CN110106227A - 一种检测食用油中菌落总数的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测食用油中菌落总数的方法，包括如下步骤：取油样于灭菌锥形瓶中，加入灭菌液体石蜡和灭菌吐温80，超声后放入摇床中震荡混合；将混合液加入灭菌生理盐水，最后将其放入水浴锅中充分乳化；使用无菌生理盐水将乳化后的混合液进行系列稀释得到样液；将融化并冷却的培养基倾注到平皿内，待其凝固后取样液均匀涂布在培养基上，置于恒温培养箱中培养；先用肉眼观察，点数菌落数，求出同一稀释度各平皿的平均菌落数；计算得到菌落总数，本发明可将待测油样均匀分散于灭菌生理盐水中，形成均匀的溶液，有助于准确测定食用油中菌落总数；且选用的培养基，解决了普通的培养基难以满足检测需求的问题，可帮助有效地检测到菌落总数。
Description
技术领域
本发明涉及食用油检测领域，尤其涉及一种检测食用油中菌落总数的方法。
背景技术
菌落总数是指食品检样经过处理后，在一定条件下培养后，所得1mL(或1g)检样形成菌落的总数。菌落总数指的是产品中所有需氧微生物含量的高低，是衡量产品受污染程度的一项重要指标，可以用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，反映着食品在生产过程中的卫生状况。
食用油中水分含量低，不适合微生物的生长。但是如果食用油在贮藏或使用过程中处理不当，也很容易受到微生物的污染，特别是有明水存在时。在水分足够多的情况下，油脂是能够滋生微生物的，微生物的过度繁殖会产生不良风味，而且不饱和脂肪酸会发生酸败，更容易加速油脂变质。
所以，检测食用油中菌落总数对油脂的贮藏，运输和加工具有重要的指导意义。厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于培养条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，而且菌落总数并不能区分细菌的种类。
另一方面，油脂的特性也决定了其微生物检测的难度，通常来说，进行微生物的测定时需要将样品均匀分散于灭菌生理盐水中，形成均匀的溶液，然后再接种于平板上或者进行其他操作。然而食用油不溶于水，所以不能与生理盐水形成均一的分散体系，即与生理盐水形成均匀的稀释液，造成检测无法实施，必须要对其进行乳化。
此外，普通的培养基也很难满足其需求，因此乳化的效果和培养基的选取是食用油中微生物检测的重难点问题。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种检测食用油中菌落总数的方法，解决了食用油难以溶于水而无法检测微生物菌落的问题，对油脂中微生物指标的测定具有重要的指导意义。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测食用油中菌落总数的方法，包括如下步骤：
步骤1：样品处理：取油样于灭菌锥形瓶中，加入灭菌液体石蜡和灭菌吐温80，超声后放入摇床中震荡混合，得到混合液；选取吐温80和液体石蜡作为乳化的表面活性剂，可增强乳化的效果；
步骤2：乳化：将上步骤1的混合液加入灭菌生理盐水，最后将其放入水浴锅中充分乳化；混合液与生理盐水形成均匀的稀释液，将乳化后油样和生理盐水充分混合，形成均匀的溶液，使油脂中的微生物能均匀的分布于生理盐水中；这样可以使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在，保证检测的准确性；
步骤3：稀释：使用无菌生理盐水将步骤2乳化后的混合液进行10倍的系列稀释得到样液，系列稀释是对乳化后的混合液依次10倍稀释，得到不同稀释度的混合液，用不同浓度的稀释液分别做实验，最后取培养琼脂平板上出现单个的菌落时的浓度进行计数，经过计算，得出菌液含菌量；
步骤4：取样和培养：在无菌工作台中，将融化并冷却的培养基倾注到平皿内，待其凝固后取样液均匀涂布在培养基上，置于恒温培养箱中培养；
步骤5：计算：首先选取平均菌落数在30-300之间的平皿，作为菌落总数测定的范围；当只有一个稀释度的平均菌落符合此范围时，以该平均菌落数符合此范围的平皿的菌落数乘以其稀释倍数，得到菌落总数，计算过程中若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数；若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以二，以代表全皿菌落数。
优选地，所述步骤1中油样、灭菌液体石蜡和灭菌吐温80的体积比为0.8～1:1.6～2:0.8～1，优选的体积比为1:2:1。
优选地，所述步骤1中，混合液经超声4-6min后，放入40-50℃摇床中震荡混合15-25min。
优选地，所述步骤2中将混合液加入70-80ml灭菌生理盐水，所述步骤2中往混合液加入灭菌生理盐水，混合液与灭菌生理盐水的体积比为0.8～1：2.4～3，优选的体积比为1:3。
优选地，所述步骤2中，将混合液加入灭菌生理盐水后，放入40-50℃水浴锅中充分乳化25-35min。
优选地，所述步骤4与步骤5之间还包括步骤a，步骤a为计数：先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用5-10倍放大镜检查，记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿的平均菌落数。
优选地，所述步骤4中，将融化并冷却至45℃-50℃的培养基倾注到平皿内，每皿10-20ml，待其凝固后取样液均匀涂布在培养基上，置于35-42℃恒温培养箱中培养45-51h，选取45-50℃注入，可以防止烫手，且导入培养皿中时不会因突然遇冷在壁上产生水珠而影响涂布；以及，固体培养基通常40℃左右开始凝固，且好氧微生物通常耐受温度不是很高，选用45-50℃可以加快凝固。
优选地，所述步骤4中采用营养琼脂培养基，每1000ml营养琼脂培养基中含有蛋白胨20g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g、卵磷脂1g、吐温80 7g和蒸馏水1000m1，PH值范围为7.1-7.4。
优选地，所述步骤4的营养琼脂培养基的制法为：先将1g卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入7g吐温80将其他成分(除琼脂外)加到其余的蒸馏水中溶解，加入已溶解的卵磷脂、吐温80混匀，调pH值为7.1—7.4，加入琼脂，121℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。
优选地，所述食用油采用棕榈油。
有益效果：未经过处理的食用油一般不溶于水，所以不能与生理盐水形成均一的分散体系，导致不能对其进行菌落总数的检测；而现有检测方法中，对食用油的处理不充分使食用油难以均匀分散在稀释液中，导致培养过程中得到菌落总数不准确，影响检测的结果；本发明的乳化步骤可将待测油样与生理盐水形成均一的分散体系，形成均匀的稀释液，可以使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在，准确测定食用油中菌落总数。
且现有检测方法中采用其它的培养基，而一些受厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于培养条件不能满足其生理需求，因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，本发明应用琼脂营养培养基，解决了普通的培养基难以满足检测需求的问题，使受厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌正常繁殖生长，有效地得到实际的细菌总数，以及准确地检测到菌落总数。
附图说明
图1是本发明的步骤流程图；
图2是本发明实施例棕榈油中菌落总数轻度污染程度的示意图；
图3是本发明实施例棕榈油中菌落总数中度污染程度的示意图；
图4是本发明实施例棕榈油中菌落总数重度污染程度的示意图。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
请参阅图1，一种检测食用油中菌落总数的方法，包括如下步骤：
步骤1：样品处理：取8ml棕榈油油样于灭菌锥形瓶中，加入4ml灭菌液体石蜡和8ml灭菌吐温80，超声4min后放入40℃摇床中震荡混合15min，选取吐温80作为乳化的表面活性剂，可增强乳化的效果，液体石蜡和吐温80从现有技术中化学试剂，对其灭菌的方式采用121℃高压灭菌25min；
步骤2：乳化：将上步骤1的混合液加入70ml灭菌生理盐水，最后将其放入40℃水浴锅中充分乳化25min，乳化油脂，可帮助油脂分布均匀，与生理盐水形成均匀的稀释液，将乳化后油样和生理盐水充分混合，形成均匀的溶液，使油脂中的微生物能均匀的分布于生理盐水中；这样可以使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在，保证检测的准确性；
步骤3：稀释：使用无菌生理盐水将步骤2乳化后的混合液进行10倍系列稀释得到样液；避免稀释过度，采用不同浓度的稀释液分别做实验，最后取营养琼脂培养基上出现单个的菌落时的浓度进行计数，经过计算可得出准确得出菌液含菌量；
步骤4：取样和培养：在无菌工作台中，将融化并冷却至45℃的培养基倾注到平皿内，每皿10ml，待其凝固后取样液均匀涂布在培养基上，置于35℃恒温培养箱中培养45h，选取45℃注入，可以防止烫手，且导入培养皿中时不会因突然遇冷在壁上产生水珠而影响涂布；以及，固体培养基通常40℃左右开始凝固，且好氧微生物通常耐受温度不是很高，选用45℃可以加快凝固。
所述步骤4中采用营养琼脂培养基，每1000ml营养琼脂培养基中含有蛋白胨20g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g、卵磷脂1g、吐温80 7g和蒸馏水1000m1，PH值范围为7.1-7.4。
每1000ml营养琼脂培养基中含有蛋白胨20g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g、卵磷脂1g、吐温80 7g和蒸馏水1000m1，PH值范围为7.1；其制法为：先将1g卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入7g吐温80将其他成分(除琼脂外)加到其余的蒸馏水中溶解，加入已溶解的卵磷脂、吐温80混匀，调pH值为7.1，加入琼脂，121℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。
步骤a：计数：先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用5倍放大镜检查，可防止遗漏，记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿的平均菌落数。
在计数过程中若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数；若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以二，以代表全皿菌落数。
步骤5：计算：首先选取平均菌落数在30-300之间的平皿，作为菌落总数测定的范围；当只有一个稀释度的平均菌落符合此范围时，以该平均菌落数符合此范围的平皿的菌落数乘以其稀释倍数，得到菌落总数，若存在其他情况，参考国标GB4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》。
菌落计数的报告：菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示。
实施例2
请参阅图1，一种检测食用油中菌落总数的方法，包括如下步骤：
步骤1：样品处理：取12ml棕榈油油样于灭菌锥形瓶中，加入6ml灭菌液体石蜡和12ml灭菌吐温80，超声6min后放入50℃摇床中震荡混合25min，选取吐温80作为乳化的表面活性剂，可增强乳化的效果，液体石蜡和吐温80从现有技术中化学试剂，对其灭菌的方式采用121℃高压灭菌35min；
步骤2：乳化：将上步骤1的混合液加入80ml灭菌生理盐水，最后将其放入50℃水浴锅中充分乳化35min，乳化油脂，可帮助油脂分布均匀，与生理盐水形成均匀的稀释液，将乳化后油样和生理盐水充分混合，形成均匀的溶液，使油脂中的微生物能均匀的分布于生理盐水中；这样可以使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在，保证检测的准确性；
步骤3：稀释：使用无菌生理盐水将步骤2乳化后的混合液进行10倍系列稀释得到样液；避免稀释过度，采用不同浓度的稀释液分别做实验，最后取琼脂平板上出现单个的菌落时的浓度进行计数，经过计算可得出准确得出菌液含菌量。
步骤4：取样和培养：在无菌工作台中，将融化并冷却至50℃的培养基倾注到平皿内，每皿20ml，待其凝固后取样液均匀涂布在培养基上，置于42℃恒温培养箱中培养51h，选取50℃注入，可以防止烫手，且导入培养皿中时不会因突然遇冷在壁上产生水珠而影响涂布；以及，固体培养基通常40℃左右开始凝固，且好氧微生物通常耐受温度不是很高，选用50℃可以加快凝固。
每1000ml营养琼脂培养基中含有蛋白胨20g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g、卵磷脂1g、吐温80 7g和蒸馏水1000m1，PH值范围为7.4；其制法为：先将1g卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入7g吐温80将其他成分(除琼脂外)加到其余的蒸馏水中溶解，加入已溶解的卵磷脂、吐温80混匀，调pH值为7.4，加入琼脂，121℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。
步骤a：计数：先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用10倍放大镜检查，可防止遗漏，记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿的平均菌落数。
在计数过程中若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数；若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以二，以代表全皿菌落数。
步骤5：计算：首先选取平均菌落数在30-300之间的平皿，作为菌落总数测定的范围；当只有一个稀释度的平均菌落符合此范围时，以该平均菌落数符合此范围的平皿的菌落数乘以其稀释倍数，得到菌落总数，若存在其他情况，参考国标GB4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》。
菌落计数的报告：菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示。
实施例3
请参阅图1，一种检测食用油中菌落总数的方法，包括如下步骤：
步骤1：样品处理：取10ml棕榈油油样于灭菌锥形瓶中，加入5ml灭菌液体石蜡和10ml灭菌吐温80，超声5min后放入45℃摇床中震荡混合20min，选取吐温80作为乳化的表面活性剂，可增强乳化的效果，液体石蜡和吐温80从现有技术中化学试剂，对其灭菌的方式采用121℃高压灭菌30min；
步骤2：乳化：将上步骤1的混合液加入75ml灭菌生理盐水，最后将其放入45℃水浴锅中充分乳化30min，乳化油脂，可帮助油脂分布均匀，与生理盐水形成均匀的稀释液，将乳化后油样和生理盐水充分混合，形成均匀的溶液，使油脂中的微生物能均匀的分布于生理盐水中；这样可以使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在，保证检测的准确性；
步骤3：稀释：使用无菌生理盐水将步骤2乳化后的混合液进行10倍系列稀释得到样液；避免稀释过度，采用不同浓度的稀释液分别做实验，最后取琼脂平板上出现单个的菌落时的浓度进行计数，经过计算可得出准确得出菌液含菌量。
步骤4：取样和培养：在无菌工作台中，将融化并冷却至45℃的培养基倾注到平皿内，每皿15ml，待其凝固后取样液均匀涂布在培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养48h，选取45℃注入，可以防止烫手，且导入培养皿中时不会因突然遇冷在壁上产生水珠而影响涂布；以及，固体培养基通常40℃左右开始凝固，且好氧微生物通常耐受温度不是很高，选用45℃可以加快凝固。
每1000ml营养琼脂培养基中含有蛋白胨20g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g、卵磷脂1g、吐温80 7g和蒸馏水1000m1，PH值范围为7.3；其制法为：先将1g卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入7g吐温80将其他成分(除琼脂外)加到其余的蒸馏水中溶解，加入已溶解的卵磷脂、吐温80混匀，调pH值为7.3，加入琼脂，121℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。
步骤a：计数：先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用10倍放大镜检查，可防止遗漏，记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿的平均菌落数。
在计数过程中若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数；若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以二，以代表全皿菌落数。
步骤5：计算：首先选取平均菌落数在30-300之间的平皿，作为菌落总数测定的范围；当只有一个稀释度的平均菌落符合此范围时，以该平均菌落数符合此范围的平皿的菌落数乘以其稀释倍数，得到菌落总数，若存在其他情况，参考国标GB4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》。
菌落计数的报告：菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示。
实施例4
请参阅图2-4，图2-4所示依次分别是本实施例以棕榈油检测所得到的轻度污染、中度污染和重度污染棕榈油平板。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测食用油中菌落总数的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：样品处理：取油样于灭菌锥形瓶中，加入灭菌液体石蜡和灭菌吐温80，超声后放入摇床中震荡，制得混合液；
步骤2：乳化：将上步骤1的混合液加入灭菌生理盐水，放入水浴锅中充分乳化；
步骤3：稀释：使用无菌生理盐水将步骤2乳化后的混合液进行系列稀释得到样液；
步骤4：取样和培养：在无菌工作台中，将融化并冷却的培养基倾注到平皿内，待其凝固后取样液均匀涂布在培养基上，置于恒温培养箱中培养；
步骤5：计算：首先选取平均菌落数在30-300之间的平皿，作为菌落总数测定的范围；当只有一个稀释度的平均菌落符合此范围时，以该平均菌落数符合此范围的平皿的菌落数乘以其稀释倍数，得到菌落总数。
2.根据权利要求1所述的一种检测食用油中菌落总数的方法，其特征在于，所述步骤1中油样、灭菌液体石蜡和灭菌吐温80的体积比为0.8～1:1.6～2:0.8～1。
3.根据权利要求1所述的一种检测食用油中菌落总数的方法，其特征在于，所述步骤1中，混合液经超声4-6min处理后，放入40-50℃摇床中震荡混合15-25min。
4.根据权利要求1所述的一种检测食用油中菌落总数的方法，其特征在于，所述步骤2中往混合液加入灭菌生理盐水，混合液与灭菌生理盐水的体积比为0.8～1：2.4～3。
5.根据权利要求4所述的一种检测食用油中菌落总数的方法，其特征在于，所述步骤2中，将混合液加入灭菌生理盐水后，放入40-50℃水浴锅中充分乳化25-35min。
6.根据权利要求1所述的一种检测食用油中菌落总数的方法，其特征在于，所述步骤4与步骤5之间还包括步骤a，步骤a为计数：先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大镜检查，记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿的平均菌落数。
7.根据权利要求1所述的一种检测食用油中菌落总数的方法，其特征在于，所述步骤4中，将融化并冷却至45℃-50℃的培养基倾注到平皿内，每皿10-20ml，待其凝固后取样液均匀涂布在培养基上，置于35-42℃恒温培养箱中培养45-51h。
8.根据权利要求1所述的一种检测食用油中菌落总数的方法，其特征在于，所述步骤4中采用营养琼脂培养基，每1000ml营养琼脂培养基中含有蛋白胨20g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g、卵磷脂1g、吐温80 7g和蒸馏水1000m1，PH值范围为7.1-7.4。
9.根据权利要求8所述的一种检测食用油中菌落总数的方法，其特征在于，所述步骤4的营养琼脂培养基制法为：先将1g卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入7g吐温80，再将除琼脂外的其他成分加到其余的蒸馏水中溶解，加入已溶解的卵磷脂、吐温80混匀，调pH值为7.1-7.4，加入琼脂，121℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。
10.根据权利要求1所述的一种检测食用油中菌落总数的方法，其特征在于，所述食用油采用棕榈油。
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