TW202227640A - 偵測乳酸桿菌的寡核苷酸及其用於偵測乳酸桿菌的方法 - Google Patents

Abstract

本揭露提供用於鑑定植物乳酸桿菌特定菌株的組合物和方法，該特定菌株例如存放在DSMZ登錄號為DSM 28632的植物乳酸桿菌植物亞種PS128(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum PS128)。

Description

偵測乳酸桿菌的寡核苷酸及其用於偵測乳酸桿菌的方法

本揭露係關於用於偵測包括乳酸桿菌屬物種的核酸、探針、試劑套組和方法。

乳酸菌(Lactic acid bacteria，以下稱為LAB)是能夠將碳水化合物受質轉化為有機酸(主要是乳酸)並產生多種代謝物的細菌。LAB被發現對動物具有許多有益健康的作用。例如，由於LAB具有調節宿主腸道菌相的能力，因此可有效幫助腸道健康，並且可有效預防或治療腹痛、腹瀉、便秘和腹脹。

LAB還可以調節宿主對心理壓力的心理和生理反應。壓力是引起人和動物情緒障礙和神經化學變化的因素之一，並且可以導致壓力引起的疾病，包括焦慮、抑鬱和腸躁症(irritable bowel syndrome)。因此，除了傳統的精神科藥物之外，LAB可以作為補充物治療壓力引起的疾病，因為已顯示LAB可影響宿主的腸腦軸(gut-brain axis，GBA)。例如，鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus)可透過迷走神經改變健康小鼠的中樞神經系統功能， 而遭受壓力的大鼠補充嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)益生菌菌株後可逆轉強迫游泳試驗(forced swimming test，FST)的行為缺陷並恢復腦幹中基礎正腎上腺素(noradrenaline，NA)的量。

但是，乳酸菌是一個異質性群體的組成，其存在於與植物和動物物質相關的多種營養豐富的環境中，以及人類的呼吸道、胃腸道和生殖道中。在厚壁菌門(Firmicutes phylum)中，LAB成員屬於乳桿菌目(Lactobacillales)，並包括以下各屬：氣球菌屬(Aerococcus)、異球菌屬(Alloiococcus)、肉桿菌屬(Carnobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、乳酸球菌屬(Lactococcus)、白念珠球菌屬(Leuconostoc)、酒球菌屬(Oenococcus)、小球菌屬(Pediococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、四聯球菌屬(Tetragenococcus)、徘徊球菌屬(Vagococcus)以及魏斯氏菌屬(Weissella)。其中，乳酸桿菌屬是LAB群體中最大的屬，共超過100個種。例如，從台灣客家族群傳統上製備的自然發酵的芥菜產品「福菜」和「酸菜」中，分析了500株LAB分離株，並經鑑定為分屬於5個屬18個種的119個代表性菌株，包括了腸球菌屬(1個種)、乳酸桿菌屬(11個種)、白念珠球菌屬(3個種)、小球菌屬(1個種)和魏斯氏菌屬(2個種)。

此外，因為這些細菌為適應不同的環境而演化，LAB的益生菌特性為具有菌株特異性(strain-specific)。因此，有必要能夠從菌株中鑑別出特定的LAB菌株，尤其是在發現該LAB菌株具有某些有益健康的特性時。例如，如歐洲專利號EP 2937424B1所示，LAB菌株PS128可以降低受試者的血清皮質酮並減緩由壓力引起的疾病或精神疾病。PS128的情緒鎮定作用可擴展到其他非 人類動物，例如狗(WO 2020/156418 A1)。LAB菌株PS128還可治療功能性胃腸道疾病，例如便秘和功能性消化不良(US 10188684B2)。LAB菌株PS128還顯示出可透過調節基底神經節中的多巴胺神經傳遞來預防或治療運動障礙，例如抽動綜合症(tic disorders)和基底神經節疾病(WO 2018/014225 A1)。此外，LAB菌株PS128亦顯示出可增加耐力並減少肌肉疲勞或肌肉損傷，進而增強個體的體力和表現(WO 2020/156417 A1)。

因此，需要一種將LAB菌株與其他菌株進行特異性鑑定和區別的方法。

本揭露提供了一種用於偵測乳酸桿菌屬的植物乳酸桿菌植物亞種PS128(以下簡稱PS128)的方法。PS128以DSMZ登錄號DSM 28632寄存。該方法包括擴增PS128的核酸序列。該方法進一步包括偵測經擴增之產物。本揭露亦涵蓋可作為引子的核酸，該引子可用於擴增PS128基因組核酸序列。在一個實施例中，作為引子的核酸在非任意雜交條件下與PS128的特定序列雜交。在一個實施例中，由引子擴增的PS128核酸序列是PS128菌株獨有的。引子可以是化學合成的寡核苷酸，其具有序列5’-TGTTGGGATGTTCTCTGCCT-3’(SEQ ID NO：1)或5’-ACATTTACTGCGTTCTGTGC-3’(SEQ ID NO：2)或相應的互補序列。例如，作為引子的核酸具有包含上述核苷酸的至少12、13、14、15、16、17、18或19個連續核苷酸或該全長序列，只要它們可以與PS128的核酸序列進行特異性雜交並產生擴增產物。在一個實施例中，由上述序列的引子進行擴增的擴增產物約為900個鹼基對(bp)，例如890bp、895bp、900bp、 905bp、910bp、915bp、920bp、925bp和930bp。在另一個實施例中，擴增產物是915個鹼基對。

在一個實施例中，可以在檢測試劑套組中提供引子(或探針)。該試劑套組還可以包括上述物種的陽性和陰性對照組。陽性對照組可以是含有待擴增靶標DNA的任何樣本，包括菌種本身，且含量超過偵測極限。陰性對照組是不包含待擴增的靶標DNA的樣本。

在一個實施例中，本揭露方法的擴增步驟係透過聚合酶鏈反應(PCR)完成。在一些實施例中，擴增反應可以選自聚合酶鏈反應(PCR)、股替代擴增反應(strand displacement amplification，SDA)、依賴核酸序列擴增法(nucleic acid sequence based amplification，NASBA)、滾環式擴增法(rolling circle amplification，RCA)、T7聚合酶介導的擴增反應、T3聚合酶介導的擴增反應和SP6聚合酶介導的擴增反應。

在一個實施例中，透過凝膠電泳、質譜或單股DNA偵測技術例如螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)來偵測擴增產物。

於一方面，本揭露提供了反應混合物。在一些實施例中，反應混合物包含：(i)包含核酸模板的樣本；(ii)一個或多個寡核苷酸對，其被配置為偵測PS128獨特基因組序列的存在與否。在一些實施例中，該寡核苷酸對偵測PS128的獨特基因組序列區域。在一些實施例中，該一個或多個寡核苷酸對包含具有SEQ ID NO：1序列的正向引子、或SEQ ID NO：1的互補序列，和SEQ ID NO：2的反向引子、或SEQ ID NO：2的互補序列。在一些實施例中，該核酸模板包含基因組DNA。在一些實施例中，反應混合物進一步包含聚合酶和去氧核苷三磷酸(dNTPs)。

在另一方面，提供了試劑套組。在一些實施例中，試劑套組包含寡核苷酸對，其特異性地鑑定PS128獨特基因組序列的存在與否。在一些實施例中，一個或多個寡核苷酸對包含具有SEQ ID NO：1序列的正向引子、或SEQ ID NO：1的互補序列，和SEQ ID NO：2的反向引子、或SEQ ID NO：2的互補序列。

根據本揭露的以下詳細描述，本揭露的其他優點和特徵將變得顯而易見。

圖1是電泳凝膠的照片，其顯示了使用PS128作為樣本，並使用具有SEQ ID NO：1序列的正向引子和具有SEQ ID NO：2序列的反向引子的PCR擴增結果(Lane 2)。Lane 1為估計PCR產物大小的100bp的階梯標準品。Lane 3為使用植物乳酸桿菌(L.plantarum)ATCC 14917^T作為樣本的陰性對照組。

圖2是電泳凝膠的照片，其顯示了使用具有SEQ ID NO：1序列的正向引子和具有SEQ ID NO：2序列的反向引子對下列樣本進行PCR的擴增結果，樣本分別是Lane 2為PS128、Lane 3為L.plantarum 299v、Lane 4為L.plantarum LP-115、Lane 5為L.plantarum 14D、Lane 6為L.plantarum LP_LDL、Lane 7為L.plantarum TWK-10、Lane 8為L.plantarum GL208、以及Lane 9為L.plantarum ATCC 14917^T。Lane 1和Lane 10為估計PCR產物大小的100bp的階梯標準品。

圖3是電泳凝膠的照片，其顯示了使用具有SEQ ID NO：3序列的正向引子和具有SEQ ID NO：4序列的反向引子進行PCR的擴增結果，各樣本分別為PS128(Lane 2)、L.plantarum 299v(Lane 3)、L.plantarum LP-115 (Lane 4)、L.plantarum 14D(Lane 5)、L.plantarum LP_LDL(Lane 6)、L.plantarum TWK-10(Lane 7)、L.plantarum GL208(Lane 8)以及L.plantarum ATCC 14917^T(Lane 9)，並使用鼠李糖乳酸桿菌(Lactobacillus rhamnosus GG)(Lane 10)作為陰性對照組。Lane 1和Lane 11為估計PCR產物大小的100bp的階梯標準品。Lane 2至9均顯示248bp的條帶。

除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語通常與本領域具有通常知識者所理解的具有相同的含義。一般而言，本文所用的命名法和以下所述的細胞培養、分子遺傳學、有機化學和核酸化學以及雜交的實驗室方法是本領域眾所周知和常用的。標準技術用於核酸和胜肽合成。一般而言，酶反應和純化步驟係根據製造商的說明書進行。本文全文中提供的技術和步驟通常係根據本領域的常規方法和各種一般參考文獻進行(例如，Green and Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL,4th ed.(2012).Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.及Ausubel,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,1990-2017,John Wiley Interscience)。本文以下所用的命名法以及分析化學和有機合成的實驗方法是本領域眾所周知和常用的。使用標準技術方法或其修改版本進行化學合成和化學分析。

術語「核酸」和「聚核苷酸」在本文可互換使用，其是指單股或雙股形式的去氧核糖核酸或核糖核酸及其聚合物。該術語涵蓋含有已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或鍵結的核酸，這些核苷酸是合成的、自然存在的和非自然存在的，具有與參考核酸相似的結合特性，並且以參考核苷酸相似的 方式代謝。此類似物的實例包括但不限於硫代磷酸酯(phosphorothioates)、胺基磷酸酯(phosphoramidates)、甲基磷酸酯(methyl phosphonates)、旋光性甲基磷酸酯(chiral-methyl phosphonates)、2-O-甲基核糖核苷酸(2-O-methyl ribonucleotides)和胜肽-核酸(peptide-nucleic acids，PNAs)。

除非另有說明，否則特定的核酸序列也涵蓋其保守修飾的變體(例如簡併的密碼子取代)和互補序列，以及明確指出的序列。具體而言，簡併的密碼子取代可透過產生其中一個或多個所選的(或全部的)密碼子的第三位置被混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來達成(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。術語「核酸」可與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和聚核苷酸互換使用。

用語「非任意雜交條件」是指將探針與其靶標子序列(target subsequence)雜交但不與其他序列雜交的條件，通常是在核酸的複雜混合物中。非任意條件取決於序列，並且在不同情況下會有所不同。較長的序列在較高溫度時進行特異性雜交。廣泛的核酸雜交操作指南出自Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。一般而言，非任意條件可以是在限定的離子強度pH下比特定序列的熱熔點低約5至10℃的嚴格條件。Tm是指(在一定的離子強度、pH和核酸濃度下)50%與靶標互補的探針與靶標序列雜交並處於平衡狀態的溫度(因為靶標序列過量存在，於Tm溫度時，50%的探針處於平衡狀態)。嚴格的條件可以是鹽濃度小於約1.0M鈉離子，通常約0.01至1.0M鈉離子濃度(或其他鹽)，pH 7.0至8.3，且使用 短探針(例如10至50個核苷酸)時的溫度至少約30℃，使用長探針(例如大於50個核苷酸)時的溫度至少約60℃。嚴格的條件也可以透過添加去穩定劑如甲醯胺而達成。對於選擇性或特異性雜交，陽性訊號至少是背景值的兩倍，可選地是雜交背景值的十倍。例示性嚴格的雜交條件如下：50%甲醯胺、5×生理食鹽水-檸檬酸鈉(SSC)和1%十二烷基硫酸鈉(SDS)、在42℃下進行反應，或5×SSC、1% SDS、在65℃下進行反應，用0.2×SSC洗滌，在65℃下用0.1% SDS洗滌。

如果核酸所編碼的多肽實質上相同，則在嚴格條件下不彼此雜交的核酸仍實質上相同。例如，當一套核酸複本是使用遺傳密碼允許的最大密碼子簡併取代時，就會發生這種情況。在這種情況下，核酸通常在中等嚴格的雜交條件下雜交。例示性的「中等嚴格的雜交條件」包括在37℃下使用40%甲醯胺、1M NaCl、1% SDS的緩衝液進行雜交，並在45℃下以1×SSC洗滌。雜交呈陽性至少是背景值的兩倍。本領域具有通常知識者將輕易知道可以利用替代的雜交和洗滌條件來提供相似嚴格的條件。

用語「選擇性地(或特異性地)雜交」是指在特定的雜交條件下，當序列在複雜混合物中存在時(例如，總細胞DNA或RNA，或DNA或RNA庫)，該分子僅與特定核苷酸序列結合、雙股結合(duplexing)或雜交。

核酸的擴增可以透過Seiki等人(Science,230,1350(1985))所開發的PCR方法進行。該方法包括製備兩股寡核苷酸，在待偵測的特定核酸序列區域的兩端，一股寡核苷酸辨識正股(plus strand)並且與其雜交，另一股辨識反股(minus strand)並且與其雜交，使其作為根據模板核苷酸進行聚合反應的引子，核酸樣本因為熱變性作用(heat denaturation)而呈單股的形式，將所 得雙股核酸分開為單股，並再次進行相同的反應。透過重複這個連續過程，介於兩個引子之間區域的複本數增加，進而可以偵測該區域。

以下具體實施例用於說明本揭露。本領域具有通常知識者可以輕易地想到本揭露的其他優點和效果。本揭露還可以透過不同的實施或應用來實現，並且在不脫離本揭露的精神下，基於不同觀點和應用，也可以對操作說明的細節進行各種修改和改變。

以多個實施例說明本揭露，以下實施例不應被視為對本揭露內容範圍的限制。

實施例

實施例1：使用聚合酶鏈反應(PCR)鑑定植物乳酸桿菌植物亞種PS128

使用針對PS128獨特基因組序列區域進行擴增而設計的特異性引子進行PCR，以區分具有高度序列相似性的菌種。

使用表1中列出的試劑，在表2所示的條件下，使用從PS128萃取的20ng DNA進行PS128的PCR。使用從此菌株萃取的DNA作為模板，對獲得的擴增產物進行電泳分析，結果顯示於圖1，其中使用的引子係由以下SEQ ID NO：1和SEQ ID NQ：2表示。

正向引子：5’-TGTTGGGATGTTCTCTGCCT-3’(SEQ ID NO：1)

反向引子：5’-ACATTTACTGCGTTCTGTGC-3’(SEQ ID NO：2)

表1、PCR反應溶液成分(每PCR試管25μL)

*Takara Bio U.S.A., Inc.

表2、PCR條件

如圖1所示，Lane 1為DNA階梯標準品(100至3,000bp)，Lane 2為以PS128的DNA作為DNA模板得到的約900bp的擴增產物，Lane 3為作為陰性對照組的植物乳酸桿菌ATCC 14917^T的PCR結果。

實施例2：PCR方法偵測PS128的特異性

為了測試本揭露的PCR方法的特異性，使用具有SEQ ID NO：1和2序列的引子擴增植物乳酸桿菌的其他菌株。

總共取得了7種不同的植物乳酸桿菌菌株，如下表3所示。

表3、其他測試的植物乳酸桿菌菌株

使用如上述實施例1所述之具有SEQ ID NO：1和2序列的一對引子，根據表1和2中所示的PCR試劑和條件，對取得的七株不同的植物乳酸桿菌菌株進行擴增反應。如圖2所示，這七株菌株中沒有一個顯示出大小約為900bp的擴增產物，結果表示該對引子對鑑定PS128具有菌株特異性。

作為比較，Song等報導了透過PCR鑑定人類腸道植物乳酸桿菌菌株的一對引子(Song YL,Kato N,Liu CX,Matsumiya Y,Kato H,Watanabe K.(2000)“Rapid identification of 11 human intestinal Lactobacillus species by multiplex PCR assays using group- and species-specific primers derived from the 16S-23S rRNA intergenic spacer region and its flanking 23S rRNA.”FEMS Microbiol.Lett.187：167- 173)，其正向引子序列為5’-ATTCATAGTCTAGTTGGAGGT-3’(SEQ ID NO：3)，反向引子序列為5’-CCTGAACTGAGAGAATTTGA-3’(SEQ ID NO：4)。在與前述相同的條件下，使用Song等報導的引子對7種不同的植物乳酸桿菌菌株和PS128重複進行PCR。結果如圖3所示，除鼠李糖乳酸桿菌之外，Song等報導的引子對於所有測試共八株的植物乳酸桿菌產生了類似的條帶，其PCR產物大小為248bp。

儘管上文已經詳細描述了本揭露的一些實施例，但是，對於本領域具有通常知識者來說，可以在不實質上背離本揭露的教示和優點的情況下，對所示的特定實施例進行各種修改和改變。這樣的修改和改變包含在闡述於本揭露申請專利範圍中的精神和範圍內。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊：植物乳酸桿菌植物亞種PS128係於民國103年4月17日寄存於財團法人食品工業發展研究所，並取得登錄編號為BCRC 910622。

國外寄存資訊：植物乳酸桿菌植物亞種PS128係於2014年3月31日寄存於德國微生物及細胞培養收集中心，並取得DSMZ的登錄號為DSM 28632。

<110> 益福生醫股份有限公司

<120> 偵測乳酸桿菌的寡核苷酸及其用於偵測乳酸桿菌的方法

<130> 115684

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 2

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 比對引子

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 比對引子

<400> 4

Claims (12)

1. 一種偵測植物乳酸桿菌植物亞種PS128的方法，包括：

   提供包含核酸模板的樣本；

   提供一對核酸作為引子；

   以該引子擴增該植物乳酸桿菌植物亞種PS128的核酸序列；以及

   偵測該擴增的產物，

   其中，該對核酸分別包含SEQ ID NO：1和2的至少12個連續核苷酸。
2. 如請求項1所述的方法，其中，該對核酸分別包含SEQ ID NQ：1和2的至少15個連續核苷酸。
3. 如請求項1所述的方法，其中，該對核酸分別包含SEQ ID NO：1和2的至少18個連續核苷酸。
4. 如請求項1所述的方法，其中，該對核酸分別由SEQ ID NO：1和2的核酸序列組成。
5. 如請求項1所述的方法，其中，該擴增的產物的大小為大約900個鹼基對。
6. 如請求項1所述的方法，其中，該擴增係透過選自以下的一種進行的：聚合酶鏈反應、股替代擴增反應、依賴核酸序列擴增法、滾環式擴增法、T7聚合酶介導的擴增反應、T3聚合酶介導的擴增反應和SP6聚合酶介導的擴增反應。
7. 如請求項1所述的方法，其中，該偵測係透過凝膠電泳、質譜或單股DNA偵測技術進行。
8. 如請求項7所述的方法，其中，該單股DNA偵測技術包括螢光共振能量轉移。
9. 一種反應混合物，其包括：

   (i)包含核酸模板的樣本；以及

   (ii)一對核酸，其被配置為偵測植物乳酸桿菌植物亞種PS128基因組序列的存在與否，

   其中，該對核酸分別包含SEQ ID NO：1和2的至少12個連續核苷酸。
10. 如請求項9所述的反應混合物，其進一步包含聚合酶和去氧核苷三磷酸。
11. 一種寡核苷酸，其包含SEQ ID NO：1或2的至少12個連續核苷酸。
12. 一種用於鑑定植物乳酸桿菌植物亞種PS128基因組序列存在的試劑套組，其包含一對核酸，其中，該對核酸分別包含SEQ ID NO：1和2的至少12個連續核苷酸。

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