CN105223300A - 荔枝多酚及其产品的质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荔枝多酚及其产品的质量控制方法；旨在提供一种用途广泛的荔枝多酚，及其一种可同时定性定量测定荔枝多酚及其制剂中多种有效成分含量，并构建全面评价及监控其质量的方法；其技术要点：以荔枝皮、核、带叶嫩枝为原料提取得到的多酚类物质，进一步经柱层析、萃取，并结合HPLC半制备色谱，分离得到含化合物1(-)-表儿茶素，化合物2原花青素A2，化合物3原花青素B2，化合物4表儿茶素-(4β→8，2β→O→7)-表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素，下简称PC-C，化合物5B型原花青素二聚体，化合物6A型原花青素3聚体；属于化学检测技术领域。

Description

荔枝多酚及其产品的质量控制方法

技术领域

本发明公开了一种多酚及其产品的质量控制方法，具体地说，是一种荔枝多酚及其产品的质量控制方法；属于化学检测技术领域。

背景技术

植物多酚是多羟基酚类化合物的总称，广泛存在于蔬菜、水果、豆类、茶等植物中，多酚的独特结构赋予了它一些独特的化学性质，使其具有抗氧化、预防心脑血管疾病、抗肿瘤、抗衰老等多种功能，在药品、保健食品、化妆品以及功能性饮料等领域的应用越来越广泛。已成功开发利用的植物多酚类抗氧化提取物有葡萄籽提取物和绿茶提取物等。研究结果显示，荔枝提取物的总酚含量和抗氧化活性均与葡萄籽非常接近，极具开发价值。

多酚的含量检测方法主要采用盐酸-正丁醇法、香兰素法、Folin-Ciocalteau法测定(均为UV法)，也有文献报道采用HPLC法测定里面的1～2种成分，主要是目前中检所可提供的对照品表儿茶素和芦丁。但提取出来的多酚类成分较多，UV法存在一些缺陷，如重现性差，准确度低(易受杂质干扰)，无法确定提取物的组成，采用HPLC法测定里面的1～2种成分也不能体现整体成分含量和比例与药效的关系，因此很有必要建立一个能如实体现其内在品质的质量标准。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用途广泛的荔枝多酚，及其一种可同时定性定量测定荔枝多酚及其制剂中多种有效成分含量，并构建全面评价及监控其质量的方法。

为此，本发明提供的一个技术方案为：

一种荔枝多酚，以荔枝皮、核、带叶嫩枝为原料提取得到的多酚类物质，进一步经柱层析、萃取，并结合HPLC半制备色谱，分离得到含化合物1(-)-表儿茶素，化合物2原花青素A2，化合物3原花青素B2，化合物4PC-C，化合物5B型原花青素二聚体，化合物6A型原花青素3聚体。

本发明提供的另一个技术方案为：

一种荔枝多酚产品是采用荔枝提取物为原料制成的药物制剂或保健食品或食品与化妆品。

进一步的，上述的荔枝多酚产品，所述的药物制剂包括微囊或微乳或口服溶液剂或颗粒剂或胶囊剂或片剂或散粉剂或乳膏剂或凝胶剂。

进一步的，上述的荔枝多酚产品，所述的化妆品包括洗面奶或营养液或冷霜或眼霜。

本发明提供的最后一个技术方案为：

一种荔枝多酚及其产品的质量控制方法，依次包括下述步骤：

(1)建立对照品的UPLC图谱及供试品的UPLC指纹图谱，色谱条件为：进样量1～5μl；色谱柱为ACQUITYHSST3(2.1×100mm；1.8μm)；流动相为用乙腈-甲酸或乙酸或磷酸或三氟乙酸调至pH为2.0～3.0的水溶液，梯度洗脱；检测波长：280nm；梯度洗脱步骤为：0～6min，流动相乙腈由10％渐变为14％、6～7min，流动相乙腈由14％渐变为19％、7～11min，流动相乙腈由19％渐变为21％、11～13min，流动相乙腈由21％渐变为32％；所述对照品为表儿茶素、原花青素B2、原花青素A2、PC-C的混合溶液；所述供试品为荔枝多酚或其产品的30％甲醇提取液；

(2)鉴定步骤，采用对照品法和UPLC-PDA/QDA/MS等技术手段指证指纹图谱中10个化学成分，以表儿茶素为对照品，通过相对保留时间确定各成分在色谱系统的位置(见表1)

表1各成分在色谱系统的相对保留时间

通过表儿茶素对照品确认色谱中的表儿茶素，按相对保留时间指证指纹图谱中其他9个化学成分，供试品图谱与已建立的对照指纹图谱比较，相似度大于0.90，可判断供试品为合格产品。

(3)含量测定步骤，以表儿茶素为对照品，以外标一点法测定表儿茶素含量，采用一测多评法，以表儿茶素为内标，测定并计算供试品中待测组分即原花青素B2、原花青素A2、PC-C的含量，根据有效成分含量的高低，判断供试品的优劣，从而达到监控荔枝多酚及其产品质量的目的。

进一步的，上述荔枝多酚及其产品的质量控制方法，所述步骤(2)中供试品的高效液相色谱指纹图谱与对照指纹图谱比较共有32个共有特征峰，各特征峰的保留时间分别为1.823min、1.928min、2.166min、2.256min、2.497min、2.798min、2.991min、3.160min、3.407min、3.852min、4.011min、4.328min、5.071min、5.625min、5.967min、7.428min、7.563min、7.728min、7.856min、8.167min、8.389min、8.715min、8.876min、8.988min、9.050min、9.411min、9.491min、9.604min、9.706min、9.854min、10.516min、11.060min，通过表儿茶素对照品确认色谱中保留时间为4.328min(12号峰)为表儿茶素，3.407min(RRT0.79，9号峰)、5.071min(RRT1.17，13号峰)、7.428min(RRT1.72，16号峰)、8.715min(RRT2.01，22号峰)、8.876min(RRT2.05，23号峰)、9.050min(RRT2.09，25号峰)、9.411min(RRT2.17，26号峰)、9.491min(RRT2.19，27号峰)、10.516min(RRT2.43，31号峰)9个特征峰依次为原花青素B2、PC-C、A型原花青素三聚体1、B型原花青素二聚体、原花青素A2、A型原花青素三聚体2、A型原花青素三聚体3、A型原花青素三聚体4、A型原花青素二聚体。

进一步的，上述荔枝多酚及其产品的质量控制方法，所述步骤(3)中的一测多评法具体为以表儿茶素为内标，分别计算原花青素B2、原花青素A2、PC-C对于表儿茶素的校正因子；以表儿茶素为对照品，采用外标一点法计算供试品中表儿茶素的含量；再根据公式CX＝f·CS·AX/AS，计算供试品中其他待测组分的含量；

其中，CX为供试品中待测组分的浓度，f为所述的校正因子，CS为供试品中表儿茶素的浓度，AX为所述其他待测组分在供试品图谱中的峰面积，AS为表儿茶素在供试品图谱中的峰面积。

与现有技术相比，本发明具有以下效果：

中药与天然药物用药从整体出发，是以多成分、多靶点发挥作用，单一成分的检测不能代表其整体功效和内在质量。指纹图谱是一种综合的、可量化的化学鉴定手段，可以鉴别真伪，评价原料药材、半成品和成品质量的均一性和稳定性，体现了中药与天然药物作用的整体性和模糊性。发明人采用指纹图谱整体评价植物提取物及其产品，同时，通过一测多评法对有效成分进行含量测定，为保证产品一致性和稳定性提供可行的模式。

本发明针对目前植物多酚类提取物及其产品多采用盐酸-正丁醇法(以原花青素为对照品)、香兰素法(以儿茶素为对照品)、Folin-Ciocalteau法(以没食子酸为对照品)测定总酚含量，由于植物多酚为一类化合物的总称，不同植物多酚类提取物所含的组分不同，而不同组分在同一种方法中的显色能力有较大差别，仅以一种成分为对照测定总酚含量或采用HPLC法测定其中1～2种成分，不能准确反映提取物及其产品的质量，因此，有必要建立科学、全面多指标质量评价监控方法。我们结合UPLC指纹图谱分析方法，针对指纹图谱中成分较多的几种成分，首先分离得到单体，进而建立“一测多评”方法，可同时鉴别及测定荔枝多酚及其产品中多种有效成分，既解决了对照品难求的问题，又可以有针对性控制产品的质量，能全面监控半成品和成品的质量，监控工艺的稳定性，保证其质量的稳定、可控，有效避免了产品质量不一致，提取物中的有效成分组成大相径庭的现象，保证该品种的正常生产、流通秩序。本发明还具有方法先进、重现性好、可操作性强和快速等优点。

附图说明

图1是荔枝多酚提取物的分离图；其中：①：硅胶(200-300目)柱层析，氯仿-甲醇、氯仿丙酮洗脱，TLC法合并相同馏分；②：SephadexLH-20葡聚糖凝胶柱层析，甲醇洗脱，UPLC法合并相同馏分；③：HPLC半制备色谱法，流动相：甲醇-0.2％甲酸溶液。

图2是化合物1的1H-NMR图；图3是化合物1的13C-NMR图；图4是化合物2的一级质谱图；图5是化合物2的二级质谱图；图6是化合物2的1H-NMR图；图7是化合物2的13C-NMR图；图8是化合物3的一级质谱图；图9是化合物3的二级质谱图；图10是化合物3的1H-NMR图；图11是化合物3的13C-NMR图；图12是化合物4的一级质谱图；图13是化合物4的二级质谱图；图14是化合物4的1H-NMR图；图15是化合物4的13C-NMR图；图16是化合物5的UV光谱图及质谱图；图17是化合物6的UV光谱图及质谱图；图18是荔枝多酚UPLC指纹图谱对照图谱(280nm)；图19是荔枝多酚UPLC指纹图谱(280nm)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利保护范围内所做有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。

实施例1

本发明提供的一种荔枝多酚，以荔枝皮、核、带叶嫩枝为原料提取得到的多酚类物质，进一步经柱层析、萃取，并结合HPLC半制备色谱，分离得到含化合物1(-)-表儿茶素，化合物2原花青素A2，化合物3原花青素B2，化合物4PC-C，化合物5B型原花青素二聚体，化合物6A型原花青素3聚体。

其制备方法，取荔枝多酚提取物，分离步骤见附图1，具体为经AB-8大孔树脂纯化后，洗脱液40～50℃减压浓缩至无醇味，然后用石油醚(1:2)萃取1～2次，弃去石油醚层，水层用乙酸乙酯(1:3)萃取1～3次，合并乙酸乙酯层，40℃减压浓缩至干，得纯化后的荔枝多酚提取物(红棕色粉末)。取上述红棕色粉末，甲醇溶解，加1～2倍量硅胶(200～300目)拌样。另取20～40倍量硅胶，以甲醇—氯仿(1:7)为溶剂湿法装柱，洗脱梯度：甲醇—氯仿(1:7)；甲醇—氯仿(1:5)；甲醇—氯仿(1:2.5)；甲醇—氯仿(1:1)，每个梯度洗脱3～5个柱体积，TLC法合并相同馏分(展开剂：甲醇—氯仿＝1:5)，得5个级分：Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5，40℃减压浓缩至干，甲醇复溶。Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5经UPLC分析，Fr1主要含化合物1、Fr2主要含化合物2、Fr3主要含化合物3及化合物5、Fr4主要含化合物4及化合物6，Fr5不含目标化合物。

Fr1、Fr2、Fr3、Fr4按上述柱层析方法，以丙酮—氯仿为洗脱溶剂，洗脱梯度为丙酮—氯仿(1:3)、丙酮—氯仿(1:2)、丙酮—氯仿(1:1)，每个梯度洗脱3～5个柱体积。Fr1收集化合物1。Fr2收集化合物2。Fr3、Fr4未能完全分离，但起纯化作用。

进一步的，采用SephadexLH-20葡聚糖凝胶，以甲醇为洗脱剂，对Fr1、Fr2、Fr3、Fr4继续分离纯化，Fr1收集化合物1，经UPLC法分析纯度大于98％。Fr2收集化合物2，经UPLC法分析纯度约为95％。Fr3分离得化合物3及化合物5，UPLC法分析化合物5纯度大于98％。Fr4未能分离，但起纯化作用。

进一步的，取纯度未达98％的化合物2、化合物3及Fr4采用HPLC半制备色谱法继续分离纯化，以十八烷基硅烷为填充剂，流动相有机相为甲醇或乙腈，水相为0.1％～0.5％的甲酸、乙酸、三氟乙酸等挥发酸的水溶液。按峰收集馏分，气吹法除去馏分中有机溶剂后，冷冻干燥得化合物2、化合物3、化合物4、化合物6，纯度均大于98％。

运用UPLC-PDA/QDA/MS、ESI-MS2、NMR、IR、UV等技术手段对6个化合物进行结构鉴定：

化合物1：淡黄色无定型粉末，易溶于甲醇，化合物1的1H-NMR(参阅图2)(500MHz；CD3OD)δ：4.80(1H，d)，4.16(1H，m)，2.71(1H，dd，15.5，3)，2.84(1H，dd，15.5，5)，5.90(1H，d，2.0)，5.92(1H，d，2.0)，6.96(1H，d，2.0)，6.73(1H，d，8.0)，6.79(1H，dd，8.0,2.0)；13C-NMR(参阅图3)(500MHz；CD3OD)δ：79.86，67.47，29.26，100.04，157.65，96.35，158.0，95.85，157.36，132.27，115.29，145.92，145.76，115.86，119.37上述数据与文献报道(-)-表儿茶素的δH和δC基本一致，故鉴定化合物1为(-)-表儿茶素，分子式为C15H14O6，分子结构式：

(-)-表儿茶素(化合物1)的分子结构式

化合物2：白色无定型粉末，易溶于甲醇，化合物2在ESI-MS负离子模式下的分子离子[M﹣H]－为575.12m/z(参阅图4)，二级质谱(参阅图5)中主要的离子碎片539.10m/z是由分子离子失去2分子H2O产生，449.08m/z是由分子离子发生HRF裂解(heterocyclicringfission，HRF)失去1分子间苯三酚产生，423.07m/z是由分子离子发生RDA裂解(retro-Diels-Alder，RDA)产生，407.08m/z是由分子离子发生BFF裂解(benzofuranforming，BFF)再失去1分子H2O和1分子CO产生，289.07m/z和285.04m/z是由分子离子发生QM裂解(quinonemethidefission，QM)产生。化合物2的质谱结果与Koerner等报道的原花青素A2的结果相似。化合物2的1H-NMR(参阅图6)(400MHz；CD3OD)δ：4.14(1H,d,3.5Hz)，4.49(1H,d,3.5Hz)，6.07(1H,d,2.5Hz)，6.14(1H,d,2.5Hz)，7.15(1H,d,2.5Hz)，6.89(1H,d,8.5Hz)，7.03(1H,dd,10.5,3.0Hz)，4.99(1H,m)，4.31(1H,m)，3.03(1H,dd,21.5,6.0Hz)，2.85(1H,dd,21.5,3.0Hz)，6.09(1H,s)，7.14(1H,d,2.5Hz)，6.87(1H,d,8.5Hz)，6.98(1H,dd,10.5,2.4Hz)；13C-NMR(参阅图7)(400MHz；CD3OD)δ：100.38，68.06，29.25，104.38，156.97，98.33，158.10，96.54，154.23，132.45，115.96，146.75，146.29，116.06，119.79，81.76，66.95，29.87，102.45，156.57，96.64，152.27，107.32，152.11，131.38，115.66，145.61，145.97，115.66，120.40。上述数据与文献报道的原花青素A2的δH和δC基本一致，故鉴定化合物2为原花青素A2，分子式为C30H24O12，分子结构式：

原花青素A2(化合物2)的分子结构式

化合物3：白色无定型粉末，易溶于甲醇，化合物3在ESI-MS负离子模式下的分子离子[M﹣H]－为577.13m/z(参阅图8)，二级质谱(参阅图9)中主要的离子碎片425.09m/z是由分子离子发生RDA裂解产生，407.08m/z是由分子离子发生RDA裂解再失去1分子H2O产生，289.08m/z是由分子离子发生QM裂解产生。化合物3的质谱结果与Callemien等报道的B型原花青素二聚体结果一致。化合物3的1H-NMR(参阅图10)(500MHz；CD3OD)δ：5.04(1H,s)，3.90(1H,s)，4.64(1H,s)，5.94(1H,s)，5.98(1H,s)，6.88(1H,brs)，6.69(1H,d,11.0Hz)，6.71(1H,d,11.0Hz)，4.94(1H,s)，4.29(1H,s)，12.79(1H,d,14.5Hz)，2.92(1H,d,15.5Hz)，5.90(1H,s)，7.11(1H,s)，6.72,(1H,d,9.0Hz)，6.74(1H,d,9.0Hz)；13C-NMR(参阅图11)(500MHz；CD3OD)δ：77.07，73.53，37.11，101.37，158.43，97.32，159.23，96.08，156.51，132.52，115.23，145.86，145.60，115.91，119.24，79.71，66.98，29.71，100.46，158.43，96.47，154.47，107.30，154.47，132.07，115.23，145.60，145.86，115.91，119.85。上述数据与文献报道的原花青素B2的δC和δH基本一致，故鉴定化合物3为原花青素B2，分子式为C30H26O12，分子结构式：

原花青素B2(化合物3)的分子结构式

化合物4：白色无定型粉末，易溶于甲醇，化合物4在ESI-MS负离子模式下的分子离子[M﹣H]－为863.17m/z(参阅图12)，二级质谱中(参阅图13)主要的离子碎片711.15m/z由RDA裂解产生，693.13m/z由RDA裂解再失去1分子H2O产生，573.11m/z和289.07m/z由QM裂解产生，451.10m/z由QM裂解再失去1分子间苯三酚产生，411.07m/z为表儿茶素苄硫醇的分子离子峰。化合物4的质谱结果与Passos等报道的A型原花青素三聚体结果相似。化合物4的1H-NMR(参阅图14)(400MHz；CD3OD)δ：3.27(1H,br,s)，4.14(1H,d,4.5Hz)，5.96(1H,d,3.0Hz)，6.01(1H,d,3.0Hz)，7.02(1H,d,2.0Hz)，6.82(1H)，6.72(1H)，5.65(1H,s)，4.12(1H,s)，4.56(1H,s)，5.80(1H,s)，7.31(1H,s)，6.75(1H)，7.19(1H,d,7.8Hz)，4.38(1H,s)，3.85(1H,s)，2.82(2H,m)，6.09(1H,s)，6.87(1H)，6.83(1H)，6.72(1H)。13C-NMR(参阅图15)(400MHz；CD3OD)δ：99.95，67.52，29.84，106.45，156.01，98.31，156.75，96.52，154.15，133.15，116.15，146.60，146.27，116.72，119.43，78.87，72.57，38.27，104.94，155.76，96.63，151.77，108.84，151.09，131.76，115.75，145.46，145.89，115.75，121.34，80.30，67.19，28.87，100.11，157.82，96.10，155.53，106.73，155.53，132.46，115.48，145.32，145.75，116.02，119.87。上述数据与文献报道的表儿茶素-(4β→8，2β→O→7)-表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素的δH和δC基本一致，故鉴定化合物4为表儿茶素-(4β→8，2β→O→7)-表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素，简称PC-C，分子式为C45H38O18，分子结构式：

表儿茶素-(4β→8，2β→O→7)-表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素(化合物4)的分子结构式

化合物5的UV吸收光谱图和质谱图(参阅图16)，最大吸收为279nm，在ESI负离子模式下分子离子质量数为577，初步鉴定为B型原花青素二聚体。

化合物6的UV吸收光谱图和质谱图(参阅图17)，最大吸收为278nm，在ESI负离子模式下分子离子质量数为863，初步鉴定为A型原花青素3聚体。

取荔枝多酚中相对含量较高的原花青素B2、(-)-表儿茶素，PC-C，原花青素A2作为质量控制的指标成分(参阅图18，分别对应指纹图谱中的峰9、12、13、23)。

实施例2

1仪器与试药

1.1仪器：ACQUITYUPLCH-Class液相色谱仪(美国Waters)；色谱柱：ACQUITYHSST3(2.1×100mm；1.8μm)

1.2试药：

1.2.1对照品：表儿茶素对照品(批号：878-200102，中国药品生物制品检定所)；原花青素B2对照品(批号：20120525，天津尖峰天然产物研究开发有限公司)；原花青素A2对照品、表儿茶素-(4β→8，2β→O→7)-表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素对照品(广东药学院药物研究所制备，经UV、IR、ESI-MS²、NMR谱确证，纯度≥98％)

1.2.2供试品：10批荔枝皮(包括7个品种：黑叶、妃子笑、糯米糍、白蜡、桂味、槐枝、白糖罂)和5个不同成熟期黑叶荔枝果皮的提取物。

2.方法与结果

2.1溶液的制备：

2.1.1供试品溶液的制备

取提取物0.1g，精密称定，置100ml量瓶中，加30％甲醇适量超声处理5分钟使溶解，放至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀。用0.2μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.1.2对照品溶液的制备：取原花青素B2、表儿茶素、原花青素A2、表儿茶素-(4β→8，2β→O→7)-表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素对照品适量，用30％甲醇溶解，稀释制成每毫升各含15μg、150μg、125μg、60μg的混合对照品溶液。

2.2超高效液相色谱分析：精密吸取供试品溶液和对照品溶液3μl，进样；色谱条件：色谱柱为ACQUITYHSST3(2.1×100mm；1.8μm)；流动相为乙腈(A)－0.5％甲酸溶液(B)，采用表2的梯度洗脱方式：

表2梯度洗脱表

检测波长：280nm；柱温：35℃；流速：0.4mL/min；分别得到对照品高效液相色谱图和供试品的高效液相色谱指纹图谱。

2.3共有峰确定：如图1和图2所示，将上述得到的15批供试品的超高效液相色谱指纹图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2009版》进行比较，共有模式(参照指纹图谱)共出现32个。其保留时间分别为1.823min、1.928min、2.166min、2.256min、2.497min、2.798min、2.991min、3.160min、3.407min、3.852min、4.011min、4.328min、5.071min、5.625min、5.967min、7.428min、7.563min、7.728min、7.856min、8.167min、8.389min、8.715min、8.876min、8.988min、9.050min、9.411min、9.491min、9.604min、9.706min、9.854min、10.516min、11.060min，其中保留时间为3.407min、4.328min、5.071min、8.876min的4个特征峰依次与对照品色谱图中原花青素B2、表儿茶素、表儿茶素-(4β→8，2β→O→7)-表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素、原花青素A2相同，保留时间为8.715min的特征峰为B型原花青素二聚体(通过相对保留时间确定，RRT＝2.01)；保留时间为10.516min的特征峰为A型原花青素二聚体(通过相对保留时间确定，RRT＝2.43)；保留时间为7.428min、9.050min、9.411min、9.491min的4个特征峰为A型原花青素三聚体(通过相对保留时间确定，RRT分别为1.72、2.09、2.17、2.19)。

即供试品的图谱(参阅图19)包含与对照品图谱相同的色谱峰；供试品图谱与已建立的对照指纹图谱(由10批以上供试品建立的共有模式图谱)比较，共有峰为32个，相似度大于0.90，可判断供试品为合格产品。

2.4精密度试验：取同一供试品溶液连续进样6次，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2009版》进行评价，结果表明供试品溶液相似度均等于1，仪器的精密度良好。精密度结果见表3：

表3精密度试验结果

2.5稳定性考察：取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12小时进样，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2009版》进行评价，结果表明供试品溶液相似度均等于1，供试品溶液在放置12小时内稳定，满足检测要求。稳定性结果见表4：

表4稳定性试验结果

2.6重复性试验：取同一批供试品6份，按“供试品溶液的制备”项下方法制备，分别进样，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2009版》进行评价，结果表明供试品溶液相似度均等于1，方法重复性好。结果见表5：

表5重复性试验结果

2.7指纹图谱的建立与分析：取15批样品，按“供试品溶液的制备”项下方法制备，分别进样，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2009版》进行评价，结果见表6，结果表明供试品溶液相似度均大于0.9，说明建立的指纹图谱有效可行。

表6相似度结果

2.8采用上述一测多评法测定供试品4个待测成分的含量，根据有效成分含量的高低，可判断供试品的优劣。

实施例3

1仪器与试药

1.1仪器：ACQUITYUPLCH-Class液相色谱仪(美国Waters)；色谱柱：ACQUITYHSST3(2.1×100mm；1.8μm)

1.2试药：

1.2.1对照品：表儿茶素对照品(批号：878-200102，中国药品生物制品检定所)；原花青素B2对照品(批号：20120525，天津尖峰天然产物研究开发有限公司)；原花青素A2对照品、表儿茶素-(4β→8，2β→O→7)-表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素对照品(广东药学院药物研究所制备，经UV、IR、ESI-MS²、NMR谱确证，纯度≥98％)。

1.2.2供试品：提取物、荔枝多酚微球、荔枝多酚纳米乳、荔枝多酚胶囊、荔枝多酚片。

2方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1混合对照品贮备液：取原花青素B2对照品7.5mg，精密称定，置10ml量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，得原花青素B2对照品贮备液。分别取表儿茶素、原花青素A2、表儿茶素-(4β→8，2β→O→7)-表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素对照品15mg、12.5mg、6mg，精密称定，置同一50ml量瓶中，加入原花青素B2对照品贮备液2ml，少量甲醇溶解后，用30％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

混合对照品溶液：取混合对照品贮备液5ml，置10ml量瓶中，用30％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.2供试品溶液的制备

取提取物约0.1g，精密称定，置100ml量瓶中，加入30％甲醇适量，超声使溶解(约5min)，放至室温后，用30％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

取荔枝多酚微球约0.2g，精密称定，置100ml量瓶中，加入70％甲醇30ml，超声15min，放至室温后，用30％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

取荔枝多酚纳米乳约0.2g，精密称定，置100ml量瓶中，加入70％甲醇30ml，超声15min，放至室温后，用30％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

取胶囊内容物约0.2g，精密称定，置100ml量瓶中，加入70％甲醇30ml，超声15min，放至室温后，用30％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

取片剂粉碎后粉末约0.5g，精密称定，置100ml量瓶中，加入70％甲醇30ml，超声15min，放至室温后，用30％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2线性范围：取混合对照品贮备液定量稀释制成分别含表儿茶素29.652、59.304、88.956、148.26、177.912、237.216、296.52μg/ml，原花青素B22.734、5.468、8.202、13.67、16.404、21.872、27.34μg/ml，原花青素A223.916、47.832、71.748、119.58、143.496、191.328、239.16μg/ml，表儿茶素-(4β→8，2β→O→7)-表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素11.32、22.64、33.96、56.6、67.92、90.56、113.2μg/ml的系列混合对照溶液，取上述系列溶液，依法进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，分别得各对照品的标准曲线，见表7。

表7四种成分的标准曲线和范围

注：“PC-C”表示表儿茶素-(4β→8，2β→O→7)-表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素(下同)

2.3校正因子的计算：以表儿茶素为内标，将各待测组分标准曲线的截距校正为0后，得各待测组分经校正后的标准曲线回归方程A＝kc(见回归方程L₂)，根据校正因子的计算公式f＝(As/Cs)/(Ar/Cr)得f＝Ks/Kr，其中As为内标物对照品峰面积、Cs为内标物浓度、Ar为某待测成分对照品峰面积、Cr为某待测成分对照品浓度、Ks为表儿茶素对照品经校正后的回归方程的系数、Kr为其他待测成分对照品经校正后的回归方程的系数。根据公式f＝Ks/Kr计算得到的校正因子的结果见表8。

表8校正因子的计算结果

2.4精密度试验：取同一供试品溶液，连续进样6次，每次3μl，记录色谱图，精密度试验结果见表9，从表中数据可知，仪器精密度良好。

表9精密度试验结果

2.5重复性试验：取同批提取物0.1g，精密称定，置100ml量瓶中，共6份，按供试品溶液制备方法处理，依法进样分析，以外标法计算各组分的含量。结果见表10，表儿茶素、原花青素B2、原花青素A2、PC-C平均含量分别为13.37％、0.8631％、10.44％、5.324％，RSD分别为1.1％、1.9％、1.6％、1.3％，结果表明方法重复性良好。

表10重复性试验结果

2.6稳定性试验：取同一混合对照品溶液及同一供试品溶液，分别在0，2，4，8，12h依法进样测定，记录色谱图，考察混合对照品溶液及供试品溶液的稳定性。结果见表11，从表中可知，供试品溶液和混合对照品溶液至少在12h内稳定，满足检测要求。

表11稳定性试验结果

2.6加样回收试验：取各组分含量已知的荔枝多酚提取物10mg，置20ml量瓶中，共6份，分别加入一定量的对照品溶液，按供试品溶液制备方法制备，依法进样分析，按外标法，计算加样回收率，结果见表12，表儿茶素、原花青素B2、原花青素A2、PC-C的平均加样回收率分别为99.8％、97.9％、100.9％、100.0％，RSD分别为1.2％、0.67％、1.4％、1.2％，各待测成分的加样回收率符合要求。

表12加样回收试验结果

2.7校正因子的耐用性试验：通过改变流速、柱温及检测波长，考察校正因子的耐用性。各变动因素及结果见表13，结果表明，校正因子的耐用性良好。

表13校正因子的耐用性试验结果

2.8待测组分色谱峰的定位：表儿茶素通过对照品定位，其他待测成分采用相对表儿茶素峰保留时间(RelativeRetentionTime；RRT值)进行定位。原花青素B2、原花青素A2及PC-C相对表儿茶素峰保留时间(RRT值)见表14。使用一测多评法进行含量测定时，通过表儿茶素峰的保留时间计算其他待测成分峰的RRT值，根据RRT值及峰形可对原花青素B2、原花青素A2及PC-C准确定位。

表14相对保留时间的计算结果

2.9一测多评法和外标法测定结果的比较：通过各待测组分的对照品，以外标法测得供试品中各待测成分的含量，以及通过一测多评法(以表儿茶素为内标)计算各待测成分的含量，两种方法测定的结果见表15。通过t检验，比较传统外标法的实测值和一测多评法的计算值结果，t检验结果表明，两种方法没有差别(P﹥0.25)，说明建立的一测多评法对荔枝多酚及其制剂进行含量测定的结果准确可靠。

表15一测多评法和外标法测定结果的比较

实施例4

含量测定：取表儿茶素对照品适量，精密称定，用30％甲醇溶解并稀释制成150μg/ml的溶液，作为对照品溶液；另取供试品，按“供试品溶液的制备”项下制备供试品溶液，按外标一点法测定供试品中表儿茶素的含量，按一测多评法计算供试品中原花青素B2、原花青素A2及PC-C的含量，结果见表16。

表16样品含量测定结果(一测多评法)

综上所述，本发明中荔枝多酚及其制剂指纹图谱及一测多评法的构建简单、快速、准确可靠、重现性好，可全面监控荔枝多酚及其产品的质量。

Claims (7)

1.一种荔枝多酚，其特征在于，以荔枝皮、核、带叶嫩枝为原料提取得到的多酚类物质，进一步经柱层析、萃取，并结合HPLC半制备色谱，分离得到含化合物1(-)-表儿茶素，化合物2原花青素A2，化合物3原花青素B2，化合物4PC-C，化合物5B型原花青素二聚体，化合物6A型原花青素3聚体。

2.一种荔枝多酚产品，其特征在于，采用权利要求1提取物为原料制成的药物制剂或保健食品或食品与化妆品。

3.如权利要求2所述的荔枝多酚产品，其特征在于：所述的药物制剂包括微囊或微乳或口服溶液剂或颗粒剂或胶囊剂或片剂或散粉剂或乳膏剂或凝胶剂。

4.如权利要求2所述的荔枝多酚产品，其特征在于：所述的化妆品包括洗面奶或营养液或冷霜或眼霜。

5.权利要求1或2所述的荔枝多酚及其产品的质量控制方法，其特征在于，依次包括下述步骤：

(1)建立对照品的UPLC图谱及供试品的UPLC指纹图谱：

色谱条件为：进样量1～5μl；色谱柱为2.1×100mm；1.8μm；流动相为用乙腈-甲酸或乙酸或磷酸或三氟乙酸调至pH为2.0～3.0的水溶液，梯度洗脱；检测波长：280nm；梯度洗脱步骤为：0～6min，流动相乙腈由10％渐变为14％、6～7min，流动相乙腈由14％渐变为19％、7～11min，流动相乙腈由19％渐变为21％、11～13min，流动相乙腈由21％渐变为32％；所述对照品为表儿茶素、原花青素B2、原花青素A2、PC-C的混合溶液；所述供试品为荔枝多酚或其产品的30％甲醇提取液；

(2)鉴定步骤，采用对照品法和UPLC-PDA/QDA/MS技术手段指证指纹图谱中10个化学成分，以表儿茶素为对照品，通过相对保留时间确定原花青素B2、表儿茶素、PC-C、A型原花青素三聚体1、B型原花青素二聚体、原花青素A2、A型原花青素三聚体2、A型原花青素三聚体3、A型原花青素三聚体4、A型原花青素二聚体在色谱系统的位置：通过表儿茶素对照品确认色谱中的表儿茶素，按相对保留时间指证指纹图谱中其他9个化学成分，供试品图谱与已建立的对照指纹图谱比较，相似度大于0.90，可判断供试品为合格产品；

(3)含量测定步骤，以表儿茶素为对照品，以外标一点法测定表儿茶素含量，采用一测多评法，以表儿茶素为内标，测定并计算供试品中待测组分即原花青素B2、原花青素A2、PC-C的含量，根据有效成分含量的高低，判断供试品的优劣，达到监控荔枝多酚及其产品质量的目的。

6.根据权利要求5所述的荔枝多酚及其产品的质量控制方法，其特征在于，所述步骤(2)中供试品的高效液相色谱指纹图谱与对照指纹图谱比较共有32个共有特征峰，各特征峰的保留时间分别为1.823min、1.928min、2.166min、2.256min、2.497min、2.798min、2.991min、3.160min、3.407min、3.852min、4.011min、4.328min、5.071min、5.625min、5.967min、7.428min、7.563min、7.728min、7.856min、8.167min、8.389min、8.715min、8.876min、8.988min、9.050min、9.411min、9.491min、9.604min、9.706min、9.854min、10.516min、11.060min，通过表儿茶素对照品确认色谱中保留时间为4.328min即12号峰为表儿茶素，3.407min即RRT0.79，9号峰、5.071min即RRT1.17，13号峰、7.428min即RRT1.72，16号峰、8.715min即RRT2.01，22号峰、8.876min即RRT2.05，23号峰、9.050min即RRT2.09，25号峰、9.411min即RRT2.17，26号峰、9.491min即RRT2.19，27号峰、10.516min即RRT2.43，31号峰；9个特征峰依次为原花青素B2、PC-C、A型原花青素三聚体1、B型原花青素二聚体、原花青素A2、A型原花青素三聚体2、A型原花青素三聚体3、A型原花青素三聚体4、A型原花青素二聚体。

7.如权利要求5所述的荔枝多酚及其产品的质量控制方法，其特征在于：所述步骤(3)中的一测多评法具体为以表儿茶素为内标，分别计算原花青素B2、原花青素A2、PC-C对于表儿茶素的校正因子；以表儿茶素为对照品，采用外标一点法计算供试品中表儿茶素的含量；再根据公式CX＝f·CS·AX/AS，计算供试品中其他待测组分的含量；

其中，CX为供试品中待测组分的浓度，f为所述的校正因子，CS为供试品中表儿茶素的浓度，AX为所述其他待测组分在供试品图谱中的峰面积，AS为表儿茶素在供试品图谱中的峰面积。