CN102329825A - 同时提取大豆油脂和大豆蛋白的微生物发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时提取大豆油脂和蛋白的微生物发酵方法，包括：(1)大豆预处理；(2)预处理后的大豆粉与KH₂PO₄等配制成液体培养基；(3)豆粉液体培养基灭菌；(4)将活化后的微生物菌种接入到步骤(3)中进行发酵；(5)发酵产物离心，分别得到游离油、乳状液、水解液和残渣；乳状液破乳，获得游离油；(6)调节水解液pH值，离心后用水清洗沉淀，再离心，将沉淀用水溶解后调节pH值，喷雾干燥或冷冻干燥。本发明以总油、总蛋白提取率为考察指标，兼顾游离油得率指标，确定豆粉发酵提取油脂最佳条件及破乳最佳条件，使原料中的油脂实际得率达到80％以上，蛋白得率达到80％以上。所得蛋白无苦味，蛋白中含盐量较低。

Description

同时提取大豆油脂和大豆蛋白的微生物发酵方法

技术领域

本发明涉及大豆油脂和大豆蛋白的提取方法，尤其涉及挤压膨化预处理后的大豆经微生物发酵同时提取油脂和蛋白的方法，属于大豆油脂和大豆蛋白的提取领域。 

背景技术

目前大豆油脂制取工艺有两种，一种是溶剂浸出法，另一种是机械压榨法。 

溶剂浸出法，出油率较高，粕中残油率低(＜1％，干基)，但是溶剂会有一些残留，对人体有着较大伤害，而且湿粕在高温脱溶过程中蛋白变性严重，有机溶剂的使用增加了工艺的繁琐性，设备投资大，能耗大，降低生产的安全性，造成环境污染。 

压榨法制油，油、饼质量差，豆粕中残油率高(5％～7％，干基)；粕中蛋白变性严重，只能用作肥料，造成大量优质植物蛋白浪费。 

在上世纪50年代国外学者把生物技术(酶)应用于油脂以探求更科学、健康、安全的提取方法。到上世纪90年代，由于水酶法技术不仅可以克服常规制油工艺在经济、环境、安全等多方面的弊端，且在提取油的同时可以有效的回收油料中其他营养物质，因此引起国内外学者的关注。水酶法提取研究逐步成为当前国内外食品工业的热点，水酶法提取技术是利用油料同时得到油脂和蛋白最理想方法，但也是研究难度较大的工艺方法，特别是低含油量的油料，最典型的是大豆，具有得油率较低的特点，以及酶解后蛋白与油脂所形成的乳状液难以破乳分离等技术难题。 

1973-1977年意大利科学家Montedoro，G和Petruccioli，G对酶法提取橄榄油进行相关的研究。1983年美国Fullbook用酶从菜籽与大豆中提取油与蛋白质，取得了预期的效果。1986年McGlone，o.C.和Canales，A.L.M，利用新的酶法技术成功的提取椰子油。1987年马来西亚科学家Cheah，S.C.，Augustin，M.A.利用酶法成功的提取了棕榈油。1988年泰国科学家Olsen，H.S.研究了多种植物种子水酶法制油初探。1993年Dominguez等对利用水酶法从大豆和向日葵籽中提取油脂进行相关研究，1995年他们又对酶处理后正己烷浸提大豆油脂进行相关研究。1994年意大利 科学家Ranalli，A，和Costantini，N.利用生物技术提取橄榄油，1995年Ranalli，A，和Costantini，N利用当时已有的技术和研究成果进一步研究了引入蛋白水解酶对橄榄油提取率的影响，1996年他们分析了蛋白水解酶制取橄榄油的物理和化学特性并且提出了工艺参数对橄榄油数量和质量的影响，并且针对蛋白酶的添加量对橄榄油得率的影响进行了分析。1997年巴西科学家Pereira-Freitas、Hartman和Couri等首次将轧坯后湿法挤压膨化技术应用于水酶法提取大豆油当中，他们指出经过热塑性挤压过程，有利于酶对细胞结构的破坏作用，减少非水化磷脂和促进蛋白质变性，减少乳液稳定性，从而提高提油率，使总油提取率达到88％左右。1997年Picuric-Jovanovic和K，Vrvaski等利用水酶法成功的提取李子核仁油，并且在第二年他们又研究水酶法提取油脂的工艺条件对李子核仁油的氧化稳定性的影响。2001年Y.B.Che Man和Suhardiyono等用Alcalase蛋白酶通过水酶法成功的提取了米糠油，并且通过响应面寻优的方法和验证实验得到了最大提油率为79％和蛋白提取率为68％。 

综合国外研究报道，水酶法制油大多局限于高含油作物，而对于低含油的大豆研究较少。 

中国对水酶法提油技术研究相对国外较晚。1992年自无锡轻工大学首次对酶法从全脂豆粉中同时制取大豆油和大豆水解蛋白的工艺进行初步研究。路线包括三步：第一，采取水提法将大豆中的蛋白质和油脂与不溶性残渣分离从而达到初步提取蛋白质和油的目的；第二步是采取酶法将与蛋白质相结合的油脂分离出来；第三步是通过破乳从乳化油中制备高质量的油脂。原料没有进行预处理且在提取油脂过程中经过两次酶解，由于当时生物酶技术的限制，所以只采用了碱性蛋白酶和中性蛋白酶进行水解，不仅工艺复杂，而且油脂提取率仅能达到65％左右。由于预处理技术、生物酶技术以及破乳技术不成熟等限制，自1994年后中国国内未见相关论文发表。2000年浙江大学何国庆教授指导博士研究生钱俊青对水酶有机溶剂提取大豆油进行了系统研究，经过研究得到了最佳酶的选择以及最佳酶解工艺条件和萃取条件，大豆油提取率达到84％左右，但由于当时技术的限制并没有摆脱有机溶剂的使用，以至从根本上解决水酶法提取大豆油的难点。 

目前，国内外还没有人对微生物发酵同时提取大豆油和蛋白进行相关的报道。 

微生物发酵法提取大豆油脂和蛋白相对于现有的水酶法技术有如下优势： 

优势一：成本低 

微生物发酵较水酶法的优势在于利用微生物在全脂豆粉中生长产酶的同时分 解蛋白，同时提取油脂及蛋白，避免了商品酶成本高，难保存的缺点，并且水解蛋白更充分，释放的游离油脂更多。 

优势二：所得蛋白品质好及工艺简单 

在植物油料中，油脂存在于油料细胞内，并通常与其他大分子(蛋白质和碳水化合物)结合在一起，构成脂多糖、脂蛋白等复合体。水酶法提油工艺是在机械破碎的基础上，利用酶进一步破坏细胞，分解脂蛋白、脂多糖等，从而使油从非油相中释放出来，从而同时得到蛋白与油脂。 

蛋白质在蛋白酶的作用下被水解成多肽或者氨基酸，这不仅有利于组织中含氮物质的提取回收，且由于蛋白质被水解溶出，引起细胞中与蛋白质相关的细胞质结构的崩溃以及包围着油脂的蛋白膜的破坏，从而释放出了油脂。不同酶在各自的最适作用条件下对油料作物中蛋白质的水解效果有很大差异，由于碱性蛋白酶对蛋白的水解能力最强，破坏程度最大，因而大多数水酶法都采用单一的碱性蛋白酶去提取油脂与蛋白，还没有人用多种蛋白酶系提取油与蛋白取得较好的效果。 

公开号CN101401658A的发明专利公开了一种水酶法从花生中提取油与水解蛋白的中试方法，该方法采用水酶法从花生中提取油与水解蛋白的中试方法，它以花生为原料，用单一的碱性蛋白酶——Alcalase碱性内切蛋白酶进行酶解，引入三相分离机同时分离油、油水混合物和不溶残渣，并使用碟片式离心机对分离得到的油水混合物进一步分离，得到乳状液和水解液。此方法适用于花生这种高含油作物提取制油工艺，因此提油较易，工艺相对来说较简单。 

公开号CN101602979A的发明专利公开了一种水酶法从大豆中提取油与蛋白的方法，该方法采用单一酶法从大豆中提取油与蛋白，所用的商品酶为Alcalase碱性内切蛋白酶。 

以上两项专利采用的Al ca lase碱性内切蛋白酶仅能从蛋白肽链内部水解蛋白，共同的缺点是生产的蛋白有苦味，并且在水酶法过程中为了保持酶良好的作用条件，需不断向豆粉溶液中滴加碱液，以保持恒定的pH值，但这样所产生的后果便是终产品蛋白中含有大量的盐，增加了工艺操作步骤(需除盐)； 

优势三：对乳状液的定量及油得率的计量方式更科学 

公开号CN101602979A发明专利的提油率是以总油提取率为标准的，这是不能作为实际提油率的指标来使用，不能说明总油提取率是多少实际提油率就是多少； 

公开号CN101602979A发明专利没有对酶解离心后各相中的油脂分布进行分 析，未对乳状液中的油脂含量进行测定，因此也就没有对最终实际所得油进行定量，本发明不仅对乳状液进行了定量，且对其油脂含量进行了测定，并对最终实际油得率进行了计量，因此更科学和准确。 

优势四：破乳效果更彻底 

在水酶法工艺中，评价提油与提蛋白的效果不能简单地仅以总油得率与水解蛋白得率作为考察指标。因为油料在提取的过程中将不可避免的形成乳状液(油包裹在乳状液中)，为提高总游离油得率，必须对所形成的乳状液进行破乳。因此评价生物法提取油脂的效果，必须综合考虑游离油得率、水解蛋白得率以及工艺中形成的乳状液的稳定性。 

假如所选用的方法能使形成的乳状液非常不稳定易于破乳，经过破乳操作以后，可以使总游离油得率达到相当高的水平，这样的工艺是最具有实际意义，易于产业化生产的。 

公开号CN101401658A的发明专利乳状液经冷冻解冻破乳后得到破乳油，优化后的工艺为：冷冻解冻的最适宜条件是-16℃冻结15h，35℃解冻2h，3500rpm离心20min，此时乳状液中油回收率达到92.16％。 

公开号CN101602979A的发明专利并未对所产的乳状液的破乳工艺进行阐述，只笼统提到“经破乳处理”；因此所得的油为乳化油，而非真正意义上的游离油。 

微生物发酵法是利用微生物在全脂豆粉中一边生长一边发酵产酶水解大豆原料，提油条件温和，油料蛋白的性能几乎不发生变化，油脂不经精炼过程就能得到高品质的油。但是以水为溶剂生物提取植物油的方法应用于向大豆这样低含油量的油料，效果较差，油脂提取率低。而大豆中所含的蛋白不仅量多，而且质量优异，是植物蛋白中的精品，因此，解决低含油量大豆油料生物法提取油脂的难题，意义重大。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有大豆油和蛋白提取方法所存在的设备复杂、污染严重，所得大豆油存在溶剂残留，营养价值低，大豆蛋白变性程度高等缺陷，提供一种同时提取大豆油脂和蛋白的微生物发酵方法，该方法设备简单、操作安全、污染少；所得大豆油无溶剂残留，分离得到的乳化油经破乳后无需精炼即可获得高品质的油，油中有益成分破坏少，营养价值高；大豆蛋白变性程度低，可利用价值高且投资少。 

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的： 

一种同时提取大豆油脂和蛋白的微生物发酵方法，包括以下步骤：(1)将大豆预处理；(2)预处理后的大豆粉与KH2PO4等配制成液体培养基；(3)豆粉液体培养基灭菌；(4)将活化后的微生物菌种接入到步骤(3)的液体培养基中进行发酵；(5)将发酵产物离心，分别得到游离油、乳状液、水解液和残渣；将乳状液破乳，获得游离油；(6)调节水解液pH值，离心，沉淀用水清洗后再离心，将沉淀用水溶解后调节pH值，喷雾干燥或冷冻干燥，获得大豆分离蛋白。 

其中，步骤(1)中大豆预处理的方式可以是挤压膨化、超声波或磨碎；本发明分别采用挤压膨化、超声波或磨碎等方式对大豆进行预处理，试验结果显示不同预处理条件下微生物发酵提取豆粉中油脂和蛋白，挤压膨化的效果最好，其次是超声波和磨碎的物料。这是因为物料在经过挤压机出口时，由于瞬间的高温高压作用，物料细胞壁破碎，大豆细胞内的蛋白与油脂充分暴露出来，这样就有利于微生物充分接触利用豆粉，同时发酵产生的酶也可直接水解蛋白，释放油脂；而在超声波处理过程中产生的“空化效应”，会释放巨大能量，产生高达几百个大气压的局部瞬间压力，形成冲击波，使介质受到极大的冲击力，这个能量足以使细胞破裂以达到破壁的目的，因此同样有利于发酵酶解的进行。与未接种的挤压膨化豆粉相比，接种膨化豆粉的总油和总蛋白提取率明显要高出许多，说明发酵有利于油与蛋白的提取。 

本发明人经过大量的试验发现经不同温度灭菌和时间处理后，大豆总油与总蛋白的提取率是不同的，采用80-105℃灭菌15-30分钟这一条件基本可达到本发明的效果。其中，未优化前的豆粉溶液在121℃，湿热灭菌15min时的总油与总蛋白提取率最高，分别为89％和80.3％，而在65℃条件下加热40min时，总油和总蛋白提取率仅为65.3％和61.74％，80℃，加热30min时分别达到87.1％和77.7％，有了明显提高。超过80℃后各提取率增长趋势减弱。说明加热有效地提高了油和蛋白的提取率。这是因为加热处理不仅起到了灭菌的作用，同时也是对原料的一次湿热处理，在这个加热过程中，细胞中的一部分可溶性物质溶入水中，溶出越多，则细胞组织结构越疏松，细胞组织结构破坏的程度也就随之越大，在随后的发酵产酶过程中，酶与底物的接触面积就越大，酶解也就越易进行。但由于热处理温度越高，时间越长，蛋白质降解的程度也越高，变性程度也就越大，影响后期提取的大豆分离蛋白功能性，因此综合考虑灭菌效果及蛋白和油的提取率，选用80℃湿热灭菌30min。 

无机盐的含量对总油和总蛋白提取率有着重要影响，KH2PO4的添加可起到缓 冲的作用，KH2PO4的添加量可以为0.03-0.15wt％，本发明人通过大量的试验发现，当KH2PO4的浓度达到0.09％时总油提取率达到92％，蛋白提取率达到84％，而不加KH2PO4的总油提取率只有87％，蛋白提取率也仅为77％，因此KH2PO4的添加有益于蛋白与油脂的提取，而当KH2PO4的浓度超过0.09％时，虽然蛋白提取率还稍有增加，但提油率却下降，这是因为，虽然加大KH2PO4的浓度有利于蛋白的溶出，但是离子强度过强，抑制了酶的活性，从而限制了水解提取效果。综合考虑各因素，KH2PO4的添加量优选为0.075-0.12wt％，更优选为0.09wt％。 

豆粉浓度对总油与总蛋白提取率有着较大影响。豆粉浓度过高，使发酵溶液中的氧溶解不足，造成菌种呼吸困难，生长代谢不完全，产酶量极剧减少，不利于油脂与蛋白的提取；豆粉溶液浓度过低，使原料利用率较低，造成水资源的浪费，生产成本过大。本发明通过大量的试验发现，豆粉浓度为4-10wt％时，可以兼顾到总油与总蛋白提取率和生产成本的控制，其中，当豆粉浓度为7.4wt％时，效果为最好。 

在各个外部培养条件中，发酵培养基的起始pH值直接影响菌体的生长和水解酶类的水解活性，只有在合适的范围内，菌体才能生长良好同时产生水解酶类，酶解蛋白的反应才能高效进行，才有利于油脂的释放。大豆蛋白质主要由大豆球蛋白和伴球蛋白组成，全部的球蛋白易溶于稀碱溶液中，蛋白质溶解度随pH升高而增大，随着蛋白质的溶出，油也溶出，也就越利于酶的水解。如图6所示，蛋白质与油提取率随pH升高而增大。但当体系pH超过8以后再提高体系pH值，总蛋白质提取率呈下滑趋势，而总油提取率在pH9时最高。综合考虑总油与总蛋白得率，步骤(3)中所述的液体培养基组成为：按重量百分比计，大豆粉4-10％，KH2PO40.075-0.12％，吐温80 0.1-1％，余量为水；pH值为6.9-10；优选为：大豆粉7.4％，KH2PO40.09％，吐温800.5％；pH值为8.4。 

步骤(4)中所述的微生物菌种优选为枯草芽孢杆菌菌种；菌种接种量的多少影响着菌种发酵产酶能力，从而间接影响总油与总蛋白提取率。接种量过高，菌种发酵产酶增加不明显，增加成本；接种量过低，不利于发酵产酶的进行，进而影响蛋白与油脂的提取。本发明通过大量实验最终确定所述的接种量按v/v计，优选为4-8％，更优选为5.4％； 

步骤(4)中所述的发酵温度优选为37℃，所述的发酵时间优选为30-45小时，更优选为36小时。 

其中，步骤(5)中还可以将得到的残渣进行如下处理：将残渣用水洗后离心分别得到乳化层、水洗液和残渣；合并乳状液与乳化层，破乳，获得游离油； 

步骤(5)中将乳状液优选在以下任意一种所述的条件下进行破乳：65℃加热2小时、80℃加热40分钟或95℃加热15-20分钟； 

步骤(6)中将水解液pH值调节至4.5，离心(3000-5000rpm/min离心15min)后沉淀用水清洗，再离心，其沉淀用水溶解调节至pH值为7，进行喷雾干燥或冷冻干燥，获得大豆分离蛋白。 

本发明涉及微生物发酵前处理和发酵条件的优化选择及最佳破乳条件的建立，最终从大豆中提取油脂和蛋白。本发明对微生物提取大豆油和蛋白进行了全面而系统的研究，以总油和总蛋白提取率，兼顾游离油为考察指标，确定最佳发酵豆粉提油条件及破乳条件，使原料中的油脂实际得率(总游离油得率)达到80％以上，蛋白得率达到80％以上。 

本发明所采用的微生物发酵全脂豆粉提取油脂和蛋白，蛋白水解更充分，所得蛋白无苦味，且在发酵过程中无需再滴加碱液，因此终产品中的蛋白含盐量较低，减轻了后继工艺操作步骤的工作量。 

本发明全脂豆粉通过微生物发酵后，释放的游离油更多，乳状液更易破乳。豆粉发酵离心后(破乳前)可直接得到原料中70％以上的游离油，只有少部分残留在乳状层中，通过加热处理即可实现100％破乳，即乳状液中的油全部得到回收，这是目前国内外任何水酶法提油所不能实现的(采用水酶法提取油脂过程中所形成的乳状液通过加热方法仅能回收到30-40％的游离油)。此外，本发明破乳工艺相较于冷冻破乳操作简单，生产成本低，更容易实现工业化生产。 

附图说明

图1不同预处理原料在湿热条件下的总油和总蛋白提取率。 

图2不同无机盐含量对总油和总蛋白提取率的影响 

图3不同发酵时间对总油和总蛋白提取率。 

图4不同豆粉浓度对总油和总蛋白提取率的影响。 

图5不同接种量对总油和总蛋白提取率的影响。 

图6不同pH对总油和总蛋白提取率的影响。 

图7各因素对考察指标的降维分析图。 

图8Y＝f(x1，x2)的响应面。 

图9Y＝f(x2，x3)的响应面 

图10Y＝f(x1，x3)的响应面。 

图11油在各相中的分布。 

图12蛋白在各相中的分布。 

图13本发明方法的工艺流程图。 

图14本发明的工艺步骤流程图。 

具体实施方式

下面结合具体实施案例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 

试验例1 

1试验材料与方法 

1.1试验材料 

1.1.1菌种 

枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)购自中国工业微生物菌种保藏中心(ATCC 20524)； 

1.1.2原料 

大豆，含油率为21％，蛋白质含量为31.1％，贮存于4℃的冰箱中。 

1.1.3培养基 

种子培养基：蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.5％，pH7.2-7.4，121℃灭菌20min。 

全脂豆粉培养基：6wt％全脂豆粉，0.5wt％吐温80，pH9，115℃灭菌15min； 

平板计数琼脂培养基：胰蛋白胨0.5％，酵母浸膏0.25％，葡萄糖0.1％，琼脂1.5％，pH7.0±0.2，121℃灭菌15min。 

1.1.4主要仪器设备 

1.1.5测试方法： 

蛋白含量的测定：凯氏定氮法 

乳中油脂含量的测定：哥特-罗紫法 

残渣中的油脂含量：索氏抽提法 

豆粉溶液中的菌落总数的测定：GB/T 4789.2-2010菌落总数测定 

1.1.6计算公式 

样品中菌落总数计算 

$N=\frac{\mathrm{\ΣC}}{(n1+0.1n2)d}$

N——样品中菌落数(CFU/mL) 

∑C——所选各稀释度的平板中菌落数总和 

n1——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数 

n2——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数 

d——稀释因子(第一稀释度) 

1.2试验方法 

1.2.1工艺流程(见图13)。 

详细的工艺如下： 

挤压膨化大豆粉分别在最佳条件下灭菌、发酵后，5000转离心分离20min，得到游离油、乳状液、水解液和渣I。渣I用水洗20min后离心得到乳化层、水洗液和渣2。合并乳状液与乳化层，破乳，获得游离油；合并水解液与水洗液，调节水解液至pH4.5，然后离心，沉淀用水清洗后，再次离心，所得沉淀用水溶解调节至pH7后，进行喷雾干燥或冷冻干燥，获得分离蛋白。 

1.2.2菌种活化：取1-2环斜面保存菌种接入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，37℃下160rpm/min振荡培养20-24h，使菌体浓度达到10⁸cfu/ml。 

1.2.3不同原料处理的选择 

分别选用经过挤压膨化的物料——处理条件为：模孔孔径14.6mm，套筒温度90℃、物料含水率14％、螺杆转速100rpm；超声波处理——(400W，50℃，15min)和未经任何预处理的原料大豆，用粉碎机粉碎，分别过100目筛子，配成全脂豆粉溶液，其成分为：6％全脂豆粉，0.5％吐温80，pH9，115℃条件下湿热灭菌15分钟后，接种5％活化后的种子，37℃下160rpm/min振荡发酵36小时，测总油提取率和总蛋白提取率。 

1.2.4不同灭菌温度的选择 

全脂豆粉溶液分别在65℃灭菌40min，70℃灭菌35min，80℃灭菌30min；90℃灭菌25min；105℃灭20min；115℃灭15min，121℃灭15min后用生理盐水进行10倍梯度稀释，分别选择原液、10^-1，10^-2，3个稀释度的样液各1mL加入无菌培养皿内，每皿中加入20mL平板计数琼脂培养基，混匀，恒温培养箱中36±1℃培养48小时，计算各平皿内菌落总数；将各灭菌条件下的豆粉溶液接种5％活化后的种子，37℃下160rpm/min振荡发酵36小时，测总油和总蛋白的提取率。 

1.2.5不同无机盐含量对总油和总蛋白提取率的影响 

在上述优化的条件基础上，KH₂PO₄的浓度分别为0，0.03％，0.06％，0.09％，0.12％，0.15％时总油和总蛋白提取率。 

1.2.6不同发酵时间对总油与总蛋白提取率的影响 

接种全脂豆粉培养基，每6小时测一次总油和总蛋白提取率。1.2.7发酵条件的优化 

1.2.7.1不同豆粉浓度对总油和总蛋白提取率的影响 

当发酵豆粉溶液在0.5％吐温80，0.09wt％KH₂PO₄，起始pH9时，测豆粉浓度分别为4％，7％，10％，13％，16％，37℃下160rpm/min振荡发酵36小时的总油与总蛋 白提取率； 

1.2.7.2不同起始pH值对总油和总蛋白提取率的影响

当豆粉溶液为：7％全脂豆粉，0.5％吐温80，0.09wt％KH₂PO₄，的基础上，在接菌量为5％，发酵初始pH分别选定在6，7，8，9，10时，测37℃下160rpm/min振荡发酵36小时的总油和总蛋白提取率； 

1.2.7.3不同接菌量对总油和总蛋白提取率的影响 

在豆粉溶液为：7％全脂豆粉，0.5％吐温80，0.09wt％KH₂PO₄，起始pH9，接菌量分别为2％，4％，6％，8％，10％时，测37℃下160rpm/min振荡发酵36小时的总油和总蛋白提取率； 

2试验结果 

2.1不同预处理原料对总油提取率和总蛋白提取率的影响 

试验见图1；试验结果显示不同预处理条件下微生物发酵提取豆粉中油脂和蛋白，挤压膨化的效果最好，其次是超声波和磨碎的物料。这是因为物料在经过挤压机出口时，由于瞬间的高温高压作用，物料细胞壁破碎，大豆细胞内的蛋白与油脂充分暴露出来，这样就有利于微生物充分接触利用豆粉，同时发酵产生的酶也更易直接水解蛋白，释放油脂；而在超声波处理过程中产生的“空化效应”，会释放巨大能量，产生高达几百个大气压的局部瞬间压力，形成冲击波，使介质受到极大的冲击力，这个能量足以使细胞破裂以达到破壁的目的，因此同样有利于发酵酶解的进行。与未接种的挤压膨化豆粉相比，接种的总油和总蛋白提取率明显要高出许多，说明发酵有利于油与蛋白的提取。以下实验如不作特殊说明，均采用挤压膨化豆粉。 

2.2不同灭菌温度下总油与总蛋白提取率及微生物检出情况 

表1  不同灭菌条件下的菌落总数 

从表1可以看到除65℃，70℃灭菌出现菌落外，其他任一灭菌条件下的全脂豆粉溶液，经36±1℃，培养48小时都无菌体检出，可以满足发酵工艺的灭菌要求。 

表2  不同灭菌条件下的总油和总蛋白提取率 

表2结果显示，挤压膨化后的豆粉经不同温度灭菌对总油和总蛋白的提取率影响较大，总油、总蛋白提取率随温度的升高而不断提升。65℃，45min时，总油和总蛋白提取率仅为65.3％和61.74％，80℃，30min时分别达到87.1％和77.7％，有了明显提高。超过80℃后各提取率增长趋势减弱。加热不仅起到了灭菌的作用，同时也是对原料的一次湿热处理，在这个过程中，大豆胚芽中的纤维素和果胶质受温度影响发生热降解，温度越高，时间越长，纤维素、果胶物质降解程度越大，使原来紧紧包裹着内容物的细胞骨架结构变得松散，这样就越有利于可溶性固形物的溶出，细胞破坏程度就越大，越有利于下一步的发酵酶解。但由于热处理温度越高，时间越长，蛋白质变性程度也就越大，影响后期大豆蛋白的功能性，因此综合考虑灭菌效果、油、蛋白提取率及蛋白功能性，选择灭菌条件80℃，30min。 

2.3KH₂PO₄的浓度对总油和总蛋白提取率的影响 

无机盐的含量对总油和总蛋白提取率有着重要影响，KH₂PO₄的添加起到缓冲的作用，豆粉溶液热处理时，细胞中的纤维素和果胶质物质发生热降解，从而使包裹在细胞骨架里面的蛋白溶解出来，这同时也造成了pH值下降，如果pH下降过大，会影响蛋白的继续溶出(蛋白适宜的溶解pH范围应在7-11)，不利于后期油脂和蛋白的提取，pH值保持在我们所需恒定范围内，这不仅有利于内容物的溶出，更主要的是有利于后期菌种发酵和酶解处于合适的酸度范围内。 

图2显示，当KH₂PO₄的浓度达到0.09％时总油提取率达到92％，而不加KH₂PO₄的总油提取率只有87％，蛋白提取率也由77％提高到84％，因此KH₂PO₄的添加有益于蛋白与油脂的提取；当KH₂PO₄的浓度超过0.09％时，虽然蛋白提取率还稍有增加，但提 油率却下降，加大KH₂PO₄的浓度有利于蛋白的溶出，但是离子强度过高，抑制了酶的活性，从而限制了水解提取效果，影响提取率；综合考虑各因素，KH₂PO₄的添加量优选为0.075-0.12wt％，更优选为0.09wt％。 

2.4总油和总蛋白提取率随发酵时间的变化 

发酵时间直接影响菌体的生长代谢周期和水解酶量的生成，从而间接地影响总油和总蛋白提取率，只有在合适的范围内，菌体才能处于所需的生长阶段，获得理想的蛋白与油脂提取率。 

图3显示当全脂豆粉接种发酵30h，总油提取率达到93％，发酵36h时，达到最大值93.56％，此后总油提取率趋于下降。42h时，总蛋白提取率达到最高，为88％。前期实验研究发现此菌种在发酵36h时，有最高酶活，42h大豆中的蛋白被充分水解，此时发酵液中的水溶性蛋白增加，特别是多肽含量增多。由于本实验主要是以油为经济考察指标，兼顾总蛋白提取率，选择发酵时间为36h。 

2.5发酵各条件对总油和总蛋白提取率的影响 

由于已知此菌种在全脂豆粉中的最适生长与产酶温度为37℃，因此本试验不再考察温度对总油与总蛋白提取率的影响，仅对豆粉浓度，接种量、起始pH进行优化。 

2.5.1不同豆粉浓度对总油和总蛋白提取率的影响 

豆粉浓度对总油与总蛋白提取率有着较大影响。豆粉浓度过高，使发酵溶液中的氧溶解不足，造成菌种呼吸困难，生长代谢不完全，产酶量极剧减少，不利于油脂与蛋白的提取；豆粉溶液浓度过低，使原料利用率较低，造成水资源的浪费，生产成本过大。 

图4显示当豆粉浓度为7wt％时，总油与总蛋白提取率有最高值，在低于或高于此值时，其总油与总蛋白提取率都呈下滑趋势。所以在下面的响应面试验设计中豆粉浓度选择4-10wt％。 

2.5.2不同接种量对总油和总蛋白提取率的影响 

接种量的多少影响着菌种发酵产酶能力，从而间接影响总油与总蛋白提取率。接种量过高，菌种发酵产酶增加不明显，增加成本；接种量过低，不利于发酵产酶的进行，进而影响蛋白与油脂的提取。 

图5显示当接种量为6％(v/v)时，总油与总蛋白提取率有最高值，高于或低于此接种量其总油和总蛋白提取率都呈下降趋势，所以在下面的响应面试验设计中 接种量选择4-8％(v/v)。 

2.5.3不同起始pH对总油和总蛋白提取率的影响 

在各个外部培养条件中，发酵培养基的起始pH直接影响菌体的生长和水解酶类的水解活性，只有在合适的范围内，菌体才能生长良好同时产生水解酶类，酶解蛋白的反应才能高效进行，才有利于油脂的释放。大豆蛋白质主要由大豆球蛋白和伴球蛋白组成，全部的球蛋白易溶于稀碱溶液中，蛋白质溶解度随pH升高而增大，随着蛋白质的溶出，油也溶出，也就越利于酶的水解。如图6所示，蛋白质与油提取率随pH升高而增大。但当体系pH超过8后，再提高体系pH，总蛋白质提取率呈下滑趋势，而总油提取率在pH9时最高。综合考虑总油与总蛋白得率，在下面的响应面试验设计中pH选择6.9-10，中心点pH设为8.5。 

2.6试验因素水平编码表 

在单因素研究的基础上，选取豆粉浓度、起始pH、接菌量3个因素为自变量，以总油提取率为响应值，根据中心组合设计原理，设计响应面分析实验，其因素水平编码表见表3。 

表3因素水平编码表 

2.6.1响应面实验安排及实验结果 

本试验应用响应面方法进行过程优化。以x₁、x₂、x₃为自变量，以总油提取率为响应值Y，响应面实验方案及结果见表4。实验号1-14为析因实验，15-20为6个中心试验，用以估计实验误差。 

表4  响应面实验方案及实验结果 

2.6.2响应面实验结果分析 

通过统计分析软件SAS9.1进行数据分析，建立二次响应面回归方程模型如下： 

Y＝94.32707+2.314416X1-0.157001X2-1.182916X3-5.481334X1X1-2.4325X1X2-0.935X1X3-0.931092X2X2-1.1575X2X3-1.132618X3X3 

回归分析与方差分析结果见表5，响应面寻优见表6，降维分析见图7，交互相影响的响应面分析见图8-图10。 

表5  回归与方差分析结果 

注：经分析，总回归的相关性系数(R²)为97.29％，决定系数(R²Adj)为94.85％ 

由表5可知，方程因变量与自变量之间的线性关系明显，该模型回归显著(p＜0.0001)，失拟项不显著，并且该模型R²＝97.29％，R² _Adj＝94.85％，说明该模型与实验拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于该反应的理论推测。由F检验可以得到因子贡献率为：x₁＞x₃＞x₂，即豆粉浓度＞接种量＞pH。在三个变量中，豆粉浓度对提油率影响最大，酸度对提油率影响最小。而交互项X1*X2，X2*X3对总油提取率影响显著(p＜0.05)，X1*X3交互影响不显著(p＞0.05)。 

由图7可以看出各因素对考察指标总油提取率的影响规律。 

应用响应面寻优分析方法对回归模型进行分析，寻找最优响应结果见表6，由表6可知在KH₂PO₄为0.09wt％的前提下，当全脂豆粉浓度为7.4wt％，接菌量为5.4％(v/v)，pH为8.4，响应面有最优值95.01±0.52％。 

表6  响应面寻优结果 

2.6.3响应面分析与优化 

图8和图9显示了交互作用显著的两两发酵条件的响应曲面图，通过该组动态图即可对发酵条件交互影响大豆油脂提取率的效应进行分析与评价，并从中确定最佳因素水平范围。图8显示了当接菌量位于中心水平，即6％(v/v)时，豆粉浓度和发酵初始pH对总油提取率的交互影响效应，效果显著；图9显示了当豆粉浓度中心水平时，即7％(w/t)时，发酵初始pH和接菌量对总油提取率的交互影响效应，效果显著；而图10表示在发酵初始pH为中心水平(pH8.5)时豆粉浓度与接菌量交互作用对总油提取率的影响，但是二者的交互作用不显著。

2.6.4验证实验与对比试验 

在响应面分析法求得的最佳条件下，即当全脂豆粉浓度为7.4wt％，接菌量为5.4％(v/v)，0.09wt％KH₂PO₄，吐温80 0.5wt％，pH为8.4，进行3次平行实验，总油提取率3次平行实验的平均值为95.1％。说明响应值的实验值与回归方程预测值吻合良好。此条件下测总蛋白的实际提取率为86.1％。 

试验例2 

1材料与方法 

1.1实验材料 

原料：挤压膨化后的大豆(模孔孔径146mm、套筒温度90℃、物料含水率14％、螺杆转速100rpm)，粉碎后过100目筛子，贮存于4℃冰箱中。 

豆粉溶液：全脂豆粉浓度为7.4wt％，0.09wt％KH₂PO₄，0.5wt％吐温80，pH8.4，80℃灭菌30min 

1.2实验方法 

1.2.1工艺步骤 

如图14所示。 

1.2.2发酵条件：将活化好的枯草芽孢杆菌按5.4％(v/v)接种于全脂豆粉溶液中，37℃，160rpm/min发酵36小时。 

1.2.3测试方法： 

蛋白含量的测定：凯氏定氮法 

乳中油脂含量的测定：哥特-罗紫法 

残渣中的油脂含量：索氏抽提法

1.2.4计算公式 

1.2.5发酵后各相的分离与计量 

将发酵后的全脂豆粉溶液以5000rpm/min离心20min后，分为三个部分，最上层为乳状层部分(包括游离油和乳状液)，中间为水解液，底部为酶解后的残渣。 

将各部分分别收集，并称重。 

1.2.6破乳 

分别称取15g乳状液置于小烧杯内，在温度分别为65℃，80℃，95℃的水浴锅内作用不同时间，离心后测其破乳率。 

在65℃条件下，分别作用30min，1h，1.5h，2h，2.5h； 

在80℃条件下，分别作用10min，20min，30min，40min； 

在95℃度条件下，分别作用5min，10min，15min，20min。 

1.2.7蛋白的回收 

微生物发酵提取油脂后的水解液中含有近85％的蛋白，通过调节pH至4.5，使绝大部分蛋白沉降下来，在3000-5000rpm/min条件下离心15min后，收集沉淀，用水清洗沉淀后，再次在相同条件下离心，在所得沉淀中加入清水，并将pH调至7，沉淀溶解后，喷雾干燥或冷冻干燥，得到分离蛋白粉。 

1.2.8纯酶水解全脂豆粉 

采用Alcalase碱性蛋白酶，在料水比1∶6.5，57℃条件下，加酶量2％，pH9.5时，酶解膨化豆粉4h，5 000r/min离心20min，测总油和总蛋白提取率，其水解液中的蛋白按1.2.7进行回收并制取蛋白粉。 

1.2.9水解蛋白苦味值的评定 

水解蛋白苦味值的评定按如下方法进行测评： 

以0mg/L、8mg/L、16mg/L、24mg/L、32mg/L浓度的盐酸奎宁溶液分别定义为无味、微苦、中度苦、苦、很苦的标准对多肽液进行评分，感官评定小组由5人组成。评定员用蒸馏水漱口之后，取浓度10mg/mL经发酵和纯酶Alcalase提取的蛋白溶液适量置于口中片刻后吐出，漱口后取与之苦味程度相近的标准液品尝，如两苦味相近，则可将待评液定为该标准液的苦味值，否则需取其他标准液再试，直至苦味相同。结果取5人的平均值。 

2试验结论 

2.1油与蛋白在各相中的分布 

从图11中可以看出全脂豆粉经发酵离心后，直接可以获得74％的游离油，其中乳状液中含有10.5％的油脂，水解液中溶解6.5％的油脂。 

通过这些数据比较，发现豆粉经发酵后，大部分油脂都以游离油的形态释放出来，乳状液中只含有少量的油脂，这样大大减少了后继破乳工艺的工作量。 

图12显示全脂豆粉经发酵后，86.1％的蛋白质被水解出来，其中接近85％的蛋白质溶解于水解液中，1.5％存在于乳状液中，存在于乳状液中的这部分蛋白对于油水两相起到了表面活性剂的作用，从而使油以乳状液的形式稳定地存在于水溶液中。 

2.2乳中各种成分含量及破乳效果 

表7  乳状液中各种成分含量 

乳状液在各种加热条件下的破乳情况见表8-10 

表8  65℃加热条件下破乳率 

表9  80℃加热条件下破乳率 

表10  95℃加热条件下破乳率 

从表8-10中可以看到在65℃时加热2h，完全破乳，而在80℃时加热40min，95℃加热15-20min即可达到相同的效果。可根据生产上的需要，选择任一条件来回收乳状液中的油脂。 

结合2.1的结果，经过破乳处理后，可从原料大豆中回收到原料豆中近85％油，残渣中残留5％左右的油，剩余的油脂则以游离油的状态存在于水解液中。结合破乳工艺难易程度及破乳效果，证明本发明提取大豆油脂的方法是切实可行的。 

2.3商品Alcalase酶解豆粉的总油和总蛋白提取率 

从表11中可知利用商品Alcalase酶提取大豆油脂，总油提取率比微生物发酵法低2.8％，而蛋白提取率则高3.4％，这是由于枯草芽孢杆菌发酵豆粉产生的碱性蛋白酶活比纯Alcalase酶弱，酶解作用比较温和，提取蛋白不如纯酶的彻底。 

表11  Alcalase酶解全脂大豆的总油与总蛋白提取率 

目前已知枯草芽孢杆菌可产生数十种酶，在本实验中采用微生物发酵工艺的油脂提取率高于纯酶酶解的，这也许是因为枯草芽孢杆菌在生长代谢过程中产生了其他种类的酶，如纤维素酶、果胶酶等，这些酶的存在有利于油脂的提取，它们破坏了包裹在油脂外面组成细胞壁结构的纤维骨架和果胶物质，从而加速了油 脂的释放。 

2.4商品Alcalase酶解豆粉和微生物发酵全脂豆粉所得分离蛋白质的感官评价 

通过对样品液的品尝，评定组成员5人一致认为采用本发明发酵方法所得到的水解蛋白无味，即不苦，而Alcalase酶解大豆蛋白具有明显的苦味。 

通常酶解的大豆蛋白风味较差，具有明显的苦味，限制了其在工业上的应用。其原因是在水解过程中形成了苦味肽，而大部分苦味肽的苦味是由其中的疏水性氨基酸引起的。在完整的球蛋白分子中，大部分疏水性侧链藏在内部，它们不接触味蕾，感觉不到苦味。当蛋白质水解时，肽链含有的疏水性氨基酸侧链充分暴露出来，接触味蕾产生苦味。随水解进程的继续，越来越多的疏水氨基酸侧链暴露出来，使苦味增加。 

大豆蛋白经发酵后存在状态和空间结构都发生了变化，其氨基酸含量、肽链组成成分的改变都直接影响着水解蛋白的感官指标，从而影响其作为食品关键组分的应用。 

发酵全脂豆粉水解蛋白和Alcalase酶水解蛋白的氨基酸组成如表12所示。 

从表12中可见发酵后的大豆水解蛋白总氨基酸中一些疏水性氨基酸含量要明显比原料大豆蛋白少，具有较强苦味的四种疏水性氨基酸——缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸在发酵水解蛋白中，以游离态形式存在的为8.95％，占四种氨基酸总含量的45.98％，而以多肽形式存在的占四种氨基酸总含量的54.02％，仅占蛋白中氨基酸总量的10.51％，含量很低；游离态的疏水氨基酸是不具有苦味的，具有苦味的是肽链末端的疏水性氨基酸，因此通过发酵提取的大豆蛋白不具有苦味。 

Alcalase酶解蛋白中，疏水性氨基酸所占比重较大，仅苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸和酪氨酸四种具有较强苦味的氨基酸含量就占总氨基酸的23.17％。这些氨基酸大部分并没有被碱性蛋白酶水解下来，而是以氨基酸组成多肽的形式存在于肽链中，占蛋白总氨基酸含量的20.66％。因此，大量含有疏水性氨基酸多肽的存在是Alcalase水解蛋白具有苦味的物质基础。 

表12各方法所得水解蛋白的氨基酸相对组成(％) 

注：表中*代表疏水性氨基酸 

Claims (10)

1.一种同时提取大豆油脂和大豆蛋白的微生物发酵方法，包括以下步骤：(1)将大豆预处理；(2)预处理后的大豆粉与KH₂PO₄配制成液体培养基；(3)豆粉液体培养基灭菌；(4)将活化后的微生物菌种接入到步骤(3)的液体培养基中进行发酵；(5)将发酵产物离心，分别得到游离油、乳状液、水解液和残渣；将乳状液破乳，获得游离油；(6)调节水解液pH值，离心，用水清洗沉淀后再离心，将沉淀用水溶解后调节pH值，喷雾干燥或冷冻干燥，获得大豆分离蛋白。

2.按照权利要求1所述的微生物发酵方法，其特征在于：步骤(1)中大豆预处理的方式是挤压膨化、超声波或磨碎。

3.按照权利要求1所述的微生物发酵方法，其特征在于：步骤(3)中所述灭菌为采用80-105℃灭菌15-30分钟；优选为80℃灭菌30分钟。

4.按照权利要求1所述的微生物发酵方法，其特征在于，步骤(2)中所述的液体培养基组成为：按重量百分比计，大豆粉4-10％，KH₂PO₄0.075-0.12％，吐温80 0.1-1％，余量为去离子水，pH值为6.9-10；优选的，液体培养基组成为：大豆粉7.4％，KH₂PO₄0.09％，吐温80 0.5％；pH值为8.4。

5.按照权利要求1所述的微生物发酵方法，其特征在于：步骤(4)中所述的微生物菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)菌种。

6.按照权利要求1所述的微生物发酵方法，其特征在于：按体积比计，步骤(4)中所述的微生物菌种的接种量为4-8％，优选为5.4％。

7.按照权利要求1所述的微生物发酵方法，其特征在于：步骤(4)中所述的发酵温度为37℃。

8.按照权利要求1所述的微生物发酵方法，其特征在于：步骤(4)中所述的发酵时间为30-45小时，优选为36小时。

9.按照权利要求1所述的微生物发酵方法，其特征在于：步骤(5)中将所得到的残渣进行如下处理：将残渣用水洗后离心分别得到乳化层、水洗液和残渣；合并乳状液与乳化层，破乳，获得游离油；步骤(6)中调节水解液pH值至4.5，离心后所得沉淀用水清洗，再次离心，将沉淀用水溶解后调节pH值至7，喷雾干燥或冷冻干燥，获得大豆分离蛋白。

10.按照权利要求1所述的微生物发酵方法，其特征在于：步骤(5)中将乳状液在以下任意一种所述条件下进行破乳：65℃加热2小时、80℃加热40分钟或95℃加热15-20分钟。

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