CN105378102A - 作为高甘油三酯血症标记物的大肠杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过对受试者胃肠系统中的肠细菌如大肠杆菌定量来预测所述受试者患上高甘油三酯血症的风险。本发明还涉及治疗患有高甘油三酯血症或具有患上所述病症的风险的受试者。

Description

作为高甘油三酯血症标记物的大肠杆菌
背景技术
血脂异常是脂蛋白代谢疾病，其特征在于血液中存在的脂质(如，胆固醇和/或脂肪)的量异常。在发展中国家，血脂异常尤其是高脂血症，例如高甘油三酯血症(HTG)、高胆固醇血症、高脂蛋白血症或它们的组合的患病率很高。例如，在美国，定义为血浆甘油三酯水平大于1.2mmol/升(150mg/dl)的高甘油三酯血症的患病率在女性中为约27.6％，在男性中为约35.1％(MozumdarandLiguori,DiabetesCare,34(1):216-219(2011)(Mozumdar和Liguori，《糖尿病护理》，第34卷，第1期，第216-219页，2011年)；Fordetal,JAMA,287(3):356-359(2002)(Ford等人，《美国医学会杂志》，第287卷，第3期，第356-359页，2002年))。
HTG可以是甘油三酯生成量增加、甘油三酯分解代谢减少乃至它们二者引起的。高甘油三酯血症的典型风险因素包括脂肪性食物的消费、酒精的过量摄取、久坐生活方式、年龄、肥胖症、和/或代谢病的存在。其他风险因素包括2型糖尿病、遗传疾病(如，家族性高甘油三酯血症、家族性复合高脂血症、家族性异常β脂蛋白血症)、某些药物(如，类固醇、β-阻滞剂和高雌激素口服避孕药)以及其他疾病(如，甲状腺机能减退、高同型半胱氨酸血症、库欣氏(Cushing)病、其他内分泌、肾脏或肝脏疾病和自体免疫性疾病)。
通常，HTG根据基于空腹血浆甘油三酯(TG)水平的分立类别进行诊断。例如，美国内分泌学会(EndocrineSociety)分类系统定义正常TG为<1.7mmol/升(<150mg/dl)，轻度HTG为1.7-2.3mmol/升(150-199mg/dl)，中度HTG为2.3-11.2mmol/升(200-900mg/dl)，重度HTG为11.2-22.4mmol/升(1000-1999mg/dl)，以及极重度HTG为>22.4mmol/升(>2000mg/dl)。
已表明，肠道微生物群落在代谢病例如肥胖症、糖尿病和心血管疾病中发挥作用。不受任何具体理论的约束，据信肠道细菌可通过存在于细菌细胞壁上的脂多糖(LPS)诱导宿主个体中的先天免疫应答，导致宿主炎症和其他生理事件的级联反应。另外，据认为，膳食化合物的细菌代谢物可调控宿主中的生物活动，从而促成代谢病。
HTG的典型标记物缺乏体现个体患病风险水平的特异性。遗憾的是，目前没有预测个体患上代谢性高甘油三酯血症的风险的快速且准确的诊断方法。本发明满足了此需要，还提供了相关优点。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供预测受试者是否具有患上高甘油三酯血症的风险的方法。所述方法包括以下步骤：a)转换得自所述受试者的样品，以检测所述样品中大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)的水平；以及b)确定所述样品中与对照样品相比更高的大肠杆菌水平预测所述受试者具有患上高甘油三酯血症的风险。
在一些方面，所述样品是全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪便、泪液、任何其他体液、组织样品(如，活检样品)及其细胞提取物(如，红细胞提取物)。在优选的方面，所述样品是粪便样品。
在一些方面，检测大肠杆菌的水平包括进行核酸扩增。在其他方面，检测大肠杆菌的水平包括菌落计数。
在一些方面，所述对照样品来自健康对照受试者或不具有患上高甘油三酯血症的风险的受试者。
在一些实施例中，所述预测受试者是否具有患上高甘油三酯血症的风险的方法还包括如果所述受试者具有患上高甘油三酯血症的风险，则推荐施用治疗有效量的治疗药物、抗生素、噬菌体、膳食干预、营养干预或它们的组合的步骤。
在一些方面，所述治疗药物选自苯扎贝特(Bezalip)、环丙贝特(Modalim)、氯贝特、吉非贝齐(Lopid)、非诺贝特(TriCor)和它们的组合。
在一些方面，所述膳食干预选自碳水化合物的膳食限制、脂肪的膳食限制和它们的组合。
在一些方面，所述营养干预选自植物甾醇、牛磺酸、益生菌、碳水化合物、蛋白质、膳食纤维、植物营养素和它们的组合。在一些情况下，所述营养干预选自植物甾醇、长链多不饱和脂肪酸、牛磺酸、益生菌、碳水化合物、抗性淀粉、β-环糊精、蛋白质、大豆蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、膳食纤维、车前子、果胶、β-葡聚糖、果寡糖、菊粉、植物营养素、异黄酮、多酚、白藜芦醇、安石榴苷和它们的组合。
在另一个实施例中，本发明提供用于治疗受试者中的高甘油三酯血症的方法。所述方法包括以下步骤：a)转换得自所述受试者的样品，以检测所述样品中大肠杆菌的水平；b)确定所述样品中与对照样品相比更高的大肠杆菌水平表明诊断到所述受试者中有高甘油三酯血症；以及c)施用治疗有效量的用于治疗高甘油三酯血症的治疗药物、抗生素、膳食干预、营养干预或它们的组合。
在一些方面，所述样品是全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪便、泪液、任何其他体液、组织样品(如，活检样品)及其细胞提取物(如，红细胞提取物)。在优选的方面，所述样品是粪便样品。
在一些方面，检测大肠杆菌的水平包括进行核酸扩增。在其他方面，检测大肠杆菌的水平包括菌落计数。
在一些方面，所述对照样品来自健康对照受试者或不具有患上高甘油三酯血症的风险的受试者。
在一些方面，所述治疗药物选自苯扎贝特(Bezalip)、环丙贝特(Modalim)、氯贝特、吉非贝齐(Lopid)、非诺贝特(TriCor)和它们的组合。
在一些方面，所述膳食干预选自碳水化合物的膳食限制、脂肪的膳食限制和它们的组合。
在一些方面，所述营养干预选自植物甾醇、牛磺酸、益生菌、碳水化合物、蛋白质、膳食纤维、植物营养素和它们的组合。
在又一个实施例中，本发明提供用于诊断受试者中的高甘油三酯血症的方法，其中所述方法包括a)转换得自所述受试者的样品，以检测所述样品中大肠杆菌的水平；以及b)确定所述样品中与对照样品相比更高的大肠杆菌水平表明诊断到所述受试者中有高甘油三酯血症。
在一些方面，所述样品是全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪便、泪液、任何其他体液、组织样品(如，活检样品)及其细胞提取物(如，红细胞提取物)。在优选的方面，所述样品是粪便样品。
在一些方面，检测大肠杆菌的水平包括进行核酸扩增。在一些方面，核酸扩增使用具有如SEQIDNO:3和4所示的序列的寡核苷酸进行。在其他实施例中，核酸扩增包括肠细菌基因间重复共有序列PCR(repetitiveintergenicconsensusPCR)或基因外重复PCR(repetitiveextragenicPCR)。
通过以下具体实施方式，本发明的其他目标、特征和优点对本领域的技术人员将更显而易见。
具体实施方式
I.引言
高甘油三酯血症(HTG)是空腹血清甘油三酯(TG)水平由于甘油三酯或富含甘油三酯的脂蛋白颗粒的过量生成和/或移除受损而升高的病症。它可由造成TG代谢紊乱的遗传缺陷导致，或可由其他脂质和代谢病症导致，包括高脂肪饮食、酒精的过量摄取、某些药物、糖尿病、甲状腺机能减退、胰岛素抵抗和高血压。
由于目前可用的生物标记物缺乏特异性，预测个体患上HTG的风险可能具有挑战性。此外，已建议，在代谢病和心血管疾病的其他风险因素(包括高脂血症的继发性原因，血脂异常和心血管疾病、肥胖症、高血压、葡萄糖代谢异常、肝功能异常的家族史等)的背景中，应始终对甘油三酯水平升高的存在情况进行评估。
已发现，个体胃肠系统中大肠杆菌水平的升高是患上高甘油三酯血症的预兆。本发明提供用于评估个体患高甘油三酯血症的风险，以及用于提供治疗该疾病的有效疗法的方法。
在某些方面，本发明的实施利用到分子生物学领域的技术。公开了在本发明中有用的一般方法的基础教科书包括SambrookandRussell,MolecularCloning,ALaboratoryManual(3rded.2001)(Sambrook和Russell，《分子克隆：实验室手册》，第3版，2001年)；Kriegler,GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual(1990)(Kriegler，《基因转移和表达：实验室手册》，1990年)和CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubeletal.,eds.,1994))(《分子生物学实验室指南》，Ausubel等人编，1994年)。
II.定义
如本文所用，以下术语具有归属于它们的含义，除非另外指明。
“血脂异常”包括定义为血浆胆固醇、甘油三酯(TG)或它们二者升高，或高密度脂蛋白水平低的任何病症。血脂异常可促使动脉硬化症的发展，并因而增加动脉硬化症的风险。有不同种类的血脂异常，它们通过升高的脂质和脂蛋白的模式区分。I类定义为乳糜微粒和TG升高，IIa类定义为低密度脂蛋白(LDL)和胆固醇升高，IIb类定义为极低密度脂蛋白(VLDL)和LDL升高以及TG和胆固醇升高，III类定义为VLDL和乳糜微粒残留物升高以及TG和胆固醇升高，IV类定义为VLDL和TG升高，以及V类定义为乳糜微粒和VLDL升高以及TG和胆固醇升高。
术语“高甘油三酯血症”包括高于一定的截止阈值点或与年龄和性别匹配的健康对照相比增加或升高的空腹血浆甘油三酯(TG)测量值。该诊断可被定义为当血浆TG浓度升至高于阈值例如针对个体年龄和性别的第90或95百分位数之时。
血浆甘油三酯的两个主要来源是外源来源(来自膳食脂肪)并在乳糜微粒中携带，以及内源来源(来自肝脏)并在极低密度脂蛋白(VLDL)颗粒中携带。
术语“样品”包括得自个体的任何生物样本。用于本发明的合适样品包括但不限于全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪便、泪液、任何其他体液、组织样品(如，活检样品)及其细胞提取物(如，红细胞提取物)。在一个优选的实施例中，样品是粪便样品。
术语“个体”、“受试者”或“患者”通常包括人，但也包括其他动物，例如其他灵长类、啮齿类、犬科类、猫科类、马科类、羊类、猪类等等。
术语“转换样品”包括样品的物理或化学变化，以提取和/或获得本文所定义的标记物(如，大肠杆菌或其他细菌)。为测量标记物而对样品进行的提取、操作、化学沉淀、ELISA、免疫萃取、物理或化学改性均构成转换。只要样品在转换步骤之前和之后不相同，变化即为转换。
术语“分类”包括使样品与疾病状态“关联”或“归类”。在某些情况下，“分类”基于统计证据、经验性证据或它们二者。在某些实施例中，分类的方法和系统使用所谓的具有已知疾病状态的样品训练集。训练数据集一旦建立，即作为未知样品的特征的比较基础、模型或模板，以对样品的未知疾病状态进行分类。在某些情况下，对样品分类类似于诊断样品的疾病状态。在某些其他情况下，对样品分类类似于将样品的疾病状态与另一种疾病状态进行区分。
术语“膳食干预”包括与个体的饮食或膳食摄取相关的处理。该处理包括涉及以下方面的饮食相关组分、限制、建议：预防个体的缺陷、治疗个体的疾病或医学病症，或更一般地说，减轻个体的症状，管理个体疾病的进展或为个体提供营养、生理或医疗益处。膳食干预的例子包括但不限于减少碳水化合物、减少脂肪、重量控制、减少酒精消费、增加身体活动和保持低脂肪或极低脂肪饮食。
术语“营养干预”包括与个体的营养摄取相关的处理。该处理包括涉及以下方面的营养相关组分、补充剂、建议：预防个体的缺陷、治疗个体的疾病或医学病症，或更一般地说，减轻个体的症状，管理个体疾病的进展或为个体提供营养、生理或医疗益处。营养干预的例子包括但不限于ω-3脂肪酸(如，鱼油)、植物甾醇、长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)、牛磺酸、益生菌(如，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)等)、碳水化合物(如，抗性淀粉、β-环糊精等)、蛋白质(如，大豆蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白等)、膳食纤维(如，车前子、果胶、β-葡聚糖、果寡糖、菊粉等)、植物营养素(如，异黄酮、葡萄多酚、白藜芦醇、石榴中的安石榴苷、绿茶、乌龙茶等)、类二十烷酸、棕榈油酸和它们的组合。
术语“治疗有效量或剂量”包括能够在对其有需要的受试者中实现治疗效果的药物的剂量。例如，可用于治疗高甘油三酯血症的药物的治疗有效量可以是能够预防或缓解与高甘油三酯血症相关的一种或多种症状的量。确切的量可由本领域技术人员使用已知技术确定(参见例如Lieberman,PharmaceuticalDosageForms(vols.1-3,1992)(Lieberman，《药物剂型》，第1-3卷，1992年)；Lloyd,TheArt,ScienceandTechnologyofPharmaceuticalCompounding(1999)(Lloyd，《药物配混的艺术、科学和技术》，1999年)；Pickar,DosageCalculations(1999)(Pickar，《剂量计算》，1999年)和Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,20thEdition,2003,Gennaro,Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins(《雷明顿：制药科学和实践》，第20版，2003年，Gennaro编，利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司))。
III.具体实施方式
本文提供用于通过测量样品例如来自患者的粪便样品中大肠杆菌(如，肠道大肠杆菌)的水平，来预测患者中的高甘油三酯血症(HTG)的方法。本发明还提供用于治疗具有患上HTG的风险或易于患上HTG的患者的方法。因此，本发明提供可用于指导治疗决策的准确的HTG诊断预测。
A.检测大肠杆菌
1.样品的制备
本文描述的方法涉及测量存在于个体的胃肠组织尤其是粪便样品中的大肠杆菌的量或大肠杆菌特异性DNA或RNA的量，作为检测高甘油三酯血症的存在情况、评估其发展风险和/或监控其进展的方法。在一些实施例中，实施本发明的第一个步骤是从个体获得粪便样品并从样品提取核酸。
可从待使用本发明的方法测试或监控患有血脂异常例如高甘油三酯血症的个体获得样品。样品可获自：粪便；患者组织，其可以是粘膜组织，包括但不限于口腔、鼻腔、肺和肠粘膜组织；或体液，如，血液、痰、尿液、粘液、淋巴液和泪液。在一些实施例中，收集适量的样品，并且在进一步制备前可根据标准规程储存。
在一些情况下，将样品悬浮于缓冲液或培养基中，然后以各种稀释度接种在半选择性或选择性培养基(如，Drigalski生长培养基)上，以富集细菌。
根据本发明对存在于个体胃肠样品中的大肠杆菌RNA或DNA的分析，可使用如粪便或胃肠细胞进行。用于制备供核酸提取用的组织样品的方法是本领域的技术人员熟知的。例如，应首先处理受试者的胃肠细胞样品，从而破坏细胞膜以便释放细胞内所含的核酸。
2.核酸的提取和定量
从生物样品提取RNA或DNA的方法是熟知的，并且在分子生物学领域例行实施，参见例如Sambrook和Russell，出处同上。应消除RNA污染以避免干扰DNA分析。市售的试剂盒如，QIAampDNA粪便微型试剂盒(Qiagen，马里兰州日尔曼敦(Germantown,MD))、UltraClean粪便DNA分离试剂盒(MOBIOLaboratories，加州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))、MoBioDNA分离试剂盒((MOBIOLaboratories，加州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))、PowerMicrobiomeTMRNA分离试剂盒(MOBIOLaboratories，加州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))、粪便核酸分离试剂盒(NorgenBiotekCorp.，加拿大安大略省)也可用于提取细菌核酸。
3.核酸检测和定量
可用于确定样品中大肠杆菌DNA或RNA水平(量)(从而确定大肠杆菌的水平)的测定法包括但不限于电泳分析、限制性片段长度多态性分析、序列分析、杂交分析、核糖核酸分型分析、核糖体DNA异质性分析和PCR分析，包括定量PCR(qPCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)、基于PCR的变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)、基因外重复回文序列PCR(rep-PCR)和肠细菌基因间重复共有序列PCR(ERIC-PCR)。这些测定法已有明确描述，并且标准方法是本领域已知的。参见例如Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.NewYork(1984-2008),Chapter7andSupplement47(Ausubel等人，《分子生物学实验室指南》，约翰·威利父子出版公司，纽约，1984-2008，第7章和附录47)；Theophilusetal.,“PCRMutationDetectionProtocols，”HumanaPress,(2002)(Theophilus等人，《PCR突变检测方案》，休玛纳出版社，2002年)；Innisetal.,PCRProtocols,SanDiego,AcademicPress,Inc.(1990)(Innis等人，《PCR方案》，圣迭戈，学术出版社，1990年)；Maniatisetal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLab.,NewYork,(1982)(Maniatis等人，《分子克隆：实验室手册》，冷泉港实验室，纽约，1982年)；Ausubeletal.,CurrentProtocolsinGeneticsandGenomics,JohnWiley&Sons,Inc.NewYork(1984-2008)(Ausubel等人，《遗传学和基因组学实验指南》，约翰·威利父子出版公司，纽约，1984-2008)和Ausubeletal.,CurrentProtocolsinHumanGenetics,JohnWiley&Sons,Inc.NewYork(1984-2008)(Ausubel等人，《人类遗传学实验指南》，约翰·威利父子出版公司，纽约，1984-2008)；这些文献出于所有目的均整体以引用方式并入本文中。
在一些实施例中，样品中的大肠杆菌水平通过标准核酸扩增法例如PCR分析进行定量。在一个实施例中，使用以下寡核苷酸引物对：5'-CATGCCGCGTGTATGAAGAA(SEQIDNO:3)和5'-CGGGTAACGTCAATGAGCAAA(SEQIDNO:4)。反应条件可包括以下步骤：50℃变性2min，PCR扩增如下：95℃10min、95℃15s、60℃1min共40个循环。可通过本领域已知的标准方法检测和测量扩增产物。
在另一个实施例中，将16SrRNA基因特异性PCR用于检测大肠杆菌水平。例如，细菌16SrRNA的高变区可用区域特异性引物扩增以生成扩增子。
ERIC-PCR是指这样一种类型的PCR分析，其中扩增产物用特定的肠细菌重复序列的引物生成(参见例如Dalla-Costaetal.,J.Med.Microbiol.,47:227-234(1998)(Dalla-Costa等人，《医学微生物学杂志》，第47卷，第227-234页，1998年))。在本发明的一个实施例中，样品中大肠杆菌DNA的水平通过用以下寡核苷酸引物对进行ERIC-PCR来测定：5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC(SEQIDNO:29)和5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG(SEQIDNO:30)。示例性PCR反应混合物可包含模板DNA、寡核苷酸引物、dNTP、扩增缓冲液和TaqDNA聚合酶。示例性反应条件包括95℃变性5min，PCR扩增如下：95℃45s、52℃1min、70℃10min共35个循环，并且在70℃下延伸20min。扩增产物可通过凝胶电泳或通过本领域已知的其他方法分离。
Rep-PCRDNA指纹分析是指这样一种类型的PCR分析，其中将相邻的基因外重复元件之间的DNA的扩增用于获得菌株特异性DNA指纹。在本发明的一个实施例中，样品中大肠杆菌DNA的存在情况通过用以下寡核苷酸引物进行rep-PCR来测定：5'-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG(SEQIDNO:31)。在一些情况下，将全细胞悬浮液用作扩增模板。在一些实施例中，反应条件包括95℃变性5min，PCR扩增如下：95℃3s、92℃30s、50℃1min、65℃8min共30个循环，并且在65℃下延伸8min。扩增产物可通过凝胶电泳分析。扩增产物的凝胶图像可以数字方式成像，并通过进行统计分析而与标准化DNA指纹图像比较。
4.细菌检测和定量
在本发明的一些方面，例如免疫测定法的方法可用于检测样品中大肠杆菌的水平。免疫测定法的非限制性例子包括ELISA、固相免疫测定法、Western印迹和蛋白质微阵列。
在本发明的一些方面，基于培养物的细菌分析是通过在有氧或厌氧条件中在培养基上培养(接种)细菌并且对形成的菌落计数来测定。在一个实施例中，将样品在培养基(如，Ringer培养基)中稀释，并接种到非选择性培养基例如TSS培养基上，在有氧或厌氧条件中在37℃下培养约24-48小时。样品中细菌的数量相对于样品大小与形成的菌落数量成比例。该方法的详细描述见于如Schumannetal.,Physiol.Genomics,23:235-245(2005)(Schumann等人，《生理基因组学》，第23卷，第235-245页，2005年)。
在另一个实施例中，样品中的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)通过以下方法定量：1)在培养基(如，Ringer培养基)中稀释样品、摇动并离心(如，10,000rpm离心10min)；2)将沉淀物重悬于培养基(如，Ringer培养基)中；3)将细胞涂布于Drigalski和EMB平板上，并在有氧条件中在37℃下温育约18至24小时；以及4)对形成的菌落计数。该方法的详细描述见于如Membrezetal.,FASEBJour.,22:2416-2426(2008)(Membrez等人，《美国实验生物学会联合会杂志》，第22卷，第2416-2426页，2008年)。
在又一个实施例中，在洗涤上述步骤1)的细菌细胞沉淀物后，将细胞悬浮液接种到肠杆菌科富集肉汤(E.E.肉汤；英格兰贝辛斯托克Oxoid有限公司(OxoidLTD,Basingstoke,England))中在37℃下温育24小时，然后将细胞涂布到EMB琼脂上。菌落的肠杆菌科可使用标准技术例如APIID32E测试(北卡罗来纳州德罕的生物梅里埃公司(Biomerieux,Durham,NC))来鉴定。该方法的详细描述见于如Murrayetal.,ManualofClinicalMicrobiology,9thEd.,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,D.C.(2003)(Murray等人，《临床微生物学手册》，第9版，美国微生物学会，华盛顿哥伦比亚特区，2003年)。
在一些实施例中，与高甘油三酯血症相关的细菌可通过以下步骤检测：将样品接种在检测培养基上，其中该培养基包含对希望检测的细菌的代谢活性(例如酶活性)具有特异性的特定底物；通过根据是否发生反应来选择底物，可以表征微生物的性质。此类方法的例子在如美国专利No.8,334,112中有详细描述。
在一些实施例中，肠杆菌的水平可使用对所关注的肠杆菌科例如大肠杆菌具有特异性的结合分子(如，抗体、抗体片段、适配子等)来检测。
在其他实施例中，肠杆菌科的水平可通过检测对所关注的肠杆菌科例如大肠杆菌具有特异性的分子(如，肽、蛋白质、酶、化合物等)来测量。在一个实施例中，检测样品中肠杆菌科例如大肠杆菌的水平的方法包括以下步骤；使样品与细菌所生成和/或分泌的酶的以可检测方式进行了标记的底物在引起该底物被该酶修饰的条件下接触；以及检测该底物是否被修饰。该底物的修饰表明样品中存在肠杆菌科，该底物未修饰表明样品中不存在该细菌。此类方法的例子在如美国专利No.8,377,651中有详细描述。
鉴定特定大肠杆菌菌株的方法可用于本发明。此类方法包括核糖核酸分型分析、测序(如，16SrRNA测序)、变性梯度凝胶电泳、末端限制性片段长度多态性、核糖体基因间间隔区PCR分析、DNA微阵列、FISH、qPCR和qRT-PCR。
B.预测高甘油三酯血症
在一些实施例中，如果个体样品中大肠杆菌的水平高于对照样品(如，来自健康对照或不患有高甘油三酯血症个体的样品)，则确定该个体具有患上HTG的风险或易于患上HTG。在一些实施例中，如果大肠杆菌水平为对照的至少约2倍(2×)，如至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍，则预测为HTG。在一些实施例中，如果大肠杆菌水平为对照的至少约5倍(5×)，如至少约5×、6×、7×、8×、9×、10×、11×、12×、13×、14×、15×或更多，则预测为HTG。
在一些实施例中，如果样品中的大肠杆菌水平等于或低于对照样品，则个体不具有患上HTG的风险或未患HTG。
在一些实施例中，如果个体样品中大肠杆菌的水平高于对照样品(如，来自健康对照或不患有高甘油三酯血症个体的样品)，则诊断个体患有HTG。在一些情况下，如果测试样品中的大肠杆菌水平为对照的至少约2倍(2×)，如至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍，则诊断为HTG。在一些实施例中，如果大肠杆菌水平为对照的至少约5倍(5×)，如至少约5×、6×、7×、8×、9×、10×、11×、12×、13×、14×、15×或更多，则诊断为HTG。
C.治疗药物施用
在一些实施例中，本发明方法包括施用治疗有效量的治疗药物、抗生素、膳食干预、营养干预或它们的组合，从而治疗高甘油三酯血症或其症状。在一些情况下，选择治疗有效量以减少肠道中的肠细菌总量，或肠细菌相对量。
在一些实施例中，肠道中相对于细菌总量的肠细菌相对量被减少或消除约1％至约100％，优选地约50％至约100％，甚至更优选地约75％至约100％。在其他实施例中，该相对量减少至少约50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些情况下，该百分比根据肠道中存在的细菌种的菌落形成单位(cfu)计算。
在一些实施例中，单独施用治疗有效量的治疗药物。在其他实施例中，治疗药物与治疗有效量的营养干预结合施用。
可用于治疗与HTG或其临床亚型相关的一种或多种症状的合适药物包括但不限于贝特类，包括苯扎贝特(Bezalip)、环丙贝特(Modalim)、氯贝特、吉非贝齐(Lopid)、非诺贝特(TriCor)和它们的组合。
对于治疗药物施用，高甘油三酯血症(HTG)药物可单独施用或与一种或多种另外的HTG药物和/或一种或多种减少HTG药物相关副作用的药物结合共施用。
HTG药物可根据需要与合适的药物赋形剂一起施用，并且可通过任何可接受的施用方式进行。因此，施用可以是例如静脉内、局部、皮下、经皮、透皮、肌内、经口、颊面、舌下、齿龈、上颚、关节内、肠胃外、小动脉内、真皮内、心室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道施用或通过吸入而施用。所谓“共施用”是指HTG药物在第二药物(如，另一种HTG药物、可用于减少HTG药物副作用的药物等)施用的同时、之前或之后施用。
治疗有效量的HTG药物可重复施用，如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次，或该剂量可通过连续输注而施用。剂量可采取固体、半固体、冻干粉或液体剂型的形式，诸如片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、栓剂、滞留型灌肠剂、霜剂、膏剂、洗剂、凝胶剂、气溶胶剂、泡沫剂等等，优选地为适于简单施用精确剂量的单位剂型。
如本文所用，术语“单位剂型”包括适合作为用于人类受试者和其他哺乳动物的单一剂量的物理离散单位，每个单位包含预定量的、经计算可产生所需起效、耐受性和/或治疗效果、与合适的药物赋形剂结合的HTG药物(如，安瓿瓶)。此外，可制备更浓缩的剂型，然后可由其制备更稀的单位剂型。因此，更浓缩的剂型包含的HTG药物的量将基本上高例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或更多倍。
合适的赋形剂的例子包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素、水、盐水、糖浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和聚丙烯酸例如卡波姆，如卡波姆941、卡波姆980、卡波姆981等。剂型还可以包含润滑剂例如滑石、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂例如苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯和羟基苯甲酸丙酯(即，对羟基苯甲酸酯)；pH调节剂例如无机和有机酸和碱；甜味剂和矫味剂。剂型还可包含可生物降解的聚合物珠、葡聚糖和环糊精包合络合物。
对于经口施用，治疗有效剂量可以是片剂、胶囊剂、乳剂、混悬剂、溶液剂、糖浆剂、喷剂、锭剂、散剂和持续释放制剂的形式。用于经口施用的合适赋形剂包括药用级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等等。
在一些实施例中，治疗有效剂量采取丸剂、片剂或胶囊剂的形式，因此连同HTG药物一起，剂型可包含任何以下成分：稀释剂例如乳糖、蔗糖、磷酸二钙等等；崩解剂例如淀粉或其衍生物；润滑剂例如硬脂酸镁等等；以及粘合剂如淀粉、阿拉伯树胶、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、纤维素以及它们的衍生物。HTG药物还可配制为布置于例如聚乙二醇(PEG)载体中的栓剂。
液体剂型可通过以下方式制备：将HTG药物以及任选地一种或多种药物可接受的佐剂溶解或分散在载体诸如盐水溶液(如，0.9％w/v氯化钠)、右旋糖水溶液、甘油、乙醇等等中，以形成如用于经口、局部或静脉内施用的溶液剂或混悬剂。HTG药物也可配制为滞留型灌肠剂。
优选地，可注射溶液剂在约4.5至约7.5的pH下配制。
治疗有效剂量也可以冻干形式提供。此类剂型可包括用于在施用前进行复原的缓冲剂如碳酸氢盐，或可将缓冲剂包含在冻干剂型中以例如用水复原。冻干剂型还可以包含合适的血管收缩剂如肾上腺素。可将冻干剂型提供在注射器中，任选地与用于复原的缓冲液一起包装，使得复原的剂型可立即施用于个体。
D.膳食干预
在一些实施例中，向具有患上HTG的风险或诊断患有HTG的个体施用膳食干预。此类干预包括个性化饮食、体重管理(体重减轻)计划、增加身体活动、行为改变和热量限制。在一些实施例中，膳食干预包括限制饮食中的碳水化合物和/或脂肪。
在一些实施例中，膳食干预是低碳水化合物饮食，其中碳水化合物低于每日热量摄取的20％。低碳水化合物饮食可以是将碳水化合物摄取限制到约20至60克/天的饮食。
在一些实施例中，膳食干预是低脂肪饮食，其中脂肪为每日热量摄取的约20-30％或更少。
E.营养干预(膳食补充)
在一些实施例中，营养干预包括例如植物甾醇例如长链多不饱和脂肪酸(如，ω-3多不饱和脂肪酸例如二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)、ω-6多不饱和脂肪酸和α-亚麻酸)和单不饱和脂肪酸、牛磺酸、植物化学物质、植物甾醇(如，植物固醇和植物甾烷醇)、益生菌(如，嗜酸乳杆菌(LactobacillusAcidophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)、乳双歧杆菌(Bifidobacriumlactis)、长双歧杆菌(Bifidobacriumlongum))、碳水化合物(如，抗性淀粉、β-环糊精)、蛋白质(如，大豆蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白)、膳食纤维(如，车前子、果胶、β-葡聚糖、菊粉)、植物营养素/植物化学物质(如，异黄酮、葡萄多酚例如类黄酮、黄酮醇、花青素、鞣酸和白藜芦醇、安石榴苷、儿茶素)、药草、香料和它们的组合。另外的营养干预包括但不限于果寡糖(FOS)、部分水解瓜尔胶(PHG6)、PHG6/FOS共混物、鱼油、多不饱和脂肪酸(PUFA)例如n-6脂肪酸和n-3脂肪酸、胆碱、烟酸、抗性淀粉、类二十烷酸、棕榈油酸、益生元、酵母、抗生素、食物产品、饮料产品和它们的组合。
在一些实施例中，营养干预是管饲制剂或口服营养补充剂(如，液体或固体)。在其他实施例中，营养干预是食物产品或饮料产品。
营养干预可以用对于降低患有高脂血症如高甘油三酯血症的个体中升高的甘油三酯有益的制剂、剂量和持续时间来施用。
在一些实施例中，单独施用治疗有效量的营养干预。在其他实施例中，营养干预与治疗有效量的治疗药物结合施用。治疗药物的非限制性例子包括贝特类，诸如例如苯扎贝特(Bezalip)、环丙贝特(Modalim)、氯贝特(Abitrate、Atromid-S)、吉非贝齐(Lopid)、非诺贝特(Lifibr、Antara、Lipofen、Triglide、TriCor)和它们的组合。贝特类包括可用于降低血浆脂质水平的任何纤维酸(fibricacid)衍生剂。
在一些实施例中，营养干预是植物甾醇来源。植物甾醇包括植物固醇和甾烷醇酯。营养干预制剂可包含有限量的饱和脂肪酸(如，低于该干预的总能量的7％)、胆固醇(如，低于200mg)和反式脂肪酸。
在其他实施例中，营养干预是长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)来源。营养补充剂可以是2至4克/天的ω-3脂肪酸例如EPA和DHA，或来自海鱼的ω-3脂肪酸。在其他实施例中，补充剂可以是鱼油，剂量为约3至18克/天，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18克/天。干预可以是富含(高)ω-3或ω-6多不饱和脂肪酸的饮食。
在某些情况下，尤其是如果受试者具有升高的甘油三酯水平，可提供n-3脂肪酸。在某些情况下，PHG6/FOS共混物是特别优选的。
益生元包括旨在促进益生菌在肠道中生长的食物物质。例如，益生元可以是膳食纤维。膳食纤维是不能由人体消化的纤维。膳食纤维的非限制性例子包括果寡糖、半乳寡糖、木寡糖、异麦芽糖、大豆寡糖、焦糊精、转半乳糖基化寡糖、乳酮糖、β-葡聚糖、菊粉、棉子糖、水苏糖和它们的组合。
益生菌是指对宿主个体的健康或安康具有有益效果的微生物细胞制剂或微生物细胞组分。益生菌的非限制性例子包括双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、子囊菌门(Ascomycota)、半知菌门(Deuteromycota)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酵母菌属(Saccharoymces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum，NCC490、CNCMI-2170、NCC2705、CNCMI-2618)、乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis，NCC2818、CNCM1-3446、Bb12)、动物双岐杆菌(Bifidobacteriumanimalis)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)(NCC4007、CGMCC1.3724)、鼠李糖乳杆菌GG(ATCC53103)、类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)(NCC2461、CNCMI-2116)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)(NCC533、CNCMI-1225)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisia)、布拉酵母(Saccharomycesboulardii)、屎肠球菌SF68(EnterococcusfaeciumSF68(NCIMB10415))以及它们的混合物。在患有中度高胆固醇血症的2型糖尿病个体中进行的研究显示，每日消费包含嗜酸乳杆菌和乳双歧杆菌的益生菌酸奶6周后，LDL-胆固醇水平降低(Ejtahedetal.,JDairySci,94(7):3288-94(2011)(Ejtahed等人，《乳品科学杂志》，第94卷，第7期，第3288-3294页，2011年))。
可用于本发明的抗生素包括：氨基糖苷类抗生素，例如但不限于新霉素、卡那霉素、链霉素；多肽类抗生素，例如多粘菌素B；β-内酰胺类青霉素，例如氨苄青霉素；以及喹诺酮/氟喹诺酮类抗生素，例如环丙沙星和诺氟沙星。在另一个实施例中，可使用噬菌体或不同噬菌体的组合。当存在抗生素抗药性时可有利地使用噬菌体。噬菌体是侵入细菌细胞的病毒，并且就裂解性噬菌体而言，破坏细菌代谢并且导致细菌裂解。噬菌体可用于治疗病原细菌感染。由于大多数噬菌体对一个菌种有特异性，因此可使用单一噬菌体或可使用不同噬菌体的组合。
在另一个实施例中，营养干预是蛋白质来源。例如，可使用任何合适的膳食蛋白质，如，动物蛋白质(例如乳蛋白、肉蛋白和卵蛋白)、植物蛋白质(例如大豆蛋白、小麦蛋白、大米蛋白和豌豆蛋白)、游离氨基酸(如，牛磺酸)或它们的组合。
大豆蛋白消费的生物学效应以及循环脂质的减少和患上心血管疾病的风险是相当明确的。例如，已表明，大豆蛋白补充与血浆甘油三酯水平相对于碳水化合物的降低(Woffordetal.,EurJClinNutr,66(4):419-25(2012)(Wofford等人，《欧洲临床营养学杂志》，第66卷，第4期，第419-425页，2012年))以及与LDL胆固醇水平的降低(Andersonetal.,JAmCollNutr,30(2):79-91(2011)(Anderson等人，《美国营养学院杂志》，第30卷，第2期，第79-91页，2011年))显著相关。包括大豆异黄酮、β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白在内的大豆蛋白成分还减少了动物模型中的循环TG(deSouzaFerreiraetal.,JFuncFoods,2:275-283(2010)(deSouzaFerreira等人，《功能性食品杂志》，第2卷，第275-283页，2010年))。
动物和人类研究的数据提示，牛磺酸(2-氨基乙磺酸)对胆固醇水平以及可能地对血浆甘油三酯具有积极影响(Mizushimaetal.,AdvExpMedBiol,403:615-22(1996)(Mizushima等人，《实验医学和生物学进展》，第403卷，第615-622页，1996年)；LombardiniandMilitante,AdvExpMedBiol,583,251-254(2006)(Lombardini和Militante，《实验医学和生物学进展》，第583卷，第251-254页，2006年))。
在又一个实施例中，营养剂是碳水化合物来源。碳水化合物的非限制性例子包括抗性淀粉、β-环糊精、蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固形物、麦芽糖糊精以及它们的混合物。
抗性淀粉例如高直链玉米淀粉是任何不在小肠中消化，而是转到大肠并在其中被肠道微生物群落发酵的淀粉。一项研究显示，高直链玉米淀粉降低了高脂血症动物模型中的TG浓度(Liuetal.,JNutriBiochem,21(2):89-97(2010)(Liu等人，《营养生物化学杂志》，第21卷，第2期，第89-97页，2010年))。在另一项研究中，高胆固醇饮食补充β-环糊精降低了大鼠中的血浆TG水平(Garcia-Mediavillaetal.,PharmacolToxicol,92(2):94-9(2003)(Garcia-Mediavilla等人，《药理学和毒理学》，第92卷，第2期，第94-99页，2003年)；Favieretal.,Metabolism,44(2):200-6(1995)(Favier等人，《代谢》，第44卷，第2期，第200-206页，1995年))。
在另一个实施例中，营养剂是膳食纤维来源。膳食纤维包括但不限于车前子、果胶、来自燕麦麸皮或大麦的β-葡聚糖、果寡糖(如，菊粉)、果胶、瓜尔胶、阿拉伯树胶、半乳寡糖、唾液酸乳糖、来源于乳的寡糖以及来自水果、蔬菜、坚果和谷物的任何膳食纤维和它们的组合。
低脂肪、高碳水化合物饮食常常升高血浆TG浓度，然而，包含膳食纤维的干预可抵消这些效果。例如，将菊粉加入中度的高碳水化合物饮食降低了健康个体中的血浆TG浓度(Letexieretal.,AmJClinNutr,77(3):559-64(Letexier等人，《美国临床营养学杂志》，第77卷，第3期，第559-564页))。已表明，车前子消费降低了2型糖尿病受试者(Sartoreetal.,EurJClinNutr,63(10):1269-71(2009)(Sartore等人，《欧洲临床营养学杂志》，第63卷，第10期，第1269-1271页，2009年))和肥胖青少年受试者(Morenoetal.,JPhysiolBiochem,59(3):235-42(2003)(Moreno等人，《生理学和生物化学杂志》，第59卷，第3期，第235-242页，2003年))中的TG。此外，元分析研究显示，车前子导致了血清总胆固醇和LDL胆固醇的时间和剂量依赖性降低(Weietal.,EurJClinNutr,63(7):821-7(2009)(Wei等人，《欧洲临床营养学杂志》，第63卷，第7期，第821-827页，2009年))。40至60岁受试者的流行病学研究显示，果胶的消费与血清TG浓度负相关(Wuetal.,AmJClinNutr(Wu等人，《美国临床营养学杂志》，第78卷，第6期，第1085-1091页，2003年))。此外，蔗糖饮食补充果寡糖改善了胰岛素抵抗大鼠模型中的血浆TG和游离脂肪酸浓度(Aghelietal.,JNutr,128(8):1283-8(1998)(Agheli等人，《营养学杂志》，第128卷，第8期，第1283-1288页，1998年))。
可用于降低肠道中肠细菌的量的其他营养剂可包括植物化学物质，例如植物营养素。植物化学物质是指植物或水果来源的化合物，植物营养素是指来源于可食用植物的植物化学物质。非限制性植物营养素和植物化学物质包括植物营养素例如异黄酮，来自葡萄的多酚例如黄烷、花青素、槲皮素、杨梅素、山奈素和白藜芦醇，来自石榴的植物化学物质例如安石榴苷、鞣花单宁、天竺葵色素、花葵素、石榴皮鞣素、花青素、矢车菊素和鞣花酸，来自绿茶、乌龙茶或咖啡的植物化学物质例如吲哚、多酚、表没食子儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、类黄酮、单宁、茶黄素、鞣酸、茶碱、可可碱、花青素和原矢车菊素，来自腰果梨香精的植物化学物质例如(E)-2-己烯醛，来自迷迭香的植物化学物质例如鼠尾草酚、鼠尾草酸或迷迭香酸以及它们的混合物。
在一些实施例中，营养干预包括食物产品(包括基于乳粉的产品、速溶饮料、即饮型制剂、营养粉末)；基于乳的产品(如，酸奶或冰淇淋)、谷类产品、饮料、水、茶(如，绿茶或乌龙茶)、咖啡、基于意式浓缩咖啡(espresso)的饮料、麦芽饮料、巧克力味饮料、烹调产品和汤。在一个实施例中，营养剂是全营养配方。
IV.实例
提供以下实例以举例说明而非限制受权利要求书保护的发明。
实例1：
越来越多的证据支持脂多糖(LPS)在调节胰岛素敏感性中的作用，但关于肠道细菌的完整LPS对宿主葡萄糖代谢的相对贡献却知之甚少。本研究显示，在ob/ob小鼠的末端回肠、盲肠和结肠中，大肠杆菌的丰度分别比瘦的C57BL/6J小鼠高2.0、3.1和2.9logCFU/g。为研究大肠杆菌丰度过高是否不仅仅是瘦蛋白缺乏的结果，而且还部分地促成ob/ob小鼠的肥胖症和胰岛素抵抗，从ob/ob小鼠的粪便分离了大肠杆菌，并通过饮用水施用至常规普食饲养的C57BL/6J小鼠达9周的时间。补充大肠杆菌导致了粪便和盲肠大肠杆菌计数持续升高，但这对小鼠的体重、身体组成和葡萄糖耐量无影响。然而，在经大肠杆菌处理的小鼠中，观察到血浆(p＝0.07)和肝脏甘油三酯浓度(p＝0.051)升高的趋势。更重要地，在口服脂质耐量测试期间，与介质处理相比，大肠杆菌施用使血浆甘油三酯的出现显著降低20％，并且此效果与回肠中脂质含量增加31％一致。总之，结果显示：定殖大肠杆菌在肠道脂质代谢和肠道脂质积聚中发挥着重要作用，与肥胖症无关。此发现确立了肠道微生物群落和膳食脂质的自我平衡调节之间的关系。
引言
2型糖尿病是广泛流行的健康问题，国际糖尿病联合会(InternationalDiabetesFederation)估计该病在世界范围的患病率在2012年末达到3.71亿人[1]。身体活动不足、过度肥胖和胰岛素抵抗可能是2型糖尿病快速发展的促进因素，并且已提出包括脂肪因子(adipokine)、氧化应激、线粒体功能异常和慢性低度炎症在内的因素对2型糖尿病的发病具有影响[2]。
最近的数据表明肠道微生物群落可促进2型糖尿病的发展。有几个研究小组已报道：2型糖尿病与肠道微生物群落的改变有关[3,4]，并且2型糖尿病相关性肠道元基因组的标记(signature)在涉及糖、支链氨基酸的转运、甲烷代谢和生物异源物质降解以及硫酸盐还原的途径中富集[5]。为支持肠道微生物群落是2型糖尿病的致因，一些基于肠道微生物群落减少的证据表明：在无菌条件下培养的小鼠或将抗生素施用于胰岛素抵抗ob/ob和C57BL/6J小鼠显示出口服葡萄糖耐量显著提高[6,7]。另一些证据关注位于革兰氏阴性菌细胞壁上的脂多糖(LPS)的促炎性性质，这些证据证实LPS部分地造成高脂肪饮食诱导的胰岛素抵抗[8]。当将LPS长期输注至小鼠时，导致了轻度肥胖、葡萄糖耐量受损和肝脏胰岛素抵抗[8]。在LPS信号转导受损的CD14缺陷小鼠中，LPS的这些效应被减弱[8]，表明在对细菌源性LPS的炎症响应与胰岛素抵抗的发展之间存在病理生理关系。
在正常生理条件下，少量LPS可存在于循环中，但据报道2型糖尿病人中LPS的浓度高于健康受试者[9,10]。然而，负责肠上皮细胞摄取LPS的内在机制仍不清楚。已提出跨细胞途径和细胞旁途径[11]。重要的是，膳食脂肪是促进LPS吸收的关键营养因子[12]。在小鼠中，Cani等人证实了高脂肪饲养升高循环LPS水平[8]。在健康个体中，循环LPS浓度与能量摄取正相关[13]，在肥胖个体中，高甘油三酯血症的程度与血清中的LPS浓度正相关[14]。最近，Amar等人证实了高脂肪饲养导致GFP标记的大肠杆菌附着到回肠的粘膜[15]，从而暗示肠革兰氏阴性菌例如大肠杆菌动态适应膳食脂肪。
大肠杆菌是人肠中的主要兼性厌氧菌。大肠杆菌定殖菌株在富营养物质和富碳的肠环境中通常是无害的，当进入富氮的尿道中则可变为致病的[16]。其他菌株例如肠毒性大肠杆菌是致病的，并且可引起痢疾[17]。与病原性大肠杆菌相反，大肠杆菌Nissle1917菌株则可作为益生菌的作用，例如通过改善胃肠疾病而起作用[18]。最近，Santacruz等人证实了超重孕妇肠道微生物群落中存在的大肠杆菌水平高于正常体重孕妇[19]。
为研究定殖大肠杆菌在与高脂肪饲养无关的胰岛素抵抗中的作用，进行了一系列实验，首先检查普食饲养的肥胖和胰岛素抵抗ob/ob小鼠肠道不同部分中的大肠杆菌丰度。然后，从ob/ob小鼠的粪便分离大肠杆菌，并施用至常规普食饲养的C57BL/6J小鼠。检查经处理的小鼠的葡萄糖和脂质代谢，数据提供于本文中。
材料和方法
检查ob/ob小鼠与瘦小鼠中的肠腔内容物。
从法国拉尔布雷勒的查尔斯河实验室(CharlesRiverLaboratories(L'Arbresle,France))购得六周龄C57BL/6J和ob/ob小鼠。分组圈养小鼠(5只小鼠/笼)，在12h/12h光/暗循环下，让小鼠自由获取普食(Kliba3437，瑞士ProvimiKlibaNafag公司)和水。在3周适应后，处死小鼠并取其胃肠道，从胃至直肠切成约2.5cm长的9段。对每段称重并立即冰冻于液氮中用于定量PCR。
来源于ob/ob小鼠的大肠杆菌对小鼠的定居。
按一套共3个方案，研究了ob/ob小鼠来源的大肠杆菌对常规瘦小鼠的定居。对于每个方案，从法国拉尔布雷勒的查尔斯河实验室购得8周龄雄性C57BL/6J小鼠。将小鼠分别圈养，在12h/12h光/暗循环下，让小鼠自由获取普食(Kliba3437，瑞士ProvimiKlibaNafag公司)和Vittel水。在2周适应后，将小鼠分配到两个重量匹配的组之一。第1组接受Vittel水，第2组接受加入108CFU/mL大肠杆菌的饮用水，长达65天。每周记录体重、水和食物摄取两次。从基线(第0天)至补充周期结束(第63天)，使用EchoMRITM3-in-1(德克萨斯州休斯敦声望医疗系统公司(EchoMedicalSystems,Houston,TX))在清醒状态下测量身体组成。在第-3天、第+3天，然后在处理期间两周一次，对来自粪便的肠杆菌科计数。在处理结束时，小鼠：1)过夜空腹后处死，2)空腹6小时后接受口服葡萄糖耐量测试(OGTT)，或3)过夜空腹后接受口服脂质耐量测试(OLTT)挑战。所有小鼠均在第66天处死。通过切开尾部测量血糖，然后用异氟烷麻醉小鼠。从腔静脉取血液样品收集于涂有EDTA的管中，通过离心收集血浆并储存在-40℃下直到分析。对脂肪组织、肝脏、肠和盲肠内容物称重，快速冷冻于液氮中，并储存在-80℃的冷冻机中以待进一步分析。进行两个独立的实验，每个实验组使用总共12只动物。
从ob/ob小鼠粪便分离、制备和检测大肠杆菌
将8只ob/ob小鼠的粪便接种于肠杆菌科特异性Drigalski培养基上。每只小鼠选择一至两个肠杆菌科菌落，用API20Egallery(法国生物梅里埃公司(Biomerieux,France))分析。将来自相同菌落的DNA通过肠细菌基因间重复共有序列-PCR(ERIC-PCR；参见例如Dalla-Costaetal.,J.Med.Microbiol.,47:227-234(1998)(Dalla-Costa等人，《医学微生物学杂志》，第47卷，第227-234页，1998年))和基因外重复回文序列(REP)PCR比较遗传同一性[20,21]。
在用LB培养基制备的有氧悬浮液中，对选择的大肠杆菌菌落计数。通过将预培养物加入15mLLB培养基，从冰冻甘油储液制备新鲜大肠杆菌悬浮液，每周两次。使预培养物在37℃下生长6至8小时。然后，将2.5mL饱和预培养物溶液加入两个装有250mLLB培养基的烧瓶中，使培养物过夜生长。第二天早上，将细菌溶液以5000×g(4℃)离心5min，将细菌沉淀物重悬在最终体积为2.5L的Vittel水中，然后供应给小鼠。为确认大肠杆菌成功定居，通过将不同稀释度的新鲜粪便悬浮液接种在半选择性培养基(Drigalski生长培养基)上进行富集来定量粪便中的大肠杆菌水平。此外，盲肠大肠杆菌使用大肠杆菌特异性引物进行定量PCR来定量，并与总细菌含量进行比较。PCR扩增的引物和条件在表1中示出。
表1.用于检测细菌的引物序列和PCR条件
“F”代表正向引物。“R”代表反向引物。
口服葡萄糖耐量测试(OGTT)
OGTT在处理期结束时在光循环中食物剥夺6小时后进行。使用AscensiaEliteXL血糖仪(瑞士苏黎世拜耳公司(BayerAG,Zurich,Switzerland))测量通过切开尾部而获得的血液中的空腹葡萄糖浓度后，在时间0点通过经口灌服给动物供应30％葡萄糖溶液，剂量为2g/kg(重量/体重)。在15、30、60和120min后测量血糖。在0、15和60min也将血液收集在涂有EDTA的管中以进行胰岛素分析(德国汉堡IBL公司(IBL；Hamburg,Germany))。
口服脂质耐量测试(OLTT)
在独立的实验中，经大肠杆菌处理的小鼠和对照小鼠在过夜空腹(14小时)后进行OLTT。与OGTT一样，在处理期结束时进行OLTT。动物在时间0点通过经口灌服接受6ml/g(重量/体重)玉米油。在0、60、120、180和240min将血液收集到涂有EDTA的管中，以进行甘油三酯(TG)和非酯化脂肪酸(NEFA)分析。TG和NEFA分别使用购自法国的生物梅里埃公司和维吉尼亚州里士满的和光诊断公司(WakoDiagnostics(Richmond,VA))的商业化试剂盒测量。
血浆和组织分析
使用COBASC111(德国曼海姆的罗氏诊断公司((RocheDiagnostics,Mannheim,Germany))测量血浆甘油三酯、总胆固醇、非酯化脂肪酸(维吉尼亚州里士满的和光诊断公司)、β-羟基丁酸(德国诺伊斯的和光化学公司(WakoChemicalsGmbH,Neuss,Germany))。使用商业化试剂盒测量血浆胰岛素(德国汉堡的IBL公司)和LPS-结合蛋白(ELISA-LBP；#CKM043；马萨诸塞州坎顿的细胞科学公司(CellSciences,Inc.；Canton,MA))水平。血糖通过切开尾部使用AscensiaEliteXL血糖仪(瑞士苏黎世的拜耳公司)测量。血浆炎症标记物在MSD小鼠TH1/TH29-Plex超灵敏试剂盒平板(马里兰州盖瑟斯堡的MSD公司(MesoScaleDiscovery,Gaithersburg,Maryland))上测量。使用制造商的说明实施检测。
根据Folch等人的研究[22]从200mg冰冻肝脏提取脂质。胆固醇使用商业化试剂盒(德国曼海姆的罗氏诊断公司)遵照制造商的说明测量。TG首先在碱性溶液(0.5N的KOH乙醇溶液)中水解，然后使用商业化酶TG分析试剂盒(法国的生物梅里埃公司)遵照制造商的说明测量。
mRNA表达分析
总RNA使用AgencourtRNAdvance组织试剂盒(德国贝克曼库尔特Agencourt(Agencourt,BeckmanCoulter,Germany))根据制造商提供的方案从50mg肝脏或肠段制备。使用第1链cDNA实时PCR合成试剂盒(AMV；瑞士巴塞尔的罗氏生物医学公司(RocheBiomedical,Basel,Switzerland))以oligod(T)15作为引物对1.5μg总RNA进行逆转录。实时逆转录-PCR分析在荧光温度循环仪(PCR5700序列检测系统，应用生物系统公司(AppliedBiosystems))中进行。引物序列在表2中列出。
表2.用于RNA表达分析的引物序列和PCR条件。
“F”代表正向引物。“R”代表反向引物。
统计分析
数据以中值±中值的标准误差示出。将在独特时间点获取的结果通过Wilcoxon检验评估，而将双尾非参数检验(Mann-Whitney检验)用于比较处理与对照组。为分析大肠杆菌对体重和体重增加的影响，应用了混合效应建模(重复测量)。
结果
遗传性肥胖(ob/ob)小鼠的肠道末端部分和粪便中的大肠杆菌水平增加。通过定量PCR技术检查ob/ob小鼠和以C57BL/6J为背景的野生型小鼠的肠腔内容物，结果显示ob/ob和野生型小鼠中的总细菌数类似(表3)，而肠道末端部分(即，盲肠、结肠和粪便)中大肠杆菌的比例在ob/ob中比在瘦小鼠中分别高2.0、3.1和2.9logCFU/g。为评估过度代表的菌株(over-representedstrain)在功能上是否可能与肥胖症相关，从这些小鼠分离大肠杆菌。为此，将8只不同ob/ob小鼠的粪便加入肠杆菌科选择性培养基，并在选择性条件下生长。所有生长的菌落通过在API20Egallery上分析被鉴定为大肠杆菌。用ERIC-PCR和REP-PCR比较所有克隆的遗传同一性，结果显示所有菌落具有相同的分子标记(molecularsignature)。由于这些技术未显示不同分离株之间的任何差异，挑取来自显示出最高体重的小鼠的单个菌落进行以下实验。
表3.ob/ob小鼠和野生型对照小鼠胃肠道中的总细菌和大肠杆菌计 数。
数据以中值±中值的标准误差示出。*p<0.05，**p<0.01(Wilcoxon检验)，n＝5只小鼠/组。
为测试从ob/ob小鼠分离的大肠杆菌菌株的可能生理影响，让野生型常规普食饲养的小鼠自由获取含108CFU/mL大肠杆菌的水65天。每周测量水摄取两次，补充大肠杆菌未见差异(表4)。
表4.累积水和食物摄取/效率。
对照 经处理
累积水摄取(g) 88.1±3.2 77.9±3.9
累积食物摄取(Kcal) 1380±121 1536±279
食物效率(mg/Kcal) 4.04±0.42 3.95±0.43
数据以中值±中值的标准误差示出，n＝11-12。
根据水消费，大肠杆菌的平均摄取为约8.6±0.2LogCFU/天。在研究中的不同时间点采集经大肠杆菌处理的小鼠的粪便，通过基于培养物的大肠杆菌计数监控定居的成功情况。如表5所示，经处理的小鼠显示出粪便大肠杆菌计数增加，并且大肠杆菌计数的升高在实验过程中持续(直至第62天)。
表5.处理后的粪便大肠杆菌计数。
数据以中值±中值的标准误差示出。**p<0.01，***p<0.001(Mann-Whitney检验)，n＝11至12只小鼠/组。
大肠杆菌定居的增加是特异性的。粪便总细菌量、厚壁菌门、拟杆菌门、肠杆菌科、拟杆菌门-普雷沃氏菌属-卟啉单胞菌、双歧杆菌和乳杆菌组的细菌量通过定量PCR技术测定，除肠杆菌科(大肠杆菌所属的科)外，所有组均未受到大肠杆菌补充的影响(表6)。
表6.在研究开始和结束时各组的细菌量。
单位为Log细胞/g。数据以中值±中值的标准误差示出，n＝11-12。
据报道，血浆LPS结合蛋白(LBP)水平与血浆LPS的量相关[23]。因此，将LBP用作对LPS的全身性暴露的替代标记物。两个组中均存在LBP，但与对照动物相比，大肠杆菌处理组的浓度升高(表7)。因此，大肠杆菌在饮用水中施用导致了受体小鼠中的大肠杆菌群落增加，表明大肠杆菌成功且持续定居在这些小鼠中。
表7.经处理和未处理小鼠中的盲肠大肠杆菌计数和血浆脂多糖结合蛋 白浓度
数据以中值±中值的标准误差示出。**p<0.01，***p<0.001(Mann-Whitney检验)，n＝11-12只小鼠/组。
测量小鼠中的血浆促炎细胞因子，未见在过夜空腹状态下大肠杆菌处理和对照小鼠之间这些参数(IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、KC-GRO、IL-10、IL-12-p70和TNα)的差异(表8)。还测量了空肠NF-κB、IL-6和TNFαmRNA表达，未见两组之间的差异(表8和表9)。
表8.过夜空腹后的血浆细胞因子。
pg/ml 对照 经处理
IFN-γ 1.2±0.1 0.8±0.2
IL-1β 9.2±0.4 6.1±0.7
IL-2 9.6±0.7 8.0±1.4
IL-4 3.6±0.9 2.5±0.8
IL-5 6.8±0.6 8.5±0.4
KC-GRO 54.2±4.7 55.3±7.7
IL-10 35.7±3.4 23.2±2.2
IL12-p70 1083.4±75.6 1211.5±142.5
TNFα 490.8±36.0 295.5±30.5
单位为pg/ml。数据以中值±中值的标准误差示出，n＝11-12。
表9.过夜空腹后的空肠TNFα表达。
相对于RPLP0 对照 经处理
NF-κB 1.6±0.2 1.8±0.4
IL-6 4.4±0.2 5.7±0.2
TNFα 1.2±0.2 1.2±0.4
数据以中值±中值的标准误差示出，n＝12。
在实验开始时，两个组显示出相同的体重(大肠杆菌处理小鼠25.2±0.3g，对照小鼠25.3±0.3g)，在研究过程中体重增加不受大肠杆菌处理的影响(表10)。
表10.对照和处理小鼠的体重
数据为中值±中值的标准误差，n＝9-12只小鼠/组。
在处理之前和之后测量了身体组成，结果显示大肠杆菌处理动物和相应对照之间的瘦质量和脂肪质量无差异(表11)。大肠杆菌处理小鼠显示出正常体重和葡萄糖耐量。
表11.经处理和未处理小鼠的身体组成。
数据为中值±中值的标准误差，n＝9-12只小鼠/组。
在研究结束时，小鼠经受口服葡萄糖负荷挑战。如表12所示，两个组中的空腹血糖几乎相同，葡萄糖耐量曲线显示经处理小鼠和对照小鼠之间无差异。与葡萄糖数据一致，口服葡萄糖耐量测试(OGTT)期间的血浆胰岛素值显示出经处理和未处理动物之间无差异(表12)，表明普食饲养的C57BL/6J小鼠中的葡萄糖处理不受肠内大肠杆菌数量升高的影响。
表12.口服葡萄糖耐量期间的血糖、血浆胰岛素以及两个参数的曲线 下面积。
数据以中值±中值的标准误差示出，n＝9-12只小鼠/组。AUC代表曲线下面积。
大肠杆菌处理小鼠的血浆和肝脏中的脂质谱发生改变。在食物剥夺6小时后处死时，比较处理和未处理小鼠的器官重量，两组之间未见差异(表13)。
表13.处死时的体重和组织重量
对照 经处理
体重(g) 27.2±0.5 27.2±0.4
附睾脂肪组织(g) 0.647±0.078 0.681±0.043
腹膜后脂肪组织(g) 0.166±0.025 0.164±0.012
肠系膜脂肪组织(g) 0.216±0.022 0.232±0.018
总脂肪垫(g) 1.028±0.121 1.077±0.072
褐色脂肪组织(g) 0.076±0.007 0.067±0.003
腓肠肌(g) 0.332±0.011 0.322±0.006
肝脏(g) 1.085±0.023 1.046±0.018
盲肠(g) 0.272±0.015 0.248±0.011
数据以中值±中值的标准误差示出，n＝12。
然而，在大肠杆菌处理组中，观察到血浆甘油三酯(TG)升高的趋势(p＝0.07，表14)，而血浆非酯化脂肪酸(NEFA)不受处理的影响。除TG改变之外，处理组的循环酮体β-羟基丁酸(β-HB)倾向于高于未处理组(p＝0.07)。在肠中，空肠微粒体甘油三酯转运蛋白(MTTP，负责含甘油三酯的脂蛋白分泌的基因)的表达跟随血浆TG水平，并且与对照小鼠相比，处理小鼠显示出升高的趋势(+37％)(相对于GAPDH分别为10.8e-2±1.8e-2和8.6e-2±0.9e-2，p＝0.069)。在肝脏中，大肠杆菌处理小鼠中的TG浓度类似地升高24％(p＝0.051，表14)。由于β-HB的量反映脂肪酸氧化的程度，因此检查了肝脏中若干脂质氧化基因的mRNA表达。乙酰辅酶A羧化酶2(ACC2)是调节胞质溶胶丙二酰辅酶A合成的酶[24]，胞质溶胶丙二酰辅酶A的浓度通过抑制线粒体长链脂肪酸转运蛋白CPT1a而负调节脂质氧化。处理组中ACC2的mRNA表达减少(表14)，这暗示线粒体摄取更多的脂肪酸用于氧化。此外，过氧化物酶体增殖物活化受体α(PPARα)是负责启动脂质氧化程序的基因[25]，在大肠杆菌处理小鼠中显示出表达增加的趋势(表14)。
表14.大肠杆菌处理小鼠的血浆和肝脏中的脂质谱发生改变
数据以中值±中值的标准误差示出。*p<0.05(Mann-Whitney检验)，ap＝0.07，bp＝0.05，cp＝0.08，n＝11-12只小鼠/组。TG，甘油三酯；NEFA，非酯化脂肪酸；β-HB，β-羟基丁酸；ACC2，乙酰辅酶A羧化酶2；PPARα，过氧化物酶体增殖物活化受体。
因此，大肠杆菌处理通过促进在6小时空腹状态下的肝脏脂肪酸β-氧化来选择性影响肝脏脂质代谢，而不改变小鼠身体组成和口服葡萄糖耐量，但它似乎是这样。然而，大肠杆菌的这种效应对长时间空腹敏感，因为在14小时过夜空腹后，大肠杆菌处理和未处理小鼠之间的血浆TG、β-HB和NEFA水平以及肝脏脂质含量类似(表15)。
表15.14小时过夜空腹后测得的脂质。
数据以中值±中值的标准误差示出，n＝12。
为进一步研究大肠杆菌诱导的脂质代谢变化，小鼠经受口服脂质耐量测试(OLTT)挑战。为此，给14小时空腹小鼠经口灌服脂质负荷，并在4小时时间内测量血浆TG浓度。如所预期，在OLTT期间对照小鼠中的血浆TG水平升高，峰值在经口灌服后60min(表16)。相比之下，大肠杆菌处理小鼠未显示出预期的血浆TG升高，并且在整个4小时观察内，TG浓度保持在基线附近。另一方面，在脂质经口灌服后，NEFA浓度降低，并且在处理和对照小鼠中，抑制程度几乎相同(表16)。
表16.口服脂质挑战期间的甘油三酯和非酯化脂肪酸浓度。
数据以中值±中值的标准误差示出。*p<0.05，与对照组相比，**p<0.01，与对照组相比。(Mann-Whitney检验)，n＝11-12只小鼠/组。
OLTT后血浆参数表明，该效应是TG特异性的，因为其他脂质类别例如NEFA或胆固醇不受处理的影响(表17)。在OLTT后，大量脂质存在于盲肠中，但在两组动物中的量类似(表18)。然而，在大肠杆菌处理小鼠中发现回肠TG显著升高(表18)，暗示肠道对TG的保留是处理小鼠表面上对口服脂质负荷无响应的原因。大肠杆菌处理小鼠的特征在于对口服脂质负荷的异常响应和回肠中的脂质积聚。
表17.OLTT后测得的血浆脂质。
对照 经处理
甘油三酯(mmol/L) 1.59±0.10 1.18±0.08*
NEFA(mmol/L) 0.60±0.05 0.65±0.05
胆固醇(mmol/L) 2.28±0.10 2.35±0.02
β-羟基丁酸(μmol/L) 3125±138 3145±188
表18.盲肠内容物中和回肠中的甘油三酯浓度。
数据以中值±中值的标准误差示出。*与对照组相比，p<0.05，**与对照组相比，p<0.01。(Mann-Whitney检验)，n＝11-12只小鼠/组。
为确定在小鼠研究(表3和表14)中观察到的血浆甘油三酯升高和肠内大肠杆菌丰度之间的关系在患有2型糖尿病的人受试者中是否也是如此，测量了超重糖尿病和超重非糖尿病患者中的血浆TG浓度和粪便大肠杆菌计数。糖尿病受试者显示出血浆TG水平以及大肠杆菌计数在统计学意义上显著升高(表19)。数据表明，检测到更高水平(如，浓度)的肠内大肠杆菌可以预示超重受试者中血浆TG升高和/或糖尿病。
表19.超重糖尿病和超重非糖尿病人受试者的血浆甘油三酯浓度和粪 便大肠杆菌计数
数据以中值±中值的标准误差示出。***与超重非糖尿病组相比，p<0.001。(Mann-Whitney检验)，n＝21-25人/组。
讨论
有大量文献记载了LPS的促炎性质导致胰岛素抵抗。然而，对通过提供活大肠杆菌来增加肠腔LPS的数量是否会损害胰岛素敏感性却知之甚少。因此，从ob/ob小鼠分离大肠杆菌并补充给常规C57BL/6J小鼠。与最近的关于LPS的出版物形成对比的是，未观察到处理后小鼠的体重和口服葡萄糖耐量显著改变。相反，响应于口服脂质挑战的肠内脂质代谢显著改变。
已证实，革兰氏阴性菌外膜中的脂多糖(LPS)参与代谢病的致病[8]。在本研究中，观察到ob/ob的末端回肠、盲肠和结肠的革兰氏阴性大肠杆菌水平高于野生型小鼠。推测起来，由于ob/ob小鼠中GLP-2介导的肠屏障功能受损，定殖大肠杆菌的表面上的LPS可进入全身循环[26]，因为已表明ob/ob小鼠的循环LPS浓度高于野生型对照[27]。代替测量LPS。LBP已被提议作为LPS的替代标记物，因为ob/ob的血浆LBP和LPS浓度均高于对照小鼠[23]。在本研究中，在吸收后状态下以及口服脂质挑战后，大肠杆菌处理小鼠的LBP水平较高，暗示这些小鼠处于促炎状态。然而，过夜空腹下测得的循环细胞因子(表8)在处理和未处理小鼠中不可区分，表明对补充大肠杆菌所产生的炎症响应可忽略不计。此前，已表明抗生素处理提高了ob/ob小鼠的葡萄糖耐量并减少了肠内TNFαmRNA表达[6]。在本研究中，葡萄糖耐量缺乏变化与类似量的肠内TNFαmRNA表达一致，这支持了大肠杆菌处理不在非肥胖普食饲养小鼠中施加真正的炎症响应的事实。然而，大肠杆菌处理和高脂肪饮食饲养的组合可损害屏障功能并导致小鼠中的促炎响应和胰岛素抵抗。
最出乎意料的发现是大肠杆菌处理如何导致脂质重新分配到不同的库(pool)中。在脂质挑战测试期间，大肠杆菌处理小鼠显示出血浆TG的出现减少。在OLTT后，处理和未处理组二者中的盲肠脂质类似，暗示肠内脂质吸收不良不太可能是血浆TG的出现受到抑制的致因。在吸收后状态下(在光循环中食物剥夺6h)，大肠杆菌处理小鼠显示出血浆TG升高，但该效应在过夜空腹后消失。基于此数据，假设肠道中的过量大肠杆菌定居导致肠道中膳食TG的保留，并延缓TG释放至循环中。为支持此观点，在吸收后状态下的处理小鼠中，涉及肠内脂蛋白分泌的基因MTTP的mRNA表达和血浆TG浓度均升高。最近，Robertson等人证实了脂质可储存在肠细胞中，并且在数小时后响应于葡萄糖挑战而释放[28]。同样最近，Fielding等人证明了，来自第一餐的脂质中的一部分存在于之后餐食的乳糜微粒中[29]。这些数据显示，肠内大肠杆菌的量在调节进入全身循环的膳食脂肪的动力学方面具有临床关联性。
异位脂肪积聚是胰岛素抵抗的标志特征之一，而且胰岛素抵抗个体和动物中肝脏和骨骼肌的过量脂肪积聚的观察结果支持此观点。然而，作为瞬时脂质储库的肠尚未得到充分认识。最近，Zhu等人应用相干反斯托克斯拉曼散射成像技术，观察到脂肪挑战后肠细胞能够储存脂质小滴[30]。随后，Uchida等人证实了，与瘦小鼠相比，肥胖小鼠的肠内TG分泌响应于膳食脂肪挑战而减少[31]。相似地，Douglass等人报道，在饲养状态下和口服脂质挑战后，ob/ob小鼠在肠中积聚TG[32]。在本研究中，用从ob/ob小鼠粪便分离的大肠杆菌处理普食饲养的小鼠减少了TG在循环中的出现，并且增加了口服脂质挑战后回肠中测得的脂质含量，使人想起由Douglass等人公布的在ob/ob小鼠中的发现。这些数据暗示，在ob/ob中肠内脂质代谢的调节失常可通过用从ob/ob小鼠粪便分离的大肠杆菌补充小鼠来模拟。另一方面，瘦蛋白突变导致的其他异常，例如食欲过盛、肥胖症以及通过口服葡萄糖耐量测试测得的胰岛素抵抗不受大肠杆菌处理的影响。
另一个异位脂质库是肝脏，并且脂肪在肝脏中的积聚与许多病原性病症例如非酒精性和酒精性脂肪性肝病以及非酒精性脂肪性肝炎相关。已假设肠道微生物群落的生态失调会导致NAFLD和NASH[33]。在本研究中，在吸收后状态下测得的大肠杆菌处理小鼠中的该肝脏TG浓度高于未处理小鼠。基因表达分析和血浆酮体测量表明处理小鼠中脂肪酸氧化补偿性增加，这是通常存在于NAFLD中的现象[34]。数据暗示了肠内大肠杆菌和NAFLD发展之间的因果关系。有趣的是，在过夜空腹状态下肝脏脂肪和循环TG二者均未受大肠杆菌处理的影响。
概括地说，本实例证明定殖大肠杆菌通过改变TG在肠、肝脏和血浆中的分布而在调节宿主脂质代谢中发挥重要作用。然而，小鼠的体重和口服葡萄糖耐量未受大肠杆菌补充的影响。总之，这些数据将对定殖大肠杆菌的认识从感染性疾病的发病机理扩展到大肠杆菌在膳食脂质的自我平衡调节中的作用。
实例2：
在小肠中，膳食脂质在被肠细胞吸收前就被消化。一旦膳食脂质在细胞内，则将经历若干合成和转运步骤，然后通过乳糜微粒释放至淋巴循环。为确定大肠杆菌处理对小鼠肠中脂质代谢的影响，我们分析了对脂质合成和转运途径具有重要意义的基因和蛋白质的表达。首先，我们检查了介导膳食脂质吸收的主要转运蛋白即脂肪酸转运蛋白4(FATP4)的表达。我们的结果显示，fatp4的mRNA表达未受大肠杆菌处理或口服脂质耐量测试的影响。然而，FATP4蛋白质水平未显示出与fatp4mRNA相同的表达模式。在对照小鼠中，口服脂质挑战使FATP4蛋白质水平增加2倍，而在大肠杆菌处理小鼠中，FATP4表达在脂质挑战后无变化。其次，我们检查了肠中单酰基甘油酰基转移酶(MGAT)的mRNA和蛋白质表达。在肠细胞中，MGAT是负责脂肪酸酯化形成甘油三酯的酶之一。在mRNA水平上，大肠杆菌处理和脂质挑战对MGAT表达无影响，这个结果类似于fatp4。在蛋白质水平上，MGAT表达在对照小鼠中通过脂质挑战而升高，但在大肠杆菌处理小鼠中未升高，这个结果也类似于FATP4。再次，我们测量了肠中微粒体甘油三酯转运蛋白(MTTP)的mRNA和蛋白质。MTTP是通过将富含apoB48磷脂的颗粒融合到脂质小滴而合成内质网(ER)中的富含甘油三酯的前乳糜微粒转运囊泡的关键(35)。我们的结果显示，在未处理和大肠杆菌处理小鼠二者中，脂质挑战以相似的程度诱导了mttp的mRNA表达。在相同的脂质挑战条件下，未处理小鼠中MTTP蛋白质浓度升高，但大肠杆菌处理小鼠中未升高。最后，我们测量了SEC24c的蛋白质水平。SEC24c存在于前乳糜微粒转运囊泡中，并且在肠细胞中对前乳糜微粒囊泡从ER运输至高尔基体具有重要意义(36)。在未处理小鼠中，SEC24c蛋白水平在脂质挑战后高于挑战前。在大肠杆菌处理小鼠中，SEC24c蛋白浓度未受脂质挑战的影响。
在我们测量的所有基因中，mRNA表达并非永远对应于蛋白质水平。mRNA浓度和蛋白质浓度之间的矛盾暗示：大肠杆菌的存在可影响蛋白质合成或蛋白质降解，这导致脂质合成和运输所需的细胞蛋白质下调。在肠细胞中，ER是蛋白质合成/降解和脂质合成/运输的重要细胞器。ER中未折叠蛋白质的积聚引起ER应激，并且已证实ER应激通过两个ER应激途径PERK-eiF2α-ATF4和IRE1α-XBP1影响脂肪生成和脂质代谢的维持(37)。此外，已证实大肠杆菌引起肠中的ER应激(38,39)。根据文献证据，我们假设ER应激在大肠杆菌处理小鼠中升高。我们的结果显示，大肠杆菌处理与口服脂质挑战无关地升高了xbp1mRNA水平。与未处理小鼠相比，大肠杆菌处理还升高了atf4和chop的mRNA，但差异在脂质挑战的条件下显著。
最后，我们的数据表明，大肠杆菌处理抑制了肠中甘油三酯合成和运输所必需的蛋白质的由膳食脂质诱导的表达。具体地讲，MTTP和SEC24c蛋白质上调的缺乏可限制前乳糜微粒囊泡从ER转运至高尔基体，这解释了大肠杆菌处理小鼠的肠中对脂质的保留。虽然分子机制仍需确定，但肠中ER应激的升高可促成大肠杆菌处理所导致的肠内脂质代谢调节异常。
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本说明书引用的所有出版物和专利申请均整体以引用的方式并入本文，如同具体且单独地说明单个出版物或专利申请整体以引用的方式并入。
虽然为了清晰理解而以例证和举例的方式相当详细地描述了上述发明，但是本领域的技术人员将认识到可在所附权利要求书的范围内作出某些变化和修改。此外，本文提供的各参考文献整体以引用的方式并入，达到如同各参考文献单独地以引用的方式并入的相同程度。

Claims (22)

1.一种用于预测受试者是否具有患上高甘油三酯血症的风险的方法，所述方法包括：
a)转换得自所述受试者的样品，以检测所述样品中大肠杆菌的水平；以及
b)确定所述样品中与对照样品相比更高的大肠杆菌水平预测所述受试者具有患上高甘油三酯血症的风险。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是粪便样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其中检测大肠杆菌的水平包括进行核酸扩增。
4.根据权利要求1所述的方法，其中检测大肠杆菌的水平包括进行菌落计数。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照样品来自健康对照受试者或不具有患上高甘油三酯血症的风险的受试者。
6.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括如果所述受试者具有患上高甘油三酯血症的风险，则推荐施用或施用治疗有效量的治疗药物、抗生素、噬菌体、膳食干预、营养干预或它们的组合。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述治疗药物选自苯扎贝特(Bezalip)、环丙贝特(Modalim)、氯贝特、吉非贝齐(Lopid)、非诺贝特(TriCor)和它们的组合。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述膳食干预选自碳水化合物的膳食限制、脂肪的膳食限制和它们的组合。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述营养干预选自植物甾醇、牛磺酸、益生菌、碳水化合物、蛋白质、膳食纤维、植物营养素和它们的组合。
10.一种用于治疗受试者中的高甘油三酯血症的方法，所述方法包括：
a)转换得自所述受试者样品，以检测所述样品中大肠杆菌的水平；
b)确定所述样品中与对照样品相比更高的大肠杆菌水平表明诊断到所述受试者中有高甘油三酯血症；以及
c)如果所述受试者被诊断为患有高甘油三酯血症，则施用治疗有效量的治疗药物、抗生素、噬菌体、膳食干预、营养干预或它们的组合。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述样品是粪便样品。
12.根据权利要求10所述的方法，其中检测大肠杆菌的水平包括进行核酸扩增。
13.根据权利要求10所述的方法，其中检测大肠杆菌的水平包括进行菌落计数。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述对照样品来自健康对照受试者。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述治疗药物选自苯扎贝特(Bezalip)、环丙贝特(Modalim)、氯贝特、吉非贝齐(Lopid)、非诺贝特(TriCor)和它们的组合。
16.根据权利要求10所述的方法，其中所述膳食干预选自碳水化合物的膳食限制、脂肪的膳食限制和它们的组合。
17.根据权利要求10所述的方法，其中所述营养干预选自植物甾醇、牛磺酸、益生菌、碳水化合物、蛋白质、膳食纤维、植物营养素和它们的组合。
18.一种用于诊断受试者中的高甘油三酯血症的方法，所述方法包括：
a)转换得自所述受试者的样品，以检测所述样品中大肠杆菌的水平；以及
b)确定所述样品中与对照样品相比更高的大肠杆菌水平表明诊断到所述受试者中有高甘油三酯血症。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述样品是粪便样品。
20.根据权利要求18所述的方法，其中检测大肠杆菌的水平包括进行核酸扩增。
21.根据权利要求20所述的方法，其中核酸扩增使用具有SEQIDNO:3和4所示的序列的寡核苷酸进行。
22.根据权利要求20所述的方法，其中核酸扩增包括肠细菌基因间重复共有序列PCR或基因外重复PCR。
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