CN113637780A - 一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN113637780A
CN113637780A CN202110898736.5A CN202110898736A CN113637780A CN 113637780 A CN113637780 A CN 113637780A CN 202110898736 A CN202110898736 A CN 202110898736A CN 113637780 A CN113637780 A CN 113637780A
Authority
CN
China
Prior art keywords
clostridium
probe
detecting
detection
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110898736.5A
Other languages
English (en)
Inventor
方鹏宇
郭红辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Jundao Nutrition Technology Co ltd
Original Assignee
Guangdong Jundao Nutrition Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Jundao Nutrition Technology Co ltd filed Critical Guangdong Jundao Nutrition Technology Co ltd
Priority to CN202110898736.5A priority Critical patent/CN113637780A/zh
Publication of CN113637780A publication Critical patent/CN113637780A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒。本发明利用多重荧光PCR技术，通过对引物、探针的设计筛选及反应体系的优化，建立了2型糖尿病易感肠道菌，即多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和毛螺菌的检测方法，实现了四种菌的一管多重检测，具有检测特异性强、灵敏度高、重复性好的优点，且操作简单方便、快速、节约耗材、成本低廉，可作为多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌的定性检测试剂，为2型糖尿病的研究提供快速、特异、可重复的检测手段。

Description

一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域。更具体地，涉及一种检测2型糖尿病易感肠道菌的多重qPCR引物和探针、检测方法及试剂盒。
背景技术
随着我国经济、环境、生活水平的改变，糖尿病患病率逐年上升，其中2型糖尿病(T2DM)的患病比例更高。2型糖尿病被认为是由一系列危险因素引起的，如遗传、年龄、肥胖和不健康的生活方式等，越来越多的证据表明，2型糖尿病与肠道菌群的数量发展有着一定的相关性，通过检测肠道菌群，可以为2型糖尿病的诊断提供辅助证据。例如，中国专利CN109797190A公开了一种用于评估II型糖尿病风险的微生物标志物及其应用，其微生物标志物包括双歧杆菌属(Bifidobacterium)、普雷沃菌属(Prevotella)、梭菌属(Clostridium)、罗氏菌属(Roseburia)、肠球菌属(Enterococcus)或韦荣球菌属(Veillonella)中任意两种以上的组合。另有研究表明，多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)、柔嫩梭菌(Clostridium Leptum)、球形梭菌(Clostridium Coccoides)以及毛螺菌(Lachnospiraceae Bacterium)是2型糖尿病患者的易感肠道菌，糖尿病患者进食后，血糖值升高时，其丰度也会相应升高，可作为2型糖尿病风险的微生物标志物。
目前，肠道菌群的检测方法主要包括传统培养法和分子生物学法两大类。传统培养法是微生物鉴定的基本方法，但其存在耗时长、培养要求高、影响因素多等问题。分子生物学方法的出现则为肠道细菌的检测提供了更多可能，它具有检测时间短、灵敏度高、结果准确等优势，弥补了传统培养法的诸多不足，被广泛地应用于肠道微生态生物研究。其中，由于多重qPCR方法可同时检测多种肠道菌，具有检测速度快，成本低等优势，在肠道菌的检测方面应用广泛，但多重qPCR方法的建立难度比普通qPCR高很多，多重qPCR对引物和探针的特异性要求很高，否则会因同属内菌的DNA序列同源性较高，出现非特异性扩增，造成假阳性；引物和探针之间也不能相互干扰，否则将导致检测结果不准确；引物的扩增效率也会影响结果的准确性，如果引物的扩增效率相差较多，当在同一反应体系中同时进行扩增时，会因各引物间扩增效率的不同，导致样本初始DNA扩增的不均衡，一些含量低的菌或者引物扩增效率低的菌无法同含量高或者扩增效率高的引物竞争，导致此类菌的扩增产物较少，荧光信号较弱，造成假阴性结果。
虽国内外已有不少关于肠道菌的实时荧光PCR检测方法与应用的报道，例如中国专利CN 110904250A公开了用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物、试剂盒及检测方法，其可同时检测长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌。但目前还未有同时检测2型糖尿病易感肠道菌，即多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌这四种2型糖尿病易感肠道菌的多重荧光PCR方法，因此，提供一种检测上述四种菌的多重qPCR方法对2型糖尿病的研究具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服尚未有同时检测多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和毛螺菌这四种2型糖尿病易感肠道菌的多重qPCR引物、探针方法及试剂盒的缺陷和不足，提供2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒。
本发明的目的是提供一种检测2型糖尿病易感肠道菌的多重qPCR引物和探针。
本发明的另一目的是提供一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法。
本发明的再一目的是提供一种2型糖尿病易感肠道菌的检测试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明利用多重荧光PCR技术，以2型糖尿病的易感肠道菌，即多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌的16S rRNA的高度保守区为靶区域，设计特异性引物和荧光探针，从中筛选出了可用于同时检测上述四种肠道菌的qPCR引物和探针。本发明还利用基因重组技术，构建了含有多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌的目的基因的重组质粒，作为qPCR检测的阳性对照。在所述qPCR引物和探针以及重组质粒的基础上，建立了相应的检测方法，并提供了检测多种肠道菌的多重qPCR试剂盒。
本发明首先提供了一种检测2型糖尿病易感肠道菌的多重qPCR引物和探针，包括用于检测多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和毛螺菌的一对引物和四条探针；其中，用于同时检测多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和毛螺菌的引物T2DM-F1/R1的序列依次如SEQ IDNO.1～2所示，用于检测多形拟杆菌的探针BT-P1的序列如SEQ ID NO.3所示，用于检测柔嫩梭菌的探针CL-P2的序列如SEQ ID NO.4所示，用于检测球形梭菌的探针CC-P1的序列如SEQID NO.5所示，用于检测毛螺菌的探针LB-P2的序列如SEQ ID NO.6所示，所述四条探针的5’端标记有不同的荧光发射基团，3’端标记有淬灭基团。
优选地，SEQ ID NO.3所示探针的5’端荧光发射基团为FAM，SEQ ID NO.4所示探针的5’端荧光发射基团为VIC，SEQ ID NO.5所示探针的5’端荧光发射基团为Cy5，SEQ IDNO.6所示探针的5’端荧光发射基团为TEXAS RED，3’端淬灭基团均为BHQ1，见实施例1。
本发明还提供了一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法，包含以下步骤：
S1.提取待测样本中的核酸；
S2.以步骤S1所得核酸为模板，用SEQ ID NO.1～2所示引物和SEQ ID NO.3～6所示探针进行qPCR反应；
S3.反应结束后，通过探针序列上所携带的不同荧光通道曲线及Ct值判断结果，若出现扩增曲线且Ct值≤38，则代表对应菌的检测结果为阳性。
其中，所述待测样本可为粪便。
优选地，步骤S2所述qPCR反应的反应体系为：待检测核酸样本5μL，5×DNA PCRBuffer 5μL，40pmol/μL的T2DM-F1 0.25μL，40pmol/μL的T2DM-R1 0.25μL，20pmol/μL的BT-P1 0.15μL，20pmol/μL的CC-P1 0.5μL，20pmol/μL的CL-P20.5μL，20pmol/μL的LB-P2 0.25μL，酶系3μL，dNTPs 1μL，H2O 9.1μL，见实施例2。
其中，所述dNTPs中含有2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸盐(dUTP)；所述酶系中包含0.5μL的热启动Taq酶和0.5μL的尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)，其余为酶稀释液。
UDG酶的加入可以防止扩增产物的污染，UDG酶的作用机理是选择性水解断裂含有dUTP的双链或者单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成有缺失碱基的DNA链，使其在碱性介质以及高温下进一步水解断裂，从而被消除。
优选地，步骤S2所述qPCR反应的反应程序为：50℃，2min，1个循环；95℃，15min，1个循环；94℃，15sec，55℃，45sec，40个循环，见实施例2。
本发明还提供一种2型糖尿病易感肠道菌的检测试剂盒，其含有权利要求1所述多重qPCR引物和探针，dNTPs以及qPCR反应所需酶试剂。
优选地，所述酶试剂为热启动Taq酶，见实施例2。
优选地，所述试剂盒中还含有尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)和含2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸盐(dUTP)的dNTPs，见实施例2。
优选地，所述试剂盒中还包含多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌目的基因的重组质粒作为阳性质控品，以及灭菌生理盐水作为阴性质控品，见实施例2。
本发明具有以下有益效果：
本发明利用多重荧光PCR技术，通过对引物、探针的设计筛选及反应体系的优化，建立了2型糖尿病易感肠道菌，即多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和毛螺菌的检测方法，实现了四种菌的一管多重检测，具有检测特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性好、准确度高的优点，且操作简单快捷、节约耗材、成本低廉，可作为多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌的定性检测试剂，为2型糖尿病的研究提供快速、特异、可重复的检测手段。
附图说明
图1为多形拟杆菌检测引物及探针的灵敏度检测结果。
图2为柔嫩梭菌检测引物及探针的灵敏度检测结果。
图3为球形梭菌检测引物及探针的灵敏度检测结果。
图4为毛螺菌检测引物及探针的灵敏度检测结果。
图5为多重qPCR引物和探针的特异性检测结果。
图6为多形拟杆菌检测引物及探针在干扰物质存在条件下的检测结果。
图7为柔嫩梭菌检测引物及探针在干扰物质存在条件下的检测结果。
图8为球形梭菌检测引物及探针在干扰物质存在条件下的检测结果。
图9为毛螺菌检测引物及探针在干扰物质存在条件下的检测结果。
图10为多形拟杆菌检测引物及探针的精密度检测结果。
图11为柔嫩梭菌检测引物及探针的精密度检测结果。
图12为球形梭菌检测引物及探针的精密度检测结果。
图13为毛螺菌检测引物及探针的精密度检测结果。
图14为疑似糖尿病患者的实际临床样本检测结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1多重qPCR引物和探针的设计及筛选
本发明利用多重荧光PCR技术，以2型糖尿病患者易感的四种肠道菌，即多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌的16S rRNA的高度保守区为靶区域，设计了3对特异性引物，并针对每种菌各设计了2条Taqman探针。所用基因的基因登录号依次为：CP012937.1、CAJJWU010000001.1、CAJTKH010000001.1、PEDL01000001.1。通过单通道引物探针NTC测试和四通道引物探针测试，从中筛选出一组可用于同时检测上述四种肠道菌，且检测效果好的qPCR引物和探针。筛选过程如下所述：
(1)单通道引物探针NTC测试
将设计合成的3对特异性引物与4种菌的特异性探针(每种菌各2条特异性探针)分别排列组合后(共24种引物探针组合)，配制成单一PCR反应液，并将构建的含有多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌目的基因的重组质粒依10倍稀释成4个梯度浓度作为阳性模板，分别进行进行单通道NTC检测，选择出NTC无非特异性扩增且阳性模板扩增效率好的引物探针。
通过测试从3对特异性引物中筛选出了2对引物，每个菌的特异性探针筛选出一条，再进行四通道的组合测试。
(2)四通道引物探针测试
将经确认后的2对引物分别与4种菌的探针组合配制成PCR反应体系，同时将构建的重组质粒10倍稀释成4个梯度浓度做为阳性模板，进行NTC检测，选择出NTC无非特异性扩增且阳性模板扩增效率好的引物探针。
通过单通道引物探针NTC测试和四通道引物探针测试，最终筛选得到了一组可用于同时检测多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌这四种肠道菌的qPCR引物和探针，如表1所示：
表1多重qPCR的引物及探针序列
Figure BDA0003198911550000051
Figure BDA0003198911550000061
实时荧光PCR的基本原理为：在PCR反应体系中加入一种荧光基团，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，通过荧光信号不断累积监测PCR全程从而对样本中的病原体核酸进行定量或定性。
本发明最终筛选得到的用于同时检测多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和毛螺菌的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示；用于检测多形拟杆菌的探针序列如SEQ ID NO.3所示，其5’端荧光发射基团为FAM；用于检测柔嫩梭菌的探针序列如SEQ ID NO.4所示，其5’端荧光发射基团为VIC；用于检测球形梭菌的探针序列如SEQ ID NO.5所示，其5’端荧光发射基团为Cy5；用于检测毛螺菌的探针序列如SEQ ID NO.6所示，其5’端荧光发射基团为TEXASRED，3’端淬灭基团均为BHQ1。
实施例2多重qPCR检测方法的建立及检测试剂盒
以构建所得的多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌的重组质粒为模板，用实施例1中筛选得到的引物和探针构建多重qPCR检测方法，并进行优化。
反应体系的优化：
(1)优化引物探针的用量
将经筛选确认得到的引物探针组合配制成PCR反应体系，调整引物探针的用量，配制成多个体系，并将合成的质粒10倍稀释成4个梯度浓度做为阳性模板进行扩增检测，选定合适的引物探针的用量。
表2多重qPCR的引物及探针用量的优化
物料名称 体系1 体系2 体系3 体系4 体系5
5×DNA PCR Buffer 5μL 5μL 5μL 5μL 5μL
T2DM-F1(40pmol/μL) 0.25μL 0.25μL 0.25μL 0.25μL 0.25μL
T2DM-R1(40pmol/μL) 0.25μL 0.25μL 0.25μL 0.25μL 0.25μL
BT-P1(20pmol/μL) 0.25μL 0.15μL 0.15μL 0.15μL 0.15μL
CC-P1(20pmol/μL) 0.25μL 0.25μL 0.5μL 0.5μL 0.5μL
CL-P2(20pmol/μL) 0.25μL 0.25μL 0.25μL 0.5μL 0.5μL
LB-P2(20pmol/μL) 0.25μL 0.25μL 0.25μL 0.25μL 0.35μL
酶及酶稀释液 3μL 3μL 3μL 3μL 3μL
dNTPs 1μL 1μL 1μL 1μL 1μL
H<sub>2</sub>O 9.5μL 9.6μL 9.35μL 9.1μL 9μL
将按表2配制好的反应体系置于qPCR仪中，设置50℃，2min，1个循环；95℃，15min，1个循环；94℃，15sec，55℃，45sec，40个循环，用于收集荧光。
检测结果显示：体系4相对于其他体系，样本荧光信号高度适中，4通道的Ct值接近，重复性好；因此，最终确定引物、探针的的用量为体系4。
(2)优化热启动Taq酶、UDG酶的用量
将经筛选确认得到的引物探针组合配制成PCR反应体系，采用不同量的热启动Taq酶，分别为2.5U、5U、7.5U，配制成多个体系(体系1、体系2、体系3)，并将合成的质粒10倍稀释成4个梯度浓度做为阳性模板进行扩增检测，选定合适的热启动Taq酶的用量。
将经筛选确认得到的引物探针组合配制成PCR反应体系，采用不同量的UDG酶，分别为0.25U、0.5U、0.75U，配制成多个体系(体系4、体系5、体系6)，取数量级为103copies/mL的扩增产物作为污染源(待检样本)进行检测。
表3热启动Taq酶、UDG酶用量的优化
Figure BDA0003198911550000071
Figure BDA0003198911550000081
PCR反应体系采用不同量(2.5U、5U、7.5U)的热启动Taq酶，于不同的反应管同时进行检测。结果发现，酶量为5U时各浓度模板的扩增效率较好，最终确定热启动Taq酶的最佳反应浓度为5U/20μL体系。
PCR反应体系采用不同量(2.5U、5U、7.5U)的UDG酶，于不同的反应管同时进行检测。结果发现，酶量为0.5U、0.75U时扩增产物的检测结果均为阴性，最终确定UDG酶的最佳反应浓度为0.5U/20μL体系。
经一系列优化后，本发明最终确定检测多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌这四种肠道菌的多重qPCR方法的反应体系程序为：50℃，2min，1个循环；95℃，15min，1个循环；94℃，15sec，55℃，45sec，40个循环；反应体系如表4所示：
表4多重qPCR方法的反应体系
Figure BDA0003198911550000082
Figure BDA0003198911550000091
表4所用dNTPs中含有2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸盐(dUTP)；所用酶系中包含0.5μL的热启动Taq酶和0.5μL的尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)，其余为热启动酶稀释液。
UDG酶的加入可以防止扩增产物的污染，UDG酶的作用机理是选择性水解断裂含有dUTP的双链或者单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成有缺失碱基的DNA链，使其在碱性介质以及高温下进一步水解断裂，从而被消除。
在所设计的引物、探针以及所构建的检测方法的基础上，本发明还提供了一种2型糖尿病易感肠道菌的检测试剂盒，所述试剂盒中包含SEQ ID NO.1～2所示引物和SEQ IDNO.3～6所示探针，dNTPs以及qPCR反应所需酶试剂；试剂盒中还包含多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌目的基因的重组质粒作为阳性质控品，以及灭菌生理盐水作为阴性质控品。
qPCR反应所需酶试剂可以为热启动Taq酶。
为获得更佳的检测效果，还可在试剂盒中加入含有尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)和含2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸盐(dUTP)的dNTPs。
实施例3多重qPCR引物和探针的灵敏度检测
将已定值的实施例2所述重组质粒混合后作为初始样本，稀释至浓度为106copies/mL，依次稀释至105、104、103以及500copies/mL作为待测样本，测试多重qPCR引物和探针的灵敏度，反应体系及反应条件同实施例2。
为避免曲线重叠影响查看，本发明通过检测探针所对应的荧光通道对结果分别进行了观察。qPCR引物和探针的灵敏度检测结果如图1～4所示，图1～4依次为多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌的检测引物及探针的灵敏度检测结果，由图可知，梯度稀释后的样本的检测结果线性较好，灵敏度高，最低检测限均为500copies/mL。
实施例4多重qPCR引物和探针的特异性检测
为检测本发明所述多重qPCR引物和探针的特异性，本发明以产气杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、消化链球菌作为特异性参考品，进行了特异性检测，反应体系及反应条件同实施例2。结果如图5所示，由图可知，本发明所设引物和探针的特异性高，与其他常见肠道细菌，包括产气杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、消化链球菌等无交叉反应，检测特异性高。
实施例5干扰物质测试结果
分别向103copies/mL的球形梭菌、柔嫩梭菌、多形拟杆菌和毛螺菌的目的基因的重组质粒中加入二甲双胍(2.5mg/μL)、阿卡波糖(0.5mg/μL)、西格列汀(0.5mg/μL)、罗格列酮(0.02mg/μL)、达格列净(0.025mg/μL)作为干扰物质测试样本，以不含干扰物质的样本作为对照，测试干扰物质对引物探针扩增的影响。为避免曲线重叠影响查看，本发明通过检测探针所对应的荧光通道对结果分别进行了观察。实验结果如图6～9所示，图6～9依次为多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌检测引物及探针在干扰物质存在条件下的检测结果。上述结果表明，在外源物质甲双胍、阿卡波糖、西格列汀、罗格列酮和达格列净等存在时，本发明所设检测引物及探针的检测效果不受影响，稳定性好，准确度高。
实施例6多重qPCR引物和探针的精密度检测
将实施例2中构建的多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌的重组质粒分别稀释至105copies/mL和103copies/mL作为参考品，进行精密度检测，分别重复10次。为避免曲线重叠影响查看，本发明通过检测探针所对应的荧光通道对结果分别进行了观察。实验结果如图10～13所示，图10～13依次为多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌检测引物及探针的精密度检测结果，由图可知，检测重复性较好。
实施例7实际临床样本的检测
本发明收集并提取了12例疑似为2型糖尿病患者的粪便样本的核酸，阴性质控品同步参与提取；参照实施例2的检测方法，取5μL核酸样本加入配制好PCR反应体系中，在实时荧光PCR仪中进行扩增反应。12例临床样本的检测结果如图14所示，检测结果均为阳性，表明本发明所述检测方法可用于2型糖尿病患者易感肠道菌的检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东君道营养科技有限公司
<120> 一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaaggtggg gatgacgtc 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgatccgcg attactagca a 21
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagaaggcag ctacctggtg acaggatgc 29
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgcgaggtg gagcaaaacc ctaa 24
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttgagcgaat cccaaaaata acgtccca 28
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aagcaagacc gcgaggtgga gcaa 24

Claims (10)

1.一种检测2型糖尿病易感肠道菌的多重qPCR引物和探针，其特征在于，包括用于检测多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和毛螺菌的一对引物和四条探针；其中，用于同时检测多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和毛螺菌的引物T2DM-F1/R1的序列依次如SEQ ID NO.1～2所示，用于检测多形拟杆菌的探针BT-P1的序列如SEQ ID NO.3所示，用于检测柔嫩梭菌的探针CL-P2的序列如SEQ ID NO.4所示，用于检测球形梭菌的探针CC-P1的序列如SEQ IDNO.5所示，用于检测毛螺菌的探针LB-P2的序列如SEQ ID NO.6所示，所述四条探针的5’端标记有不同的荧光发射基团，3’端标记有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述引物和探针，其特征在于，SEQ ID NO.3所示探针的5’端荧光发射基团为FAM，SEQ ID NO.4所示探针的5’端荧光发射基团为VIC，SEQ ID NO.5所示探针的5’端荧光发射基团为Cy5，SEQ ID NO.6所示探针的5’端荧光发射基团为TEXAS RED，3’端淬灭基团均为BHQ1。
3.一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：
S1.提取待测样本中的核酸；
S2.以步骤S1所得核酸为模板，用权利要求1所述引物和探针进行qPCR反应；
S3.反应结束后，通过探针序列上所携带的不同荧光通道曲线及Ct值判断结果，若出现扩增曲线且Ct值≤38，则代表对应菌的检测结果为阳性。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S2所述qPCR反应的反应体系为：待检测核酸样本5μL，5×DNA PCR Buffer 5μL，40pmol/μL的T2DM-F1 0.25μL，40pmol/μL的T2DM-R1 0.25μL，20pmol/μL的BT-P1 0.15μL，20pmol/μL的CC-P1 0.5μL，20pmol/μL的CL-P2 0.5μL，20pmol/μL的LB-P2 0.25μL，酶系3μL，dNTPs 1μL，H2O 9.1μL。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S2所述qPCR反应的反应程序为：50℃，2min，1个循环；95℃，15min，1个循环；94℃，15sec，55℃，45sec，40个循环。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述酶系中含有热启动Taq酶和尿嘧啶DNA糖基化酶，所述dNTPs中还含有2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸盐。
7.一种2型糖尿病易感肠道菌的检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述多重qPCR引物和探针，dNTPs以及qPCR反应所需酶试剂。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述酶试剂为热启动Taq酶。
9.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有尿嘧啶DNA糖基化酶和含2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸盐的dNTPs。
10.根据权利要求7～9任一所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌目的基因的重组质粒作为阳性质控品，以及灭菌生理盐水作为阴性质控品。
CN202110898736.5A 2021-08-05 2021-08-05 一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒 Pending CN113637780A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110898736.5A CN113637780A (zh) 2021-08-05 2021-08-05 一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110898736.5A CN113637780A (zh) 2021-08-05 2021-08-05 一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113637780A true CN113637780A (zh) 2021-11-12

Family

ID=78419895

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110898736.5A Pending CN113637780A (zh) 2021-08-05 2021-08-05 一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113637780A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101033486A (zh) * 2006-03-08 2007-09-12 缪金明 一种新型荧光定量pcr检测技术
WO2019078765A2 (ru) * 2017-10-20 2019-04-25 Общество с ограниченной ответственностью "Кномикс" Система детекции наиболее значимых прокариотических представителей микробиоты кишечника человека на основе пцр панели
CN109797190A (zh) * 2019-03-11 2019-05-24 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 一种用于评估ii型糖尿病风险的微生物标志物及其应用
CN110904250A (zh) * 2019-10-29 2020-03-24 知几未来（成都）临床医学检验有限公司 用于检测多种菌的多重荧光定量pcr引物、试剂盒及检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101033486A (zh) * 2006-03-08 2007-09-12 缪金明 一种新型荧光定量pcr检测技术
WO2019078765A2 (ru) * 2017-10-20 2019-04-25 Общество с ограниченной ответственностью "Кномикс" Система детекции наиболее значимых прокариотических представителей микробиоты кишечника человека на основе пцр панели
CN109797190A (zh) * 2019-03-11 2019-05-24 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 一种用于评估ii型糖尿病风险的微生物标志物及其应用
CN110904250A (zh) * 2019-10-29 2020-03-24 知几未来（成都）临床医学检验有限公司 用于检测多种菌的多重荧光定量pcr引物、试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
江美玲等: "2型糖尿患者肠道菌群特征分析", 《广东医学》, vol. 34, no. 13, 10 July 2013 (2013-07-10), pages 2006 - 2010 *
热比亚·努力等: "维吾尔族新发2型糖尿病患者肠道乳杆菌属和多形拟杆菌的定量研究", 《中国微生态学杂志》, vol. 30, no. 06, 15 June 2018 (2018-06-15), pages 621 - 627 *
马苏娴等: "2型糖尿病患者肠道菌群变化及意义", 《山东医药》, vol. 57, no. 16, 28 April 2017 (2017-04-28), pages 20 - 23 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112458193B (zh) 基于pcr-量子点荧光法的肠道菌群核酸检测试剂盒及检测方法
CN110904250B (zh) 用于检测多种菌的多重荧光定量pcr引物、试剂盒及检测方法
CN111440886A (zh) 一种快速检测碳青霉烯酶基因的引物组、试剂盒及检测方法
CN105779625B (zh) 一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量pcr引物、试剂盒及方法
CN107523619A (zh) 包含mcr基因的耐药菌的PCR检测试剂盒及其应用
CN117051142A (zh) 一种布鲁氏菌TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测引物及应用
CN111394487B (zh) 用于检测结核杆菌及其耐药性的方法
JP5961171B2 (ja) 毒素産生性クロストリディウム・ディフィシルの検出方法
CN107083446B (zh) 腹泻病原菌多重基因检测体系及其试剂盒和应用
Wang et al. A CRISPR-Cas12a-based platform facilitates the detection and serotyping of Streptococcus suis serotype 2
CN110656188A (zh) 检测引发血流感染的杆菌的引物和/或探针组合物及其应用
CN109988854A (zh) 用于检测致病鲍特杆菌的寡核苷酸组合、方法及试剂盒
CN113046452B (zh) 一种用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物及其应用
CN103421892B (zh) 鉴别空肠弯曲菌及大环内酯类耐药突变的荧光pcr方法
CN110684854A (zh) 用于检测幽门螺杆菌耐药突变位点的引物和探针组及应用
KR20210046887A (ko) 결핵균 및 비결핵항산균을 동시에 감별하여 검출할 수 있는 고감도 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트
CN113637780A (zh) 一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒
WO2005030027A2 (en) Salmonella detection identification
KR102223951B1 (ko) 리얼타임 ｐｃｒ을 이용한 여성의 질액 내지는 질 유래물질 검출 키트 및 방법
CN113736894B (zh) 四种肠道保护菌的检测方法及核酸检测试剂盒
CN107523620A (zh) 包含产ndm耐药菌的pcr检测试剂盒及其应用
CN107523618A (zh) 包含产碳青霉烯酶基因的耐药菌的pcr检测试剂盒及其应用
KR102572368B1 (ko) 파라인플루엔자 바이러스 1형 및 3형 동시 감별 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102250376B1 (ko) 마이코플라즈마 폐렴균 및 마이코플라즈마 폐렴균 돌연변이 동시 검출용 프라이머와 프로브 및 이의 용도
CN114836581B (zh) 用于检测消化道感染性疾病病原体的引物组合

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20211112