CN102827683A - 固态发酵水酶法提取菜籽油和蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
固态发酵水酶法提取菜籽油和蛋白的方法属于属于植物油脂和蛋白的提取加工技术，主要包括以下步骤：（1）菜籽粉碎后调节水分制成发酵培养基，然后高压灭菌，冷却后将活化的混合菌以一定比例接种到灭菌的发酵培养基中进行固态发酵，得到发酵产物；（2）将发酵产物烘干粉碎后与水混合得到混合液，调节混合液的pH值和温度，向混合液中加入蛋白酶进行酶解，酶解后离心分离得到菜籽油和菜籽蛋白；该方法所需设备简单、操作安全、成本低，菜籽油和菜籽蛋白提取率高，所得菜籽油无溶剂残留、营养价值高，所得菜籽蛋白品质好，产品中硫苷、植酸和单宁等抗营养物质含量低。
Description
技术领域
本发明属于植物油脂和蛋白的提取加工技术，尤其涉及固态发酵水酶法提取菜籽油和蛋白的方法。
背景技术
微生物固态发酵分泌的酶能够有效的降解或者钝化菜籽中硫苷、植酸和单宁等抗营养物质，水酶法提取技术是利用油料同时得到油脂和蛋白最理想方法，因此采用固态发酵结合水酶法是一种提取高品质菜籽油和菜籽蛋白的方法。国内外已有人研究水酶法提取菜籽中油脂和蛋白，Jensen和Olsen（1990）采用黑曲霉的复合酶，将菜籽进行两次研磨后，调节pH值为4.5，加酶后保温（50℃）4h，再经三次洗涤和离心，最终得到油、水相和沉淀，油脂得率为84%，沉淀为浓缩蛋白可作为饲料。刘志强等人（2004）对脱皮菜籽进行了水酶法同时提油和蛋白研究，采用纤维素酶：果胶酶=3:1复合对菜籽浆进行酶解，离心后吸出清油，采用超滤提取菜籽蛋白，油和蛋白得率分别为92.6%和82.3%。而固态发酵结合水酶法提取菜籽油和菜籽蛋白的研究未见报道，现有的水酶法提取菜籽中油脂和蛋白的方法存在提取率低、产品中毒素和抗营养物质含量高等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供固态发酵水酶法提取菜籽油和蛋白的方法，达到同时回收高品质菜籽油和菜籽蛋白、提高菜籽油脂得率、去除菜籽中的硫苷、植酸和单宁等抗营养物质含量的目的。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
固态发酵水酶法提取菜籽油和蛋白的方法，该方法包括以下步骤：（1）脱皮菜籽粉碎后加水制成发酵培养基，加水量与粉碎后菜籽质量比为0.5-2.5:1，将发酵培养基经高压灭菌后冷却，将活化的枯草芽孢杆菌、啤酒酵母和植物乳杆菌以1:1:1的比例接种到灭菌后的发酵培养基中进行固态发酵，得到发酵产物，固态发酵条件为发酵温度20-40℃，接种量为发酵培养基质量的6-10%，发酵时间20-60h；（2）将发酵产物烘干粉碎后与水混合得到混合液，加水量与烘干粉碎后的发酵产物质量比为3-7:1，调节混合液的pH值和温度，向混合液中加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件为酶解温度50-70℃，酶解pH为6-10，加酶量为混合液质量的1-5%，酶解时间1.5-3.5h，酶解后离心分离得到菜籽油和菜籽蛋白。
所述的加水量与粉碎后菜籽质量比为1.52:1。
所述的固态发酵优选参数为：发酵温度30℃，接种量为发酵培养基质量的8%，发酵时间41.3h。
所述的加水量与烘干粉碎后的发酵产物质量比为5.14:1。
所述的酶解优选参数为：酶解温度60℃，酶解pH为8.0，加酶量为混合液质量的3.15%，酶解时间2.65h。
本发明方法是在微生物发酵的基础上，采用能降解植物油料细胞的酶作用于油料，使油脂易于从油料固体中释放出来，利用蛋白质对油和水的亲和力差异而将油和蛋白分离。采用微生物对菜籽进行固态发酵，微生物分泌的酶能够有效的降解或者钝化菜籽中的抗营养物质（硫苷、植酸和单宁等），从而得到高品质的油脂和蛋白产品。本方法具有所需的工艺设备简单、成本低，菜籽油和菜籽蛋白提取率高且营养价值高，产品中硫苷、植酸和单宁等抗营养物质含量低。
附图说明
图1 是本发明方法的工艺路线图
图2 发酵温度与发酵时间交互对油脂提取率的响应面
图3 接种量与液料比交互对油脂提取率的响应面
图4 接种量与发酵时间交互对油脂提取率的响应面
图5 发酵温度与接种量交互对蛋白提取率的响应面
图6 接种量与发酵时间交互对蛋白提取率的响应面
图7 液料比与发酵时间交互对蛋白提取率的响应面
图8 酶解温度与加酶量交互对油脂提取率的响应面
图9 酶解pH与液料比交互对油脂提取率的响应面
图10酶解pH与加酶量交互对油脂提取率的响应面
图11酶解温度与酶解pH交互对蛋白提取率的响应面
图12酶解pH与加酶量交互对蛋白提取率的响应面
图13加酶量与酶解时间交互对蛋白提取率的响应面
具体实施方案
下面结合附图对本发明具体实施例进行详细描述，
固态发酵水酶法提取菜籽油和蛋白的方法，该方法包括以下步骤：（1）脱皮菜籽粉碎后加水制成发酵培养基，加水量与粉碎后菜籽质量比为0.5-2.5:1，将发酵培养基经高压灭菌后冷却，将活化的枯草芽孢杆菌、啤酒酵母和植物乳杆菌以1:1:1的比例接种到灭菌后的发酵培养基中进行固态发酵，得到发酵产物，固态发酵条件为发酵温度20-40℃，接种量为发酵培养基质量的6-10%，发酵时间20-60h；（2）将发酵产物烘干粉碎后与水混合得到混合液，加水量与烘干粉碎后的发酵产物质量比为3-7:1，调节混合液的pH值和温度，向混合液中加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件为酶解温度50-70℃，酶解pH为6-10，加酶量为混合液质量的1-5%，酶解时间1.5-3.5h，酶解后离心分离得到菜籽油和菜籽蛋白。
所述的加水量与粉碎后菜籽质量比为1.52:1。
所述的固态发酵优选参数为：发酵温度30℃，接种量为发酵培养基质量的8%，发酵时间41.3h。
所述的加水量与烘干粉碎后的发酵产物质量比为5.14:1。
所述的酶解优选参数为：酶解温度60℃，酶解pH为8.0，加酶量为混合液质量的3.15%，酶解时间2.65h。
本发明方法是在微生物发酵的基础上，采用能降解植物油料细胞的酶作用于油料，使油脂易于从油料固体中释放出来，利用蛋白质对油和水的亲和力差异而将油和蛋白分离。采用微生物对菜籽进行固态发酵，微生物分泌的酶能够有效的降解或者钝化菜籽中的抗营养物质（硫苷、植酸和单宁等），从而得到高品质的油脂和蛋白产品。本方法具有所需的工艺设备简单、成本低，菜籽油和菜籽蛋白提取率高且营养价值高，产品中硫苷、植酸和单宁等抗营养物质含量低。
实施例1： 菜籽固态发酵最佳参数的筛选试验
1材料与方法
1.1材料、试剂
| 菜籽 | 市售 |
| protex-6L碱性内切蛋白酶 | 丹麦novo公司 |
1.2主要仪器设备
| pHS-25型酸度计 | 上海伟业仪器厂 |
| 电子分析天平 | 梅勒特-托利多仪器(上海)有限公司 |
| 离心机 | 北京医用离心机厂 |
| 精密电动搅拌机 | 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 |
| 电热恒温水浴锅 | 余姚市东方电工仪器厂 |
| 半自动定氮仪 | 上海新嘉电子有限公司 |
| 消化仪 | 上海纤检仪器有限公司 |
| F2102型植物试样粉碎机 | 天津泰斯特仪器有限公司 |
| 索氏抽提器 | 天津玻璃仪器厂 |
| 高压灭菌锅 | 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 |
| 恒温培养箱 | 北京市永光明医疗仪器厂 |
1.3实验方法
1.3.1菜籽的成分测定
水分的测定：GB304—87进行测定；粗脂肪的测定：GB5512—85中索氏抽提法进行测定；粗蛋白的测定：GB6432—94标准方法进行；灰分测定：GB5009.4-85；
1.3.2工艺流程
菜籽→粉碎→水分调节→高压灭菌→冷却→接种→固态发酵→发酵产物→烘干→粉碎→加水混合→调节pH值和温度→酶解→离心→菜籽油和菜籽蛋白
1.3.3计算公式
2结果与讨论
2.1 原料主要成分见表2-1.
表2-1原料菜籽主要成分
2.2 实验因素水平编码表
在单因素研究的基础上，选取发酵温度、接种量、液料比和发酵时间4个因素为自变量，以油脂提取率和蛋白提取率为响应值，根据中心组合设计原理，设计响应面分析实验，其因素水平编码表见表表2-2。
表2-2 因素水平编码表
2.3 响应面实验安排及实验结果
本实验应用响应面优化法进行过程优化。以A、B、C、D为自变量，以油脂提取率R1和蛋白提取率R2为响应值，响应面实验方案及结果见表2-3。实验号1-24为析因实验，25-36为12个中心试验，用以估计实验误差。
表2-3 试验安排及结果
2.3响应面实验结果分析
油脂提取率R1通过统计分析软件Design-Expert进行数据分析，建立二次响应面回归模型如下：
R1=89.95-1.11A+0.34B+0.45C+0.46D+0.62AB-0.041AC+1.57AD+2.19BC-2.06BD+0.26CD-1.47A2-2.52B2-1.12C2-2.50D2
油脂提取率R1的回归与方差分析结果见表2-4，交互相显著的响应面分析见图2-图4。
表2-4 油脂提取率的回归与方差分析结果
由表2-4可知，方程因变量与自变量之间的线性关系明显，该模型回归显著（p<0.0001），失拟项不显著（p>0.05），并且该模型R2= 95.62%，R2 Adj= 92.7%，说明该模型与实验拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于该反应的理论推测。由F检验可以得到因子贡献率为：A>D>C>B，即发酵温度>发酵时间>液料比>接种量。
蛋白提取率R2通过统计分析软件Design-Expert进行数据分析，建立二次响应面回归模型如下：
R2=91.16+0.49A-0.098B-0.21C+0.29D-0.44AB+0.22AC-0.034AD+0.24BC-0.34BD+0.29CD-2.04A2-1.48B2-0.65C2-0.69D2
蛋白提取率R2的回归与方差分析结果见表2-5，交互相显著的响应面分析见图5-图7。
表2-5蛋白提取率的回归与方差分析结果
由表2-5可知，方程因变量与自变量之间的线性关系明显，该模型回归显著（p<0.0001），失拟项不显著（p>0.05），并且该模型R2= 97.46%，R2 Adj= 95.77%，说明该模型与实验拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于该反应的理论推测。由F检验可以得到因子贡献率为：A>D>C>B，即发酵温度>发酵时间>液料比>接种量。
应用响应面寻优分析方法对回归模型进行分析，寻找最优响应结果发酵温度为29.95℃，接种量为8%，液料比为1.52，发酵时间为41.3h，响应值油脂提取率和蛋白提取率有最优值，分别为89.99%和91.17%左右。
2.4验证实验与对比试验
在响应面分析法求得的最佳条件下，即发酵温度为29.95℃，接种量为8%，液料比为1.52，发酵时间为41.3h，进行3次平行实验，3次平行实验油脂提取率的平均值和蛋白提取率的平均值分别为90.64%和92.25%。说明响应值的实验值与回归方程预测值吻合良好。
实施例2: 菜籽酶解最佳参数的筛选试验
基于实施例1所确定的最佳固态发酵提取菜籽油和菜籽蛋白的工艺，进行单因素菜籽酶解试验，确定菜籽酶解工艺参数的范围。以油脂提取率和蛋白提取率为考察指标，进行响应面设计5因素5水平试验。
1材料与方法
1.1材料、试剂
| 菜籽 | 市售 |
| protex-6L碱性内切蛋白酶 | 丹麦novo公司 |
1.2主要仪器设备
| pHS-25型酸度计 | 上海伟业仪器厂 |
| 电子分析天平 | 梅勒特-托利多仪器(上海)有限公司 |
| 离心机 | 北京医用离心机厂 |
| 精密电动搅拌机 | 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 |
| 电热恒温水浴锅 | 余姚市东方电工仪器厂 |
| 半自动定氮仪 | 上海新嘉电子有限公司 |
| 消化仪 | 上海纤检仪器有限公司 |
| F2102型植物试样粉碎机 | 天津泰斯特仪器有限公司 |
| 索氏抽提器 | 天津玻璃仪器厂 |
| 高压灭菌锅 | 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 |
| 恒温培养箱 | 北京市永光明医疗仪器厂 |
1.3实验方法
1.3.1菜籽的成分测定
水分的测定：GB304—87进行测定；粗脂肪的测定：GB5512—85中索氏抽提法进行测定；粗蛋白的测定：GB6432—94标准方法进行；灰分测定：GB5009.4-85；
1.3.2工艺流程
菜籽→粉碎→水分调节→高压灭菌→冷却→接种→固态发酵→发酵产物→烘干→粉碎→加水混合→调节pH值和温度→酶解→离心→菜籽油和菜籽蛋白
1.3.3计算公式
2结果与讨论
2.1 实验因素水平编码表
在单因素研究的基础上，选取酶解温度、酶解pH、液料比、加酶量和酶解时间5个因素为自变量，以油脂提取率和蛋白提取率为响应值，根据中心组合设计原理，设计响应面分析实验，其因素水平编码表见表表2-1。
表2-1 因素水平编码表
2.2 响应面实验安排及实验结果
本实验应用响应面优化法进行过程优化。以A、B、C、D为自变量，以油脂提取率R1和蛋白提取率R2为响应值，响应面实验方案及结果见表2-2。实验号1-26为析因实验，27-36为10个中心试验，用以估计实验误差。
表2-2 试验安排及结果
2.3响应面实验结果分析
油脂提取率R1通过统计分析软件Design-Expert进行数据分析，建立二次响应面回归模型如下：
R1=92.49-0.99A+0.46B+0.32C+0.58D+0.24E+0.43AB+0.15AC+1.38AD-0.13AE
+2.38BC-2.25BD-0.028BE+0.45CD+0.29CE-0.44DE-1.38A2-2.43B2-1.02C2-2.40D2-0.065E2
油脂提取率R1的回归与方差分析结果见表2-3，交互相显著的响应面分析见图8-图10。
表2-3 油脂提取率的回归与方差分析结果
由表2-3可知，方程因变量与自变量之间的线性关系明显，该模型回归显著（p<0.0001），失拟项不显著（p>0.05），并且该模型R2= 95.23%，R2 Adj= 88.87%，说明该模型与实验拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于该反应的理论推测。由F检验可以得到因子贡献率为：A>D>B>C>E，即酶解温度>加酶量>酶解pH>液料比>酶解时间。
蛋白提取率R2通过统计分析软件Design-Expert进行数据分析，建立二次响应面回归模型如下：
R2=89.82+0.79A+0.077B-0.035C+0.47D-0.11E-0.70AB-0.039AC-0.30AD+0.24AE-0.21BC-0.78BD+0.43BE-0.16CD+0.38CE+0.67DE-2.47A2-1.91B2-1.08C2-1.11D2-
0.36E2
蛋白提取率R2的回归与方差分析结果见表2-4，交互相显著的响应面分析见图11-图13。
表2-4蛋白提取率的回归与方差分析结果
由表2-4可知，方程因变量与自变量之间的线性关系明显，该模型回归显著（p<0.0001），失拟项不显著（p>0.05），并且该模型R2= 95.05%，R2 Adj= 88.44%，说明该模型与实验拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以用于该反应的理论推测。由F检验可以得到因子贡献率为：A>D>E>B>C，即酶解温度>加酶量>酶解时间>酶解pH>液料比。
应用响应面寻优分析方法对回归模型进行分析，寻找最优响应结果酶解温度为60.1℃，酶解pH为8.05，液料比为5.14，加酶量为3.15%，酶解时间为2.65h，响应值油脂提取率和蛋白提取率有最优值，分别为92.62%和89.83%左右。
2.4验证实验与对比试验
在响应面分析法求得的最佳条件下，即酶解温度为60.1℃，酶解pH为8.05，液料比为5.14，加酶量为3.15%，酶解时间为2.65h，进行3次平行实验，3次平行实验油脂提取率的平均值和蛋白提取率的平均值分别为93.14%和90.25%。说明响应值的实验值与回归方程预测值吻合良好。
Claims (5)
1.固态发酵水酶法提取菜籽油和蛋白的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：（1）脱皮菜籽粉碎后加水制成发酵培养基，加水量与粉碎后菜籽质量比为0.5-2.5:1，将发酵培养基经高压灭菌后冷却，将活化的枯草芽孢杆菌、啤酒酵母和植物乳杆菌以1:1:1的比例接种到灭菌后的发酵培养基中进行固态发酵，得到发酵产物，固态发酵条件为发酵温度20-40℃，接种量为发酵培养基质量的6-10%，发酵时间20-60h；（2）将发酵产物烘干粉碎后与水混合得到混合液，加水量与烘干粉碎后的发酵产物质量比为3-7:1，调节混合液的pH值和温度，向混合液中加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件为酶解温度50-70℃，酶解pH为6-10，加酶量为混合液质量的1-5%，酶解时间1.5-3.5h，酶解后离心分离得到菜籽油和菜籽蛋白。
2.根据权利要求1所述的固态发酵水酶法提取菜籽油和蛋白的方法，其特征在于所述的加水量与粉碎后菜籽质量比为1.52:1。
3.根据权利要求1所述的固态发酵水酶法提取菜籽油和蛋白的方法，其特征在于所述的固态发酵优选参数为：发酵温度30℃，接种量为发酵培养基质量的8%，发酵时间41.3h。
4.根据权利要求1所述的固态发酵水酶法提取菜籽油和蛋白的方法，其特征在于所述的加水量与烘干粉碎后的发酵产物质量比为5.14:1。
5.根据权利要求1所述的固态发酵水酶法提取菜籽油和蛋白的方法，其特征在于所述的酶解优选参数为：酶解温度60℃，酶解pH为8.0，加酶量为混合液质量的3.15%，酶解时间2.65h。
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Application publication date: 20121219 |