CN102759591B - 一种注射用益气复脉中10种人参皂苷的含量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种注射用益气复脉中10种人参皂苷的含量检测方法，包括以下步骤：1)对照品的制备分别精密称取10种人参皂苷对照品，分别为：人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rb2、Rb3、Rd、Rg3、Rc，加甲醇溶解，制得溶液，2)供试品溶液的制备取注射用益气复脉药物粉末，精密称定，用水溶解，过上树脂柱，以甲醇-水冲洗后，以甲醇洗脱，洗脱液过滤，制得溶液，3)测定方法分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱，记录色谱图，测定样品中10种人参皂苷的含量，计算其总和。

Description

一种注射用益气复脉中10种人参皂苷的含量检测方法

技术领域：

本发明涉及一种中药组合物的检测方法，特别涉及一种注射用益气复脉制剂中10种人参皂苷的含量检测方法。

背景技术：

注射用益气复脉(冻干)是由红参、麦冬、五味子制成的用于静脉滴注的中药复方制剂，具有益气复脉，养阴生津的疗效。主要用于冠心病劳累性心绞痛气阴两虚证，症见胸痹心痛，心悸气短、倦怠懒言、头晕目玄、面色少华、舌淡、少苔或剥苔，脉细弱或结代；冠心病所致慢性左心功能不全II、III级气阴两虚证，症见心悸、气短甚则气急喘促，胸闷隐痛，时作时止，倦怠乏力，面色苍白，动则汗出，舌淡、少苔或剥苔，脉细弱或结代。

注射用益气复脉(冻干)性状：本品为浅黄色的疏松块状物；有引湿性。取1瓶内容物，加水2～3ml溶解后，为棕红色澄明液体。用法用量：静脉滴注。每日1次，每次8瓶，用250ml～500ml5％葡萄糖注射液或生理盐水稀释后静脉滴注。每分钟约40滴。疗程2周。

已经报道了用近红外光谱法快速测定注射用益气复脉(冻干)中人参总皂苷的含量的方法，由于总皂苷基础测量的方法欠佳，导致模型的预测能力不理想。

本发明在前研究的基础上对注射用益气复脉(冻干)中总皂苷的含量的测定进行进一步改进，采用HPLC方法分析测得10种含量较高的人参皂苷的和(人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rb2、Rb3、Rd、Rg3、Rc)来表征总皂苷含量，据研究，10种人参皂苷的含量之和能占到总皂苷测定值的60％，能间接地反映出样品中总皂苷的含量，且由于HPLC方法准确度较高，使得基础测量的数据更合理，此校正模型取得了较好的结果。

发明内容：

本发明所述的检测注射用益气复脉中10种含量较高的人参皂苷的和的方法，包括以下步骤：

1)对照品的制备

分别精密称取10种人参皂苷对照品，分别为：人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rb2、Rb3、Rd、Rg3、Rc，加甲醇溶解，制得溶液。

2)供试品溶液的制备

取注射用益气复脉药物粉末，精密称定，用水溶解，过上树脂柱，以甲醇-水冲洗后，以甲醇洗脱，洗脱液过滤，制得溶液。

3)测定方法

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱，记录色谱图，测定样品中10种人参皂苷的含量，计算其总和。

优选的检测方法，包括以下步骤：

1)对照品的制备

分别精密称取10种人参皂苷对照品，置于50ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，制得每1ml各含约0.1mg的溶液。

2)供试品溶液的制备

取注射用益气复脉粉1.2g，精密称定，置烧杯中，用水10mL溶解，上已处理好的Strata^TM-X商品树脂柱(内径1cm，树脂床高约2cm；300μm)，流速约1.0mL·min^-1，弃去流出液，待流至树脂层液面时，以0.5mol·L^-1NaOH甲醇-水(2∶8)5mL分两次冲洗后，继以用20％甲醇冲洗后，最后以甲醇洗脱，洗脱液收集于10mL量瓶中至刻度，摇匀，过0.45μm膜，即可。

3)测定方法

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱，记录色谱图。分别测定样品中10种人参皂苷的含量，计算其总和。

其中的色谱条件如下：

色谱柱：WatersSymmetryC₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相A为0.05％磷酸、B为乙腈组成，按下表进行梯度洗脱；检测波长：203nm；流速：1.0mL·min^-1；柱温：30℃。

表1HPLC梯度洗脱程序

本发明方法的建立：

1仪器与材料

Matrix-F(SFDA版)型傅里叶变换近红外漫反射光谱仪(德国布鲁克公司)，光纤探头扫描，定量分析软件为OPUS6.5；waters2695高效液相色谱仪，waters2998二极管阵列检测器(美国waters公司)；MettlerXS105电子天平(瑞士梅特勒公司)；

人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rb2、Rb3、Rd、Rg3、Rc对照品(中国药品生物制品检定所提供)；试剂均为分析纯，水为超纯水；

注射用益气复脉(冻干)样品(天津天士力之骄药业有限公司提供，科研用样品，60批，分别编号为1～60)。

2方法

2.1注射用益气复脉冻干中10种人参皂苷的HPLC分析

2.1.1色谱条件

色谱柱：WatersSymmetryC₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相A为0.05％磷酸、B为乙腈组成，按下表进行梯度洗脱；检测波长：203nm；流速：1.0mL·min^-1；柱温：30℃。

表1HPLC梯度洗脱程序

2.1.2对照品溶液的制备

分别精密称取10种人参皂苷对照品，置于50ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，制得每1ml各含约0.1mg的溶液。

2.1.3供试品溶液的制备

取注射用益气复脉(冻干)约1.2g，精密称定，置烧杯中，用水10mL溶解，上已处理好的Strata^TM-X商品树脂柱(内径1cm，树脂床高约2cm；300μm)，流速约1.0mL·min^-1，弃去流出液，待流至树脂层液面时，以0.5mol·L^-1NaOH甲醇-水(2∶8)5mL分两次冲洗后，继以用20％甲醇冲洗后，最后以甲醇洗脱，洗脱液收集于10mL量瓶中至刻度，摇匀，过0.45μm膜，即可。

2.1.4阴性对照溶液的制备

按处方比例，模拟工艺，在实验室制备缺红参的阴性样品，处理方法同上，制备阴性对照溶液。

在此分析条件下各10μL进样分析。对照品溶液，样品溶液和阴性对照溶液的色谱图见下图1。结果表明在此分析条件下，样品分离良好，阴性对照无干扰。

2.2近红外光谱分析

2.2.1近红外光谱采集将收集到的60份样品用布擦拭干净其西林瓶底部，分别用光纤探头从西林瓶底部扫描其近红外光谱。具体扫描参数为：测量温度26℃，湿度30％，光谱仪开机预热1小时，漫反射检测，扫描波长范围为4000～12000cm^-1，扫描次数32次，分辨率8cm^-1，每份样品扫描6张，取其平均光谱。60份样品的近红外光谱如图2所示。

2.2.2校正集和验证集样品的选择依据样品中10种人参皂苷含量之和的大小，从60份样品中选择50份有代表性的样品作为校正集来建立校正模型(其含量分布范围较广，能涵盖验证集样品的含量)。剩余10份作为验证样品，用校正模型对其含量进行预测，并与测定值进行比较分析^[4]。校正集和验证集的含量分布范围见表2所示。

表2校正集和验证集样品的含量分布范围

2.2.3校正模型的建立运用opus6.5数据分析软件，在光谱预处理和选取合适波段的基础上，运用偏最小二乘法(PLS)建立校正模型，采用内部交互验证检验模型。

3结果与讨论

3.1光谱预处理

近红外光谱中各个物质的吸收较弱且信号重叠严重，对其进行预处理能有效消除仪器噪音和基线漂移地影响，提取有用的特征信号。在opus软件自动优化的基础上，通过不断调节，比较不同校正模型的决定系数(R²)和内部验证均方差(RMSECV)，R²越接近于100说明模型的预测值越准确，RMSECV越小说明模型预测精度越高。最终发现二阶导数处理法在4246.8～4424.2cm^-1、5774.2～6102.1cm^-1和7498.4～9747.1cm^-1范围内能有效地提取光谱中的特征信息，消除仪器不稳、环境变化和样品不均等带来漂移和波动^[5]。在PLS算法下运用不同预处理方法时的R²和RMSECV如下表3所示。

表3不同预处理方法下的R²和RMSECV

3.2校正模型的建立

选择如上表示最优参数，运用二阶导数的预处理方法，选择波段为4246.8～4424.2cm^-1、5774.2～6102.1cm^-1和7498.4～9747.1cm^-1，最佳维数为8时，将50校正集样品的NIR图谱与其HPLC测定值运用PLS算法进行关联，建立10种人参皂苷含量之和的定量模型，结果如图3所示，建立的定量校正模型准确性好，R²(决定系数)和RMSECV(内部交叉验证均方差)分别为97.89和0.117。图4为RMSECV和Rank之间的趋势图。

3.3模型的验证

调入其余10份样品的NIR图谱，用建立好的校正模型预测其含量，并与其HPLC测定值进行比较，计算得模型预测均方差(RMSEP)为0.134。经统计学双配对样本t检验，预测值与测定值的相关系数为0.953，P＞0.05，表明2种方法无统计学差异，在校正集样品的含量覆盖范围之内，该模型能够准确预测样品含量。

3.4精密度考察

取同一样品，擦拭干净西林瓶，重复扫描5次，用模型预测其含量，结果之间的RSD为1.2％，表明方法的精密度良好。

3.5重复性考察

分别取同一批号的样品5瓶，分别扫描其NIR图谱，用模型预测其含量，结果之间的RSD为1.5％，表明该方法的重复性良好。

3.6模型稳健性考察

取同一批号的同一瓶样品，在同一实验场所，每天扫描一次，共5天，用模型预测其含量，结果之间的RSD为1.9％，表明该方模型的稳健性较好。

4结论

本研究用近红外光谱法测定了注射用益气复脉(冻干)中10种人参皂苷的含量之和，方法精密度良好，准确度高，与传统方法比较具有简便、快速、不破坏样品的优点，能用于生产中大批量样品的快速检测。

由于冻干粉针剂含水量极低，约为0.4％，打开测定容易吸潮；而且冻干粉针剂的样品厚度和颗粒度具有较好的一致性，故选择从西林瓶底部直接用光纤探头进行扫描。为了消除西林瓶的干扰，每次测定时以西林品为空白背景，从底部不同的地方测定6次取平均光谱。

本发明的测定方法效果好，操作简单，易于推广。

附图说明

图1色谱条件与系统适应性图谱

其中，图1A：阴性对照色谱图，图1B：10种对照品色谱图，图1C：样品色谱图图260批样品的近红外光谱图

图3校正集NIR预测值与真值之间的相关图

图4校正集RMSECV与Rank之间的趋势图

具体实施方式：

以下通过实施例，进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

对照品溶液的制备

分别精密称取10种人参皂苷对照品，分别为：人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rb2、Rb3、Rd、Rg3、Rc，置于50ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，制得每1ml各含约0.1mg的溶液。

供试品溶液的制备

取注射用益气复脉(冻干粉)约1.2g，精密称定，置烧杯中，用水10mL溶解，上已处理好的Strata^TM-X商品树脂柱(内径1cm，树脂床高约2cm；300μm)，流速约1.0mL·min^-1，弃去流出液，待流至树脂层液面时，以0.5mol·L^-1NaOH甲醇-水(2∶8)5mL分两次冲洗后，继以用20％甲醇冲洗后，最后以甲醇洗脱，洗脱液收集于10mL量瓶中至刻度，摇匀，过0.45μm膜，即可。

在此分析条件下各10μL进样。对照品溶液，样品溶液的色谱图见图1。

用归一化法计算各人参皂苷的含量，他们的和即为10种人参皂苷含量之和。

Claims (5)

1.一种注射用益气复脉中10种人参皂苷的含量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)对照品的制备

分别精密称取10种人参皂苷对照品，分别为：人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rb2、Rb3、Rd、Rg3、Rc，加甲醇溶解，制得溶液；

2)供试品溶液的制备

取注射用益气复脉药物粉末，精密称定，用水溶解，过上树脂柱，以甲醇-水冲洗后，以甲醇洗脱，洗脱液过滤，制得溶液；

3)测定方法

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱，记录色谱图，测定样品中10种人参皂苷的含量，计算其总和；

其中，所述色谱条件如下：色谱柱：C₁₈柱，型号4.6mm×250mm，5μm，流动相A为0.05％磷酸、B为乙腈组成，按下表进行梯度洗脱；检测波长：203nm；流速：1.0mL·min^-1；柱温：30℃，

2.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)对照品的制备

分别精密称取10种人参皂苷对照品，置于50ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，制得每1ml各含约0.1mg的溶液；

2)供试品溶液的制备

取注射用益气复脉粉1.2g，精密称定，置烧杯中，用水10mL溶解，上已处理好的Strata^TM-X商品树脂柱，其型号内径1cm，树脂床高约2cm；300μm，流速约1.0mL·min^-1，弃去流出液，待流至树脂层液面时，以0.5mol·L^-1NaOH甲醇-水＝2:8，5mL分两次冲洗后，继以用20％甲醇冲洗后，最后以甲醇洗脱，洗脱液收集于10mL量瓶中至刻度，摇匀，过0.45μm膜，即可；

3)测定方法

分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱，记录色谱图，分别测定样品中10种人参皂苷的含量，计算其总和。

3.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，对照品溶液和供试品溶液各进样10μL。

4.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，该条件下，样品分离良好，阴性对照无干扰。

5.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

对照品溶液的制备

分别精密称取10种人参皂苷对照品，分别为：人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rb2、Rb3、Rd、Rg3、Rc，置于50ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，制得每1ml各含约0.1mg的溶液；

供试品溶液的制备

取注射用益气复脉冻干粉1.2g，精密称定，置烧杯中，用水10mL溶解，上已处理好的Strata^TM-X商品树脂柱，内径1cm，树脂床高约2cm；300μm，流速约1.0mL·min^-1，弃去流出液，待流至树脂层液面时，以0.5mol·L^-1NaOH甲醇-水＝2:8，5mL分两次冲洗后，继以用20％甲醇冲洗后，最后以甲醇洗脱，洗脱液收集于10mL量瓶中至刻度，摇匀，过0.45μm膜，即可；

在此测定方法下，对照品溶液和供试品溶液各10μL进样；

用归一化法计算各人参皂苷的含量，它们的和即为10种人参皂苷含量之和。