外寄存信息：植物乳酸杆菌植物亚种PS128在2014年3月31日寄存于德国微生物及细胞培养收集中心，并取得DSMZ的登录号为DSM 28632。
序列表
<110> 益福生医股份有限公司
<120> 检测乳酸杆菌的寡核苷酸及其用于检测乳酸杆菌的方法
<130> 210590CN
<160> 4
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
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cctgaactga gagaatttga 20
Claims (9)
1.一种检测植物乳酸杆菌植物亚种PS128的方法，包括：
提供包含核酸模板的样品；
提供一对核酸作为引物；
以所述引物扩增所述植物乳酸杆菌植物亚种PS128的核酸序列；以及
检测所述扩增的产物，
其中所述一对核酸分别由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增的产物的大小为大约900个碱基对。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增通过选自以下项的一种进行：聚合酶链反应、链置换扩增、核酸序列依赖性扩增、滚环扩增、T7聚合酶介导的扩增、T3聚合酶介导的扩增和SP6聚合酶介导的扩增。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测通过凝胶电泳、质谱或单链DNA检测技术进行。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述单链DNA检测技术包括荧光共振能量转移。
6.一种反应混合物，其包括：
(i) 包含核酸模板的样品；以及
(ii) 一对核酸，其被配置为检测植物乳酸杆菌植物亚种PS128基因组序列的存在与否，
其中所述一对核酸分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
7.根据权利要求6所述的反应混合物，其进一步包含聚合酶和三磷酸脱氧核苷。
8.检测植物乳酸杆菌植物亚种PS128的一对核酸，其中所述一对核酸分别由SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2的核酸序列组成。
9.一种用于鉴定植物乳酸杆菌植物亚种PS128基因组序列的存在的试剂盒，其包含一对核酸，其中，所述一对核酸分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
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2022
- 2022-01-10 CN CN202210020814.6A patent/CN114763578B/zh active Active
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