CN110029155A - 一种基于荧光定量pcr组合式肠道细菌检测方法 - Google Patents

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李佩铷
边高瑞
贾长生
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Abstract

本发明提供了一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法，包括前期准备、PCR产物纯化且定量、对各菌种定量采用荧光定量PCR法进行标准曲线的绘制、样本中各菌种含量测定的步骤。本发明的荧光定量PCR组合式检测方法，对肠道细菌进行检测，操作简便、耗时短、灵敏度高，极大的提高了检测效率同时，增加了检测的精准度，是一种值得推广且经得住考验的方法。

Description

一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法。
背景技术
肠道细菌，并非每一种细菌都是"凶神恶煞"，肠道细菌能提高人的认知能力。同时肠道细菌总数庞大，且过于复杂，对肠道细菌的研究目前还不能研究的足够充分，生物领域中并不缺乏对肠道细菌的研究和检测。但是如何快速、准确地检测肠道细菌中的含量及菌种仍有极高的挑战和技术难题。
发明内容
为了快速、准确地检测肠道细菌的含量，本发明提供了一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法，具体步骤为：
(1)前期准备：
选取肠道内混合发酵液提取gDNA为模板，利用各菌种特异性引物扩增目的条带，纯化后进行琼脂糖凝胶电泳检测实验，其中孔道内获得物依次为：罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、、细菌通用阴性对照、DNA Marker2000；
(2)PCR产物纯化且定量：
对步骤(一)中获得孔道内菌株，进行PCR产物纯化且定量；
(3)对各菌种定量采用荧光定量PCR法进行标准曲线的绘制：
各菌株PCR产物10倍梯度稀释至10-8，取10-2-10-8梯度作为标准曲线各梯度下模板浓度的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制标准曲线，其中每个梯度设置三个重复周期，一个周期为：第一温度(90-95)℃下(20-30)s、第二温度(90-95)℃下(5-10)s、第三温度(60-63)℃下(0.8-1.5)min，设置第二、第三温度下循环30-40次；
(4)样本中各菌种含量测定
将样本中各菌种的Ct值与步骤(3)获得标准曲线对比，进行线性拟合，获得混合发酵液中肠道细菌各菌种的组成比例。
作为改进，步骤(一)中的反应体系为：总体积为40-65μl，包括Taq酶：0.15-0.45μl、Buffer：2-7μl、dNTP：3-6μl、F(10μM)：2-3.5μl、R(10μM):1.5-3μl、Template：0.1-0.9μl、ddH2O：30-50μl。
作为改进，步骤(三)中反应体系为：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix：8-13μl、F(10μM)：0.2-0.6μl、R(10μM):0.2-0.6μl、50×ROX ReferenceDye 1：0.2-0.6μl、TemplateDNA：0.5-1.5μl、ddH2O：15-25μl。
有益效果：本发明提供的荧光定量PCR组合式检测方法，对肠道细菌进行检测，操作简便、耗时短、灵敏度高，极大的提高了检测效率同时，增加了检测的精准度，是一种值得推广且经得住考验的方法。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为本发明琼脂糖凝胶电泳检测图。
图2为本发明罗伊氏乳杆菌荧光定量PCR法标准曲线图。
图3为本发明鼠李糖乳杆菌荧光定量PCR法标准曲线图。
图4为本发明乳双歧杆菌荧光定量PCR法标准曲线图。
图5为本发明嗜酸乳杆菌荧光定量PCR法标准曲线图。
图6为本发明干酪乳杆菌荧光定量PCR法标准曲线图。
图7为本发明细菌通用荧光定量PCR法标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明中F、R为引物，选自：
实施例1
选取混合发酵液提取gDNA为模板，利用各菌种特异性引物扩增目的条带，纯化后进行琼脂糖凝胶电泳检测实验，进行纯化后PCR产物定量获得如表1所示：
表1PCR产物定量后浓度(ng.μl-1)
对各菌种进行荧光定量PCR法标准曲线的绘制获得表2-8。
表2各菌种荧光定量PCR法标准曲线数据
表3罗伊氏乳杆菌荧光定量PCR法标准曲线数据
表4鼠李糖乳杆菌荧光定量PCR法标准曲线数据
表5乳双歧杆菌荧光定量PCR法标准曲线数据
表6嗜酸乳杆菌荧光定量PCR法标准曲线数据
表7干酪乳杆菌荧光定量PCR法标准曲线数据
表8细菌通用荧光定量PCR法标准曲线数据
将样本中各菌种的Ct值与获得标准曲线对比，进行线性拟合，获得数据见表9所示。
表9各菌种Ct值与标准值比对数据
进而获得混合发酵液中肠道细菌各菌种的组成比例。由此得知，本发明的测量方法精准度高且可操作性强。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法，其特征在于：具体步骤为：
(1)前期准备：
选取肠道内混合发酵液提取gDNA为模板，利用各菌种特异性引物扩增目的条带，纯化后进行琼脂糖凝胶电泳检测实验，其中孔道内获得物依次为：罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、细菌通用、细菌通用阴性对照、DNA Marker2000；
(2)PCR产物纯化且定量：
对步骤(一)中获得孔道内菌株，进行PCR产物纯化且定量；
(3)对各菌种定量采用荧光定量PCR法进行标准曲线的绘制：
各菌株PCR产物10倍梯度稀释至10-8，取10-2-10-8梯度作为标准曲线各梯度下模板浓度的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制标准曲线，其中每个梯度设置三个重复周期，一个周期为：第一温度(90-95)℃下(20-30)s、第二温度(90-95)℃下(5-10)s、第三温度(60-63)℃下(0.8-1.5)min，设置第二、第三温度下循环30-40次；
(4)样本中各菌种含量测定：
将样本中各菌种的Ct值与步骤(3)获得标准曲线对比，进行线性拟合，获得混合发酵液中肠道细菌各菌种的组成比例。
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法，其特征在于：步骤(一)中的反应体系为：总体积为40-65μl，包括Taq酶：0.15-0.45μl、Buffer：2-7μl、dNTP：3-6μl、F(10μM)：2-3.5μl、R(10μM):1.5-3μl、Template：0.1-0.9μl、ddH2O：30-50μl。
3.根据权利要求1所述的一种基于荧光定量PCR组合式肠道细菌检测方法，其特征在于：步骤(三)中反应体系为：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix：8-13μl、F(10μM)：0.2-0.6μl、R(10μM):0.2-0.6μl、50×ROX ReferenceDye1：0.2-0.6μl、Template DNA：0.5-1.5μl、ddH2O：15-25μl。
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